WO1996031114A1 - Procede pour produire des micro-tubercules de pommes de terre - Google Patents

Procede pour produire des micro-tubercules de pommes de terre Download PDF

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WO1996031114A1
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medium
ethylene
chloroethylphosphonic acid
seedlings
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Inventor
Ichiro Oka
Original Assignee
Japan Tobacco Inc.
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Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Definitions

  • the present invention relates to a micro-tube (hereinafter, also referred to as “MT”) of Noresho. Longlong of invention
  • Microtubers like this The art is ⁇ efficient, so it is not costly and has not yet reached a practical technique. For this reason, the current microtuber ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 5 It is used for limited use of transmission resources, and it is just too much. Invention is going to be ⁇
  • the object of the present invention is to provide a method for increasing the size of a microtubing system.
  • the inventor of the present invention has found that as a result of a large number of plant hormones and qualities affecting the mic mouth tuber, ethylene or its 2-chloroethylphosphonic acid (trade name: Esrel) is strongly used in the mic mouth tube.
  • Esrel 2-chloroethylphosphonic acid
  • the present invention has been found to increase the pressure. Ethylene and 2-chloroethylphosphonic acid are thought to inhibit the formation of ⁇ ⁇ , and are merely (Mingo-Castel et al. (1974) Plant Physiol. 53: 798-801, Mingo-Castel et al. 1976) Plant Physiol. 57: 480-485, Hussey et al. (1984) Annals of Botany 53, 565-578, Wang et al.
  • the first in the present invention is a first in the present invention.
  • ir means “when intersected with the culture that changes in time”.
  • the potato itself is increased to 4 ⁇ in order to increase the number of buds contained in each knot, that is, the number of wins required for the ⁇ .
  • exogenous ethylene refers to ethylene that is obtained from plants (endogenous ethylene).
  • the condition for exogenous ethylene power is a force that can be created by putting ethylene itself in a container, usually a force that mixes 2-chloroethylphosphonic acid, which is ethylene, in the preparation of a culture medium, or a plant. It is produced at the time of body or by inversion during culture.
  • 2-Chlorethylphosphonic acid is added to the culture medium at the time of the first I ⁇ , etc. until the end, but it is good, but culture ⁇ 6, et al.;! It is preferable for one week before the end .
  • the excitation of 2-chloroethylphosphonic acid is carried out so that the 2-chloroethylphosphonic acid in the culture medium has an ISffl of 0.05 to 50 ⁇ , preferably 0.2 to 10 ⁇ .
  • 2-chloroethylphosphonic acid is added to the culture medium, the growth of the plant will increase. Small plants, such as cut seedlings at each node, and young plants
  • the concentration of 2-chloroethylphosphonic acid in the culture medium be less than 1 pm when not being used.
  • the cultivation under exogenous ethylene can be carried out in the same manner as the ⁇ expression used in ⁇ ⁇ , including isolation and ⁇ .
  • the plant material used is 1 ⁇ nurtured virus and other seedlings. These seedlings are cut into ⁇ W or cut into single nodes (or two nodes Ji may be used) containing rice and leaves, and the medium is added to the medium, and the temperature is 18-25 ° C, preferably 18-22 ° C. C), illuminance 3,000-10,000 lux (ff or 4,000-6,000 lux), 12-24 per day (if 16-16, say lighting ⁇ ⁇ ox lower day ⁇ I Proliferate the key by liquid communication under cows).
  • the culture vessel is luminous and airtight (anything may be used, but " ⁇ is a transparent glass bottle ⁇ ⁇ ⁇ Use a polycarbonate culture volume I ⁇ .
  • the number of plants per liter of capacity is between 0.1 and 5 seedlings, preferably between 1 and 3 seedlings, and the number of cut nodes is between 1 and 10 (ff, preferably between 2 and 4).
  • the height of the plant will reach about 80% of the height of
  • the growth may be slower than this depending on the release of ⁇ ethylen.
  • FIGS. 1 and 12 show a plant obtained by culturing under cows exogenous ethylene and a plant obtained by culturing under exogenous ethylene.
  • the left side of the left sucker 2 in Fig. 1 is obtained by cultivation under the conditions.
  • the right side of the right side of 1212 is the raw ethylene spine ⁇ ⁇ It was obtained by culturing under cows.
  • FIG. 3 M4 shows that the plant obtained under the condition of exogenous Echirenka swelling was expanded and expanded: i3 ⁇ 4.
  • the step in the present invention refers to a method in which Wang et al. Conducts a culture SI substantially similar to that of the rainbow, and the culture is carried out in a high medium using a medium having less light per day. Ice.
  • “Saihu” means, like venom, "a culture that goes back and forth in time.”
  • the microchips are formed mainly on the stems extending from the firewood contained in the difficulties in the first step.
  • the o-th step of the present invention can be carried out in accordance with the following method, including the use of a sugar that does not require a special method.
  • ⁇ , ⁇ ⁇ s, etc. is the same as the beef cattle ⁇ tmia.
  • the swelling from the cultured seedlings was used as a painting material.
  • Seedlings grown in tube bottles C3 ⁇ 4T (sometimes referred to as “tube bottle seedlings”) are 8 to 10 cn ⁇ ), I ⁇ is 5 to 10 t ⁇ J3 ⁇ 4, and seedlings grown in plastic dishes (OT is The length of the petri dish is 3 to 5 ⁇ fiber and 5 to 8 tfcm3 ⁇ 4.
