WO1996036727A1 - Procede de production de gellane avec adjonction de tensioactif - Google Patents

Procede de production de gellane avec adjonction de tensioactif Download PDF

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WO1996036727A1
WO1996036727A1 PCT/FR1996/000723 FR9600723W WO9636727A1 WO 1996036727 A1 WO1996036727 A1 WO 1996036727A1 FR 9600723 W FR9600723 W FR 9600723W WO 9636727 A1 WO9636727 A1 WO 9636727A1
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surfactant
medium
gellan
viscosity
culture
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PCT/FR1996/000723
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Inventor
Frédéric Monot
Francis X. Quinn
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Institut Français Du Petrole
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention describes a process for obtaining gellan by growth of a bacterium belonging to the species Pseudomonas elodea (also classified Sphingomonas mobilis and in certain cases Auromonas elodea) on a culture medium containing molecules having surfactant properties .
  • This process notably makes it possible to reduce the viscosity of the culture medium and to promote its yield.
  • gellan also called heteropolysaccharide S60 by Pseudomonas elodea (or Sphingomonas mobilis or Auromonas elodea) ATCC 31461 is described mainly in US Pat. article entitled “Agar-like polysaccharide produced by a Pseudomonas species: Production and basic properties” published in "Applied and Environmental Microbiology", 1982, vol. 43 n ° 5, pages 1086-1091. Gellan is produced by aerobic fermentation on common culture media containing carbon sources, organic and mineral nitrogen sources and mineral salts.
  • the culture medium can contain more than 10 g / liter of polysaccharide.
  • the polysaccharide is synthesized by the microorganism used, there is an increase in the viscosity of the reaction medium. This increase in viscosity slows the transfer of energy and matter within the culture medium and thus slows down the fermentation.
  • zones of weak agitation appear within the reactor generating a heterogeneity of the reaction medium, and this even in the case of agitated reactors.
  • the transfer of oxygen becomes slower and limits the rate of production of polysaccharide. It is possible to improve the transfer of material in viscous media by increasing the stirring speed, but this generates an increase in the power injected into the reactor and therefore a significant additional cost.
  • the present invention relates to a process for the production of gellan by culture of the microorganism Pseudomonas elodea ATCC 31461 in a fermentation medium containing a surfactant and without the addition of a non-water-soluble oil-type phase intended for the formation of an emulsion. There is therefore no formation of a water in oil emulsion or vice versa oil in water.
  • the sole addition of an appropriate surfactant causes a reduction in the viscosity of the reaction medium and thus makes it possible to promote the transfers of material and energy within the reaction medium.
  • the nutrient medium allowing the growth of the microorganism and the production of gellan by the strain can be chosen from the culture media described in the literature.
  • the conventional medium contains a carbon substrate which can be a sugar such as glucose, fructose, maltose, sucrose, xylose or mannitol (this list not being limiting) or another carbohydrate, used alone or in mixture.
  • the initial concentration of carbohydrate in the medium partly depends on the concentration of the other constituents of the medium, in particular on the nitrogen concentration.
  • the initial concentration of carbohydrate must be chosen so as to minimize as much as possible the residual concentration (that is to say at the end of fermentation) of carbohydrate.
  • the initial carbohydrate concentration generally varies from 10 to 60 g / l, preferably from 20 to 40 g / l.
  • the nitrogen source in the nutrient medium can be an organic and / or mineral nitrogen source.
  • Sources of organic nitrogen, compounds rich in proteins or residues protein hydrolysis can be yeast extract, malt extract, meat extracts, fishmeal, soybean meal, cotton meal, maceration liquor corn ("corn steep"), soluble distillation residues, casein hydrolysates, peptones, etc.
  • a source of mineral nitrogen, in the form of ammonium salt or nitrate salt can also be used alone or in addition to sources of organic nitrogen.
  • culture media such as those described in patent FR-94/15742 which comprise a nitrogen source mainly consisting of nitrate ions, can be used in the present invention.
  • the nitrogen concentration, counted in nitrogen N can be between 0.01 and 5 g / 1 in the culture medium.
  • mineral salts can be introduced into the nutritive medium, such as magnesium, potassium, sodium, sulfur, manganese, iron, boron, zinc, cobalt, molybdenum ...
  • a typical composition of the mixture of these salts is given in Example 1, described below. This composition is given by way of illustration and is not limiting.
  • the fermentation according to the present invention is carried out at temperatures between 25 and 35 ° C, preferably between 28 and 32 ° C.
  • the pH of the medium is initially adjusted to a value of between 6 and 8.
  • the medium is preferably buffered, for example, with phosphate buffer to avoid an excessive drop in pH which could inhibit the strain growth.
  • the pH can be regulated to a value of between 6 and 8 throughout the fermentation.
  • the culture medium must be shaken and ventilated. When flask cultures are used, these are incubated on reciprocating or rotary shakers. This agitation also ensures ventilation of the medium.
