WO1996041797A1

WO1996041797A1 - Complexonas de naturaleza de acidos n-2-(azol-1(2)-il)etiliminodiaceticos, sintesis, estudio analitico y aplicaciones biologicas

Info

Publication number: WO1996041797A1
Application number: PCT/ES1996/000129
Authority: WO
Inventors: Paloma Ballesteros Garcia; Pilar Lopez Larrubia; Sebastian Cerdan Garcia-Esteller
Original assignee: Universidad Nacional De Educacion A Distancia; Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-06-11
Publication date: 1996-12-27
Also published as: ES2094101B1; ES2094101A1; CA2197297A1; EP0790241A1

Abstract

Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1(2)-il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, caracterizadas por su capacidad complejante frente a iones Ca?2+, Mg2+¿ y otros cationes divalentes, lantánidos y metales de transición. Los compuestos, de estructura general (I) Azo1N-CH¿2?CH2-N (CH2CO2R)2, formula en la cual Azol = pirazol; 3,5-dimetilpirazol; indazol; etc. R = Alquilo ó H ó Na, se obtienen por reacción de alquilación de iminodiacetato de metilo con N-bromoetilazoles y posterior hidrólisis en medio ácido o básico. El procedimiento puede ser modificado por rutas sintéticas alternativas que impliquen N-aminoetilazoles como productos de partida o la utilización de procesos de ciclación en la preparación del azol N-sustituido. Se pueden aplicar en espectroscopía e imagen de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de hidrógeno u otros núcleos como sondas extrínsecas de Ca?2+, Mg2+¿ u otros iones metálicos y como agentes de contraste, en soluciones, extractos biológicos, tejidos, animales enteros y seres humanos.

Description

Título: COMPLEXONAS DE NATURALEZA DE ÁCIDOS N-2-(AZOL-

1(2)-IL)ETILIMINODIACÉTICOS, SÍNTESIS, ESTUDIO ANALÍTICO

Y APLICACIONES BIOLÓGICAS.

Introducción: Las aplicaciones Biomédicas de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) han experimentado, en la última decada, un desarrollo muy importante.¹ Tanto la espectroscopia (MRS) como la imagen (MRI) se han empleado para estudiar, no invasivamente, una multitud de procesos fisiológicos y patológicos en animales y seres humanos.² Más recientemente ha sido posible extender las aplicaciones de la RMN al estudio de la fisiología y patología de células y cultivos celulares eucarióticos.³ Estos avances han permitido comenzar a estudiar por RMN aspectos fundamentales de la Biología y la Medicina como son la proliferación, la diferenciación y el desarrollo celular. En todos estos procesos se producen cambios significativos en la concentración intracelular de calcio (pCa¡).⁴ De hecho, el pCa¡ o sus alteraciones juegan un papel primordial en una gran variedad de procesos biológicos, como son: la contracción muscular,⁵ la transducción del mensaje hormonal,⁶ la agregación plaquetaria y coagulación,⁷ la exocitosis de neurotransmisores,⁸ la fosforilación de proteínas,⁹ el metabolismo del glucógeno¹⁰ y la fototransducción y adaptación de fotorreceptores.^{1 1}

La concentración de Ca²⁺ en el medio extracelular es 10⁵ veces superior a su concentración intracelular y cambios pequeños en la permeabilidad de la membrana provocan cambios drásticos en la concentración intracelular de Ca²⁺. Este hecho hace que muchas señales hormonales, utilicen variaciones en la concentración de Ca²⁺ intracelular como mecanismos de transducción del mensaje a través de la membrana.⁶-¹²

Dado que las concentraciones intracelulares de Ca²⁺ no son directamente observables por RMN, ha sido necesario utilizar una serie de indicadores (o sondas) que, debido a su capacidad quelante, permiten determinar indirectamente el pCa¡ utilizando Resonancia Magnética. Hasta ahora, la mayor parte de las medidas de pCa¡ llevadas a cabo por RMN han utilizado casi siempre ¹⁹F RMN, empleando análogos fluorados del BAPTA (ácido bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético) como sondas extrínsecas.^{13 14} La ¹ H RMN, a pesar de ser ia más sensible y convencional de las espectroscopias de RMN, permanece aún escasamente utilizada para cualquiera de estos propósitos. En este sentido nos hemos propuesto desarrollar una nueva serie de sondas extrínsecas para la determinación pCa¡ por ¹H RMN.

Estado de la Técnica: Los agentes quelantes de Ca²⁺ más utilizados en sistemas biológicos están constituidos por moléculas denominadas complexonas que contienen unidades de ácido iminodiacético (N- carboximetilglicina).¹⁵ Existe otro tipo de moléculas como los éteres corona, por ejemplo, capaces de complejarse con el calcio, pero que debido a su carácter ionóforo o tóxico no pueden ser utilizados como indicadores en sistemas celulares. Entre la gran variedad de complexonas descritas en la literatura sólo el ácido etilendiaminotetra-acético (EDTA) ha sido utilizado previamente como sonda extrínseca de pCa por ¹ H RMN en granulos cromafines.¹⁶ El método se basa en que las velocidades de intercambio entre el Ca^{2 +} libre y el complejo EDTA-Ca²⁺ son inferiores a 360 s^{* 1} , encontrándose por tanto en la zona de intercambio lento en la escala de tiempo de ¹ H RMN. Esto hace que en los espectrómetros de alta resolución se puedan observar, simultáneamente, resonancias del EDTA libre (FR) y de sus formas queladas con metales (BD) (Figura 1). Debe resaltarse que las formas queladas con Ca²⁺ y Mg²⁺ dan resonancias con desplazamiento químico diferente, por lo que es posible distinguir entre los complejos EDTA- Ca²⁺ y EDTA-Mg²+.

(HOOCCH₂)₂NCH₂-CH2N(CH2C0₂H)₂ EDTA FR

BD

LJL^JL

3.5 ^'3,0 PPM

Figura 1: ¹H RMN de 50 mM Na₂EDTA más 30 mM Ca(N0₃)2, pH = 7,13 en D₂0; FR = libre; BD = ligado a Ca.¹⁶

Sin embargo, el EDTA presenta el inconveniente de que las resonancias en las cuales se detecta el efecto de la quelación aparecen en la región de 2,6-3,6 ppm, una de las zonas más complejas del espectro de ¹H RMN de los sistemas biológicos.

Por otro lado, la quelación de Ca²⁺ con BAPTA y EGTA (ácido etilenglicol bis(b-aminoetil ete -N.N.N'N'-tetraacético), agentes comúnmente utilizados en poten-ciometría o fluorescencia, transcurre en la región de intercambio rápido (en la escala de RMN) y, por tanto, no es posible distinguir las formas libres y ligadas, ni el tipo de catión unido a la complexona. Por ello, estos compuestos no se han podido utilizar directamente como sondas extrínsecas para pCa por H RMN.¹⁷

(HOOCCH₂)JJ N(CH₂COOH)₂

EGTA

Por este motivo se han desarrollado previamente derivados fluorados del BAPTA para su utilización con ¹⁹F RMN¹⁸ o también como sondas fluorescentes.¹³

F-BAPTA

Descripción: Considerando estos antecedentes, en el diseño de indicadores extrínsecos de pCa para ¹H RMN se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: i) Los espectros de ¹H RMN de los extractos celulares presentan su mayor complejidad en la zona de 1-5 ppm, región en la que resuenan la mayoría de los metabolitos celulares.¹⁹ ¡i) Resulta por tanto imprescindible que los indicadores extrínsecos contengan en su estructura grupos que sean sensibles a las variaciones producidas por la quelación del metal y que además resuenen a campos más bajos de 5 ppm. En este sentido, los anillos heterocíclicos resultan muy adecuados y en especial los azoles. Estos núcleos heterocíclicos originan señales bien resueltas y fácilmente identificables en la región de 6 a 8 ppm. iii) Ahora bien, para poder ser utilizados como sonda extrínseca que acuse exclusivamente cambios debidos a la quelación de metales, pero no a variaciones de pH, el pK_a del anillo heterocíclico debe estar alejado del pH fisiológico. Descartado el imidazol (pK_a = 6,9-7,0), el pirazol (pK_a = 2,5), el 3,5-dimetilpirazol pK_a = 4,2), el 1,2,4-triazol (pKa = 2,2) y el indazol (pK_a = 1 ,3) son candidatos adecuados. Por tanto las complexonas ideales para determinar pCa por ¹ H RMN deberían combinar unidades de ácido iminodiacético capaces de quelar Ca²⁺ (pCa) y anillos heterocíclicos según la estructura general:

AzolN(H⁾ * ^N *N(CH₂CO_H)2

Desde el punto de vista de diseño de la sonda, el anclaje del ácido iminodiacético al azol puede realizarse de diversas maneras. En este trabajo hemos optado por hacerlo a través de una cadena alquílica de dos átomos de carbono unida al átomo de nitrógeno N-|. El siguiente esquema ilustra el caso de la complexona derivada del pirazol.

