WO1996035786A1

WO1996035786A1 - Proteine de perle (nacreine) et son procede de production

Info

Publication number: WO1996035786A1
Application number: PCT/JP1996/001236
Authority: WO
Inventors: Aizo Matsushiro
Original assignee: Fujikawa, Yoshio
Priority date: 1995-05-09
Filing date: 1996-05-09
Publication date: 1996-11-14
Also published as: EP0829537A4; AU5659296A; US5968772A; EP0829537A1

Description

明細書真珠タンパク質（ナクレイン）およびその製造方法〔技術分野〕

本発明は、真珠を構成するタンパク質（真珠タンパク質）、特に、遺伝子工学的に産生された真珠タンパク質であるナクレイン mcreiiOタンパク質ならびに当該タンパク質の発現、およびその製造方法に関する。

〔背景技術〕

真珠貝の真珠層の殻体は、タンパク質から構成された少量の有機基質（organic matrix)とァラレ石の結晶により構成されている, そして、この有機基質は、コンキォリン (Conchiolin) と命名され (Fremy, M. E. , Recherches chimiques sur les os. Ann. Chem. Phys, 43 , 96 (1855)) 、その後多くの研究者によって、様々な角度から研究が積み重ねられてきた。

例えば、以下の文献、すなわち；

(1) Car iolou, M. A. & Morse, D. E. , "Purification and

Characterization of calcium-binding conchiolin shell peptides from the mollusc, Haliotis rufescens, as a function of development", J. Comp. Physiol. B, 157, pp.717-729 (1988);

(2) Samata, T. & Krampitz G, "Ca-binding polypeptides in oyster shells", Malacologia 22, pp.225-233 (1981)；

(3) Samata, T. , "Ca-binding glycoproteins in mol luscan shells with different types of ultrastructure", The Veliger 33, pp.190-201 (1990); (4) 和田浩爾、「真珠」、全国宝石学協会（1982);

(5) einer, S. k Hood, L. , "Soluble protein of the organic matrix of raol lusk shells: a potential temp late for shell, formation", Science, 190, pp.987-989 (1975)；

(6) Weiner, S. k Lowenstam, H. A. , "Discrete molecular weight components of the organic matrices of mollusc shells", J. exp. mar. Biol. EcoL , 30， pp.45-51 (1977)；

(7) Weiner, S. , "Aspart ic acid rich proteins： major

component of the soluble organic matrix of mollusc shells", Calicif. Tissue Int. , 29, pp.163-167 (1979)；および

(8) Weiner, S. , "Mollusk shell format ion： isolation of two organic matrix proteins associated with calci te

deposition in the bivalve, Mytilus calfornianus",

Biochemistry, 22, pp.4139-4145 (1983) 、を参照のこと。これまでに、真珠層の有機基質部分の主成分の一つが、分子量 50〜70kDのァスパラギン酸に富んだ酸性タンパクであることは解明されている〔前出の（3) および（7) の文献を参照〕が、その正確な分子量は勿論、その構成アミノ酸の一次構造すら報告されていなかった。

かような状況故、真珠生産の現場では、アコャ貝の殻体の一部が凝結した真珠の珠を形成させる技術として、海中に吊下げた養殖菴の中で 1〜 2年の歳月にわたつてアコャ貝を養殖するという、自然（養殖）環境に依存せざるを得ない真珠養殖技術が、 1世紀以上にわたって、今日まで厳然として主流をなしているのが現状である。〔発明の開示〕

本発明は、上記した課題に鑑みて発明されたものである。すなわち、真珠を構成するタンパク質を遺伝子レベルで検討ならびに解析することに加え、当該構成タンパク質に固有の遺伝子情報に関する知見に基づき、真珠タンパク質を人工的に得ることを意図するものである。

すなわち、本発明者は、まず、天然真珠からその構成タンパク質を抽出および精製することにより、主要構成要素の一つであり、また Ca²⁺ (カルシウムイオン）結合能力を保有する、分子量約 60, 000の酸性タンパク質（ナクレイン）を単離した。そして、このタンパク質の N末端のアミノ酸配列を決定して、その配列に対応する D N Aプローブを合成したのである。

—方で、実際の真珠層の形成に関与する生きたアコャ貝の外套膜（mantle) 組織から mRNAを抽出して、 cDNAライブラリーを作成した。このライブラリーから、前述した合成 D N Aプローブを用いるハイブリダイゼーション法によってナクレインの cDNAをクローニングした。

そして、遺伝子工学の常法に従って、得られた cDNAを形質発現ベクターに繫ぎ、このベクターを大腸菌などの宿主細胞に導入して、ナクレインを量産せしめた。すでに、 Watabeと Wilburの研究により、真珠層の有機基質の上ではァラレ石の結晶が特異的に形成されることが明らかになつている（Watabe N. and Wilbur K.