  • the exchange surface between the air and the liquid medium must be large enough to allow good exchanges.
  • Fernbach flasks are well suited to this type of culture.
  • the production medium is agitated using agitation modules ensuring good transfer within the reactor.
  • the medium is aerated at a rate of between 0.1 and 2 vvm (volume of air per volume of liquid and per minute).
  • the power injected for the agitation of the medium fermentation is a function of the speed and the torque exerted on the stirring shaft.
  • An increase in the viscosity of the reaction medium generally results in an increase in the torque exerted on the shaft and therefore an increase in the power injected for maintaining a constant stirring speed, as is desirable in the process.
  • the torque and the speed (or directly the power injected) can be measured using known means, and the viscosity of the reaction medium can be estimated using these measurements.
  • the surfactant is added in several operations, the first addition being made when the power injected (therefore the viscosity) begins to increase appreciably.
  • the effect of the surfactant is noted on reading the parameters mentioned above.
  • the other possible additions of surfactant can then be made at favorable times.
  • the culture medium according to the invention contains one or more surfactants. These are preferably used in non-toxic doses for the selected microorganism strain. Their concentration must however be such that it causes a reduction in the viscosity of the medium compared to a fermentation carried out without the addition of surfactants. Typically, a surfactant concentration of between 5 mg / 1 and 30 g / 1 can be used. The minimum concentration depends on the effectiveness of the surfactant and the method of agitation used.
  • the recommended concentration will be lower than in the case of cultures in vials, this in order to avoid the formation of foams due to the injection of in the medium in the form of bubbles.
  • foams which generate an expansion of the medium can be very stable and even cause an increase in the viscosity of the reaction medium.
  • the surfactant concentration will be less than 1.5%.
  • anionic, nonionic or cationic surfactants can be used.
  • nonionic surfactants are often used which are less toxic to microorganisms.
  • anionic surfactant compounds such as alkane sulfonates, alkyl aryl sulfonates, alkyl ether sulfates, alkyl sulfates, carboxylic and polycarboxylic derivatives, olefin sulfonates, succinates and the like can be used. derivatives, sulfates and sulfonates of ethoxylated or polyethoxylated alkyl phenol, sulfates and sulfonates of fatty acids and fatty esters, phosphoric esters, etc., as long as the doses used are not toxic to the microorganism.
  • nonionic surfactant there can be used compounds such as ethoxylated fatty alcohols, ethoxylated alkyl phenols, fatty acids or ethoxylated fatty esters, glycerol esters and derivatives (for example, ethoxylated or polyethoxylated), sorbitan derivatives (ethoxylated or polyethoxylated esters for example), sugar esters and ethoxylated derivatives, sugar ethers and derivatives, certain block polymers, glycol esters, polyethylene glycols, etc., as long as the doses used are not toxic for the microorganism.
  • compounds such as ethoxylated fatty alcohols, ethoxylated alkyl phenols, fatty acids or ethoxylated fatty esters, glycerol esters and derivatives (for example, ethoxylated or polyethoxylated), sorbitan derivatives (ethoxylated or polyethoxylated esters
  • cationic surfactant compounds such as long chain amines, imidazolines, ethoxylated amines, amine oxides, etc. can be used, as long as the doses used are not toxic to the microorganism.
  • the surfactants can be used alone or as a mixture.
  • Fermentation is generally carried out in batch.
  • the culture medium contains all the nutrients, then is sterilized and, once returned to the fermentation temperature, is then seeded with an active culture.
  • An aqueous surfactant solution and the nutrient medium can be sterilized separately.
  • the surfactant solution is then added sterile to the culture medium in an amount such that the final concentration in the culture medium is that desired.
  • the introduction of surfactant into the culture medium can be carried out initially or during fermentation.
  • the addition of surfactants can be carried out at once or in several successive operations distributed during the culture.
  • the seeding rate that is to say the ratio of the volumes of seeding and medium after seeding, is between 0.1 and 10%.
  • this can be equipped with sterilizable probes making it possible to record and regulate parameters such as pH, temperature, dissolved oxygen level. It is it is also possible to know the oxygen and carbon dioxide levels in the outlet gases using analyzers placed on the outlet of the reactor gases.
  • the culture can be stopped.
  • the main criterion for stopping fermentation is low glucose consumption.
  • the fermentation must contains raw gellan. This can be recovered by precipitation with an appropriate solvent, most often isopropanol. The recovered precipitate can be dried.
  • the total dry matter contains both so-called native gellan and cells from the culture of Pseudomonas elodea. This isopropanol precipitation method followed by drying is the conventional method for determining the concentration of crude gellan in the fermentation must.
