WO1996029393A1 - Cellule productrice de virus d'immunodeficience humaine de recombinaison - Google Patents

Cellule productrice de virus d'immunodeficience humaine de recombinaison Download PDF

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WO1996029393A1
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human immunodeficiency
gene
cells
recombinant human
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Takashi Shimada
Katsuhiko Akiyama
Hidekazu Kuma
Yousuke Suzuki
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Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc.
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    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant human immunodeficiency virus vector (hereinafter, HIV vector), a method for producing the vector, and a production cell stably retaining the vector.
  • HIV vector human immunodeficiency virus vector
  • Gene therapy is classified into germline gene therapy (germ line cell gene therapy) and somatic cell gene therapy (somatic cell gene therapy) depending on the type of cells into which the gene is to be introduced (target cells). It has been. Also, augmentation gene therapy (Augmentation Gene Therapy) that adds a new (normal) gene while leaving the abnormal (cause) gene intact, and replacement gene therapy that replaces the abnormal gene with a normal gene (Replacement Gene Therapy), but at present, only additional gene therapy for somatic cells is performed due to ethical and technical constraints.
  • MoMLV mouse leukemia virus vector
  • MoMLV is a type of retrovirus that infects host cells by the specific binding of its surface envelope to receptors on the host cell surface. Recombinant MoMLV transfects different cell types depending on the type of envelope, and Ec0t0r0pic infects only rodents and Amph0 infects both rodent and human cells. Classified as tr0 pic.
  • helper plasmid consisting of the gag, pol, and env genes encoded in the MoMLV genome and a promoter for driving these genes, and a gene acting as a drug
  • a helper plasmid consisting of the gag, pol, and env genes encoded in the MoMLV genome and a promoter for driving these genes, and a gene acting as a drug
  • LTR MoMLV terminal repeat
  • a packaging signal which is a signal sequence for knocking a gene into a virus particle, is removed from helper plasmid.
  • vector plasmid contains a packaging signal.
  • a reporter gene for recognizing or selecting only cells that have undergone gene transfer with a viral vector is often inserted into the gene K sequence of vector plasmid. These two genes When the cells are transfected, the recombinant virus vector is produced in the culture supernatant.
  • cell lines called packaging cells have been established as a means for more efficiently preparing MoMLV vectors. These are cell lines in which the helper plasmid and Z or vector plasmid in preparing the MoMLV vector are stably integrated into the genomic DNA of the cell. With this cell line,
  • MoMLV vectors have the property of not having host specificity. This property indicates that various cells can be target cells of the MoMLV vector, and this vector can be used in response to various diseases. However, the essential lack of host specificity of these viral vectors makes administration to living organisms difficult.
  • Tissue-specific virus vectors have been developed as a means to solve these problems.
  • the HIV vector is a type of tissue-specific virus vector that can specifically transfer genes to CD4-positive cells.
  • the HIV envelope protein gp120 is present on the surface of CD4-positive T lymphocytes during infection. (Shimada T., eta 1., J. Clin. Invest. 88 1043 1991).
  • Diseases that can be targeted for gene therapy using this viral vector include CD4 + lymphocytes, which are particularly lethal and have no established treatment for acquired immunodeficiency syndrome (AI DS). And adult T-cell leukemia.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • CD4-positive lymphocytes resulting in a marked impairment of cellular immunity, resulting in various opportunistic infections, lymphomas, It is a disease that causes neuropathy and the like.
  • HIV therapeutic agents are nucleotide reverse transcriptase inhibitors, and azidothymidine (AZT), sydanosin (ddI), zarcitabine (ddC) and the like are used alone or in combination.
  • ATL adult T-cell leukemia
  • U chiy ama et al. U chiy ama T., eta 1., Brood, 50 481 -492 19 77
  • HTLV— I Is considered to be the causative virus Hinuma Y., eta 1 .. Proc. Natl. Ac ad. Sc i. USA 78 6476-6480 1981
  • RNA decoys such as TAR decoys and RRE decoys
  • TAR decoys and RRE decoys a method of hybridizing to HIV mRNA and DNA with an antisense oligonucleotide
  • RRE decoys a method of hybridizing to HIV mRNA and DNA with an antisense oligonucleotide
  • a method of cleaving HIV RNA by ribozyme Step Ve 1 o K.
  • HIV vector is very useful as a tissue-specific virus vector as described above, there are some problems with its preparation.
  • HIV vectors are prepared at the time of use by co-transfection of helper plasmid and vector plasmid into COS cells.