  • Tube bottle seedlings are cut into single nodes containing leaves and ⁇ , and 8 nodes each.
  • LS medium + 3% sucrose, pH 5.8 iS ⁇ 12cnk containing 6 liters i. ⁇ 12cnk Height ⁇ 21cm capacity approx. 1.8 littno Glass bottle: Nipponishi ⁇ Company, hereafter "2 L ), And cultivation under the conditions of 20 ° C, illuminance of about 4,000 lux (white ⁇ , lighting time per day 16 ⁇ 3 ⁇ 4 through ⁇ SO. 4). 5 liter / min. ⁇ ? ⁇
  • Table 1 Effect of 2-chloroethylphosphonic acid »(sm: Toyoshiro) Shelf (Individual / weaving weight harvest
  • Period Total O.lg i 0.5g L (g / crane Petri dish 23.7 (100) 21.7 (100) 14.0 (100) 30.6 3
  • 0.5 g i : Total number or fifi per 1 g of g of 0.1 g i) .5 g _h MT number in parentheses ().
  • the number of microtubules ®m is 2.3 times larger in the 2-chlorochlorophosphon area where petri dishes are # 3 ⁇ 4 ⁇ compared to the ⁇ ⁇ area, and the number of 0.5 gh microtubers is also about 1.8 times larger than in the 3 ⁇ 4 area ⁇ did.
  • the knots were not as effective as the petri dish, but the total number was 1.3 times.
  • the number of microtubers decreased slightly in the group in which 2-chloroethylphosphonic acid was injected during culture. This is believed to indicate that ethylene inhibits; ⁇ formation, as has been the case in many cases.
  • Lolo ⁇ 3 ⁇ 4Make-in tube bottle seedlings are 3 timbers per ⁇ ! And Petri dish (both 5 seedlings from the cultured seedlings maintained by Japanese tobacco genetics ⁇ ) are each greased into 2 L weave. Nutrition was performed under the same ⁇ ⁇ as in Example 1.
  • Table 1 shows the number of microphone mouth tubers and fifi weight per crowd.
  • Russet Burbank tube bottle seedling Japanese tobacco genetic ffl f ⁇ : From the cultured seedlings that had been grown, the swelling was increased to 3 L per 1 ⁇ 2L ⁇ ⁇ I and cultured under the same conditions as in Example 2.
  • Table 13 shows the number of microtubers per unit and fi *.
  • 0.5 g ⁇ The total number or the weight per MT of 0.1 g of MT.
  • the number of MT of 5 g h () indicates the separation with ⁇ of the drunk plot in 100 in parentheses.
  • the number of mic-mouthed tubs was significantly higher than that of 3 ⁇ 4-mouthed; the number of giant mic-mouthed tubers of 0.5gi: was cultivated as “ « ⁇ At the second week of the culture, the difference between the number of microtubers due to the difference of 2 _ chloroethylphosphonic acid at the 2nd week of culture was powerless. I got it.
  • 2-Chloroethylphosphonic acid (commercially available 2-chloroethylphosphonic acid 100 times: 0.1 ml (0.17ppm), 0.3ml (0.3%) 5 ppm) or 0.6 ml (l pp m) for each culture week 4 weeks »0.3, 0.6 or 1.2 ml for culture» Is the S of the medium, so the 2-chloroethylphosphonate in the medium is 1-2 ppiii and 0.6-1.2 ⁇ d S ppm ⁇ , respectively.
  • the pH of the 2-chloroethylphosphonic acid solution was adjusted to about 5 to prevent the pH of the medium from dropping due to the mouth of 2-chloronoethylphosphone.
  • the pH of a solution containing 2-chloroethylphosphonic acid is 5 in order to decompose the 2-chloroethylphosphonic acid, which is low in order to prevent decomposition, and stored at ⁇ to make ethylene 3 ⁇ 4 ⁇ . That is plastic.
  • the culture was carried out under the same conditions as in Example 1, and the medium was grown on the 36th day of culture, and the micro-chuno Kui was harvested on the 3rd and 45th days of culture.
  • Table 4 shows the microphone tube tuba primary and SS.
  • the number of microtubers was larger in the 0.1 ml ⁇ section than in the mouth section, but less in the 0.3 ml and 0.6 ml sections.
  • the number of microtubers in each group was higher than that in the JD group.
  • Table 1 shows the number of microphone tubs per unit and as.
  • Toyoshi mouth, make-in and russet 'microphone using Russet Burbank The effects of 2-chloroethylphosphonic acid and ethylene inlet on the mouth tube were investigated.
  • Toyoshi mouth and make-in make three bottles of seedlings per bottle, and Russet 'Nokuichi Bank uses 2 * "f two bottles of seedlings (both bottle seedlings are both Japanese tobacco ⁇ ⁇ ⁇
  • the culture was separated from the seedlings that had been difficult to preserve, and the culture was released under the same conditions as in starvation example 1 except that the culture medium was set to 500 ml.