  • the Pseudomonas elodea ATCC 31461 strain is stored in tubes at -22 ° C. on a complex agar medium (Nutrient Agar, Company Difco, USA). For the re-cultivation of this strain, a tube is returned to room temperature for a few hours and a sample of approximately one ose is taken on the agar surface and spread on a Petri dish containing agar medium (Nutrient Agar , Difco Company, USA). After 48 hours of incubation at 30 ° C., a development of yellow colonies is observed on the surface of the agar medium.
  • Table 1 Composition of the culture medium used in the vial tests.
  • the salt solution includes:
  • the residual glucose concentration is determined using an automatic analyzer (Glucose Analyzer 2, Beckman Company, USA), by an enzymatic method with glucose oxidase.
  • concentration of crude gellan is determined on the fermentation must by precipitation of one volume of medium with two volumes of isopropanol. The precipitation is carried out hot with vigorous stirring. The precipitate is recovered by filtration on a microfiber glass filter, with a porosity of 1.2 ⁇ m, previously dried and tared. The precipitate is washed with isopropanol. The precipitate is then dried and weighed in an infrared desiccator mounted on a balance. This gives the concentration of crude gellan, that is to say the polysaccharide and cell debris.
  • the viscosity of the fermentation wort is measured using a Haake brand rotary viscometer, Germany, model Rotovisco RV20, equipped with a measuring device with coaxial cylinders, the air gap of which is 0.96 mm (Module MV1-P).
  • the viscosity is measured at a shear gradient of 80 s "l after a time long enough to obtain a stable value.
  • the surfactant used in the present case is Cemulsol OP9, trademark of the company SFOS, which is a nonionic surfactant of the ethoxylated alkyl phenol type.
  • the surfactant concentrations used and the results obtained are shown in Table 2. As in the case of Example 1, the cultures are stopped after 48 hours.
  • the surfactant used in the present case is sophorolipid which is a nonionic surfactant of the glycolipid type.
  • Sophorolipid is an ether of disaccharide (sophorose) and fatty acids and hydroxy acids which can be in acid form or in lactone form. These are glycolipids produced by microorganisms.
  • the surfactant concentrations used and the results obtained are shown in Table 3. As in the case of Example 1, the cultures were stopped after 48 hours.
  • Sophorolipid (g / 1) 1 2 10
  • test 9 Another culture (test 9) was carried out in a Fernbach flask under conditions strictly identical to those described in Example 1 with the exception of the presence of an anionic surfactant initially introduced into the medium.
  • the surfactant used in the present case is Celanol MS, trademark of the company SFOS, which is an anionic surfactant of the sodium alkyl sulfate type.
  • the concentration of surfactant used is 2 g / l and the results obtained after 48 hours of culture are as follows:
  • Viscosity (at 80 s "1 ): 4 mPa.
  • the fermenters used are equipped with multi-hole aerators, temperature regulation, a pH probe connected to a regulator controlling the injection of KOH IN or H3PO4 IN, a dissolved oxygen probe, a stirring system consisting of an axis provided with two centripetal turbines and driven by a stirring motor.
  • the temperature of the medium is regulated at 30 ° C., the pH at 6.5, the air flow rate is 2 vvm and the stirring speed is 900 revolutions / minute.
  • the main parameters determined during fermentation are the concentrations of glucose, of crude gellan and the optical density of the medium read at 620 nm.
  • the salt solution contains: 1.8 g / l MnCl2, 4H2 ⁇
  • Viscosity (at 80 s "!: 1015 mPa.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production du gellane dans lequel la viscosité du milieu de culture est contrôlée par l'adjonction d'une quantité utile d'un agent tensioactif. La présente invention concerne également un milieu de culture de production de gellane comportant une quantité utile d'un tensioactif, sans adjonction significative d'une phase non hydrosoluble. De préférence le tensioactif est un tensioactif non ionique.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE GELLANE AVEC ADJONCTION DE TENSIOACTIF
La présente invention décrit un procédé d'obtention du gellane par croissance d'une bactérie appartenant à l'espèce Pseudomonas elodea (classifiée également Sphingomonas mobilis et dans certains cas Auromonas elodea) sur un milieu de culture contenant des molécules présentant des propriétés tensio-actives. Ce procédé permet notamment de diminuer la viscosité du milieu de culture et d'en favoriser le rendement.
La production de gellane, encore appelé hétéropolysaccharide S60 par Pseudomonas elodea (ou Sphingomonas mobilis ou Auromonas elodea) ATCC 31461 est décrite principalement dans les brevets US-4.326.053, 4.326.052, 4.385.123, 4.377.636, et dans l'article intitulé "Agar-like polysaccharide produced by a Pseudomonas species: Production and basic properties" publié dans "Applied and Environmental Microbiology", 1982, vol. 43 n°5, pages 1086-1091. Le gellane est produit par fermentation aérobie sur des milieux de culture usuels contenant des sources de carbone, des sources d'azote organique et minéral et des sels minéraux.