  • the transfection method represented by the calcium phosphate method, (1) the complexity of operation, (2) the limit of gene transfer efficiency, and (3) the gene transfer efficiency between lots. Variability, (4) need for large-scale preparation of plasmid, etc. There was a need to establish a more efficient and stable method of making household services.
  • the HIV vector is expected as a tissue-specific virus vector, its preparation method has many problems, and it is currently prepared by cotransfection of a helper plasmid and a vector plasmid at the time of use.
  • the vector titer fluctuates and the stable supply cannot be performed because the transfusion efficiency is not constant each time, and (2) a large amount of vector is prepared because the operation of the transfusion is complicated.
  • (3) When preparing a large amount of HIV vector it is necessary to prepare a large amount of plasmid vector corresponding to it.
  • packaging cell lines have been established in which helper plasmid and vector plasmid have been stably integrated into genomic DNA, but packaging cell lines for HIV vectors have not yet been established. Absent.
  • cells for retaining MoMLV are cells derived from mice such as mouse 3T3 cells, whereas cells for retaining HIV vectors are cells derived from humans. Is believed to be due to having to use. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and has as its object to provide a recombinant human immunodeficiency virus-producing cell for stably preparing an HIV vector in a large amount.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that at least the sequences of the gag, poll, and env genes encoded in the human immunodeficiency virus genome, and that the packaging signal sequence has been deleted.
  • the present invention has been completed by finding that the introduction of certain recombinant human immunodeficiency virus helper plasmid into animal cells is stably maintained.
  • the present invention provides a recombinant human immunodeficiency virus helper plasmid containing at least the gag, poll, and env gene sequences encoded in the human immunodeficiency virus genome and lacking a packaging signal.
  • Production of recombinant human immunodeficiency virus in which the gene is stably retained in cells obtained by introduction into animal cells Provide cells.
  • the present invention further comprises a sequence of ga, pol, env ⁇ genes encoded by at least the human immunodeficiency virus genome, and a promoter is arranged upstream of these gene sequences. It is intended to provide a recombinant human immunodeficiency virus helper plasmid for establishing the above-mentioned recombinant human immunodeficiency virus-producing cell.
  • the present invention provides a recombinant human immunodeficiency virus helper plasmid comprising at least a gag, po1 ⁇ gene sequence encoded by the human immunodeficiency virus genome. From a plasmid in which a promoter is located upstream of these gene sequences and from a plasmid in which at least the env ⁇ gene encoded by the human immunodeficiency virus genome and a promoter is located upstream of these gene sequences. A recombinant human immunodeficiency virus is provided.
  • the present invention provides the above-mentioned recombinant human immunodeficiency virus helper plasmid, which comprises at least the sequence of the gag gene encoded by the human immunodeficiency virus genome.
  • a plasmid having a promoter arranged upstream of the gene sequence a plasmid containing at least the P01 gene encoded by the human immunodeficiency virus genome and having a promoter arranged upstream of these gene sequences, and at least A human immunodeficiency virus helper plasmid, comprising a plasmid containing the sequence of the env gene encoded in the human immunodeficiency virus genome and having a promoter arranged upstream of these gene sequences.
  • the present invention also provides a method for establishing a packaging cell using the plasmid vector, and a method for producing a recombinant HIV vector using the packaging cell.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of the helper plasmid C GPE (—).
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of vector plasmid HXN.
  • FIG. 3 shows the results of ELISA-based quantification (primary screening) of the P24 protein contained in the culture supernatant of each of the neomycin-resistant cell line and the negative control strain.
  • FIG. 4 shows the results of the secondary screening.
  • the packaging cell of the present invention can be prepared as follows.
  • helper plasmid shown in 1 above that is, a promoter derived from cytomegalovirus, which is a promoter sequence driving these genes, is arranged upstream of the gag, po1, and env genes of the wild-type HIV genome sequence.
  • the promoter for driving the gag, pol, and env genes contained in this helper plasmid is not particularly limited, and includes, for example, a B19-derived promoter and a human simple herpesvirus-derived thymidine kinase promoter. Etc. can be used.
  • the reporter gene can be used for neomycin-resistant gene, hygromycin-resistant gene and the like according to the purpose and purpose, and is not particularly limited.
  • gag, pol, and env genes were used as two or three plasmids, respectively. It is also possible to establish a packaging cell line by reconstructing and co-transforming them.
  • the helper plasmid thus constructed is transfected into cells.
  • the cells may be anything such as cancer cells such as COS cells and HeLa cells, and lymphoid cells such as ⁇ 19 ⁇ ⁇ 5.