  • Ethylene is cultured from the 2nd and 4th week. From the 2nd week and the 4th week, a 2-L container separate from the culture container containing 500 ml of commercially available 2-chloroethylphosphonic acid (1,000 times) ⁇ ]. The pH of the 2-chloroethylphosphonic acid solution was adjusted to about 5.5 after dilution to promote 3 ⁇ 4 ⁇ of ethylene from 2-chloroethylphosphonic acid. The aeration of ⁇ containing 2-chloroethylphosphonic acid went into the sickle. In this case, ventilation was performed through this cell until culture. On the 35th day of culture, the medium was turned into female medium, and the microtuber was harvested on the 35th day.
  • the method of this translation can save a lot of micro-chus in a forehead and a short time compared to the method of the thread. Also, the obtained microtube is large in size and excellent in rawness. Therefore, the present invention is not a leak. ⁇ brief description
  • FIG. 1 shows the morphology of Ruisho obtained by culturing under exogenous ethylene and potato obtained by culturing under exogenous ethylene.
  • FIG. 2 is a graph showing the morphology of potatoes obtained by culturing under exogenous ethylene and those obtained by culturing under exogenous ethylene.
  • Fig. 3 shows the morphology of wild potatoes obtained by culturing under exogenous ethylene ⁇ ! 3 ⁇ 4.
  • Figure 4 shows the morphology of potato organisms obtained by culturing under exogenous ethylene.

Description

明糸 E
' レイショのマイクロチューノく一の^ ^法
発明の擴
本発明は、 ノくィレショのマイクロチューバ一（以下 「MT」 と記すこともある） の^ に関する。 発明の龍蘭
¾έ ^ヽら広く れているバレイショ （Solanum tuberosumし ) のマイクロチューバ一 の^ 法は、 と: ^¾β£ ¾の 2つの: ヽらなる （Wangら（1982)American P otato Journal 59:33-37, Husseyら（1984) Annals of Botany 53:565-578, Estradaら（1986)Ti ssue and Organ Cul ture 7:3-10 ) 。
Figure imgf000003_0001
ノくレイショ 菌植物体を糖難カ^ い培地（1〜3 %) を用いて明 下で培養し、錢を増殖させる であり、
は、
Figure imgf000003_0002
(あるいは ΜΤΡ^日^ ί牛 T)で培養し、驢^ ¾成させる: ¾である。
¾έ ^ヽら 成を {S tするためにサイトカイ二ン等の植物ホルモンを培地に » ^ること 力ί れていた。例えば、 Wangらはべンジルアデニン （B A)、 Husseyらゃ Estrada らはベン ジルァミノプリン （B A P) と塩化（2—クロロェチル） トリメチルアンモニゥム （C C C) を培地に^ ΙΠしている。
しかしながら、 これらの方法はマイクロチューバ一 率カ く、 得られたマイクロチュ 一バー (^は^した植物 rnw®数と同数またはそ; j¾下であり、 しかも得られたマイク口 チューバ一はかなり小さい。例えば、 マイクロチューバ一の^ 法としてよく引用され て 、る Wangらの方法では 1 0 0個の植物 才料に対して最高 4 8. 6個、合計約 1 0 gのマイ クロチューバ一 （1個の ¾S 0. 2— 0. 3 g) しカ尋られていない。 しかも、培養には約 4 ヶ月という長い期間を要している。 また、 Estrada ら 料 3 0節に対し Tit鶴 5 m m ( 0 , 1—0. 2 g)のマイクロチューバ一を 2 0. 8個しカ ていない。