La presente invención cubre los siguientes objetivos: 1 : Sintetizar complexonas con una unidad de ácido iminodiacético unido a través de una cadena alquílica de dos átomos de carbono al átomo de nitrógeno Ni (ó N₂) de un anillo azólico; 2: Estudiar por ¹ H RMN el comportamiento de los protones azólicos de estas moléculas frente a las variaciones de pH y 3: Estudiar por ¹H RMN el comportamiento de los protones azólicos de dichas moléculas frente a la adición de exceso de Ca²⁺, para comprobar su viabilidad como potenciales sondas de pCa¡, y frente a la adición de exceso de Mg ⁺, para determinar la medida en que este catión presente en las células, puede interferir en las medidas de calcio.

A continuación se presentan los productos sintetizados durante este trabajo:

1 (2)-(2-Bromoetil)azoles

CH₂CH₂ Br

N-2-(Azol-1 (2)-il)etiliminodiacetatos de metilo ó N- (metoxicarbonilmetil)-N-(2-azol-1 (2)-iletil)glicinatos de metilo

— CH CH„

Hidrocloruro del ácido N-2-(p¡razol-1 -il)etiliminodiacético ó hidrocloruro de la N-(carboximetil)-N-(2-pirazol-1-iletil)glic¡na

N-2-(Azol-1(2)-il)etiliminodiacetatos sódicos ó sales disódicas de

N-(carboximetil)-N-(2-azol-1 (2)-iletil)-glicinatos de metilo

10 11

12 13

La síntesis de las citadas complexonas se ha realizado según el siguiente esquema retrosintético:

La obtención de los bromoetilderivados 1-4 se ha llevado a cabo partiendo del azol correspondiente y el 1 ,2-dibromoetano utilizando la técnica de catálisis por transferencia de fase (CTF) líquido-líquido²²-²³ empleando

NaOH al 40%, bromuro de tetrabutilamonio (BTBA) como catalizador y el exceso de 1 ,2-dibromoetano como disolvente.

El 1 -(2-bromoetil)pirazol 1 , había sido sintetizado previamente empleando como catalizador el sulfato de tetrabutilamonio y manteniendo la reacción 1 hora a reflujo intenso.²⁴ En este trabajo se han probado estas y otras condiciones con distintos azoles de partida para centrar así la forma más óptima de preparación del 2-bromoetilderivado de cada uno de ellos.

De la reacción del azol con el 1 ,2-dibromoetano se pueden obtener en principio tres productos diferentes: el 2-bromoetilazol buscado; el N,N'- bis(azolil)etano resultante de la doble alquilación con 1 ,2-dibromoetano y el vinilazol como producto de eliminación. La proporción en que se forma cada uno de ellos depende de la estequiometría de la reacción. La utilización de un exceso de 1 ,2- dibromoetano potencialmente conducirá a un aumento de 2-bromoetilazol que se obtendrá como producto mayoritario. Por otra parte el control de la temperatura y del tiempo de reacción, contribuirán a disminuir tanto la formación del producto de eliminación, como la del bis-derivado.

Así, siguiendo este esquema sintético y empleando el reactivo 1 ,2- dibromoetano como disolvente en un exceso de 8 a 10 veces respecto al heterociclo correspondiente, se ha conseguido optimizar la obtención de los distintos bromoetilazoles. Los correspondientes vinil y bis-derivados se identificaron, en los espectros de ¹ H RMN de los crudos de reacción, por sus resonancias características, que coinciden con los datos descritos en la literatura para dichos compuestos.²⁵

Estos productos se han purificado por cromatografía en columna, seguida en algunos casos de destilación a vacío. Aunque el vinilazol no se consigue separar por completo del bromoetil derivado formado en cada caso, no representa un problema para la síntesis de la complexona final, pues no interfiere en manera alguna en el paso siguiente tras el cual ya resulta fácilmente separable del resto de los productos.

La alquilación del iminodiacetato de metilo²⁷ con los 2-bromoetilazoles 1-4, requería una especie básica que neutralizara el HBr liberado. No se pudo utilizar la técnica de CTF porque el medio básico produjo una hidrólisis de los grupos éster. Había que emplear por esta razón una amina con la que se formara el hidrobromuro derivado de la misma. Se ha utilizado el propio iminodiacetato de metilo basándonos en un antecedente previo en la bibliografía en el que se anclaba el cloroacetonitrilo al iminodiacetato.²⁸

De esta manera se ha realizado la síntesis de los distintos azoliletiliminodiacetatos de metilo por reacción directa de dos equivalentes de iminodiacetato, compuesto 14, por cada uno de 2-bromoetiiazol, uno de los cuales produce la sustitución nucleófila y el otro neutraliza el HBr formando el hidrobromuro.

15

Finalizada la reacción, se puede recuperar la sal de amonio 15 y basificarla nuevamente con K₂Cθ3. La síntesis de los azoliletiliminodiacetatos derivados se ha verificado para todos los bromoetilazoles manteniendo la reacción a 1 10 °C durante un espacio de tiempo de 2,5 h a 4,5 h, según el 1 (2)-(2-bromoetil)azol de partida, obteniéndose rendimientos análogos en todos los casos, entre 55% y 65%. La purificación completa de estos productos se ha conseguido por medio de una cromatografía en columna del crudo de reacción, seguida de una destilación a vacío. De esta manera se separan totalmente del iminodiacetato de metilo, cuya presencia interfiere en gran medida en el paso siguiente.

Las complexonas libres se han obtenido por hidrólisis de los grupos esteres para obtener los carboxilatos libres que son los verdaderos agentes quelantes de iones. Esta reacción se puede llevar a cabo en medio ácido (calentamiento en exceso de HCI 2N) o medio básico (con una cantidad equimolecular de NaOH al 0,6 % y a t.a.). Tanto en un caso como en el otro, se comprueba fácilmente por ¹H RMN la terminación de la reacción por la no aparición del singlete más intenso del espectro correspondiente a los 6 protones isócronos de los dos grupos -O-CH3.

Con el N-(2-pirazol-1-il)etiliminodiacetato de metilo 5 se han llevado a cabo las dos posibilidades. Como producto de la hidrólisis acida se ha obtenido el hidrocloruro derivado 9, de fuerte carácter higroscópico y muy difícil de recristalizar. La hidrólisis básica ha proporcionado la sal disódica 10 altamente estable y de pureza suficiente que no requiere una recristalización posterior. Con los demás esteres derivados sólo se ha realizado la hidrólisis básica como vía de obtención de las complexonas. Manteniendo la reacción 24 h a t.a. se han obtenido los azoliletiliminodiacetatos sódicos, compuestos 10-13, con un rendimiento de -100 %.

El objetivo final de la síntesis de las complexonas 9-13, es el de utilizarlas como indicadores de ¹H RMN para la determinación de pCa y pMg, o egentes de contraste para MRI en sistemas celulares. Para llegar a este punto, es preciso realizar previamente una serie de ensayos analíticos que son los que se presentan a continuación.

Las determinaciones se han realizado empleando ¹ H RMN, comenzando por la titulación de pH para comprobar las variaciones que experimentan en su desplazamiento químico el protón/es azólico/s, que se quiere/n utilizar para detectar las modificaciones en la concentración de iones metálicos. Es necesario que dichos protones mantengan un d prácticamente constante en el rango de pH, para que cualquier variación que se produzca en este en presencia de cationes, se deba exclusivamente a la concentración de los mismos en el medio.