  • the transfusion method at this time may be any method, for example, a calcium phosphate method, a ribofusion method, and the like. Can be carried out in a known manner. After culturing the transfected cells for several days, the cells are detached from the culture dish and replated on a new culture dish. After several hours, add neomycin-related substance G418 to an appropriate amount of the culture medium, and select only cells transformed with the exogenous gene.
  • the hygromycin resistance gene is included in the sequence of the helper plasmid as a reporter II gene, add an appropriate amount of hygromycin to the medium. After culturing in a C 0 2 incubator for 7 to 10 days, pick up the obtained colonies one by one and re-inoculate each in a new culture dish. After 10 more days, culture for 10 days and save the culture supernatant for further screening.
  • Packaging cells for producing the HIV vector are selected as follows.
  • the primary screening is performed by quantifying the expression of p24 protein and Z or gp120 protein by ELISA method.
  • the quantification method may be another known method, for example, an analysis method by FACS (fluorescein activated cell sorting) using a fluorescent well, or a gene analysis method such as a Southern blotting method or a Northern blotting method.
  • the vector plasmid that is, the gag and poenv genes of the wild-type HIV genome sequence are deleted, and a gene sequence that can be a reporter gene is inserted into this region, and these genes are incorporated into an expression vector. Transfection is performed by a known method.
  • the reporter gene to be inserted is not particularly limited, such as a drug resistance gene such as neomycin resistance gene or hygromycin resistance gene or a gene encoding a cell surface antigen such as CD4 protein.
  • the culture supernatant is allowed to act on CD4-positive cells (transduction), and further cultured for 2 days.
  • the cells are detached from the culture dish and replated on a new culture dish.
  • the reporter gene expression Analysis is performed at the protein level or at the gene level by a known method as described above. In the case of the selection method utilizing drug resistance, the transduced cells are observed as colonies. By counting these numbers, the titer of the networked recombinant HIV vector can be determined.
  • the clone thus obtained can be used for producing a recombinant HIV vector.
  • An arbitrary recombinant HIV vector can be prepared by transfecting an arbitrary vector plasmid into the packaging cell by a known method. For example, it is used to prepare a recombinant HIV vector used for basic experiments such as marking, a recombinant HIV vector for gene therapy for introducing a drug gene into cells, and the like.
  • the transfection of a helper plasmid containing the reporter gene in the sequence or cotransfection of the helper brassmid and the reporter gene with the packaging cell strain is followed by selection for the reporter gene.
  • selection for the reporter gene By selecting by the method, it is also possible to establish a new packaging cell line stably retaining the vector plasmid in the cells. The use of this packaging cell eliminates the need for transfection when preparing a recombinant HIV vector.
  • a specific example of the above-mentioned packaging cells is HCN-348, which was submitted to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, under the Swine Treaty.
  • Deposit number FE RM BP— 5 4 6 7 The deposit number of the domestic deposit is FE RM P— 1 4 8 3 4), from the domestic deposit dated March 15, 1995, 1995 Some have been transferred to the International Depositary on January 11th.
  • Example 1 (Plasmid construction)
  • helper plasmid CGPE drives these genes upstream of the gag and poenv genes in the wild-type HIV genome sequence.
  • neomycin resistance gene (ne0) and a human simple virus are used as reporter genes downstream of the above genes.
  • the gene group in which the promoter (TK) of the virus-derived thymidine kinase was located was constructed by incorporating it into an expression vector containing the ampicillin resistance gene (amp) and the replication origin of SV40 (SV40 ori).
  • Vector-plasmid HXN deletes the gag, pol, and env genes in the wild-type HIV genome sequence, and inserts a neomycin resistance gene (neo) as a reporter gene and an upstream Human thymidine kinase (TK) derived from human simple virus is inserted as a driving promoter, and these genes include the ampicillin resistance gene (amp) and the replication origin of SV40 (SV400 ri). It was constructed by incorporating it into an expression vector.
  • neomycin resistance gene neomycin resistance gene
  • TK Human thymidine kinase
  • Transfection was performed by the usual calcium phosphate method. Sterilized purified water and a calcium chloride solution were added to 10 / g of CGPE (-) obtained in Example 1 to make the total volume 0.5 ml. This mixture was added dropwise to 0.5 ml of HBSP buffer with shaking, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to obtain a calcium plasmidophosphate coprecipitate.
  • Example 3 Next screening: quantification of p24 protein by ELISA method
  • the neomycin-resistant cell line obtained in Example 2 was seeded on a 3.5 cm culture dish and cultured for 2 days.