En fin de fermentation, le milieu de culture peut contenir plus de 10 g/litre de polysaccharide. Au fur et à mesure de la synthèse du polysaccharide par le micro-organisme mis en oeuvre, il se produit une augmentation de la viscosité du milieu réactionnel. Cette augmentation de viscosité ralentit les transferts d'énergie et de matière au sein du milieu de culture et freine ainsi la fermentation. De plus, des zones de faible agitation apparaissent au sein du réacteur engendrant une hétérogénéité du milieu réactionnel, et cela même dans le cas de réacteurs agités. Par ailleurs, le transfert d'oxygène devient plus lent et limite le taux de production de polysaccharide. Il est possible d'améliorer le transfert de matière dans les milieux visqueux en augmentant la vitesse d'agitation, mais ceci engendre une augmentation de la puissance injectée dans le réacteur et donc un surcoût important. Dans le cas de production de gomme xanthane par fermentation, il a été proposé de réaliser la fermentation sous forme d'une émulsion du milieu nutritif aqueux dans une phase non hydrosoluble de type huile. De cette manière, on réduit la viscosité du milieu de culture et on favorise les transferts de matière, en particulier d'oxygène (Documents EP-A-0058364, EP-A-0074775, EP-A-0098743 et EP-A-0187092). Dans certains cas, la formation d'une émulsion inverse huile (ou phase non hydrosoluble) dans eau peut être obtenue.
La présente invention concerne un procédé de production de gellane par culture du micro-organisme Pseudomonas elodea ATCC 31461 dans un milieu de fermentation contenant un agent tensioactif et sans ajout de phase non hydrosoluble de type huile destinée à la formation d'une émulsion. Il n'y a donc pas de formation d'une émulsion eau dans huile ou inversement huile dans eau. De façon surprenante, l'ajout seul d'un agent tensioactif approprié provoque une diminution de la viscosité du milieu réactionnel et permet ainsi de favoriser les transferts de matière et d'énergie au sein du milieu réactionnel.
Le milieu nutritif permettant la croissance du micro-organisme et la production de gellane par la souche peut être choisi parmi les milieux de culture décrits dans la littérature. Le milieu conventionnel contient un substrat carboné qui peut être un sucre tel que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le xylose ou le mannitol (cette liste n'étant pas limitative) ou un autre hydrate de carbone, utilisé seul ou en mélange. La concentration initiale en carbohydrate dans le milieu dépend en partie de la concentration des autres constituants du milieu, en particulier de la concentration en azote. Ainsi, pour favoriser la production de polysaccharide, il est préférable d'avoir des concentrations initiales en substrats carbonés et azotés telles que le rapport molaire des quantités de carbone et d'azote initiales (C/N) soit largement supérieur à 1. Cependant, la concentration initiale en carbohydrate doit être choisie de façon à minimiser le plus possible la concentration résiduelle (c'est-à-dire en fin de fermentation) en carbohydrate. La concentration initiale en carbohydrate varie en général de 10 à 60 g/1, de préférence de 20 à 40 g/1.
La source d'azote du milieu nutritif peut être une source d'azote organique et/ou minérale. Les sources d'azote organique, composés riches en protéines ou en résidus d'hydrolyse de protéines, peuvent être de l'extrait de levure, de l'extrait de malt, des extraits de viande, de la farine de poisson, de la farine de soja, de la farine de coton, de la liqueur de macération de maïs ("corn steep"), des résidus solubles de distillation, des hydrolysats de caséine, des peptones, etc. Une source d'azote minérale, sous forme de sel d'ammonium ou de sel de nitrate, peut également être utilisée seule ou en complément de sources d'azote organique. Ainsi, des milieux de culture, tels que ceux décrits dans le brevet FR-94/ 15742 qui comportent une source azotée constituée principalement d'ions nitrates, peuvent être utilisés dans la présente invention. La concentration en azote, comptée en azote N peut être comprise entre 0,01 et 5 g/1 dans le milieu de culture.
D'autres sels minéraux peuvent être introduits dans le milieu nutritif, tels que des sels de magnésium, potassium, sodium, soufre, manganèse, fer, bore, zinc, cobalt, molybdène... Une composition typique du mélange de ces sels est donnée dans l'exemple 1, ci-après décrit. Cette composition est donnée à titre d'illustration et n'est pas limitative.