Partiendo de soluciones 25 mM de los compuestos 9 y 11-13 en D₂0 y modificando el pH de alícuotas diferentes, se ha determinado el desplazamiento químico de cada uno de los protones, tanto azólicos como alifáticos, para los diferente valores de pH en el rango de 1 a 12. Los espectros se han obtenido a 360,13 MHz.

Las complexonas utilizadas para estas determinaciones han sido en todos los casos los N-2-(azol-1(2)-il)etiliminodiacetatos sódicos, salvo para la derivada del núcleo de pirazol, en el que se ha utilizado el hidrocloruro del ácido N-(2-pirazol-1-il)etiliminodiacético, compuesto 9. Los valores de d de cada protón se indican en las Tablas 1-4.

TABLA 1: Desplazamientos químicos (ppm) de los protones del compuesto 9 a distintos valores de pH.

^aSeñal ensanchada.

TABLA 2: Desplazamientos químicos (ppm) de los protones del compuesto 11 a distintos valores de pH.

^aSeñal o señales ensanchadas. TABLA 3: Desplazamiento químico (ppm) de los protones aromáticos del compuesto 12 a distintos valores de pH.

PH H3 H4 H7 H6 H5

2,00 8,22 7,91 7,63 7,57 7,30

2,73 8,22 7,90 7,63 7,56 7,30

3,91 8,22 7,89 7,62 7,55 7,30

4,75 8,22 7,89 7,63 7,56 7.30

6,26 8.22 7,90 7,63 7,56 7,30

6,94 8,21 7,89 7,63 7,55 7,30

8,40 8,17 7,87 7,65 7,54 7,27

8,91 8,14 7,86 7,68 7,53 7,26

9,84 8,12 7.85 7,66 7,52 7.25

10,92 8,11 7,85 7.67 7,52 7,25

12,09 8,11 7,85 7,67 7,52 7.25 TABLA 4: Desplazamiento químico (ppm) de los protones aromáticos del compuresto 13 a distintos valores de pH.

pH H3 H4 H7 H6 H5

1,97 8,37 7,83 7,71 7,45 7,22

2,85 8,37 7,83 7,72 7,45 7,22

4,05 8,37 7,83 7,72 7,45 7,22

5,43 8,37 7,83 7.72 7,45 7,22

6,56 8,37 7,83 7,72 7,45 7.22

7,12 8,37 7,83 7,72 7,45 7.21

7,98 8,37 7,82 7,70 7,44 7.20

8,72 8,37 7,82 7,68 7,42 7,19

9,95 8,37 7,82 7,67 7,42 7,19

11,70 8,37 7,82 7,67 7,42 7,18

12,40 8,37 7,82 7,67 7.42 7,17 Se ha observado que los desplazamientos químicos de todos los protones se mueven ligeramente hacia más bajo campo conforme desciende el valor de pH, con la excepción del protón azólico H7 del N-2-(indazol-1- il)etiliminodiacetato sódico 12 que lo hace a la inversa. Igualmente, se ha comprobado en todas las complexonas que los protones de los metilenos unidos directamente al nitrógeno que titula, varían su d de manera apreciable en torno al valor de su pK_a (pH entre 7 y 8). Sin embargo, los protones azólicos apenas experimentan modificación en todo el rango de pH.

La variación que se ha producido en el d de los distintos protones azólicos de las complexonas entre los dos extremos de pH (1 a 12), se refleja en la Tabla 5.

TABLA 5: Δδ (ppm) en los protones azólicos de los compuestos 9 y 11-13 en el intervalo de pH estudiado.

El protón que más modifica su desplazamiento químico con la variación de pH es el H4 del N-2-(3,5-dimetilpirazol-1 -il)etiliminodiacetato sódico, compuesto 11 , y el que menos lo hace, el protón H3 del N-(2-indazol-2- il)etiliminodiacetato sódico, compuesto 13 que no varía en absoluto su frecuencia de resonancia con el pH del medio.

Asimismo, se han estudiado por ¹H RMN las variaciones producidas en el desplazamiento químico de los protones azólicos de los compuestos 10- 13 (25 mM) como consecuencia de la adición de un exceso de iones: Ca²⁺ y Mg²⁺ (en relación molar 2:1 / ión:complexona). Este ensayo se ha realizado a dos valores distintos de pH final, tras la adición del ion, en cada caso: uno próximo al pH fisiológico y otro ligeramente alcalino. Hay que tener en cuenta que la formación del quelato entre la complexona y el catión va acompañada de un descenso de pH con respecto al de la disolución sin dicho ion metálico.¹⁵ Los valores de δ obtenidos para los protones azólicos para cada una de las moléculas 10-13, a los dos valores de pH y en presencia de los cationes Ca²⁺ y Mg²⁺, se encuentran recogidos en las Tablas 6 y 7.

En la Tabla 8 se muestran los incrementos producidos en el desplazamiento químico de los protones de los compuestos estudiados, al añadir los cationes al medio que se encuentra a un valor de pH próximo al fisiológico. En la Tabla 9 aparecen los datos obtenidos para el valor de pH básico.

TABLA 6: δ de los protones azólicos de las complexonas 10 a 13 en presencia de exceso de Ca²⁺ y de los CH1 3 azólicos de 11 , a dos valores de pH.

Compuesto 10.

PH H 3 H 4 H 5

8 ,87 7,67 6,37 7,67

7 ,01 7,67 6,39 7,69

Compuesto 11.

PH H 4 CH3 (3) CH₃ (5)

9 ,52 5,97 2,25 2,17

7 , 36 5,97 2,26 2,17 Compuesto 12.

pH H3 H4 H7 H6 H5

8,69 8,20 7,87 7,63 7,54 7.27

7,07 8,22 7,89 7,64 7,55 7,28

Compuesto 13.

PH H3 H4 H7 H6 H5

9,19 8,28 7,79 7,72 7,42 7,19

7,32 8,28 7,79 7,71 7,42 7,18

TABLA 7: δ de los protones azólicos de las complexonas 10 a 13 en presencia de exceso de Mg²⁺ y de los CH1 3 azólicos de 11, a dos valores de pH.

Compuesto 10.

pH H3 H4 H5

8,98 7,71 6,41 7,71

7,09 7,71 6,42 7,71 Compuesto 11.

Compuesto 12.

PH H3 H4 H7 H6 H5

8,40 8,23 7,88 7,65 | 7,56 7,28

6,78 8,23 7,89 7,63 7,56 | 7,29

Compuesto 13.

pH H3 H4 H7 H6 H5

9,66 ⁸-33 | 7,79 7,72 7,42 7,19

7,32 8,33 7,81 7,81 | 7,46 7,22 TABLA 8: Δδ (ppm) que se produce en los protones estudiados al añadir exceso de Ca²⁺ y Mg²⁺ a un pH próximo al fisológico (~7).

Compuesto Protones Con Ca^{2 +} Con Mg^{2 +}

H3 +0,02 +0,06

1 0 H₄ -0.04 -0,02

H5 -0,08 -0,06

H₄ +0,02 +0,06

1 1 CH₃ (3) +0,02 +0,04

CH₃ (5) +0,02 +0,08

H3 +0,04 +0,04

H4 +0,02 +0,02

1 2 H5 -0,02 -0,04

H6 +0,02 +0,02

H7 +0,02 +0,02

H3 -0,10 -0,04

H4 -0,07 -0,02

1 3 H5 -0,04 +0,02

H6 -0,02 +0,02

H7 -0,02 +0,10 TABLA 9: Δδ (ppm) que se produce en los protones estudiados al añadir exceso de Ca²⁺ y Mg²⁺ a pH básico (-9).

Se ha observado en todas las complexonas que al añadir Ca²⁺ o bien

Mg ⁺, el desplazamiento químico de los distintos protones azólicos es similar en los dos valores de pH estudiados. Sin embargo, se poducen mayores modificaciones en el desplazamiento químico (Δδ) de los protones que se han estudiado al valor de pH más básico. En el N-2-(pirazol-1- il)etiliminodiacetato sódico 10 el valor del desplazamiento químico de los protones H3, H4 y H5, ha variado entre 0,02 y 0.08 ppm tras la adición al medio de iones metálicos, tanto para el Ca²⁺ como para el Mg²⁺, siendo el H3 algo más sensible a la quelación del magnesio que a la del calcio, y el H4 y el H5 a la de calcio.