  • the culture supernatant of each cell line was collected, and the concentration of p24 protein contained in the supernatant was quantified by ELISA.
  • quantification was also performed on the culture supernatant of HeLa cells that had not been subjected to the operations shown in Example 1 and Example 2. The results are shown in Figure 3. Cell lines positive for p24 by this screening were preserved.
  • Example 4 (Secondary Screening: Preparation of Recombinant HIV Vector and Testing of Titer)
  • a cell line selected by primary screening in Example 3 was inoculated on a 9 cm culture dish and cultured until it became 50% confluent.
  • 10 g of the vector plasmid HXN shown in FIG. 2 was transfected by the calcium phosphate method. After culturing for 2 days, the culture supernatant was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes. 3 ml of the obtained supernatant was collected, mixed with 3 ml of a fresh culture solution, and allowed to act on CD4-positive HeLa cells cultured in a 50% confluent state. As a negative control group, the same operation was performed on He La cells not subjected to the operations of Example 1 and Example 2.
  • the human immunodeficiency virus-producing cells of the present invention allow HIV vectors to be more efficiently and stably prepared in large quantities.

Description

明 細 害 組換えヒ ト免疫不全ウィルス産生細胞株 技術分野
本発明は、 組み換えヒ ト免疫不全ウィルスベクター （以下、 H I Vベクター） 、 当該ベクターの製造方法、 並びに当該ベクターを安定的に保持する産生細胞に関 する。 背景技術
遺伝子工学の急速な発展により、 様々な分子生物学的手法の開発が行われてき た。 それに伴って、 遺伝子情報の解析および遺伝子の機能解明においては著しい 進歩がみられ、 そこから得られた成果を実際の治療現場に還元しょうとする試み が数多く行われている。 その中でも、 最も進歩の著しい分野の 1つとして遗伝子 治療分野があげられる。 種々の遺伝性疾患における原因遺伝子の発見、 解読が行 われる一方、 それらの遺伝子を物理的および化学的手法により細胞内に導入する 方法が開発され、 遗伝子治療は基礎的実験の段階から、 実際の臨床応用が行われ るまでに発展してきている。
遺伝子治療は、 遺伝子導入する細胞 （標的細胞） の種類により生殖細胞遺伝子 治療 （Ge rm l i n e C e l l Ge n e T h e r a p y ) と体細胞遗伝 子治療 （S oma t i c C e l l Ge n e T h e r a p y ) に分類されて いる。 また、 異常 （原因） 遺伝子をそのままにして、 新しい （正常） 遗伝子を付 け加える付カロ遺伝子療法 (Au gme n t a t i o n Ge n e T h e r a p y) と、 異常遗伝子を正常遺伝子で置き換える置換遺伝子療法 （Re p l a c e me n t Ge n e T h e r a p y ) に分類されているが、 現時点では倫理的 および技術的制約から、 体細胞に対する付加遺伝子治療のみが行われている。 