Ν. , Influence of the organic matrix on crystal type in

Molluscs", Nature 188, 334 (I960))。そして、ナクレインは. 有機基質の必須構成要素の一つであり、かつ Ca²⁺結合能のある夕ンパク質であることから、この夕ンパク質上で炭酸カルシウムをァラレ石に結晶化させることで、 in wiiroで真珠層の構築を実現することが可能である。〔図面の簡単な説明〕

第 1図は、ナクレインタンパク質の抽出、濃縮および精製のための概略を示した工程図である。

第 2図は、ナクレインタンパク質の DEAE-セファセルカラムクロマ卜グラフィ一による溶出曲線を示す図である。

第 3図は、ィォン交換用試料に含まれるナクレインタンパク質の DEAE-セファセルカラムクロマトグラフィ一による溶出曲線を示す図である。

第 4図は、第 3図と同じ溶出画分の S ta ins-a l lによる呈色吸収パターンを示す図である。

第 5図は、画分 31と画分 40について SDS-PAGEを行い、クーマシ一ブリリアントブルー G-250 で染色した結果を示す図である。第 6図は、画分 31と画分 40について SDS-PAGEを行い、の Sta ins -a l lで染色した結果を示す図である。

第 7図は、ナクレインタンパク質の G 75ゲル濾過の溶出パターンを示す図である。

第 8図は、 G 75ゲル濾過精製物の、 SDS-PAGEの結果を示す図で

'ある o

第 9図は、 C λ N6の構成を示す図である。

第 10図は、ナクレインと炭酸脱水酵素の構成ァミノ酸の相同性を示す図である。

第 11図は、プラスミド ΡΤ7-7 の Nde l - EcoRI部位にナクレイン cDNAのオープンリーディングフレームを挿入した構成を示す図である。

第 12図は、遺伝子工学的に大腸菌で発現させたナクレインタンパク質を示す SDS-電気泳動の図である。〔発明を実施するための最良の形態〕

以下に、本発明を実施例に沿って詳細に説明するが、本発明がこれら実施例の開示に基づいて限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。

実施例 1 ：ナクレインタンパク質の抽出および精製

ナクレインタンパク質の抽出、濃縮および精製を、第 1図に概略的に示した手順に従って行った。

① タンパク質試料の抽出 ·濃縮

はじめに、粗真珠から比較的きれいな珠を選抜し、これらの真珠の核を除いた。そして、真珠層を単離して、乳鉢で磨碎し、粉末状にしたもの約 50gを出発材料とした。この出発材料に、 0.01%のナトリウムァザィドを添加した 0.3 Mのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、 pH 8.0) 溶液 250ml を加え、室温で約 3 日間振盪して、可溶性の有機基質を抽出した。

この抽出液を、 30, 000gで、 20分間遠心分離した。その上清を透析チューブ（スぺクトロポア 6、分離基準：分子量 2， 000)に入れ、 H₂0 に対して、 4 で、 24時間透析した（透析外液の H₂0 は 2回交換した）。そして、透析内液をそのままナス型フラスコに約 50ml宛に分注して、凍結乾燥した。凍結乾燥物に、約 8 mlの 10mM Tris Buffer ( H 8.0) を加えて溶解し、これをイオン交換ク口マトグラフィ一用の試料とした。

② ナクレインタンパク質の精製

10mM EDTA (pH 7.0)水溶液で平衡化した DEAE—セファセルカラム（ φ 15mmx 120mm)に、前述のィォン交換クロマトグラフィー用の試料 4 mlを加え、溶液中に含まれるナクレインタンパク質を吸着させた。 EDTA溶液でカラムを洗浄した後、 0〜0.8 M塩化ナトリゥム（lOmM EDTA、 pH 7.0) の直線勾配（400ml)で溶出を行い. 8 mlずつの画分として分取した。第 2図に、これら画分のクロマトグラフィー溶出パターンを示した。なお、第 2図における実線は 280nm の波長の吸収、密点線は T C A濁度法（ = 340nm) によるタンパク質定量曲線を示す。

一方で、残りのイオン交換用試料の 4.5mlについても同様のクロマ卜グラフィーを行い、第 2図とほぼ同様の溶出曲線（第 3図）を得、各溶出画分の Stains-allによる呈色吸収パターン（ = 570nm) を、第 4図にて粗点線で示した。

さらに、溶出画分中の T C A濁度法での吸収ピークに相当する画分 31と画分 40の SDS-PAGE ( 8〜： 16%勾配）を実施し、クーマシ一ブリリアントブルー G-250(第 5図）と Stains-all染色（第 6図）をつた o

なお、第 5図と第 6図において、レーン 1 は、宮下 ·松代による分離試料（10 1) ；レーン 2 は、前記イオン交換用試料（25 1) ；レーン 3および 6 は、分子量マーカータンパク質〔ミオシン (分子量： 200, 000)、 ^一ガラクトシダーゼ（分子量： 116, 300)、ホスフオリラーゼ（分子量： 97, 400) 、ゥシ血清アルブミン