En cuanto al N-2-(3,5-dimetilpirazol-1-il)etiliminodiacetato sódico, 11 , el protón azólico H4 ha visto modificado su valor de d de manera bastante más apreciable al pH básico que al neutro. Un incremento menor en el valor de desplazamiento químico, se produce en los grupos metilos CH3 (3) y CH3 (5). Tanto estos protones como el anterior, son ligeramente más sensibles al Mg²⁺ que al Ca²⁺ .

El protón azólico H3 del compuesto 1 2 , N-2-(indazol- 1 - ¡l)etiliminodiacetato sódico, detecta la quelación con los cationes al pH - 7, aunque el cambio de su desplazamiento químico es muy pequeño: 0,04 ppm tanto para el Ca²⁺ como para el Mg²⁺. Sin embargo, al pH más básico la sensibilidad de este protón es considerablemente mayor. Algo similar ocurre con el resto de los protones azólicos de este compuesto. Cabe reseñar en esta complexona, que el protón H7 de la misma es el único de todos los estudiados en este trabajo, que se desplaza a más bajo campo a lo largo de la titulación de pH, aunque ese desapantallamiento es muy pequeño. Este mismo comportamiento se observa en los protones H5, H6 y H7 de esta molécula al añadir el calcio, donde también se desplazan a más bajo campo conforme disminuye la concentración de protones del medio. Por último, teniendo en cuenta que en el compuesto 13, N-2-(indazol-2- il)etiliminodiacetato sódico, el protón azólico H3 no modifica su desplazamiento químico en todo el rango de pH, las variaciones producidas en la resonancia del mismo tras añadir los cationes al medio, se deben única y exclusivamente a la quelación de los mismos con la complexona. Esta variación es fija a cualquier valor de pH: 0,1 ppm para la quelación con el calcio, y 0,04 ppm para el magnesio. El valor del Δδ en los protones H4, H5, H6 y H7 en presencia Ca²⁺ y Mg²⁺, oscila entre 0,02 ppm y 0,10 ppm, salvo para el H7 a pH básico que se desapantalla en 0,2 ppm. En esta complexona cabe destacar que a pH fisiológico uno de los protones es bastante sensible a la presencia de calcio y menos a la del magnesio, H3, y otro protón en el que ocurre justamente lo contrario, H7. Esto representa una gran ventaja pues es deseable que en una misma molécula existan protones de distinta sensibilidad frente a los cationes bivalentes.

Finalmente, los resultados obtenidos en este estudio sugieren que la presencia de sólo un grupo iminodiacético no produce, tras la quelación del mismo con iones metálicos, grandes efectos en las resonancias de los protones azólicos. Sin embargo, estos efectos, aunque pequeños, pueden ser útiles desde el punto de vista biológico, sobre todo en el compuesto 13. En este caso la posibilidad de disponer, en una misma molécula, de indicadores selectivos para Ca²⁺ y Mg²⁺ merece especial atención.

Síntesis de 1(2)-(2-bromoetil)azoles

Los azoles utilizados como productos de partida, así como el dibromoetano empleado, fueron comerciales, usándose sin purificación adicional.

MÉTODO GENERAL A

En un matraz de fondo redondo equipado con refrigerante de reflujo, se introduce el hidróxido sódico al 40%, el azol, el catalizador, bromuro de tetrabutilamonio (BTBA), y el dibromoetano, en una relación molar (3:1:1/40:8 ó 10). La mezcla se mantiene con agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se decanta la fase orgánica, se concentra y se purifica por cromatografía en columna (sílica gel y el/los disolvente/s adecuado/s), o por destilación a vacío. MÉTODO GENERAL B

En un matraz de fondo redondo eequipado con refrigerante de reflujo, se introduce el hidróxido sódico al 40%, el azol, el catalizador, bromuro de tetrabutil amonio (BTBA), y el 1 ,2-dibromoetano en una relación molar (3:1:1/40:10). La mezcla se calienta en un baño de aceite a una temperatura de 120-130°C durante una hora. Se decanta la fase orgánica, se concentra y se purifica por cromatografía en columna (sílica gel y el /los disolvente/s adecuado/s).

1-(2-Bromoetil)pirazol (1)²⁴

MÉTODO GENERAL A (Desde 29,4 hasta 117,6 mmoles de azol). Punto de ebullición: 38-40 °C (0,01 mm Hg). Rto.(%) = 71. I.R. (film): 3110, 3020, 2970, 2920, 1510, 1445, 1410, 1395, 1290, 1260, 1215, 1125, 1090, 1050, 965, 915, 880, 755 cnrr¹. Masas: m/z 176 (M+1 , 11%), 174 (M-1 , 11%), 95 (31%), 81 (41%), 69 (8%), 68 (100%), 54 (15%), 53 (17%), 52 (8%). H RMN (CDCI₃): 7,56 (d, 1 H, ³J₃4 = 1 ,6 Hz, H3), 7,46 (d, 1 H, ³J₄5 = 2,1 Hz, H5), 6,26 (triplete aparente, 1 H, H4), 4,51 (t, 2 H, ³J = 6,4 Hz, Ctí2-N), 3,72 (t, 2 H, ³J = 6,4 Hz, CH2-Br). ¹³C RMN (CDCI3): 139,8 (d, ¹J_C3H3 = 185,2Hz, C3), 129,7 (d, ¹JC5H5 = 186,4 Hz, C5), 105,1 (d, ¹Jc4H4 = 177 Hz, C4), 52,9 (t, ¹J = 141 ,6 Hz, CH₂-N), 30,2 (t, ¹J = 153,6 Hz, CH₂-Br).

1-(2-Bromoetil)-3,5-dimetilpirazol (2)²⁶

MÉTODO GENERAL B (Para 14,0 mmoles de azol). Punto de ebullición: 89- 90 °C (4 mmHg). Eluyente cromatográfico: Acetato de etilo. Rto. (%): 42. 1.R. (film): 3130, 3030, 2960, 2920, 2870, 1550, 1455, 1420, 1385, 1300, 1260, 1215,1145, 1030, 975, 880, 780 cτr¹. Masas: m/z: 204 (M+1 , 11%), 203 (M, 1%), 202 (M-1, 11%), 123 (4%), 109 (43%), 97 (6%), 96 (100%), 95 (35%), 82 (6%), 81 (6%), 68 (11%), 55 (6%). ¹H RMN (CDCI3): 5,79 (s, 1 H, H4), 4,31 (t, 2 H, ³J = 6,7 Hz, CÜ2-N). 3,68 (t, 2 H, ³J= 6,7 Hz, CiÍ2-Br), 2,27 (s, 3 H, CÜ3-5- ), 2,21 (s, 2 H, CH3-3-). ¹³C RMN (CDCI3): 148,0 (s, C3), 139,2 (s, C5), 104,9 (d, ¹Jc4H4 = 172,6 Hz, C4), 49,3 (t, ¹J = 140,7 Hz, CÜ2-N), 30,2 (t, ¹J = 153,4 Hz, CH₂-Br), 13,3 (c, ¹J = 126,9 Hz, CH₃-3-), 10,8 (c, ¹J = 128,5 Hz, CH₃-5-).

1-(2-Bromoetil)indazol (3)

MÉTODO GENERAL A (Desde 4,24 hasta 17,0 mmoles de azol). Eluyente cromatográfico: Hexano-Acetato de etilo / 6:4. Rto. (%): 44. I.R. (film): 3080, 3060, 2980, 2940, 1645, 1615, 1500, 1465, 1435, 1420, 1315, 1300, 1275, 1230,1210, 1160, 1010, 910, 850, 835, 755, 745 crrr¹. Masas: m/z: 226 (M+1 , 17%), 225 (M, 1%), 224 (M-1 , 17%), 132 (9%), 131 (100%), 118 (16%), 104 (11%), 103 (15%), 89 (8%), 77 (21%), 63 (17%), 51 (9%). ¹H RMN (CDCI3): 8,04 (d, 1 H, 5J₃₇ = 0,8 Hz, H3), 7,78 (ddd, 1 H, ³J₄₅ = 8,0 Hz, 4J₄₆ = 0,9 Hz, ⁵J47 = 0,9 Hz, H4), -7,45 (m, 2 H, H6 y H7), 7,20 (ddd, 1 H, ³J45 = 8,0 Hz, ³J₅6 = 6,2 Hz, 4J₅₇ = 1 ,8 Hz, H5), 4,76 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, CH2-N), 3,79 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, CÜ2-Br). ¹³C RMN (CDCI3): 139,5 (s, C7_a), 133,7 (d, ¹Jc3H3 = 189,9 Hz, C3), 126,3 (d, ¹JC6H6 = 165,7 Hz, C6), 123,6 (s, C3_a), 120,9 (d, ¹J_C5H5 = 154,9 Hz, C5), 120,6 (d, ¹ÜC4H₄ = 165,4 Hz, C4), 49,7 (t, ¹J = 141 ,4 Hz, £H₂- N), 29,4 (t, ¹J = 153,5 Hz, CH₂-Br).