さ らに、 遺伝子治療の方法としては、 まず患者から標的細胞を体外に取り出し、 目 的とする遺伝子を導入した後に再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植 による方法 （e x V i v o遗伝子治療） が現在行われているが、 将来的には遗 伝子を直接患者に投与する方法 （i n V i v o遗伝子治療） も検討されている < 以上のような遺伝子治療の臨床応用における大きな技術的課題の一つとして、 外来遗伝子を効率良く安定に檁的細胞へ導入する方法の開発がある。 1980年 代初期にはマイクロインジヱクシヨンなど物理的手法の応用が試みられたが、 こ の方法は、 遗伝子の導入効率が低く、 安定に導入することができず、 また、 当時 の大量細胞培養技術に限界があつたため等の理由により実用化にはつながらなかつ た。 その後、 外来遗伝子を効率良く標的細胞に導入するためのベクターとなる組 換えウィルス （ウィルスベクター） が開発され、 初めて遺伝子治療の臨床応用が 可能となった。
現在、 米国においては約 70件の遗伝子治療に関するプロ卜コールが承認され、 実際に 200人以上の患者が遺伝子治療を受けている。 これらのなかで遺伝子導 入法として最も多く用いられているものはマウス白血病ウィルス （MoMLV： Mo l ony Mu r i n e L e uk emi a V i r u s) ベクターである。
MoMLVはレトロウィルスの一種であり、 その表面に存在するエンベロープが 宿主細胞表面のレセプターと特異的に結合することにより宿主細胞に感染する。 組み換え MoMLVは、 このエンベロープの種類によって遺伝子導入できる細胞 種が異なり、 げっ歯類のみに感染する E c 0 t 0 r 0 p i cと、 げっ歯類とヒ ト の細胞の両方に感染する Amp h 0 t r 0 p i cなどに分類される。
組み換え MoMLVベクターを調製するためには先ず、 MoMLVゲノムにコ ードされる g a g、 p o l、 e n v遺伝子とこれらの遗伝子をドライブするため のプロモーターからなるヘルパープラスミ ドと、 薬物として作用する遗伝子の両 端に MoMLVの末端繰り返し配列 （LTR) が配置されたベクタープラスミ ド を構築する必要がある。 この場合、 野生型ウィルスの産生を防ぐ目的のために、 ウィルス粒子内に遺伝子をノ ッケージングするためのシグナル配列であるパッケ 一ジングシグナルをへルパープラスミ ドから除いておく。 一方、 ベクタープラス ミ ドにはパッケージングシグナルが含まれる。 また、 ウィルスベクターにより遗 伝子導入を受けた細胞のみを認識あるいは選別するためのレポーター遺伝子がベ クタ一プラスミ ドの遗伝子 K列中に挿入されることも多い。 これら 2種の遺伝子 を細胞にコ卜ランスフヱクションすると培養上清液中に組み換えウィルスベクタ 一が産出される。
近年、 MoMLVベクターの調製をより効率良く行うための手段として、 パッ ケージング細胞といわれる細胞株が樹立されている。 これらは、 MoMLVべク ターを調製する際のヘルパーブラスミ ドおよび Zまたはベクターブラスミ ドが細 胞のゲノム DN Aに安定的に組み込まれた細胞株である。 この細胞株を使用する と、
(1) ウィルスベクターを調製する際のトランスフヱクシヨンの煩雑さが解消で きる ；
(2) リン酸カルシウム法により代表されるトランスフヱクシヨンでは細胞への 遺伝子導入効率に限界があるのに対して、 高い力価のウィルスベクターを調製す るためには既に全ての細胞に遺伝子が導入されているパッケージング細胞を用 L、 るほうが有利である ；
(3) リン酸カルシウム法ではいくつかのロッ 卜に分けてトランスフヱクション を行った場合に各ロッ ト間の遺伝子導入効率にばらつきが生じるために一定の力 価のウィルスベクターを安定的に供給することができないのに対し、 パッケージ ング細胞を用いた調製法ではそのばらつきが少な L、；
(4) リン酸カルシウム法では、 大量のウィルスベクタ一を調製するためにそれ に見合う トランスフヱクション用のプラスミ ドを調製する必要があるのに対し、 パッケージング細胞を用いればその必要はない；
等の多くの利点があり、 現在は MoMLVベクターを調製するための方法として はこれらの細胞株を用いた方法が主流になっている。
また、 MoMLVベクターには宿主特異性がないという性質がある。 この性質 は種々の細胞が MoMLVベクターの標的細胞となり得ることを示しており、 本 ベクターは種々の疾患に対応して用いることができる。 しかしながら、 これらの ウィルスベクタ一の宿主特異性がないという本質的な性質は生体への投与を困難 にしている。
実際の所、 これらのウィルスベクターを治療に用いる場合には投与方法に工夫 が必要である。 例えば、 血球系の細胞に対して投与する場合は治療の対象となる 細胞を生体の外に取り出し、 遗伝子導入を行った後に再び生体に戻す方法 （ex V i vo遺伝子導入） が採られているが、 この方法には特殊な設備を必要とす るため治療を行うことができる施設が限られてしまうという問題などがある。 ま た、 臓器や組織に定着している細胞に対して投与する場合は治療の対象となる臓 器や組織に対して局所的に投与する方法が採られているが、 この方法には局所的 な投与を行うための手術を必要とするという問題などがある。