このように のマイクロチューバ—: 術は^ ¾率カ^^、ために、 コストか く、 未だ実甲的な 術に達するに至っていない。 このため、現在マイクロチューバ一 ^β¾ΐ5は、 遗伝資源 存ゃ配ィ揭の限られた用途に利用されてし、るにすぎな 、。 発明が^^しょうとする
本発明の目的は、 性の高 、マイクロチューバ一を^ *ヽっ に^^る方法を する とにあ ο 発明の開示
本発明者は、 多数の植物ホルモンや 質がマイク口チューバー に及ぼ 果を した結果、 エチレンまたはその である 2—クロルェチルホスホン酸（商品名：エス レル）力くマイク口チューバ一の^^を高めることを見出し、 本発明を した。 エチレン や 2—クロルェチルホスホン酸は、 ~ ^に ¾¾成を阻害するものと考えられて 、ただけに (Mingo- Castelら（1974)Plant Physiol. 53:798-801, Mingo- Castelら（1976)Plant Physiol. 57:480-485, Husseyら（1984) Annals of Botany 53, 565-578, Wangら（1985)Potato Physiolog y， Chapter ）、 これら力《^ ^成に ίϊ¾な効果をもたらすことは なことであった。 本発明は、相綱 ic^'ffl 力^い培地を用いて相綱に 1曰当たりの光照 J fei)侈い^ 下 で培養を行う第一: CMと相湖 ( H離か高い培地を用いて相綱に 1日当たりの «mの 少な 、^#下で培養を行う第 程とからなるノルイショのマイクロチューバ一の 法に おいて、 iis^—: では外生エチレン力 する条件下で培養を行い、 ttiism^ gでは外 生ェチレンカ しな 、条 ί牛下で培養をイ うこと^ mとするノ <レイショのマイクロチューバ 一の^^法である。
以下、本発明を細こ説明する。
1 )第一
本発明における第一: とは、
Figure imgf000004_0001
ものであり、 に糖 カί£い培地を用いて相綱に 1日当たりの ^哆ぃ条件下 て培養を行う をいう。 ここで とは 「時間的に前後する培 と 交した場 合」 という ir あり、第一： C においては、
Figure imgf000004_0002
この第一工 程では、主に、 第 ^に必要な勝、 すなわち、各節に含まれる芽を増やすためバレイショ の 自体を 4 ^させる。
[^生ェチレンの ^下での培 本発明の第一 は、 外生エチレン力 する条件下で培養を行う。 ここで外生エチレンと は、植物から ¾ ^したエチレン （内生エチレン） のエチレンをいう。外生エチレン力 する条件は、 エチレンそのものを容器内に することにより作りだすこともできる力、通常 は、 ェチレン¾¾ ^である 2—クロルェチルホスホン酸を培地の作成時に混合する力、、 または 植物体の 時、 または培養中に翻 [^ることにより、作りだす。
2—クロルェチルホスホン酸を培地に » る時期は第一 I呈の ^、ら終了直前までの 、つでも良 、が、培養 ½¾6、ら本;! ¾了の 1週間前の間力好ましい。 2—クロルェチルホ スホン酸の励 は培地中の 2―クロルェチルホスホン酸 ¾g力 . 05~50ρρπκ 好ましくは 0. 2〜10ρρπκ の ISfflになるよう翻 [T る。但し、培地に 2—クロルェチルホスホン酸を »ΤΤ ると植物体の生育が a¾し、 そ
Figure imgf000005_0001
ことがあるので、 培養苗を節毎に切断したものなど小さな植物 才 用 、る齢は植物体がある禾 した
Figure imgf000005_0002
い。 また、植物体か に：^していない時期に ^¾rtる には培地中の 2—クロルェチル ホスホン酸 が 1 pm以下になるように »T ること力好まし
〔そ の培 S^ffi
本発明の第一 は、外生ェチレン ¾下で培養を行うこと 離および 含 めて ~ ^に用いられている^ ¾ 呈と同様にして行うこと力《できる。
る植物の材料には1 ^養等 成されたゥィルスやその他 に赚して 、な 、 苗を用いる。 これらの苗を切^ Wにそのまま、 または麟と葉を含む単節（2節 Jiでもよ い） に切断したものを培地を入れた に し、 18〜25°C ましくは 18~22°C)、照 度 3, 000-10, 000ルクス （ffましくは 4, 000-6, 000ルクス)、 1日当たり 12〜24 (if ましくは 16〜24 曰 照明^ ί牛下 日^ I牛下）で液体通雜¾¾により鍵を増殖する。 培養容器は光 ¾ ^し、 気密 くあ (ま'どのようなものでも良いが、 "^には透明のガラス 製のビン^養^^ ポリカーボネート製の培養容 I ^を用いる。 培地にはリンスマイヤー •スク一グ (Linsmaier & Skoog)の培地 (1965, Physiol Plant 18: 100 - 127、以下 「L S培 ¾j と記すこともある）、 ムラシゲ'スク一グ（ urashige & Skoog)の培地 (1962, Physiol Plant 15:473-497)、 ホワイト （White)の培地（1963， The Cul tivation of Animal and Plan t Cells)なと li 培養に用いられる培地に]^源としてショ糖を 1〜3 %^¾Πしたもの （PH 5 〜7、好ましくは 5. 5 ~6. 5、以下「'！S±i殖培 ¾J と記すこともある） を用いる。 ^^源と してはショ糖の他にグルコース、 フラクトース、 マルトースなどを用いてもよい。