MÉTODO GENERAL B. (Desde 4,24 hasta 17,0 mmoles de azol). Eluyente cromatográfico: Hexano-Acetato de etilo / 6:4._Rto. (%): 46.

2-(2-Bromoetil)indazol (4)

MÉTODO GENERAL A (Desde 4,24 hasta 17,0 mmoles de azol). Eluyente cromatográfico: Hexano-Acetato de etilo / 6:4. Rto. (%): 20. I.R. (film): 3120, 3060, 2970, 2920, 1625, 1510, 1470, 1425, 1380, 1350, 1310, 1265, 1160, 1140, 785, 760 cnrr¹. Masas: m/z: 226 (M+1 , 11%), 225 (M, 1%), 224 (M-1, 11%), 119 (9%), 118 (100%), 103 (4%), 91 (9%), 89 (9%), 77 (10%), 63 (16%), 51 (5%). ¹H RMN (CDCI₃): 8,00 (d, 1 H, 5J₃₇ = 0,8 Hz, H3), 7,70 (dddd, 1 H, ³J₆7 = 7,3 Hz, 4j₅₇ = 0,9 Hz, ⁵J 7 = 1.0 Hz, ⁵J₃7 = 0,8 Hz, H7), 7,66 (ddd, 1 H, ³J₄5 = 7,3 Hz, 4J₄₆ = 1,0 Hz, ⁵J₄₇ = 1.0 Hz; H4), 7,30 (ddd, 1 H, ³J₆7 = 7,3 Hz, ³J₅6= 6,7 Hz, 4j₄₆ = 1,0 Hz, H6), 7,10 (ddd, 1 H, SJ^ = 7,3 Hz, ³J₅₆ = 6,7 Hz, J₅7 = 0,9 Hz, H5), 4,76 (t, 2 H, ³J = 6,3 Hz, CÜ2-N), 3,79 (t, 2 H, ³J = 6,3 Hz, C±b-Br). C RMN (CDCI3): 149,0 (s, C7_a), 126,1 (d, ¹ÜC6H6 = 160,6 Hz, C6), 123,6 (d, ¹JC3H3 = 189,9 Hz, C3), 121 ,6 (d, ¹J_C5H5 = 159,7 Hz, C5), 121 ,2 (s, C3_a), 120,1 (d, ¹J_C4H4 = 156,4 Hz, C4), 117,0 (d, ¹Jc7H7 = 167,0 Hz, C7), 54,5 (t, ¹J = 142,6 Hz, CH₂-N), 29,4 (t, ¹J = 155,6 Hz, C_H₂-Br). MÉTODO GENERAL B (Desde 4,24 hasta 17,0 mmoles de azol). Eluyente cromatográfico: Hexano-Acetato de etilo / 6:4. Rto. (%): 14.

Síntesis de N-2-(azol-1(2)-il)etil¡minodiacetatos de metilo ó N- (metoxi-carbon¡lmetil)-N-(2-azol-1 (2)-iletil)glicinatos de metilo

Se emplearon los bromoetilazoles sintetizados previamente y purificados. El iminodiacetato de metilo utilizado, se obtuvo a partir del iminodiacetonitrilo comercial según el método descrito en la literatura.²⁷

MÉTODO GENERAL

En un matraz de fondo redondo equipado con refrigerante de reflujo y tubo de cloruro calcico, se introduce el bromoetilazol y el iminodiacetato de metilo en una relación molar (1 :2). La mezcla se calienta en un baño de aceite a una temperatura de 110°C durante un espacio de tiempo de 2,30 a 4,30 horas. La mezcla de reacción se enfría y se extrae con cloruro de metileno, se concentra y se purifica por destilación y/o cromatografía en columna (sílica gel y el /los disolvente/s adecuado/s).

N-(2-pirazol-1 -il)etil i mi nodiacetato de meti lo ó N- (metoxicarbonilmetil)-N-(2-pirazol-1-iletil)glicinato de metilo (5) MÉTODO GENERAL. (Desde 2,24 hasta 6,7 mmoles de 1 -(2- bromoetil)pirazol). Tiempo de reacción: 2,5 h. Eluyente cromatográfico Hexano-Etanol / 8:2. Punto de ebullición: 128-130 °C (0,05-0,01 mm Hg). Rto. (%): 55. I.R. (film): 3140, 3120, 3000, 2960, 2840, 1740, 1510, 1435, 1395, 1365, 1280, 1205, 1 180, 1 145,1090, 1060, 1040, 1010, 880, 760 crτr¹. Masas: m/z: 256 (M+1 , 4%), 255 (M, 13%), 196 (28%), 188 (6%), 187 (50%), 174 (55%), 146 (40%), 128 (70%), 1 16 (27%), 100 (17%), 95 (17%), 94 (14%), 81 (18%), 69 (14%), 68 (37%), 59 (18%), 56 (25%), 54 (18%), 45 (100%). ¹H RMN (CDCI₃): 7,53 (d, 1 H, ³J₃4 = 1.8 Hz, H3), 7,50 (d, 1 H, ³J ₅ = 2,0 Hz, H5), 6,22 (triplete aparente, 1 H, H4), 4,24 (t, 2 H, ³J = 6,2 Hz, CÜ2- Azol), 3,19 (t, 2 H, ³J = 6,2 Hz, CH2-N-). ¹³C RMN (CDCI3): 171 ,6 (s, 2 C, C_0), 139,3 (d, ¹Jc3H3 = 186,9 Hz, C3), 130,0 (d, ¹ÜC5H5 = 190,9 Hz, C5), 105,1 (d, ¹ÜC4H4 = 176,3 Hz, C4), 55,3 (t, 2 C, ¹J = 136,5 Hz, C_H₂-CO-), 54,7 (t, J = 135,8 Hz, C_H₂-N-), 51,5 (c, 2 C, ¹J = 147,2 Hz, C_H₃), 51 ,2 (t, ¹J = 139,6 Hz, C_H₂-Azol). Picrato: Punto de fusión: 91 -93 °C. Análisis elemental de C 17H 20N6O 11 : Calculado: %C = 42,34, %H = 4,07, %N = 17,08. Encontrado: %C = 42,31 , %H = 4,10, %N = 17,1 1.

N-2-(3,5-dimetilp¡razol-1 -il)etiliminodiacetato de metilo ó N- (metoxi-carbonilmet¡l)-N-[2-(3,5-dimetilpirazol-1 -il)etil]glicinato de metilo (6)