これらの問題点を解決するための手段として、 組織特異的ウィルスベクターが 開発された。 H I Vベクターは CD 4陽性細胞に対して特異的に遗伝子導入がで きる組織特異的ウィルスベクターの一種であり、 感染の際に H I Vのェンベロー ブ蛋白 gp 120が CD4陽性 Tリンパ球表面に存在する CD4蛋白に特異的に 結合する性質を利用したものである （S h i ma d a T. , e t a 1. , J . C l i n. I nv e s t. 88 1043 1991 ) 。 本ウィルスベクター を用いた遺伝子治療の対象となる疾患には、 CD 4陽性リ ンパ球が原因となって いる特に致死性が高く、 治療法が確立されていない後天性免疫不全症候群 （A I DS) や成人 T細胞性白血病等の疾患が含まれる。
後天性免疫不全症候群 （AIDS) はヒ ト免疫不全ウィルス （H IV) の CD 4陽性リ ンパ球への感染によって引き起こされ、 細胞性免疫が著しい障害を受け る結果、 種々の日和見感染、 リンパ腫、 神経障害等を発症する疾患である。 現在 用いられている H I V治療薬はヌクレオチド系逆転写酵素阻害薬といわれる薬剤 であり、 アジドチミ ジン （AZT) 、 シダノシン （d d I ) 、 ザルシタビン （d d C)等が単独あるいは組み合わせて使用されている。 しかし、 これらの薬剤に は既に感染した細胞を除去する作用はなく、 また、 強い骨髄抑制、 消化器症状等 の重篤な副作用や薬剤耐性ウィルスが出現する等の大きな問題があるため、 より 有効性が高く、 副作用が少なく、 耐性化が少ない新しいタイプの薬剤の開発が強 く望まれている。
—方、 成人 T細胞性白血病 （ATL) は U c h i y amaらにより提唱 （U c h i y ama T. , e t a 1. , B l ood, 50 481 -492 19 77) された疾患概念であり、 HTLV— Iが原因ウィルスとして考えられてい る （H i numa Y. , e t a 1. . P ro c. Na t l. Ac ad. S c i. USA 78 6476-6480 1981)が、 AT Lの発症機構、 A TL細胞の増殖機構については今なお明らかにされていない部分が多い。 今日、 急性リンパ性白血病に対しては化学療法、 放射線療法、 あるいは骨髓移植療法を 組み合わせることによりかなりの率で寛解、 治癒が期待できるようになつたが、 ATLに関してはこれらの方法を用いても十分な治療成績をあげるには至ってお らず、 新しい治療法の開発が急がれている。
近年、 これらの難治性疾患に対する遺伝子治療の基礎的検討がなされるように なってきている。 A IDSに対しては、 TARデコイ、 RREデコイなどの RN Aデコイによって H I V複製を強力に促進するといわれる T a tや Re Vの作用 を抑制する方法 （Su l l enge r B. A. , e t a 1. , Ce l l 63 601 1990)、 アンチセンスオリゴヌクレオチドで H I Vの mRN Aや DN Aとハイブリダィズさせる方法 （Cha t t e r j e e S. . e t a 1. , S c i enc e 258 1485 1992) 、 リボザィムによって H I Vの RNAを切断する方法 （S t e V e 1 o K. Μ. , e t a 1. , V i ro l ogy 190 176 1992) 、 あるいは、 トランス ドミナン トミユータントにより HI Vの複製に必須の蛋白の機能を抑制する方法 （Hop e T. J. , e t a l. , J. V i r o l. 66 1849 1992) 等の H I Vの複製メカニズムをうまく利用した治療システムが考えられている。 また、 ATLに対しては、 ヒト単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ遗伝 子を ATL細胞に組み込み発現させることで、 ガンシクロビルにより ATL細胞 のみを特異的に殺傷するシステムが検討されている （今田 和典、 内山 卓、 造 血因子、 5 4 501 -503 1994) 。
H I Vベクターは以上に述べたように組織特異的ウィルスベクターとして非常 に有用性が高いが、 その調製法に関してはいくつかの問題がある。 現在の所、 H IVベクターは使用時に、 ヘルパープラスミ ドとベクターブラスミ ドを COS細 胞にコ トランスフエクシヨンすることにより調製されている。 しかしながら前述 したように、 リン酸カルシウム法に代表されるトランスフヱクション法では、 (1)操作の煩雜さ、 （2)遗伝子導入効率の限界、 （3) ロッ ト間における遺 伝子導入効率のばらつき、 （4) プラスミ ドの大量調製の必要、 等の問題があり、 より効率良くかつ安定した譌製方法を確立する必要があつた。