(B S A、分子量： 66, 300)、グルタミン酸脱水素酵素（分子量： 55, 400) 、乳酸脱水素酵素（分子量： 36, 500) 、炭酸脱水酵素 (分子量： 31, 000) 、大豆卜リプシンィンヒビター（分子量：

21, 500) 、リゾチーム（分子量： 14,400) 、ァプロチニン（分子量： 6, 000) 〕；レーン 4 は、画分 31原液（25 1) ；レーン 5は、画分 40原液（25// 1) ；レーン 7は、画分 31の 10倍濃縮液（25 1) ；レーン 8 は、画分 40の 10倍濃縮液（25 1)である。

上記した結果に基づいて、一度目のィォン交換クロマ卜のピーク画分 29〜33、二度目のイオン交換クロマ卜のピーク画分 21〜25 を全部合わせて一本の透析チューブ（分離分子量： 2, 000)に入れ、 10mMの EDTA溶液（pH 7.0) を外液として、 4 で、ー晚透析を行つた。透析終了後、内液（約 100ml)を 10mM EDTA で平衡化した DEAE—セファセルカラムに吸着させ、その後、 0.8 M 塩化ナトリゥム（10mM EDTA) 溶液で直接、ナクレインタンパク質を溶出させた。溶出液（約 10ml) をウルトラフリー C一 20 (ミリポア社、 · 分離分子量： 10, 000) を用いて 2 mlまで濃縮し、以下、ゲル濾過用の試料とした。

ゲル濾過用の担体としてセフアデックス G75を用いた。 lOmM EDTA 、 0.2M塩化ナトリゥム溶液（pH 7.0) で平衡化した G75力ラム（ ø 20mm X 950mm)に、上記ゲル濾過用試料を添加し、同緩衝液を用いて 12.5mlZhrの流速で溶出を行つた。溶出液は 3.5ml ずつの画分として分取した。第 7図に、 G75ゲル濾過の溶出パターンを示す。実線は 280nm の波長の吸光、点線は TCA-濁度法での 340nm の波長の吸光を示した。

G75ゲル濾過での TCA-濁度法のピーク画分 37~43を集めて得られた 26mlを、最終精製標品とした。この標品は、 SDS-PAGEにて単一のバンドを形成する（第 8図参照）。また、この標品について BSA を標準夕ンパクとして用いて、 TCA-濁度法にて夕ンパク質の定量を行ったところ、約 20;tz g/mlという値を得た。従って、得られた精製全タンパク量は、 26x 20^ 500^ g ということになる。この精製標品の 5 mlをセントリコン 10 (アミコン社製；分離分子量： 10, 000) を用いて 0.45mlにまで濃縮し、 N末端アミノ酸配列決定用の試料とした。

③ 考察

この精製過程にて、真珠からの粗抽出液中には、 37kDのタンパク質など微量のバンドが検出されるものの、実質的な主要成分として分子量約 60kDと 15kDの 2つのタンパク質が検出された（第 5 図参照）。

また、粗抽出液を濃縮して、陰イオン交換樹脂 DEAE—セファセルのクロマトグラフィーにかけてみると、タンパク質の大部分が —つのピークに回収され、 SDS-PAGEによるこの画分の検定から、この画分が分子量 60kDの夕ンパク質に相当するものであることが判った（第 5図）。そして、このタンパク質は、 Stains-allでよく染まるので、 Ca²⁺結合タンパク質であると考えられる（第 6 図参照）〔K. P. Campbell, D. H. MacLennan & A.0. Jorgensen, "Staining of the Ca²⁺ -Binding Proteins, Calsequestrin, Calmodulin, Troponin C, and S - 100, with the Cat ionic

Carbocyanin Dye "Stains-all", J. Biol. Chem. , 258 (18), pp. 11267-11273 (1983)〕。さらに、分子量 60kDのタンパク分子はセフアデックス G 75を担体とするゲル濾過でも単一のピークを形成する（第 7図）。

ナクレインと命名した分子量 60kDのこのタンパク質は、真珠層を構成する主要タンパク質の一つで、 Ca²⁺結合性のある、酸性タンパク質（陰イオン交換樹脂 DEAEセファセルに結合する）であるとの結論に至った。

なお、分子量 15kDのタンパク質も、真珠層の主要構成タンパク質ではあるが、 Ca²⁺結合性を持たない塩基性タンパク質（DEAEセファセルに結合せず、素通りする）である。

実施例 2 ：ナクレインタンパク質の N-末端ァミノ酸配列の決定先に述べた濃縮サンプル（0.45ml) を、 1 レーン当たり 25 / 1 ずつ 7 レーンに分けて SDS-PAGEにかけて泳動した後、 60kDのバンドを含む膜片を切出して、プロッティング配列決定用の試料とし，これを PVDFメンブランフィルター（インモビロン P) に電気的に転移した。