MÉTODO GENERAL. (Desde 2,46 hasta 5,55 mmoles de 1-(2-bromoetil)-3,5- dimetil pirazol).- Tiempo de reacción: 3,5 h. Punto de ebullición: 140-142°C (0,05-0,01 mm Hg). Rto. (%):65. I.R.: 3130, 3000, 2960, 2930, 2870, 2220, 1740, 1550, 1435, 1385, 1260, 1200, 1 180, 1170, 1120, 1050, 1020. 915, 775, 730 cm-1. Masas: m/z: 283 (M, 5%), 224 (13%), 187 (28%), 174 (27%), 146 (35%), 128 (55%), 124 (7%), 116 (19%), 1 14 (6%), 109 (7%), 100 (9%), 97 (19%), 96 (16%), 82 (14%), 68 (6%), 59 (9%), 56 (12%), 54 (7%), 45 (100%). ¹H RMN (CDCI3): 5,74 (s, 1 H, H4), 4,07 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, CH2- Azol), 3,67 (s, 6 H, CH3), 3,47 (s, 4 H, CÜ2-CO-), 3,09 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, CM2- N-), 2,24 (s, 3 H, CH3-5-). 2.18 (s, 3 H, CH₃-3). ¹³C RMN (CDCI3): 171,2 (s, 2 C, CO), 147,0 (s, C3), 139,1 (s, C5), 104,4 (d, ¹J_C4H4 = 172,1 Hz, C4), 55,1 (t, 2 C, ¹J = 136,4 z, C_H₂-CO-), 54,2 (t,¹J = 136,6 Hz, C_H₂-N-), 51 ,1 (c, 2 C, ¹J = 142,1 Hz, CJ-I3), 47,5 (t, ¹J = 138,8 Hz, C_H₂-Azol), 13,0 (c, J = 123,4 Hz, CH₃- 3-), 10,5 (c, ¹J = 127,9 Hz, CH₃-5-). Picrato: Punto de fusión: 83-85 °C. Análisis elemental de C19H24N6O11: Calculado: %C = 44,53, %H = 4,69, %N = 16,41. Encontrado: %C = 44,58, %H = 4,64, %N = 16,54.-

N-2-(indazol-1 -¡l)etili mi nodiacetato de meti lo ó N- (metoxicarbonilmetil)-N-(2-indazol-1-iletil)glicinato de metilo (7)

MÉTODO GENERAL. (Para 6 mmoies de 1-(2-bromoetil)indazol). Tiempo de reacción: 4,5 h. Punto de ebullición: 160-162 °C (0,01 mm Hg). Rto. (%): 56. I.R. (film) : 3060, 3000, 2950, 2850, 1740, 1610, 1505, 1470, 1435, 1315, 1200, 1180, 1 160, 1120, 1085, 1010, 910, 830, 755, 740 cnr¹. Masas: m/z: 305 (M, 6%), 246 (11%), 187 (23%), 175 (6%), 174 (72%), 146 (39%), 131 (6%), 128 (17%), 118 (11%), 116 (20%), 115 (6%), 94 (10%), 91 (5%), 77 (14%), 56 (8%), 51 (5%), 45 (100%). ¹H RMN (CDCI₃): 7,99 (d, 1 H, 5j₃₇ = 0,8 Hz, H3), 7,71 (ddd, 1 H, ³J₄₅ = 8,1 Hz, ⁴J₄₆ = 1.0 Hz, 5j₄₇ = 1 ,0 Hz, H4), 7,50 (dddd, 1 H, ³J₆7 = 8,1 Hz, ⁴J₅₇ = 0,8 Hz, 5j₄₇ = 1 ,o Hz, 5j₃₇ = 0,8 Hz, H7), 7,37 (ddd, 1 H, ³J₆7 = 8,1 Hz, ³J₅6 = 6,8 Hz, ⁴J₄₆ = 1 ,0 Hz, H6), 7,13 (ddd, 1 H, ³J ₅ = 8,1 Hz, ³J₅6 = 6,8 Hz, ⁴J₅7 = 0,8 Hz, H5) 4,54 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, CÜ2- Azol), 3,65 (s, 6 H, CH3), 3,49 (s, 4 H, CO-CH2-N), 3,26 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, CH2-N-). ¹ C RMN (CDCI3): 171 ,1 (s, 2 C, C_0), 139,4 (s, C7_a). 132,7 (d, ¹JC3H3 = 189,3 Hz, C3), 125,8 (d, ¹Jc6H6 = 160,7 Hz, C6), 123,6 (s, C3_a), 120,5 (d, ¹J_C5H5 = 161 ,3 Hz, C5), 120,1 (d, ¹J_C4H4 = 160,9 Hz, C4), 108,9 (d, ¹JC7H7 = 163,6 Hz, C7), 55,1 (t, 2 C, J = 137,8 Hz, C_H₂-CO-), 53,5 (t,¹J = 135,8 Hz, CΗ2-N-), 51,1 (c, 2 C, ¹J = 147,0 Hz, C_H₃), 47,7 (t, ¹J = 139,2 Hz, C_H2-Azol). Picrato: Punto de fusión: 105,5-107,5 °C. Análisis elemental de C21 H22 6O 11 : Calculado: %C = 47,19, %H = 4,20, %N = 15,73. Encontrado: %C = 46,80, %H = 4,07, %N = 15,31.

N-2-(indazol-2-il)etiliminodiacetato de metilo ó N- (metoxicarbonilmetil)-N-(2-indazol-2-iletil)glicinato de metilo (8)

MÉTODO GENERAL (Para 3,32 mmoles de 2-(2-bromoetil)indazol).- Temperatura del horno: 250 °C (0,01 mm Hg). En horno de bolas. Rto. (%): 60. I.R. (film): 3120, 3060, 3000, 2960, 1735, 1620, 1505, 1430, 1375, 1355, 1200, 1180, 1160, 1055, 1010, 980, 905, 785, 760, 745 ciτr¹. Masas: m/z: 305 (M, 10%), 246 (11%), 187 (31%), 174 (26%), 146 (28%), 128 (57%), 119 (8%), 118 (36%), 116 (13%), 114 (10%), 100 (9%), 94 (6%), 91 (6%), 89 (6%), 77 (9%), 59 (10%), 56 (7%), 54 (5%), 45 (100%). ¹H RMN (CDCI3): 8,11 (d, 1 H, ⁵J₃7 = 0,9 Hz, H3), 7,69 (dddd, 1 H, ³J₆7 = 7,7 Hz, J₅7 = 1.0 Hz, ⁵J₄₇ = 1.2 Hz, 5J₃7 = 0,9 Hz, H7), 7,65 (ddd, 1 H, ³J ₅ = 6,3 Hz, J₄₆ = 1 ,2 Hz, ⁵J₄₇ = 1 ,2 Hz, H4) 7,27 (ddd, 1 H, ³J₅6 = 8,3 Hz; ³J₆7 = 7,7 Hz, J₄₆ = 1,2 Hz, H6), 7,06 (ddd, 1 H, ³J₅6 = 8,3 Hz, ³J₄₅ = 6.3 Hz, ⁴J₅7 = 1.0 Hz, H5), 4,52 (t, 2 H, ³J = 6,1 Hz, CÜ2-AZ0I), 3,65 (s, 6 H, CH3), 3,46 (s, 4 H, CJ±J-CO-), 3,35 (t, 2 H, ³J = 6,1 Hz, CJÜ2-N-). ¹³C RMN (CDCI3): 171 ,5 (s, 2 C, £0), 148,7 (s, C7_a). 125,7 (d, ¹J_C6H6 = 165,2 Hz, C6), 124,0 (d, ¹J_C3H3 = 190.3 Hz, C3), 121 ,5 (s, C3_a), 121,2 (d, ¹J_C4H4 = 159,4 Hz, C4), 120,1 (d, ¹J_C5H5 = 165,2 Hz, C5), 117,0 (d, 1j_C7H7 = 160 Hz, C7), 55,5 (t, 2 C, ¹J = 137,6 Hz, C_H₂-CO-), 55,0 (t,¹J = 136,5 Hz, C_H₂-N-), 52,7 (t, ¹J = 141 ,2 Hz, C_H₂-Azol), 51 ,4 (c, 2 C, ¹J = 147,2 Hz, Q 3). Picrato: Punto de fusión: 140,6-142,4 °C._Análisis elemental de C21 H22N6O 11 : Calculado: %C = 47,19, %H = 4,20, %N = 15,73. Encontrado:%C = 47,40, %H = 4,62, %N = 15,61.

Hidrólisis de N-2-(azol-1(2)-iletiliminodiacetatos de metilo ó N- (metoxicarbonil-metil)-N-(2-azol-1 (2)-iletil)glicinatos de metilo Se emplearon los esteres anteriormente sintetizados y purificados. El HCI y el NaOH utilizados fueron comerciales, usándose sin purificación adicional.

MÉTODO GENERAL A: HIDRÓLISIS ACIDA

En un matraz de fondo redondo equipado con refrigerante de reflujo se introduce el ester y el HCI 2 N en una relación molar (1 :18). La mezcla se calienta en un baño de aceite a una temperatura de 100°C durante 4 horas. Se concentra y se purifica el hidrocloruro de ácido correspondiente por recristalización (empleando el/los disolvente/s adecuado/s).