容量 1リットル当たりの植 数は、 苗の は 0· 1〜5本 ましくは 1 〜3本）、切断した節の は 1〜10節（ffましくは 2〜4節）である。 容量 1リツ卜 ル当たりの培: ¾Sは 0. 1〜0. 5リットル（ifましくは 0. 2 -0. 4リットル）、通^ Sは 0. 1〜 0. 5リットル Z額の容量 1リットル '分（3?ましくは 0. 2〜0. 4リットル Z織の容量 1リ ットル ·分）である。通気は^!麵付近の液 咅地中に行う。
通^養 3〜 6週間で植物体の高さは^ |g©高さの約 80%に達する力 才料ゃェチレン の »離によっては生育がこの麵より遅くなることがある。
〔 ΐ¾で得られる植物体
外生エチレン力 する^^で培養することにより、 5»ί> に曲がり、勒く小さく、 茎 がや 、、 スト口ンに似た形態の麟や薪を多 ia# 植物体を得ること力くできる。
図 1及ひ ΊΕ12は、 外生ェチレンカ する 牛下で培養して得られた植物体と外生ェチレン カ赚しな 、 下で培養して得られた植物体の を示^ ¾である。図 1の左吸ひ 2 の左側 2 ^生ェチレンカ職しなレ、条件下で培養して得られたものであり、 図 1の右佃 ひ 1212の右側 2お ^生エチレン力棘する^ {牛下で培養して得られたものである。 また、 図 3 M 4は、 外生ェチレンカ職する条件下で得られた植物体を拡大して膨した: i ¾であ 。
は節から出たストロンの «^flE^したものであるから、 このようなスト口:/ ¾ の!^や を形成しやすい扰態になっていると考えられる。 ただし、 本工程で魂 茎 ることはない。 また、 を密閉し、 外気とのガス 3¾を Pfiji:して培養した に このような形態の植物体を得ることはあるが、通雜¾© 、 外生エチレンの節しない培 ^牛で 常このような形態の植物体を得ることはできなレ、。
2 ) Z
本発明における第 程とは、 Wangらが 、う: ½»虹程とほぼ同様な培 SI を艇する ものであり、 か高い培地を用いて相綱に 1日当たりの光昭 少ない条件 下で培 行う iceをいう。 ここで 「相湖」 とは、 膽己と同様「時間的に前後する培養 と赚した 」 という^ ある力 第^ if呈では、第一： [^と鎌した齢を する。 こ の第 ro^では、主に第一工程で^ ¾した難に含まれる薪から伸長した茎に、 マイクロチ ユーパ'一を形 させる。 本発明の第 o^は、特別な方法を用いる 要はな 糖 ¾¾¾び^^ 含めて、以下の ように の方法に従って行うこと力くできる。
前工程で植物体の高さ力、^!の高さ 50%¾± (SFましくは 80% h) に達した頃に游 している »¾殖培地を取り除き、 »¾殖培地の糖濃度を 6〜10%に ¾ した培地 (Ρ Ύ
Figure imgf000007_0001
と ϊ己すこともある） を織の容量 ιリットル当たり o. Ι ). 5リットル ましくは 0. 2 ~0. 4リットル）加え、 暗黒または 1日当たりの照明時間 12B#fB¾TF (5fましく は 8時 ¾¾下） の短日条件下で 3〜10週間（Siましくは 5〜8週間）培養して ¾¾f成を行う。
^ ,通^ sなどの培 牛は^ tmiaと同じである。
瞧例 1〕
ガラス製の管ビン （直径 2. 5 αικ長さ 12cm) 内またはプラスチックシャーレ （直径 9 oik 高 さ 2 cm) 内で の方法（Husseyら（1981)Annals of Botany 48:787-796 ) T¾成したウィル スフリーのバレイショの培養苗 G¾Sトヨシロ、
Figure imgf000007_0002
た培養苗より增膨を画才料に用いた。管ビン内- 成した苗 C¾T「管ビン苗」 と記すこ とがある）の長さは 8〜10cn^) 、 I ^は 5〜10t^J¾で、 プラスチックシャーレ内 成し た苗 （OTは 「シャーレ苗」 と記すことがある） の長さは 3〜5 αικ纖は 5〜8tfcm¾ あ っナ乙。
管ビン苗は葉と贿を含む単節に切断して 8節ずつを、 またシャーレ苗は切^ Wにそのま ま
Figure imgf000007_0003
（L S培地 +ショ糖 3 %、 p H5. 8 ) 0. 6リットルを入れ た直 iS^12cnk 高さ^ 21cmの容量約 1. 8リットノ ガラス瓶 ：日本石^^会社、以 下「2 L雜」 と記すこともある） に ¾し、 20°C、 照度約 4, 000ルクス （白^ 、 1 日当たりの照明時間 16^¾ 通^ SO. 4 ). 5リットル/分の条件下で培養を Γ? ^した。
培養 f?¾^ 2 目に市販の 2 -クロルェチルホスホン酸 （ 2—クロルェチルホスホン 轉10%、 発^ :日産化^ K会ネ ±) を水で 100倍に職し、無菌' した液 0. 3mlを雜 内に翻!]し （培地中の 2—クロルェチルホスホン酸雄ば約 0.5ppm)、 ±1己と同じ^ ί牛下で培
¾¾ ¾^7έした。
2—クロルェチルホスホン ^日後から植 »：の11 ^や!^の«は纖に曲がり始 め、新しく形成した葉は小さく、 スト口ンに似た形態となつた。 また本工程嚷了時に ίάΙΚ^ の 口区に比べて力、なり多いことも麟された。 なお、 2—クロルェチルホスホン縣 加区での植物体の生育は^ »区よりもや ^ ^、つた。