転移した後、転写膜を 0.03%クーマシープリリアントブルー R -250で染色し、脱イオン水で洗浄した後、目的のバンドを含む膜片を切り出してプロッティング配列分析器 (477 A型：アプライドバイオシステムズ社製）にセッ卜し、膜に吸着したナクレイン夕ンパクの N末端アミノ酸を二度分析し、その配列（配列番号： 1 および 2 ) を、以下の通り推定した。

Ala Ser Met Phe Lys Met Asp Xaa Tyr Met Asp Xaa Gly Xaa Arg (配列番号： 1 )

Xaa His Met Phe Lys His Asp His Tyr Met Asp Asp Gly Val Arg (配列番号： 2 )

最終精製標品が完全に純化されていなかったために、 N末端配列の 1番目および 2番目のアミノ酸の特定に際して、 1回目と 2 回目の決定データの間に乖離もあって、当初はその推定が困難であった。なお、 N末端配列の 3〜15番目のアミノ酸は、 1回目と 2回目の決定データが当初からほぼ一致していること、そして、他の解析データを踏まえて、その N末端配列は、以下の配列（配列番号： 3 ) であると決定されている。

Ala Ser Met Phe Lys His Asp His Tyr Met Asp Asn Gly Val Arg (配列番号： 3 )

実施例 3 ：ナクレインの cDNAのク口一ニング

(1) N末端ァミノ酸に対応する DNA プローブの合成

上述のアミノ酸配列に対応して、コード表から考案したセンス D N A鎖の塩基配列を設定した（配列番号： 4 ) 。

この配列に対応する下記のアンチセンス DNA鎖 44mer (配列番号： 5 ) を、 DNA 合成機（392型：アプライドバイオシステムズ社製）により合成した。このプローブ DNA に、 DIG オリゴヌクレオチド 3，-端ラベリングキット（ベーリンガ一社）を用いて、アル力リフォスファターゼを結合させて標識した。

(2) アコャ貝外套膜組織からの mRNAの抽出

曰本国愛媛県宇和島地方にて養殖中のアコャ貝約 100 個を確保し、真珠層を形成しつつある外套膜組織の摘出を、数人の専門婦によって行った。摘出した組織片をすばやく燐酸緩衝液を通した後、液体窒素で瞬間的に凍結させた。アコャ貝 20個分毎にまとめて 1本のポリェチレン製遠心チュ一ブに分取した。そして、ドライアイスによる凍結状態で運搬し、以後、 — 80°Cのディープフリ一ザ一中に保存した。

この凍結組織に 6 Mグァニジン · チオシァネート水溶液を（ 1 ： 10の割合で）加え、ホモジナイザー（ポリトロン社製）で磨碎した。この磨碎物から、グァニジン ' フエノール ' クロロフオルム法（AGPC法）により全 RNA を抽出した。 1本の遠心チューブ ( 20個分の貝から得た外套膜）材料から約 3 mg相当の R N Aを得た。この R N Aをオリゴ d Tセルロースカラム（フアルマシャ製 mRNA精製キット）に通してポリ（A) ⁺ raRNAを精製し、約 20 g の mRNAを得た。そして、このポリ（A) + mRNAをァガロース電気泳動で分析したところ、約 18 s付近にバンドを形成していた。

このようにして得られた外套膜からの mRNAをゲル電気泳動したものを、ニトロセルロースフィルターに転移した。これに先に述べた標識した D N Aプローブをハイブリダィズしたところ、 2. 3kb 付近にポジティブシグナルを示すバンドの形成がみられた _c 対照区として、アコャ貝の臓器全体から抽出した R N Aではこのようなシグナルを検出できなかった。つまり外套膜から得た R N A試料の中にのみ特異的に D N Aプローブとハイブリダィズし得るナクレインの mRNAが存在することが示されたのである。

(3) cDNAライブラリ一の作成

上記した外套膜の mRNAからの cDNAの作成を、フアルマシャ社の cDNA合成キットを用いて行った。また、合成の終わった cDNAの両端には EcoR I -No t l部位を持ったアダプターを付加した。このようにして作成した cDNAを、ス g t lOをべクターとしてクローニングを行い、パッケージングした後、大腸菌 ΗΠ · NM514 株にてプラークを作らせた。このように精製して得た mRNA 20 u g の内の 2 /z g を使って、結局、約 270， OOOp f uのファージが得られた。直径 9 cmのプラスチック製シャーレに、 1枚当たり約 10， 000のプラークが出るように捲き、出現したプラークを、ニトロセロー . スフィルター上に転移した。そして、 5枚のシャーレから得られた 5枚のフィルターに対して、上述の標識プローブを用いてプラークハイプリダイゼーションを行い、 6個のポジティブシダナルを示す独立したスポットを得た。このスポッ卜に対応する各々のプラークを採って、再びポジティブシグナルを示すプラークのスクリーニング（選択）を繰り返し行い、純化した。

純化したファージクローンを大腸菌 ΗΠ NM514 株で増殖させた後、各々のファージクローンから D N Aを抽出し、 No t l消化したものをゲル電気泳動に適用した。