MÉTODO GENERAL B: HIDRÓLISIS BÁSICA

En un matraz de fondo redondo eequipado con refrigerante de reflujo, se introduce el éster y NaOH al 0,6% en una relación molar (1 :2). La mezcla se mantiene con agitación a temperatura ambiente durante al menos 24 horas. Se concentra y se obtiene la sal disódica.

Hidrocloruro del ácido N-(2-pirazol-1 -il)etiliminodiacético ó hidrocloruro de la N-(carboximetil)-N-(2-p¡razol-1-iletil)glicina (9)

MÉTODO GENERAL A (Para 0,7 mmoles de éster). Punto de fusión: 142,5- 144,5 °C. Disolvente para la recristalización: EtOH / Et₂0. Rto. (%): -100. ¹H RMN (D₂0): 7,70 (d, 1 H, ³J₄₅ = 2,4 Hz, H5), 7,61 (d, 1 H, ³J₃₄ = 2,2 Hz, H3), 6,31 (triplete aparente, 1 H, H4), 4,53 (t, 2 H, ³J = 6,0 Hz, Ch^-Azol), 3,70 (t, 2 H, ³J = 6,0 Hz, CÜ2-N-). Análisis elemental de C9H13N3O4.HCI: Calculado: %C = 40,98, %H = 5,35, %N = 15,93. Encontrado: %C = 41 ,07, %H = 5,28, %N = 15,50. N-(2-pirazol-1-il)etiliminodiacetato sódico ó sal disódica de N-

(carboximetil)-N-(2-pirazol-1-iletil)glicina (10)

MÉTODO GENERAL B (Desde 4 hasta 40 mmoles de éster). Rto. (%):-100. I.R. (KBr): 3130, 3100, 2960, 2940, 2870, 2840, 1730, 1600, 1505, 1425, 1395, 1345, 1300, 1205, 1180, 1140, 1115, 1090, 1055, 1030, 905, 870, 775, 740 cm-¹. ¹H RMN (D₂0): 7,63 (dd, 1 H, ³J₄₅ = 1 ,8 Hz, J 35 = 0,6 Hz, H5), 7,49 (dd, 1 H, ³J₃ = 1.5 Hz, ⁴J₃5 = 0,6 Hz, H3), 6,26 (triplete aparente, 1 H, H4), 4,21 (t, 2 H, 3J = 6,7 Hz, C b-Azol), 3,09 (s, 4 H, Cj±rCO-), 2,98 (t, 2 H, ³J = 6,7 Hz, CÜ2-N-).

N-2-(3,5-dimetilp¡razol-1 -¡l)etiliminodiacetato sódico ó sal disódica de N-(carboximeti l)-N-[2-(3,5-dimet¡l pirazol-1 - il)etil]glicina (11)

MÉTODO GENERAL B. (Desde 0,353 hasta 0,706 mmoies de éster). Rto.

(%):-100. I.R. (KBr): 2980, 2950, 2920, 2880, 2830, 1600, 1550, 1420, 1350,

1300, 1260, 1230, 1200, 1140, 1095, 1040, 1010, 1000, 920, 940, 900, 825,

770 cm-¹. ¹H RMN (D₂0): 5,85 (s, 1 H, H4), 4,04 (t, 2 H, ³J = 7,5 Hz, CÜ2- Azol), 3,16 (s, 4 H, CM2-CO-), 2,90 (t, 2 H, ³J = 7,5 Hz, CHj>-N-), 2,17 (s, 3 H,

CH3-5-), 2,07 (s, 3 H CH₃-3-).

N-[2-(indazol-1-il)etil]iminodiacetato sódico ó sal disódica de N-

(carboximetil)-N-(2-indazol-1-iletil)glicina (12)

MÉTODO GENERAL B (Para 0,492 mmoles de ester).- Rto. (%):~100. I.R. (KBr): 3090, 3050, 2940, 2920, 2870, 2830, 1600, 1460, 1430, 1350, 1330, 1315, 1300, 1250, 1210, 1180, 1140, 1070, 1005, 940, 905, 880, 830, 795, 740 cm-¹. ¹H RMN (D₂0): 8,02 (d, 1 H, ⁵J₃7 = 1.0 Hz, H3), 7,75 (ddd, 1 H, ³J ₅ = 8,1 Hz, ⁴J₄₆ = 1,1 Hz, ⁵J₄₇ = 1,0 Hz, H4), 7,57 (dddd, 1 H, ³J₆7 = 7,8 Hz, ⁴J₅₇ = 0,9 Hz, 5J₄₇ = 1 ,0 Hz, 5j₃₇ = 1 ,0 Hz, H7), 7,43 (ddd, 1 H, ³J₆7 = 7,8 Hz; ³J₅6 = 6,8 Hz, J₄₆ = 1 ,1 Hz, H6), 7,14 (ddd, 1 H, ³J₄₅ = 8,1 Hz; ³J₅6 = 6,8 Hz, ⁴J₅7 = 0,9 Hz, H5) 4,46 (t, 2 H, ³J = 7,0 Hz, CH2-AZ0I), 3,14 (s, 4 H, CH2- CO-), 3,04 (t, 2 H, ³J = 7,0 Hz, CH2-N-).

N-2-(indazol-2-il)etiliminodiacetato sódico ó sal disódica de N- (carboximetil)-N-(2-indazol-2-iletil)glicina (13)

MÉTODO GENERAL B (Para 0,492 mmoles de éster). Rto. (%):-100. I.R. (KBr): 3110, 3070, 2950, 2920, 2870, 2830, 1600, 1510, 1430, 1350, 1300, 1225, 1160, 1140, 1045, 1005. 980, 940, 905, 840, 775, 755 crrr¹. ^""H RMN (D₂0): 8,29 (d, 1 H, 5J₃₇ = 0,9 Hz, H3), 7,71 (ddd, 1 H, ³J₄₅ = 8,4 Hz, ⁴J₄₆ = 1 ,1 Hz, ⁵J₄₇ = 1 ,0 Hz, H4), 7,57 (dddd, 1 H, ³J₆7 = 8,7Hz, ⁴J₅7 = 1.0Hz, 5J₄₇ = 1.0, ⁵Ü37 = 0,9 Hz, H7), 7,31 (ddd, 1 H, ³J₆₇ = 8,7 Hz, 3j₅6 = 6,6 Hz, ⁴J₄₆ = 1 ,1 Hz, H6), 7,08 (ddd, 1 H, ³J ₅ = 8,4 Hz, 3j₅₆ = 6,6 Hz, ⁴J₅7 = 1.0 Hz, H5), 4,74 (t, 2 H, ³J = 6,8 Hz, Cj±>-Azol), 4,51 (t, ³J = 6,8 Hz, CH2-N).

Titulación de pH de las sondas. (Hidrocloruros o sales disódicas)

Se emplearon las sondas sintetizadas previamente como hidrocloruros de ácidos o como sales disódicas. Las disoluciones de NaOH se realizaron utilizando D₂0 99,98 % a partir del reactivo comercial sin purificación adicional. Las de DCI se realizaron a partir de DCI concentrado comercial y empleando así mismo D2O.

MÉTODO GENERAL

Se preparan doce disoluciones 25 mM de cada una de las sondas, 10- 13, en D 0 al 99% (tantas como puntos de pH se quieran analizar). Se utiliza DC1 1 M para alcanzar valores de pH ácidos, y NaOD 1 M para los valores de pH básicos. El volumen final de las muestras debe ser de 1 mL En cada una de ellas se fija el valor de pH que se precise procurando abarcar el rango de 1 a 12 y que exista una diferencia de una unidad entre una muestra y la siguiente. Se realiza el espectro de ¹H RMN de las muestras a los distintos valores de pH. Para todos los protones de cada una de las sondas, se representa su desplazamiento químico frente al pH para obtener la curva de titulación.

Medidas de quelación con CaCI₂ y MgCI₂. (Sales disódicas)

Se emplearon las sondas sintetizadas previamente como sales disódicas. Las disoluciones de NaOH así como las de todos los iones empleados, se realizaron utilizando D₂0 99,98 % en todos los casos a partir de reactivos comerciales sin purificación adicional. Las de DCI se realizaron a partir de DCI comercial y empleando así mismo D₂0. Las disoluciones de Ca²⁺ y Mg²⁺ se prepararon a partir de CaCl22.H20 98 % y MgCl2-6H20 99,995 % respectivamente, y D2O como disolvente.