培養 Γ^½¾37日目に雜内に残っている培地を取り除き、： ½¾f ¾地（LS培地 +ショ糖 8%、 pH5.8) )を 0.6リットル加えた。 この時、 細での 2—クロルェチルホスホ ン酸の効果を調べるために管ビン苗由来の節を織した"^の雜 翻には 2—クロ ルェチルホスホン酸を^/口してレ、なレ、） に市販の 2—クロルェチルホスホン酸を 100倍に:?^ した液を 0.3ml^¾]した。
培 暗 牛下で 成を行った。 2一クロルェチルホスホン 区では暗黒 牛 ^行^ 1週間目から:^の は始まったが、 ^©tmに 2 -クロルェチルホスホ ン酸を^]口した区では暗!^件 1¾行後 2、 3日目に «の月 く始まった。暗^件下に移 してから 40日目に J«を収穫した。
当たり と **を表一 1に示した。
表一 1 2—クロルェチルホスホン酸 »の効果 (sm： トヨシロ） 棚
Figure imgf000008_0001
(個/織 重 量 収 穫
時期 総数 O.lg i: 0.5g L (g/鶴 シャーレ 23.7(100) 21.7(100) 14.0(100) 30.6 3
2週雕 55.5(234) 44.0(203) 25.0(179) 40.8 2 節 26.3(100) 24.5(100) 16.5(100) 36.8 4
(管ビン苗） 2Μ¾ 35.7(136) 29.3(120) 17.7(107) 27.7 3
培 ¾¾時 22.3( 85) 21.7( 89) 15.7 ( 95) 32.4 3 注 0.1 g以上：総数（総 MT生截 »のうち 1個当たりの重 . 1 g の MT数
0.5 g i:：総数または 0. 1 g iの ΜΤのうち 1個当たりの fifi ).5 g _hの MT数 ( )内の鮮： 区の^ ¾ [を 100とした を示した。
重量 ： 0. lg hの職の合計 ¾*である。
シャーレ苗を #¾ίした 2—クロルェチルホスホン^ ¾区では^ ¾□区に比べてマイクロチ ュ一バー ®m数は 2.3倍に、 また 0.5g hのマイクロチューバ一数も約 1.8倍に働□した。節 を ^した^にはシャーレ苗ほどの S ^な効果は認められなかったが、総数は 1.3倍 口 した。 一方、培 時に 2—クロルェチルホスホン酸を^]口した区ではマイクロチューバ一 数はやや低下した。 これは、 これまでに多くの 都 誠しているように、 エチレンが; ^ 形成を阻害することを示していると考えられる。
例 2〕
ロロ□¾メークインの管ビン苗を^!当たり 3材'つ、 またシャーレ苗（ともに日本たばこ遺伝 ^で保 していた培養苗より增衝 は 5材つをそれぞれ 2 L織に g¾し、 実 施例 1と同じ^ Φ下で 養を M½した
培養 1週間目または 2週間目に市販の 2 -クロルェチルホスホン酸を 100倍に し た液を雜当たり 0.3 mlずつ励 Πし、培養开舊 35日目に培地を画鹏地を し、 培地 ¾¾36日目にマイクロチューバ一を収穫した。
雜当たりのマイク口チューバー 数と fifiを表一 2に示した。
表一 2 2—クロルェチルホスホン^ [J口の効果（口 ：メークイン）
MT 数（個 Z雜) 重 量 収 穫 麵 翻口時期 総数 O.lg J>± 0.5g Ji (g /編 . 管ビン苗 区 73.5(100) 57.0(100) 22.0(100) 37.4 2
103.5(142) 75.0(132) 24.5(111) 39.3 2
131.0(178) 86.0(151) 35.0(159) 52.8 2 シャーレ苗 口区 61.3(100) 51.0(100) 25.7(100) 43.8 3
1週 146.5(239) 88.0(173) 31.0(121) 47.3 2
2 m. 116.0(189) 75.5(148) 32.0(125) 50.5 2 注 0. 1 gJSLh:総数（総 MT生産 t¾)のうち 1個当たりの重 *60. 1 g以上の MT数
0.5 g以上：総数または 0. 1 g以上の MTのうち 1個当たりの重 5 g i:の MT数 ( )内の!^: 口区の: ½^を 100とした ί を示した。
mm ： 0.1 の魅の合計 s*である。
管ビン苗、 シャーレ苗とも 2—クロルェチルホスホン酸を励 Πした区では^ JD区に比べて 明らかにマイクロチューバ一^^は多かった。
諭例 3〕
ロ¾3ラセット .バーバンク （Russet Burbank)の管ビン苗（日本たばこ遺伝 ffl f^で保 ：?? していた培養苗より增膨を^ I当たり 3材'つ 2 L^§Iに し、 例 2と同じ条 件で培養を した。
培養「开¾ ^時と『开½¾ 2週間目に市販の 2 -クロルェチルホスホン酸を 100倍に職した液を 当たり 0. 3ml (0.5ppm) または 0. 6ml ( 1 ppm)ずっ灘した。 その後は 例 2と同じ条 件下で培養を行った。
雜当たりマイクロチューバ一^数と fi*を表一 3に示した。
表一 3 2—クロルェチルホスホン ¾^¾ロの効果 G¾種： Russet Burbank) 娜^
Figure imgf000010_0001
(個 観 重 量 収 穫 時期 総数 0. lg J>± 0.5g (£/
^&区 33.0(100) 25. 5(100) 13.0(100) 18.0 2 培養 r幵 0.3ml 69.0(209) 54.0(212) 16. 5(127) 27.6 2
0.3ml 57.0(173) 48.0(188) 24.0(185) 41.0 2