H I Vベクターは、 組織特異的ウィルスベクターとして期待されているものの、 その調製方法には問題が多く、 現在は使用時にヘルパープラスミ ドとベクタープ ラスミ ドをコトランスフエクションすることにより調製されている。 しかしこの 方法では、 （1) トランスフエクシヨン効率が毎回一定でないためにベクターの 力価が変動して安定した供給ができない、 （2) トランスフ クシヨンの操作が 煩雑であるために大量のベクターを調製することができない、 （3)大量の HI Vベクターを調製する場合はそれに見合う大量のプラスミ ドベクターを調製する 必要がある、 等という大きな問題点が存在する。 MoMLVベクターにおいては、 既にへルパープラスミ ドとベクタープラスミ ドをゲノム DNAに安定的に組み込 んだパッケージング細胞株が確立されているが、 H I Vベクターにおけるパッケ 一ジング細胞株の確立は未だ達成されていない。 この理由の一つは、 MoMLV を保持するための細胞は、 例えばマウス 3 T 3細胞のようなマウス由来の細胞で あるのに対し、 H I Vベクターを保持するための細胞としては、 ヒト由来の細胞 を使用しなければならないことに起因するものと考えられている。 発明の開示
本発明は、 以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、 H I Vベクターを 大量にかつ安定して調製するための組換えヒト免疫不全ウイルス産生細胞を提供 することを目的としている。
本発明者は、 上述の課題を解決するために鋭窻研究を重ねた結果、 少なくとも ヒト免疫不全ウィルスゲノムにコードされている g a g、 po l、 env遺伝子 の配列を含み、 パッケージングシグナル配列を欠損しているある種の組換えヒ ト 免疫不全ウィルスへルパープラスミ ドを動物細胞に導入するとそれが安定的に保 持されていることを見い出すことによって本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 少なくともヒ ト免疫不全ウィルスゲノムにコ一ドされている gag, po l、 e n v遺伝子の配列を含み、 パッケージングシグナルが欠損し ている組換えヒト免疫不全ウィルスヘルパーブラスミ ドを動物細胞に導入して得 られる、 安定的に該遗伝子が細胞に保持された組換えヒト免疫不全ウィルス産生 細胞を提供する。
本発明はさらに、 少なくともヒ ト免疫不全ウィルスゲノムにコードされている g a , p o l、 e n v遗伝子の配列を含み、 これらの遺伝子配列の上流にプロ モーターが配置されていることを特徴とする、 上記の組換えヒ ト免疫不全ウィル ス産生細胞を樹立するための組換えヒ ト免疫不全ウィルスヘルパーブラスミ ドを 提供する。
本発明の一つの態様によれば、 本発明は、 上記の組換えヒ ト免疫不全ウィルス ヘルパーブラスミ ドが、 少なくともヒ ト免疫不全ウィルスゲノムにコードされて いる g a g、 p o 1遗伝子の配列を含みこれらの遺伝子配列の上流にプロモータ 一が配置されたブラスミ ドと、 少なくともヒト免疫不全ウィルスゲノムにコード されている e n v遗伝子を含みこれらの遺伝子配列の上流にプロモーターが配置 されたプラスミ ドから成ることを特徴とする組換えヒト免疫不全ウィルスへルバ 一ブラスミ ドを提供する。
本発明のもう一つの態様によれば、 本発明は、 上記の組換えヒ ト免疫不全ウイ ルスへルパープラスミ ドが、 少なくともヒト免疫不全ウィルスゲノムにコードさ れている g a g遺伝子の配列を含みこれらの遺伝子配列の上流にプロモーターが 配置されたプラスミ ド、 少なくともヒト免疫不全ウィルスゲノムにコードされて いる P 0 1遺伝子を含みこれらの遗伝子配列の上流にプロモーターが配置された プラスミ ド、 並びに、 少なくともヒ ト免疫不全ウィルスゲノムにコードされてい る e n v遺伝子の配列を含みこれらの遗伝子配列の上流にプロモーターが配置さ れたプラスミ ドから成ることを特徴とするヒト免疫不全ウィルスヘルパーブラス ミ ドを提供する。
また、 本発明は、 該プラスミ ドベクターを用いたパッケージング細胞の樹立方 法、 および該パッケージング細胞による組み換え H I Vベクターの製造方法をも 提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヘルパープラスミ ド C G P E (—） の構造を示す図である。
図 2は、 ベクタープラスミ ド H X Nの構造を示す図である。 図 3は、 ネオマイシン耐性細胞株と陰性対照株の各々の培養上清液に含まれる P 2 4蛋白の E L I S Aによる定量 （一次スクリーニング） の結果を示す図であ る。