MÉTODO GENERAL

Se preparan dos disoluciones 25 mM de cada una de las sondas, 10- 13, en D₂0 99,98 % a dos valores distintos de pH: uno situado entre 11 y 12 (lo más próximo a 11), y el otro entre 9 y 10 (lo más próximo a 9). El pH se ajusta de manera análoga al apartado anterior. Se añaden 50 mL de disoluciones 1M de CaCI₂ ó MgCI₂. El pH final de las muestras, en un caso debe ser próximo a 9, y en el otro próximo al pH fisiológico (~7), ajustándose si es preciso. El volumen final debe ser de 1 mL. Se realiza el espectro de ¹H RMN de cada muestra. Se anota el desplazamiento químico de todos los protones de las sondas a los dos pH analizados, y para todos los iones añadidos. Referencias Bibliográficas

I. Andrew, E. R.; Byder, G.; Griffith, J.; lies, R.: Styles, P.; Clinical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. John Wiley and Sons. N. Y., 1990. 2. Cerdán, S.; Seelig, J.; Ann. Rev. Biophys. Chem., 1990, 19, 43.

3. a) Szwergold, B.; Ann. Rev. Physiol., 1992, 54, 775; b) Gil, M. S.; Zaderenko, P.; Cruz, F.; Cerdán, S.; Ballesteros, P.; Bioorg. Med. Chem., 1994, 2, 305.

4. a) Carafoli, E.; Methods in Enzymol., 1988, 57, 3; b) Dentón, R. M.; McCormack, J. G.; Ann. Rev. Physiol., 1990, 52, 451.

5. Vergara, J.; Tzien, R. Y.; Delay, M.; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1985, 82, 6352.

6. Berridge, M. J.; Ann. Rev. Biochem., 1987, 56, 159.

7. Watson, S. P.; Ruggiero, M.; Abrahamns, S. L.; Lapetina, E. G.; J. Biol. Chem., 1986, 261, 5368.

8. Brass, L F.; Joseph, S. K.; J. Biol. Chem., 1985, 260, 15172.

9. Lapetina, E. G.; Watson, S. P.; Cuatrecasa, P.; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1984, 81, 7531.

10. Carafoli, E.; Caroni. P.; Chiesi, M.; Famulski, K.; Metabolic Compartmentation. H. Sies, Ed., Academic Press, 1982, pag. 521.

I I . Wilson, D. B.; Connolley, T. M.; Bross, T. E.; Majerus, P. N.; Sherman, W. R.; J. Biol. Chem., 1985, 260, 13946.

12. a) Carafoli, E.; Ann. Rev. Biochem., 1987, 56, 395; b) Meldolesi, J.; Pozzan, T.; Exp. Cell. Res., 1987, 777, 271. 13. Tsien, R. Y.; Methods in Cell Biology, 1989, 30, 127.

14. McCormack, J. G.; Cobbold, P. H.; Cellular Calciυm: A Practical Approach. IRL Press. Oxford University Press. Oxford. 1991.

15. Anderegg, G.; Complexones en Comprehensive Coordination Chemistry, Wilkinson, G.; Gillard, R. D.; McCIeverty, J. A. Editores. Vol 2. Pergamon Press, N. Y., 1987, pag. 777.

16. Yoon, P. S.; Sharp, R. R.; Biochemistry, 1985, 24, 7269. 17. Tsien, R. Y.; Biochemistry, 1980, 19, 2396.

18. Smith, G. A.; Hesketh, R. T.; Metcalfe, J. C; Feeney, J.; Morris, P. G.; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1983, 80, 7178.

19. Rabenstein, D. L; Millis. K. K.; Strauss, E. J.; Anal. Chem., 1988, 60, 1380A.

22. Dehmlow, E. V.; Dehmlow, S. S. Phase Trasfer Catalysis. VCH. 1993.

23. Elguero, J.; Claramunt, R. M.; Garcerán, R.; Heterocycles, 1985, 24, 2233.

24. Canty, A. J.; Honeymnan, R. T. J. Organomet. Chem., 1990. 387, 247. 25. Torres, J.; Lavandera, J. L.; Cabildo, P.; Claramunt, R. M.; Elguero, J.; J.

Heterocycl. Chem., 1988, 25, 771.

26. Ochi, H.; Miyasaka, T.; Arakawa, K. Yakugaku Zasshi, 1978, 98 (2), 165. Chem. Abst., 1978, 89 24213k

27. Koelsch, O F.; Robinson, F. M. J. Org. Chem., 1956, 21, 1211. 28. Schwarzenbach, G.; Anderegg, G.; Schneider, W.; Senn, H.; Helv. Chim. Acta, 1955, 38, 1147.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- il)etiiiminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas consistentes en N-(2-pirazol-1-il)etiliminod¡acetato de metilo (5); N-2-(3,5- dimetilpirazol-1 -il)etiliminodiacetato de metilo (6); N-2-(indazol-1 -il)etil- iminodiacetato de metilo (7); N-2-(indazol-2-il)etil¡minodiacetato de metilo (8); hidrocloruro del ácido N-(2-pirazol-1-il)etiliminodiacético (9); N-(2- pirazol-1 -il)etiliminodiacetato sódico (10); N-2-(3,5-dimetilpirazol-1 - il)etiliminodiacetato sódico (11); N-2-(indazol-1-il)etiliminodiacetato sódico (12); N-2-(indazol-2-il)etiliminodiacetato sódico (13), caracterizadas por la presencia de una unidad de ácido ó ester iminodiacético unido al nitrógeno azólico a través de una cadena de dos átomos de carbono.

2. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol- 1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, según la reivindicación 1 caracterizadas por su capacidad complejante frente a iones Ca²⁺, Mg²⁺ y otros cationes divalentes.

3. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol- 1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, según la reivindicación 1 caracterizadas por su capacidad complejante frente a lantánidos y metales de transición.

4. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, cuya obtención se puede realizar mediante la reacción de alquilación de iminodiacetato de metilo con N-bromoetilazoles y posterior hidrólisis en medio ácido ó básico.

5. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol- 1 (2)- il)etíliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, según reivindicación 4, caracterizado porque el procedimiento puede ser modificado por rutas sintéticas alternativas que impliquen la utilización de N- aminoeti lazóles como productos de partida.

6. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, según reivindicación 4, caracterizado porque el procedimiento puede ser modificado por rutas sintéticas alternativas que impliquen la utilización de procesos de ciclación en la preparación del azol N-sustituido.

7. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, para su aplicación en espectroscopia e imagen de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de hidrógeno ú otros núcleos como sondas extrínsecas y agentes de contraste caracterizadas porque pueden utilizarse de manera no invasiva y no destructiva tanto en análisis químico como en diagnóstico clínico.

8. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, para su aplicación según la reivindicación 6 como sondas extrínsecas caracterizadas por su capacidad para determinar por espectroscopia de ¹ H RMN la concentración de Ca²⁺, Mg²⁺ u otros iones metálicos en soluciones, extractos biológicos, biopsias de tejidos, células aisladas ó cultivadas, órganos perfundidos, tejidos "in vivo", animales enteros y seres humanos.

9. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- il)etiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, para su aplicación como sondas extrínsecas según la reivindicación 6 caracterizadas por su capacidad para determinar la concentración de Ca²⁺, Mg²⁺ u otros iones metálicos en extractos biológicos, biopsias de tejidos, células aisladas ó cultivadas, órganos perfundidos, tejidos "¡n vivo", animales enteros y seres humanos utilizando tecnologías de imagen por ¹ H RMN, incluyendo imaginería de voxel simple, de multivoxel e imagen espectroscópica del desplazamiento químico.

10. Complexonas de naturaleza de ácidos N-2-(azol-1 (2)- iQetiliminodiacéticos, síntesis, estudio analítico y aplicaciones biológicas, para su aplicación según reivindicación 6 caracterizadas por su capacidad para originar complejos paramagnéticos con lantánidos que resulten de utilidad como agentes de contraste en imágenes obtenidas mediante cualquiera de las tecnologías de Resonancia Magnética.