クローン化した目的の cDNAの断片には、 EcoRI の切断箇所が 1 箇所あることが判ったので、各クローンから抽出した DNA を No t I で消化した。かように No t l消化したゲルバターンをニトロセルロース · フィルターに転移し、上述の標識プローブを用いてハイブリダィゼーシヨンを行ったところ、 2. 3kb の DNA 断片がポジテイブシグナルを示した。それで、この D N A断片がナクレインの cDNAであると判断した。

実施例 4 ：ナクレイン夕ンパク質の cDNAの全塩基配列の決定実施例 3 にてナクレインの cDNAと判断された DNA 断片を、ブラスミド pB l ues cr ip t にサブクローニングした。 6 クローンの内、 4つのサブクローニングに成功し、それぞれを、 C ス N2、 C λ N5、 C λ N6, C ;i N9と命名した。そして、これらの断片の制限地図 (切断点地図）を作成したところ、殆ど共通するパターンが認められた。

C ス N6の地図を第 9図に示す。第 9図において、 PBKS (ストラタジーン社）は大腸菌のクローニング用プラスミド pB l uescr i p t の一つであり、図中の N、 E、 B、 Sの各点は、制限酵素 No t I、 EcoR I 、 BamHI 、 Sac lの切断部位を示す。

第 9図の C ス N6の場合、 5つの断片に切断することができたの . で、その各断片を塩基配列決定用のプラスミド PUC19 にサブクロ一二ングした。また、別途、 BamH I で切断していない Sac l -Eco RI断片（1. 6kb)は、直接、配列決定のために使用するには長すぎるので、この断片をまず、 PUC19 にサブクローニングして、それを ΕχοΙΠおよび Ba 1 31ヌクレアーゼにより少しずつ削つた

de l e t i on株をいくつか用意した。これらすベての断片を、 DNA シーケンサー（373S型：アプライドバイオシステムズ社）に適用して塩基配列を決定し、そのデータを遺伝情報処理ソフトウェア (GENETYX-MAC) によって編集と解析を行って、 C A N6に挿入された DNA 断片の全塩基配列ならびにァミノ酸配列を決定した（配列番号： 6 ) 。

配列番号： 6 に示した解析された全塩基配列ならびにアミノ酸配列の検討から、以下の点が判明した。

(1) コーディング領域は、塩基番号 22〜24番目のメチォニン〔ァミノ酸番号 1 〕から塩基番号 1360〜1362番目のリジン〔ァミノ酸番号 447 〕に至る 1341塩基（447アミノ酸）である。なお、このコーディング領域に相当する塩基配列を配列番号： 7 として、また、成熟ナクレインタンパク（シグナルぺプチド部分を除くコーディング領域）に相当するァミノ酸配列を配列番号： 8 として、それぞれ記した。

(2) 非コーディング領域は、塩基番号 1363~ 1365番目の TAG (アンバーナンセンスコドン）に始まり、 ATに富んだ領域になっている。

(3) シグナル配列。塩基番号 22~ 24番目の ATG メチォニン〔ァミノ酸番号 1〕から塩基番号 70〜72番目の GGC グリシン〔アミノ酸番号 17〕に至る配列は、疎水性ァミノ酸のクラスター、そして、親水性ァミノ酸のクラスターに続き、グリシンで終わるので、この部分が、このタンパク質のシグナル配列であると考 . りれ。

(4) この cDNAクローンを得るために合成した 44mer (配列番号： 5 ) の DNA プローブに対応するセンス鎖（配列番号： 4 ) は、配列番号： 6の塩基番号 73番目の G (グリシン）から 117番目の G (グリシン）に存在する。

(5) このナクレインは、 Ca²⁺結合タンパク質である。一般に、 EF hand 構造として、疎水性ァミノ酸に囲まれた Gly-Asxが、

Ca²⁺結合部位として知られている。これに類する構造として、配列番号： 6の塩基番号 745番から 990番に至る塩基配列に対応する 242~ 323番のアミノ酸配列は極めて特徴のあるもので、 Gly-Asx-Asn- (Asx; Asp または Asn)の配列（配列番号： 9 ) の繰り返しが 27回にも及び、注目に価する。

(6) 夕ンパク質のァミノ酸配列のデータベース（Swissprot

protein data base)を用いて検索を行ったところ、ナクレインは、炭酸脱水酵素（carbonic anhydrase, 以下 CA と称する）と相同性があり、特に、ヒ卜赤血球の CAEに対して高い相同性が認められた（第 10図参照）。この炭酸脱水酵素は、以下の反応式〔 I 〕で表現される反応を触媒するものである。