2 . 0.6ml 52.0(158) 42.0(165) 23.0(177) 44.5 1 注 0. 1 gJ¾上：総数（総 MT生 のうち 1個当たりの重 M ). 1 g以上の MT数
0. 5 g ±：総数または 0. 1 g の MTのうち 1個当たりの重邐カ . 5 g hの MT数 ( )内の醉 区の ^^を 100とした ί離を示した。
££ ： 0. lgj^Ltの猿の合計 msである。
何れの 2—クロルェチルホスホン酸励口区でも^ ¾口区に比べてマイク口チューバ一;^数 は明らかに多力、つたが、 0.5g i:の大きなマイク口チューバ一は培養「« ^時に励口した区よ り 2週間目に馳した区の;^多力、つた。培養 2週間目での 2 _クロルェチルホスホン 酸の の違いによるマイクロチューバ一^^数の差は無力、つた。
醜例 4〕
ロ¾¾メークインの管ビン苗を葉と »を含む に切断し、 それらを 8節ずつを 2 L¾ilに置 床し、 異なる量の 2—クロルェチルホスホン^！^を培養開麟または培養「开 ¾^¾4週間目 に翻口し、 口時期と勸嫩がマイクロチューバ一 に及ぼす を樹した。
2—クロルェチルホスホン酸（市販の 2 -クロルェチルホスホン酸を 100倍に:^した は培¾^時 区では^!当たり 0. I ml (0. 17ppm)、 0. 3ml (0. 5ppm) または 0. 6ml ( l pp m)ずつ、培養开職 4週間目 »区では 0. 3、 0. 6または 1. 2 mlずつを »した。 4週間目で は培地の S¾ つているので培地中の 2—クロルェチルホスホン酸¾¾はそれぞれ 1〜 2 ppiii、 0. 6〜1. 2ρρπκ d S ppm ^ ある。 また、 2—クロノレエチルホスホン の励口により培 地の pH力 ¾下することを防ぐため 2—クロルェチルホスホン酸液の pHを約 5に して加えた。 なお、 2 -クロルェチルホスホン酸は分解を防ぐために低 、ρΗで保存されている力 分解して ェチレンを ¾ ^させるには 2—クロルェチルホスホン酸が含まれる液の pHは 5 であること カ塑ましい。
^例 1と同じ条件下で培養を行い、 培對开¾^36日目に培地を^し、 培¾3¾¾45日目に マイクロチューノく一を収穫した。
表一 4に 当たりマイク口チューバ一^次と SSを示した。
表一 4 2—クロルェチルホスホン^ ¾口の効果 ：メ一クイン）
Figure imgf000011_0001
(個 Z雜) 重 量 収 穫 翻口時期 総数 O.lg Ri: 0. 5gPJ±
纖 Π区 照） 49. 0(100) 43. 5(100) 26. 0(100) 46. 7 2 培養 時 0. 1ml 69. 0(141) 52. 0(120) 25. 7( 99) 46. 4 3
0. 3ml 31. 0( 63) 25. 7( 59) 13. 7( 53) 18. 6 3
0. 6ml 17. 5( 36) 13. 5( 31) 5. 5( 21) 9. 1 2
4週 r曰 0. 3ml 57. 5(117) 51. 5(118) 33. 0(127) 59. 1 2
4週尸職 0. 6ml 66. 0(135) 47. 3(109) 26. 7(103) 43. 6 3
4週獵 1. 2ml 51. 7(106) 46. 7(107) 30. 0(115) 46. 5 3 注 0. 1 gJ¾Ji :総数（総 MT生戲» のうち 1個当たりの重 ¾ί) 0. 1 g :の ΜΤ数
0. 5 J¾±：総数または 0. 1 g i:の MTのうち 1個当たりの fiS* 0. 5 g U:の MT数 ( )内の醉 区の を 100とした ί離を示した。
££ ： 0. lg hの 計龍である。
培養开猶に »した齢には 0. 1 ml劂 Π区では 口区に比べてマイクロチューバ一 数は多かったが、 0. 3 ml及び 0. 6 ml»区では少なかった。 培養「开 ¾¾¾ 4週間目に勦口した場 合は何れの区でもマイクロチューバ'一^数は^ JD区に比べて多力、つた。
2 -クロルェチルホスホン酸を^ J口した区で (ま植物体の生育が it®する。 この J!@の程 は 2—クロルェチルホスホン酸の敵と植物体の忧態、 特に大きさにより異なる。 ； φ¾®ΤΤ'は培 養苗を箭した節を麵樹に用いたため、培養開 に高離に翻口した区での植物体の生 育力 しく遅く、 このためにこれらの区ではマイクロチューバ一; ¾ ^は^ j口区に比べて少 ない結果となった。節のように小さな材料を植物体の材料に用いる齢は、 の 2—クロ ルェチルホスホン酸を^)口する力、、 もしく
Figure imgf000012_0001
してから^ rafること力好ま しい。
赚例 5〕
ロロ 1号の管ビン苗を 2材'つ 2 L織に S ^し （管ビン苗は日本たばこ遺伝龍 所で保 MSしていた培養苗より増 、 殖培地を 500ml とした は 例 1と同じ 条件で培養を した。
培養開 と开½¾ 2週間目に市販の 2 -クロルェチルホスホン酸を 100倍に^ した液を 雜当たり 0.25ml (0.5ppm)ずつ翻口した。培養「开 ¾^¾35日目に培地を麵¾¾¾地に 3¾し、
^ ^日目にマイクロチューノく一を収穫した。
当たりのマイク口チューバ一^数と asを表一 5に示した。
m 1号でも 区に比^ ¾養「开½時に翻口した区、 2週離に劂ロした区のしザれも塊 錢は力、なり多力、つた。 表一 5 2—クロルェチルホスホン 口の効果（口 ： 1号）