La fermentation selon la présente invention est réalisée à des températures comprises entre 25 et 35°C, de préférence entre 28 et 32°C. Le pH du milieu est initialement ajusté à une valeur comprise entre 6 et 8. Dans le cas de cultures en fiole agitée, le milieu est de préférence tamponné, par exemple, par du tampon phosphate pour éviter une chute excessive de pH qui pourrait inhiber la croissance de la souche. Dans le cas de cultures en réacteur agité, le pH peut être régulé à une valeur comprise entre 6 et 8 tout au long de la fermentation. Le milieu de culture doit être agité et aéré. Lors de cultures en fioles, celles-ci sont mises à incuber sur des agitateurs à mouvement alternatif ou rotatif. Cette agitation assure également une aération du milieu. La surface d'échange entre l'air et le milieu liquide doit être suffisamment grande pour permettre de bons échanges. Les fioles dites de Fernbach sont bien adaptées à ce type de culture. Dans le cas de fermentations réalisées en réacteur, le milieu de production est agité à l'aide de modules d'agitation assurant un bon transfert au sein du réacteur. Le milieu est aéré à un taux compris entre 0, 1 et 2 vvm (volume d'air par volume de liquide et par minute). Dans le procédé selon l'invention, dans le cas de cultures en réacteurs agités, on peut surveiller l'évolution de la viscosité du milieu réactionnel en cours de fermentation en mesurant la puissance d'agitation injectée. La puissance injectée pour l'agitation du milieu de fermentation est fonction de la vitesse et du couple exercés sur l'arbre d'agitation. Une augmentation de la viscosité du milieu réactionnel se traduit en général par une augmentation du couple exercé sur l'arbre et donc une augmentation de la puissance injectée pour le maintien d'une vitesse d'agitation constante, comme cela est souhaitable dans le procédé. On pourra mesurer le couple et la vitesse (ou directement la puissance injectée) à l'aide de moyens connus, et estimer la viscosité du milieu réactionnel à l'aide de ces mesures. Ceci permet de mieux ajuster l'ajout du tensio-actif destiné au contrôle de la viscosité du milieu. De préférence, le tensio-actif est ajouté en plusieurs opérations, le premier ajout se faisant quand la puissance injectée (donc la viscosité) commence à augmenter de façon sensible. L'effet du tensio-actif est constaté à la lecture des paramètres cités ci-dessus. Les autres éventuels ajouts de tensio-actif pourront être effectués ensuite à des moments favorables.
En plus des ingrédients nutritionnels, le milieu de culture, selon l'invention, contient un ou plusieurs agents tensioactifs. Ceux-ci sont de préférence utilisés à des doses non toxiques pour la souche de micro-organisme choisie. Leur concentration doit cependant être telle qu'elle provoque une diminution de la viscosité du milieu par rapport à une fermentation effectuée sans ajout d'agents tensioactifs. Typiquement, une concentration de tensioactif comprise entre 5 mg/1 et 30 g/1 peut être employée. La concentration minimale dépend de l'efficacité du tensioactif et du mode d'agitation utilisé. Par exemple, dans le cas de cultures effectuées en fermenteur aéré et agité, pour un même tensioactif, la concentration préconisée sera plus faible que dans le cas de cultures en fioles, ceci afin d'éviter la formation de mousses dues à l'injection d'air dans le milieu sous forme de bulles. Ces mousses qui engendrent une expansion du milieu peuvent être très stables et même provoquer une augmentation de la viscosité du milieu réactionnel. De préférence, la concentration en tensioactif sera inférieure à 1,5 %.
Comme agent tensioactif, on peut utiliser des tensioactifs anioniques, non ioniques ou cationiques. De préférence, on utilisera des tensio actifs non ioniques souvent moins toxiques pour les micro-organismes.
Comme agent tensioactif anionique, on peut utiliser des composés tels que des alcanes sulfonates, des alkyl aryle sulfonates, des alkyl éther sulfates, des alkyl sulfates, des dérivés carboxyliques et polycarboxyliques, des oléfines sulfonates, des succinates et dérivés, des sulfates et sulfonates d'alkyl phénol éthoxylés ou polyéthoxylés, des sulfates et sulfonates d'acides gras et d'esters gras, des esters phosphoriques, etc, du moment que les doses employées ne soient pas toxiques pour le micro-organisme.
Comme agent tensioactif non ionique, on peut utiliser des composés tels que des alcools gras éthoxylés, des alkyl phénols éthoxylés, des acides gras ou esters gras éthoxylés, des esters de glycérol et dérivés (par exemple, éthoxylés ou polyéthoxylés), des dérivés de sorbitan (esters éthoxylés ou polyéthoxylés par exemple), des esters de sucres et dérivés éthoxylés, des éthers de sucres et dérivés, certains polymères blocs, des esters de glycol, des polyéthylène glycols, etc, du moment que les doses employées ne soient pas toxiques pour le micro-organisme.
Comme agent tensioactif cationique, on peut utiliser des composés tels que des aminés à longue chaîne, des imidazolines, des aminés éthoxylés, des oxydes d'aminés, etc, du moment que les doses employées ne soient pas toxiques pour le micro-organisme.
Les agents tensioactifs peuvent être utilisés seuls ou en mélange.