C0₂ + H₂0 HC0₃- + H+ 〔 I 〕そして、実際に、ナクレインタンパク質におけるこの酵素活性の有無について、以下のようにして測定を行った。

I 1 の酵素タンパク質の存在下、 20mM Veronal緩衝液（pH 8.3) 3 mlに、二酸化炭素飽和水 2 mlをよく攪拌しながら加え、 pHが 7.3まで低下するのに要する時間を測定し、これを Tとした。ただし、常温では反応温度が速すぎるため、 0 で反応を行った。また、同様にして酵素が存在しない場合における時間も測定し、これを T o とした。

なお、 Tと T o より酵素の活性は次式〔E〕で表される。活性単位（unit) = (T T) /T 〔H〕上記した手順に沿って行った測定結果を、以下の表 1 に示す, 表 1 炭酸脱水酵素活性の測定試料使用量（ g) τ (秒）比活性（単位/ rag)

105 (=To)

BECA 0.1 30 2.5x 10⁴ BECA (熱不活性化） 0.1 130

ナクレイン 0.8 45 1.6X 10³ ナクレイン 1.6 24 2. IX 10³ ナクレイン（熱不活性化） 0.8 140

BSA 4.0 120

BECA: ゥシ赤血球炭酸脱水酵素

BSA: ゥシ血清アルブミン

表中に表示した数値は、個別に行ったつの試験結果の平均値示した。表 1の結果から明らかな通り、ナクレインが炭酸脱水酵素活性を有する酵素タンパク質であることが認められた。

以上のことを総合すれば、ナクレインは真珠層を構成する構造タンパク質であると共に、海水中に溶存する Ca^{2 +}と炭酸ィォンから、ァラレ石の素材である炭酸カルシウムを自ら合成および供給する機能夕ンパク質であると言える。 (7) シグナル配列を除くコーディング領域を構成するァミノ酸の分子量に基づいた場合、このタンパク質の分子量は 50, 000 となり、 SDS-PAGEの移動度から計算した分子量約 60, 000 との間. に、約 10， 000の差が認められた。

実施例 5 ：宿主〔大腸菌〕でのナクレインの発現

先の実施例でのナクレイン cDNAの塩基配列の決定を踏まえて、この cDNAを繫げたべクターを用いて、大腸菌細胞での形質発現を行った。

まず、形質発現用ベクターとして、 PT7-7 [Studier, F. W. et al. , Methods Enzymol. 185, 60-89 (1991)]を選び、この Ndel -EcoRI部位に、 PCR 法で増幅したナクレインのオープンリーディングフレームを第 11図のように揷入した。

この構築べクターの構造からわかるように、挿入遺伝子の発現は、その遺伝子の前にある T7RNA ポリメラーゼによつて機能するプロモーター ø 10によって司られる。一方、大腸菌の BL21(;i DE3)株では、 T7RNA ポリメラーゼの発現を IPTG (イソプロピルチォガラクトシド）の添加によつて誘導できるので、前述したブラスミドで形質転換したこの菌株の形質転換体を作成して、ナクレインの合成の有無を調べた。

ナクレインの検出 ·定量には、抗ゥサギナクレイン抗体を用いて行った。この抗体は、実施例 1 にて得られた精製ナクレイン試料（タンパク 20 g/ml) の 1 mlをアジュバンド（和光純薬）と等量ずつよく混合したもの（抗原）を 1回の注射量として、 3週間おきに 2回免疫処置して、約 1 ヶ月後に得た抗血清である。この抗体は、 10, 000倍希釈しても、ナクレインを検出することができる。

前述した形質転換株を IPTGで誘導してナクレインを生合成させた菌体を SDS で溶解して、一括して SDS-電気泳動に適用し、これをブロッティング装置（日本泳動）を用いて PVDFメンブランフィルター（インモビロン P ) に移した。

これを上述した抗ゥサギ血清で処理し、さらに西洋ヮサビのべ . ルォキシダーゼで標識したャギ抗ゥサギ IgG 抗体で処理した後、 DAB (3, 3' -diaminobenzidine)で発色させた。

分離したいずれの株についても、 IPTG無添加の対照区（-）では抗体に反応するスポットは殆ど検出されなかった。これに対して、 IPTGを添加して誘導した試験区（+) では、黒く発色したバンドが色濃く検出された（第 12図- 1) 。

これらの結果は、ナクレインタンパク質が、大腸菌の細胞で量産（他のクーマシーブルー染色データから、全タンパク質の数％に相当）されることを示すものである。全く同様の手法によつて、この夕ンパク質を酵母菌や蚕などの細胞でも生合成させることが可能である。そして、工業的用途に応用する場合には、どの系を用いると最も効率良く天然と同じ夕ンパク質が合成され、精製工程にも好都合であるかなどの点につき検討することになる。