MT牛庠数（侗, 重 量 収 穫
»時期
総数 0. lg 0.5g (g/雜） 容
16. 3(100) 15.7(100) 11.7(100) 23.9 3 培養 時 27. 0(165) 22. 0(140) 12.0(103) 15.3 1
2週曰 24. 0(147) 23.0(147) 16. 5(141) 34.9 2 注 0. 1 g Jt :総数
Figure imgf000012_0002
のうち 1個当たりの 1 g i:の MT数
0. 5 gW±：総数または 0. 1 g hの MTのうち 1個当たりの ί*6 0. 5 gJ£Lhの ΜΤ数 ( )内の鮮：纖[]区の^ ¾を 100とした f を示した。
重量 ： 0. 12¾±の輕の合計 である。
例 6〕
¾¾トヨシ口、 メークインおよびラセット 'バーバンク （Russet Burbank) を用いてマイク 口チューバ一 における 2—クロルェチルホスホン酸とエチレン添口の効果を調べた。 トヨシ口とメークインは管ビン苗をそれそ^器当たり 3 つ、 ラセット 'ノく一バンクは 管ビン苗を 2*"fつ 2 に し （管ビン苗は とも日本たばこ遗伝 ¾^ ^で保 存難していた培養苗より增膨 、 1 ^殖培地を 500mlとし は餓例 1と同じ条件で 培養を離した。
2—クロノレエチルホスホン 口区では培養 2週間目に市販の 2—クロルェチルホス ホン酸を 100倍に職した液を雜当たり 0.25ml (0.5ppm)ずつ励口した。
またェチレンは培養开 2週間目と 4週間目から、 市販の 2―クロルェチルホスホン酸を 1， 000倍に職した液 500mlを入れた培養容器とは別の 2 L容器 ¾iして培養^^に通気する ことにより^]口した。 なお 2—クロルェチルホスホン酸からのェチレンの ¾ ^を促すために 2 —クロルェチルホスホン酸液の p Hを希釈後に約 5. 5 に した。 また 2—クロルェチルホス ホン酸の入つた^^の通気は鎌中に行つた。 この では培¾ ^まではこの舰を通 して通気を行った。培養『^ ½¾35日目に培地を: 雌地に し、 培 ¾ ¾^¾3 5日目に マイクロチューバ'一を収穫した。
^^当たりのマイク口チューバ一^^と SS 一 6に示した。
ェチレン»]区、 2—クロルェチルホスホン 区とも »¾Π区より ¾¾¾は多かつナ:。 また、 2—クロルェチルホスホン酸励口の方がエチレン翻口より効 あった。
表一 6 2—クロルェチルホスホン酸およびェチレン翻口の効果
M: 卜ヨシ口、 メークイン、 フセッ 卜 · く一バンク）
MT 数（個/ ζ織） 重 量 収 穫 品 種 翻卩時期
総数 0. lg kLt 0.5g i: (g/麵
トヨシロ 口 14.0(100) 13.0100) 9.5(100) 20.7 2
2週日 33.3〔238； Ιό.7 18 ) 9.7(102) 13.8 3
2週, 17.5(125) 16.0(123) 6.5( 68) 9.8 2
4週 TO 15.3(109) 14.0(107) 10.0(105) 17.5 3 メークイン ί^¾Π 22.3(100) 21.3(100) 15.3(100) 27.8 4
40.3(181) 30.3(142) l . oUUo^ 4
29.3(132) 24.7(116) 12.3( 81) 22.8 3
4週離 28.3(127) 24.0(113) 14.5( 95) 24.8 4 ラセ 7ト*パ-パンク ^S 19.3(100) 16.3(100) 11.0(100) 18.5 4
2週離 39.0(203) 33.3(205) 14.7(133) 18.1 3 注 # 2一クロルェチルホスホン酸を^ JDした区
本本 エチレンを »した区
0. 1 g ± 総数（総 MT生^)のうち 1個当たりの重 1 g hの ΜΤ数 0.5 gR 総数または 0.1 gRi:の MTのうち 1個当たりの重 M ).5gRi:の MT数
( )内の醉 纖ロ区の^ ¾を 100とした ί識を示した。
0. lg iiの:^の合計龍である。
発明の効果
本翻の方法は、 絲の方法に比べて額力、っ删間に多数のマイクロチュー く '一を で きる。 また、 得られるマイクロチュ もサイズが大きく ¾ ^生に優れたものである。従つ て、本発明は^Sめて な漏である。 麵の簡単な説明
図 1は、外生ェチレン雜下で培養して得られたルイショと外生ェチレン賺下で培養 して得られたバレイショの生物の形態を示 ^である。 図 2は、 外生ェチレン被下で培養して得られたノくレイショと外生ェチレン ^ ¾下で培養 して得られたバレイショの生物の形態を示す^ ¾である。
図 3は、 外生ェチレン雜下で培養して得られたノくレイショの生物の形態を示^！ ¾である。 図 4は、 外生エチレン 下で培養して得られたバレイショの生物の形態を示 である。

Claims

言青求の範囲
1. 力 ¾い培地を用いて相 に 1日当たりの光 多い条件下で培養を 行う第一 と相対的 離か ¾iい培地を用いて相綱に 1日当たりの光照 Jtftの少ない条 件下で培養を行う第 Bとからなる くレイショのマイクロチュー く一の^^法にぉ 、て、 一 I呈では外生ェチレンカ する 牛下で培養を行 、、 liiiem jci呈では外生ェチレ
Figure imgf000016_0001
方法。
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