La fermentation s'effectue en général en batch. Pour cela, le milieu de culture contient tous les éléments nutritifs, puis est stérilisé et, une fois revenu à la température de fermentation, est ensuite ensemencé par une culture active. Il est possible de stériliser séparément une solution aqueuse de tensioactif et le milieu nutritif. La solution de tensioactif est ensuite ajoutée stérilement au milieu de culture en quantité telle que la concentration finale dans le milieu de culture soit celle désirée. L'introduction de tensioactif dans le milieu de culture peut être pratiquée initialement ou en cours de fermentation. L'ajout des agents tensioactifs peut être réalisé en une seule fois ou en plusieurs opérations successives réparties en cours de culture.
Le taux d'ensemencement, c'est-à-dire le rapport des volumes d'ensemencement et de milieu après ensemencement, est compris entre 0,1 et 10 %. Dans le cas de cultures en réacteur, celui-ci peut être équipé de sondes stérilisables permettant d'enregistrer et de réguler des paramètres tels que le pH, la température, le taux d'oxygène dissous. Il est également possible de connaître les taux d'oxygène et de gaz carbonique dans les gaz de sortie à l'aide d'analyseurs placés sur la sortie des gaz du réacteur.
Après 1 à 4 jours de culture, la culture peut être arrêtée. Le principal critère pour l'arrêt de la fermentation est la faible consommation de glucose. Le moût de fermentation contient du gellane brut. Celui-ci peut être récupéré par précipitation avec un solvant approprié, le plus souvent l'isopropanol. Le précipité récupéré peut être séché. La matière sèche totale contient à la fois du gellane dit natif et les cellules issues de la culture de Pseudomonas elodea. Cette méthode de précipitation à l'isopropanol suivie d'un séchage est la méthode classique de détermination de la concentration en gellane brut dans le moût de fermentation.
La présente invention sera mieux comprise et ses avantages apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples suivants. Ceux-ci sont donnés à titre d'illustration et non limitatif de l'invention.
Exemple 1:
Préparation de gellane en fiole selon l'art antérieur, en absence de tensioactif (culture 1):
La souche de Pseudomonas elodea ATCC 31461 est conservée en tubes, à -22°C sur un milieu complexe gélose (Nutrient Agar, Société Difco, USA). Pour la remise en culture de cette souche, un tube est remis à la température ambiante pendant quelques heures et un prélèvement d'environ une ose est effectué sur la surface de la gélose et étalé sur une boite de Pétri contenant du milieu gélose (Nutrient Agar, Société Difco, USA). Après 48 heures d'incubation à 30°C, on observe un développement de colonies jaunes à la surface du milieu gélose. Une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 20 ml de milieu liquide (Nutrient Broth, Société Difco, USA) en fioles d'Erlenmeyer. Ces fioles sont mises en agitation pendant environ 30 heures à 30°C. La totalité du contenu d'une fiole, soit 20 ml, sert à ensemencer 180 ml de milieu réactionnel placé dans une fiole de Fernbach. La composition de ce milieu est donnée dans le tableau 1. Toutes ces opérations de transfert sont effectuées en conditions stériles et les milieux et récipients ont auparavant été stérilisés dans des conditions habituelles pour l'homme de l'art. La fiole de Fernbach est mise en agitation pendant 48 heures à 30°C. Après incubation, les analyses permettant la détermination des concentrations en gellane, glucose et de la viscosité sont effectuées.
Tableau 1 : Composition du milieu de culture utilisé dans les essais en fioles.
Figure imgf000009_0001
La solution de sels comporte :
1,8 g/1 MnCl?, 4H2O
2,5 g/1 FeS04, H2O
0,28 g/1 H3 BO3
0,027 g/1 CuCl2
0,021 g/1 ZnCb
Figure imgf000009_0002
0,010 g/1 (NH4)6 M07 O24, 4(H2O)
2,1 g/1 tartrate de sodium
La concentration résiduelle en glucose est déterminée à l'aide d'un analyseur automatique (Glucose Analyser 2, Société Beckman, USA), par une méthode enzymatique à la glucose oxydase. La concentration en gellane brut est déterminée sur le moût de fermentation par précipitation d'un volume de milieu avec deux volumes d'isopropanol. La précipitation est réalisée à chaud sous forte agitation. Le précipité est récupéré par filtration sur un filtre en micro fibres de verre, de porosité 1,2 μm préalablement séché et taré. Le précipité est lavé par l'isopropanol. Le précipité est ensuite séché et pesé dans un dessiccateur à infrarouge monté sur une balance. On a ainsi la concentration en gellane brut, c'est-à-dire le polysaccharide et les débris cellulaires.
La concentration en gellane dit natif, c'est-à-dire ne contenant pas de débris cellulaires, est déterminée en retranchant de la concentration en gellane brut la concentration en matière sèche cellulaire. Celle-ci est évaluée d'après une corrélation établie entre la densité optique du milieu mesurée à 620 nm contre de l'eau et le poids sec de cellules. Pour établir cette corrélation, des échantillons de moût de fermentation de densité optique connue ont été dilués 20 fois dans de l'eau désionisée, longuement agités puis centrifugés. Les culots obtenus ont été ensuite remis en solution puis filtrés à chaud sur des filtres préalablement séchés et tarés. La matière sèche des rétentats permet de déterminer le poids sec des cellules, le gellane ayant été éliminé lors des opérations de centrifugation et de filtration. La corrélation obtenue donne : poids sec cellulaire (en g 1) = 0,26 x (Densité optique du milieu à 620 nm).