なお、本実施例にて生合成させたナクレイン（バンド A) と天然のナクレイン標品（実施例 1 ：バンド B) を並べて電気泳動して比較したところ（第 12図- 11)、天然のナクレインの方が、分子量が明らかに大きい。この理由として、翻訳後の修飾を考慮するのが妥当である。この夕ンパク質が糖タンパク質であることを示唆する論文〔佐俣哲郎：貝雑、 leTuts 47, 127-140 (1988)〕の存在に鑑みて、糖鎖の存在を示す PAS 染色や、 N-グルコシダーゼでの切断を試みた限りでは、期待していた結果は得られなかつた。一方で、大腸菌で生合成したタンパク質と天然のナクレインタンパク質との間には、分子量の他に、 pi値にも明らかな相違がある。また、（Ca²⁺結合能を反映する） Stains-allの染色性も異なることから、結局 Gly-Asx-Asn配列（配列番号： 9 ) の繰り返し領域のァスパラギン酸が S —カルボキシル化されるなどして酸性基の結合による修飾があり、天然のナクレイン分子は P Iの酸性度が強く、従って、 Ca ^{2 +}イオン結合性も強いと考えられる。

このような諸条件を考慮すれば、天然のナクレイン分子と同じナクレイン分子を大量生産するには、酵母菌や蚕などの真核細胞を宿主とするベクターに、本発明で開示したナクレイン cDNAをつなぎ替えて、宿主細胞に導入して、発現せしめることが必要であ o

〔産業上の利用可能性〕

このように、本発明によると、養殖という自然環境に依存した従来の真珠形成技術から脱却できるのみならず、人工的に真珠夕ンパク質を形成することが可能となる。そして、本発明によつて初めて明らかとなった、真珠タンパク質形成に関与する遺伝子構造を応用することで、今後、真珠の工業的生産への途が開かれることが期待できるなどの、優れた効果を奏するものである。

配列配列番号： 1

配列の長さ： 15

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Ala Ser Met Phe Lys Met Asp Xaa Tyr Met Asp Xaa Gly Xaa Arg 1 5 10 15 配列番号： 2

配列の長さ： 15

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列の特徵：

特徴を表す記： unsure

存在位置： 1

他の情報：この位置のァミノ酸は、 Ser、 Alaあるいは Glyである特徵を表す記号： unsure

存在位置： 8

他の情報：この位置のアミノ酸は、 Hisあるいは Aspである。配列

Xaa His Met Phe Lys His Asp Xaa Tyr Met Asp Asp Gly Val Arg 1 5 10 15 配列番号： 3

配列の長さ： 15

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列

Ala Ser Met Phe Lys His Asp His Tyr Met Asp Asn Gly Val Arg

1 5 10 15

配列番号： 4

配列の長さ： 44

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

アンチセンス： NO

配列

KCNCAYATGT TYAARMWBGA YSAYTAYATG GAYGAYGGNG TNMG 44 配列番号： 5

配列の長さ： 44

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

アンチセンス： YES

配列

CKNACNCCRT CRTCCATRTA RTSRTCVWKY TTRAACATRT GISW 44 配列番号： 6

配列の長さ： 2363

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA

配列の特徴：

特徴を表す記号： CDS

存在位置： 22..1362

特徴を表す記号： sig peptide

存在位置： 22..72

特徴を表す記号： binding site

存在位置： 73..120

特徴を表す記号： repeat region

存在位置： 745..990

特徴を表す記号： repeat unit

存在位置： 745..748

特徴表す記号： active site

存在位置： 1144..1287

配列

TAGTAAATGT GAAGATTGGT G ATG TAT CTT CAT TTG ACT GCC CTA TGT 48

Met Tyr Leu His Leu Thr Ala Leu Cys

1 5

GTT GTT ATT CCG CTG TGT TAT GGC GCC TCC ATG TTT AAA CAT GAC CAC 96 Val Val lie Pro Leu Cys Tyr Gly Ala Ser Met Phe Lys His Asp His

10 15 20 25

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配列の長さ： 1341

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA

配列の特徵：

特徵を表す記号： s i g pep t i de

存在位置： 21. . 51

特徴を表す記号： b ind ing s i te

存在位置： 52. . 99

特徵を表す記亏： repeat reg i on

存在位置： 724. . 969

特徵を表す記号： repeat un i t

存在位置： 724. . 727 特徵を表す記号： act ive s i te

存在位置： 1123. . 1266

配列

ATGTATCTTC ATTTGACTGC CCTATGTGTT GTTATTCCGC TGTGTTATGG CGCCTCCATG 60 TTTAAACATG ACCACTACAT GGACAATGGT GTGAGGTATC CTAATGGTGA CGGAATCTGT 120 AAACAAtTGA ATGAAACCAA ATGTGATGCA GGGTTTAGCT ATGATAGGAG TATATGTGAA 180

GGTCCTCATT ATTGGCACAC CATATCGAAA TGCTTCATTG CATGTGGAAT TGGACAGAGA 240

CAATCTCCAA TCAACATCGT TTCTTATGAT GCTAAATTTC GTCAGCGTTT GCCAAAATTG 300

AAATTCAAGC CACATATGGA GAAATTAAAA ACAGAAGTGA CCAATCATCA GAACCGAGCT 360

CCAGAGTTCG AGCCAGAGGA TGGGGAAAAT CTGTACGTGA AGCTAAATAA CCTAGTGGAC 420

GGTCATTATA AATTCCATAA TCTTCACGTT CATAATGGTA GAACCAGACG TAAGGGATCA 480

GAACACAGTG TTAACGGTCG TTTCACACCT ATGGAGGCTC ATTTGGTTTT CCATCATGAT 540

GATCAAACAC ACTTTGAACC TACACGCACT AAGCTGGGAG GAGCATTCCC TGGTCATAAC 600

GATTTTGTCG TCGTTGGAGT TTTTCTTGAG GTCGGAGATG ACGGCTTTGG CGACGAACCG 660 GATGACGAAG AATGTAAACA CATCTTAAAG GGACATCACC CTGATAATAA CGAGAACGGC 720

AATGGAGACA ATGGCAATAA CGGCTACAAT GGGGACAACG GTAACAATGG TGACAACGGC 780 AATAACAGCT ACAATGGGGA CAACGGTAAC AATGGTGTCA ACGGCAATAA CGGCTACAAT 840 GGGGACAACG GTAACAATGG AGACAACGGC AATAACGGCT ACAATGGGGA CAACGGTAAC 900 AATGGTGACA ACGGCAATAA CGGTGAAAAC GGCAATAACG GTGAAAACGG CAATAACGGT 960

GAAAATGGTC ACAAACACGG ATGTCGGGTA AAGAAAGCAA AGCATCTCAG TAGGATCCTG 1020

GAATGTGCTT ATAGAAACGA TAAGGTCAGA GAGTTCAAGA AAGTTGGAGA AGAGGAAGGG 1080

TTAGATGTTC ATCTAACACC GGAGATGGCT TTGCCGCCAC TGAAGTACAG ACATTACTAT 1140

ACATACGAGG GATCCCTGAC CACTCCCCCG TGTACAGAGT CTGTCCTCTG GGTTGTTCAA 1200

AAATGCCATG TGCAGGTGTC AAGAAGGGTT CTTCATGCAT TACGAAATGT TGAAGGATAT 1260

AAAGATGGTA CCACACTAAG AAAGTATGGA ACTAGACGTC CAACGCAAAA GAATAAAGTT 1320

ACTGTGTACA AAAGCTTCAA A 1341 配列番号： 8

配列の長さ： 430 061 98T 081

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配列の長さ： 3

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列

Gly Asx Asn

1

Claims

請求の範囲

1. 真珠を構成する夕ンパク質の発現をコードする遺伝子であつて、前記遺伝子が配列番号： 7に記載の塩基配列を含むことを特徵とする、真珠を構成するタンパク質の発現をコードする遗伝子。

2. 前記タンパク質が、アコャ貝（T Ticifliiii /ucaia) が産生するナクレイン mcrei?0タンパク質である請求の範囲第 1項に記載の遺伝子。

3. 前記ナクレイン iiicreiTi)タンパク質が、 SDS-PAGEによって決定された 60， 000の分子量を有する請求の範囲第 2項に記載の伝子。

4. 真珠を構成するタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を含むことを特徴とする、真珠を構成するタンパク質。

5. 前記タンパク質が、アコャ艮（Pinctada fucata) が産生するナクレイン mcreiTOタンパク質である請求の範囲第 4項に記載のタンパク質。

6. 前記アミノ酸配列が、配列番号： 7に記載の塩基配列によつてコードされる請求の範囲第 4項もしくは第 5項に記載のダンパク質。

7. 前記ナクレインタンパク質が、 SDS-PAGEによって決定された 60, 000の分子量を有する請求の範囲第 4項ないし第 6項のいずれかに記載のタンパク質。

8. 7 ^ - ^. (Pinctada fucata) 力産生するナクレイン (nacrein) 夕ンパク質の製造方法であって、下記工程、すなわち；

(a) 原料アコャ貝の真珠層から真珠タンパク質を抽出し、

(b) SDS-PAGEに前記真珠タンパク質を適用して決定された

60, 000の分子量を有するタンパク質を含む画分を回収し、

(c) 前記タンパク質の N末端ァミノ酸配列をコードするプロ一ブを合成し、

(d) ァコャ貝の外套膜から得た mRNAを基に作成した cDNAラィプラリーに対して、前記プローブとハイブリダィズする cDNAをクローニングし、および

(e) 前記 cDNAを大腸菌などの宿主細胞に導入して、ナクレイン夕ンパク質を発現せしめる

工程を含む、ことを特徵とするナクレインタンパク質の製造方法。

9. 前記宿主が、大腸菌、酵母菌、および蚕かならなるグループから選択された生物の細胞である請求の範囲第 8項に記載のナクレインタンパク質の製造方法。

10. 前記宿主力、 Escherichia coli BL21 (ス DE3)の細胞である請求の範囲第 9項に記載のナクレインタンパク質の製造方法。