La viscosité du moût de fermentation est mesurée à l'aide d'un viscosimètre rotatif de marque Haake, Allemagne, modèle Rotovisco RV20, équipé d'un dispositif de mesure à cylindres coaxiaux, dont l'entrefer est de 0,96 mm (Module MV1-P). La viscosité est mesurée à un gradient de cisaillement de 80 s"l après un temps suffisamment long pour obtenir une valeur stable.
Les résultats obtenus dans le cas de l'essai 1 sont les suivants :
Glucose résiduel : 1,7 g/1 Gellane brut : 7 g/1
Gellane natif : 6,7 g/1
Viscosité (80 s" 1) : 350 mPa.s Exemple 2 :
Préparation de gellane, selon l'invention, en fiole en présence d'un tensioactif non ionique ajouté initialement (cultures 2 à 5):
Quatre autres cultures (2, 3, 4, 5) ont été réalisées en fioles de Fernbach dans des conditions rigoureusement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 à l'exception de la présence d'un agent tensioactif non ionique introduit initialement dans le milieu à différentes concentrations.
Le tensioactif employé dans le cas présent est du Cemulsol OP9, marque commerciale de la société SFOS, qui est un tensioactif non ionique de type alkyl phénol éthoxylé. Les concentrations de tensioactif utilisées et les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 2. Comme dans le cas de l'exemple 1, les cultures sont arrêtées après 48 heures.
Tableau 2 : Résultats des essais 2 à 5 réalisés à différentes concentrations de tensioactif non ionique (Cemusol OP9)
N° de culture 2 3 4 5
Cemulsol OP 9 (g/1) 1 2 5 10
Glucose résiduel (g/1) 2,8 1,8 2,8 1 ,6
Gellane brut (g/1) 9 10 10 11
Viscosité à 80 s" (mPa.s) 120 140 150 150
Il apparaît que pour des concentrations en gellane plus élevées que celle obtenue dans la culture 1 , la viscosité est nettement plus faible permettant d'obtenir de meilleurs transferts de matière et d'énergie. Il apparaît également que la diminution de la viscosité permet d'augmenter la production de gellane. Exemple 3 :
Préparation de gellane en fiole en présence d'un tensio actif non-ionique d'origine biologique ajouté initialement (cultures 6 à 8):
Trois autres cultures (6,7,8) ont été réalisées en fioles de Fernbach dans des conditions rigoureusement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 à l'exception de la présence d'un agent tensioactif non ionique introduit initialement dans le milieu à différentes concentrations.
Le tensioactif employé dans le cas présent est du sophorolipide qui est un tensioactif non-ionique de type glycolipide. Le sophorolipide est un éther de disaccharide (le sophorose) et d'acides et hydroxyacides gras qui peuvent être sous forme acide ou sous forme lactone. Ce sont des glycolipides produits par des micro-organismes. Les concentrations de tensioactif utilisées et les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau 3. Comme dans le cas de l'exemple 1, les cultures ont été arrêtées après 48 heures.
Tableau 3 : Résultats des essais 6 à 8 réalisés à différentes concentrations de sophorolipide
N° de culture 6 7 8
Sophorolipide (g/1) 1 2 10
Glucose résiduel (g/1) 0 0 0
Gellane brut (g/1) 8,9 9,5 10,3
Viscosité à 80 s" (mPa.s) 215 130 25
Il apparaît que pour des concentrations en gellane plus élevées que celle obtenue dans la culture 1, la viscosité est nettement plus faible permettant d'obtenir de meilleurs transferts de matière et d'énergie. Il apparaît également que la diminution de la viscosité permet d'augmenter la production de gellane. Exemple 4 :
Préparation de gellane en présence d'un tensioactif anionique ajouté initialement (culture 9):
Une autre culture (essai 9) a été réalisée en fiole de Fernbach dans des conditions rigoureusement identiques à celles décrites dans l'exemple 1 à l'exception de la présence d'un agent tensioactif anionique introduit initialement dans le milieu.
Le tensioactif employé dans le cas présent est du Celanol MS, marque commerciale de la société SFOS, qui est un tensioactif anionique de type sodium alkyl sulfate. La concentration de tensio-actif utilisée est de 2 g/1 et les résultats obtenus après 48 heures de culture sont les suivants :
Glucose résiduel : 1 g/1
Gellane brut : 5 g/1
Gellane natif : 3,5 g/1
Viscosité (à 80 s" 1 ) : 4 mPa. s
A concentration plus élevée en Celanol MS, la production de gellane est très faible. Au vu de cet exemple, il apparaît que le tensioactif anionique utilisé permet d'abaisser notablement la viscosité. Cependant, la production de gellane est plus faible que dans les exemples précédents, probablement du fait d'une toxicité du tensioactif employé plus élevée. Exemple 5 :
Préparation de gellane en réacteur en absence et en présence d'un tensioactif non ionique introduit en cours de fermentation
(cultures 10 et 11):
Deux cultures en fioles de Fernbach sont réalisées dans les conditions décrites dans l'exemple 1. Après 30 heures d'incubation, la quasi-totalité du contenu de ces fioles, soit 180 ml, est utilisée pour ensemencer deux réacteurs identiques contenant chacun 1,82 litres de milieu de production dont la composition initiale est donnée dans le tableau 4.
Les fermenteurs utilisés sont équipés d'aérateurs multi-trous, d'une régulation de température, d'une sonde pH reliée à un régulateur commandant l'injection de KOH IN ou de H3PO4 IN, d'une sonde à oxygène dissous, d'un système d'agitation consistant en un axe muni de deux turbines centripètes et entraîné par un moteur d'agitation. La température du milieu est régulée à 30°C, le pH à 6,5, le débit d'air est de 2 vvm et la vitesse d'agitation est de 900 tours/minute.
Les principaux paramètres déterminés en cours de fermentation sont les concentrations en glucose, en gellane brut et la densité optique du milieu lue à 620 nm.
Dans le cas de la culture 10, aucun ajout n'est pratiqué en cours de culture. Dans le cas de la culture 11, 20 ml d'une solution de Cemulsol OP9 à 0,5 g/1 préalablement stérilisée sont ajoutés stérilement dans le milieu réactionnel une première fois après 24 heures et une seconde fois après 26 heures de culture. La concentration totale de Cemulsol OP9 introduite est de 10 mg/1. Les deux fermentations réalisées en conditions par ailleurs toutes identiques, sont arrêtées après 28 heures de culture. Le tableau 5 rassemble les valeurs de concentrations en glucose résiduel et en gellanes brut et natif et la viscosité mesurée à 80 s" . Ces mesures sont effectuées selon les méthodes décrites dans l'exemple 1 . Tableau 4 : Composition initiale des milieux de production utilisés dans l'exemple 5 (essais 10 et 11)
Figure imgf000015_0001
La solution de sels comporte : l,8 g/l MnCl2, 4H2θ
2,5 g/1 FeSθ4, 7H2O
0,28 g/1 H3 BO3
0,027 g/1 CuCl2
0,021 g/1 ZnCl2
0,074 g/1 C0CI2, 6H2O
0,010 g/1 (NH4)6 M07 O24, 4(H2θ)
2,1 g/1 tartrate de sodium
Tableau 5 : Résultats obtenus après 28 heures de culture en réacteur agité avec et sans rajout de Cemulsol OP9:
Essai 10 : Absence de tensio-actif
Glucose résiduel : 4,3 g/1
Gellane brut : 12,9 g/1
Gellane natif : 9,4 g/1
Viscosité (à 80 s"1) : 1620 mPa.s Essai 11 : Deux ajouts de tensio-actif - 5 mg/1 à 24 h, puis 5 mg/1 à 26 h:
Glucose résiduel : 4,5 g/1 Gellane brut : 12,8 g/1
Gellane natif : 9,2 g/1
Viscosité (à 80 s" ! ) : 1015 mPa. s
Il apparaît que, à concentration de gellane équivalente, la viscosité du moût de l'essai 11 est nettement plus faible que celle du moût de l'essai 10, confirmant que l'ajout d'un tensioactif non ionique permet d'abaisser la viscosité, que celui-ci soit rajouté en une seule ou en plusieurs fois.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de production de gellane par culture dans un milieu réactionnel, caractérisé en ce que l'on ajoute audit milieu une quantité utile d'au moins un tensio-actif.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la viscosité dudit milieu est contrôlée par ledit tensio-actif.
3) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit tensio-actif est non ionique.
4) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en tensio-actif est inférieure à 1,5%.
5) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins une partie de ladite quantité de tensio-actif est ajouté initialement à la réaction de fermentation.
6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit ajout d'une quantité utile d'au moins un tensio-actif est effectué en cours de fermentation, en fonction de l'augmentation de la viscosité du milieu.
7) Milieu réactionnel de production de gellane, caractérisé en ce qu'il comporte un micro-organisme Peudomonas elodea (ATCC 31461), une quantité utile d'au moins un tensio-actif et en ce qu'il ne comporte pas de quantité significative de phase hydrosoluble destinée à créer une émulsion du milieu réactionnel.
8) Milieu selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit tensio-actif est non ionique. 9) Milieu selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la concentration en tensio-actif est inférieure ou égale à 1,5%.
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