図 4は、 二次スクリーニングの結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の構成および好ましい態様について詳しく説明する。
本発明のパッケージング細胞は、 以下のようにして調製することができる。 図
1に示されるヘルパープラスミ ド、 すなわち、 野生型 H I Vゲノム配列の g a g、 p o 1、 e n v遺伝子の上流にこれらの遺伝子をドライブするプロモーター配列 であるサイ トメガロウィルス由来のプロモーターが配置され、 さらにこれらの下 流にレポーター遗伝子としてネオマイシン耐性遺伝子とヒ 卜単純へルぺスウィル ス由来チミジンキナーゼのプロモーターを配置した遺伝子群を発現ベクターに組 み込んだプラスミ ド、 を公知の方法により構築する。
このヘルパープラスミ ドに含まれる g a g、 p o l、 e n v遺伝子をドライブ するためのプロモーターは特に限定されることはなく、 例えば B 1 9由来のプロ モーター、 ヒ ト単純へルぺスウィルス由来チミジンキナーゼのプロモーター等が 使用できる。 また、 レポーター遗伝子はネオマイシン耐性遗伝子の他、 ハイグロ マイシン耐性遺伝子等、 用途や目的に合わせて用いることができ、 特に限定され ることはない。
これまで図 1に示されるヘルパープラスミ ドを用いることで野生型 H I Vが出 現したという報告はないが、 さらに安全性を高める意味で g a g、 p o l、 e n v遺伝子を 2つあるいは 3つのプラスミ ドとしてそれぞれ再構築し、 これらをコ トランスフヱクシヨンすることでパッケージング細胞株を樹立することも可能で ある。
次いでこのようにして構築したヘルパープラスミ ドを細胞にトランスフヱクショ ンする。 細胞は C O S細胞、 H e L a細胞等の癌細胞、 ^1 9ゃ〇5 等のリンパ 球系の細胞等何でも良い。 また、 このときのトランスフエクシヨン法はどのよう な方法でもよく、 例えば、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法など当業者 に既知の方法で行うことができる。 トランスフ Xクションされた細胞を数日間培 養した後、 細胞を培養皿から剥離し、 新しい培養皿に再播種する。 数時間後、 ネ ォマイシン類縁物質である G 4 1 8を適量培養液に添加して、 外来性遺伝子によ り形質転換された細胞のみを選択する。 このとき、 レポーター遗伝子としてハイ グロマイシン耐性遺伝子がヘルパーブラスミ ドの配列中に含まれる場合は、 ハイ グロマイシンを適量培地に添加する。 7日から 1 0日間 C 02インキュベーター 内で培養した後、 得られたコロニーを一つずつ拾い、 各々新しい培養皿に再播種 する。 さらに 7曰から 1 0日間培養し、 培養上清を以降のスクリーニングのため に保存する。
H I Vベクターを生産するためのパッケージング細胞は以下のように選択され る。
前述した培養上清の一部をサンプルとして p 2 4蛋白および Zまたは g p 1 2 0蛋白の発現性を E L I S A法で定量して一次スクリーニングを行う。 定量法は 他の公知の方法、 例えば、 蛍光坑体を用いた F A C S (fluorescein activated cell sorting) による解析法、 あるいはサザンブロッテイング法やノーザンブロッ ティング法等の遺伝子解析法等でも良い。 これらの定量法により各蛋白の発現性 が高いクローンを保存する。
—次スクリーニングにより得られたクローンを用いて組換え H I Vベクターを 調製し、 その力価を検定することで二次スクリーニングを行う。 各クローンに対 してベクタープラスミ ド、 すなわち、 野生型 H I Vゲノム配列の g a g、 p o e n v遺伝子を欠失させ、 この領域にレポーター遺伝子となりうる遺伝子配列を 挿入しこれらの遗伝子群を発現ベクターに組み込んだプラスミ ド、 を公知の方法 により トランスフエクシヨンする。 挿入されるレポーター遺伝子は、 ネオマイシ ン耐性遗伝子やハイグロマイシン耐性遗伝子等の薬物耐性遗伝子、 あるいは C D 4蛋白等の細胞表面抗原をコードする遺伝子など特には限定されない。 2日間培 養し、 培養上清を C D 4陽性細胞に対して作用させ （トランスダクシヨン） 、 さ らに 2日間培養する。 細胞を培養皿から剥離し、 新しい培養皿に再播種する。 こ のとき、 レポーター遗伝子として薬物耐性遗伝子を用いた場合には、 培養液中に 対応する薬物を添加する。 数日間培養し、 レポーター遺伝子の発現性を、 上記し たような公知の方法により蛋白レベルであるいは遺伝子レベルで解析する。 薬物 耐性を利用した選択法の場合には、 トランスダクションを受けた細胞がコロニー として観察されるので、 これらの数を数えることにより網製された組換え H I V ベクターの力価が決定できる。 各クローンから得られた組み換え H I Vベクター の力価を比較し、 力価の最も高いクローンをパッケージング細胞として保存する。 このようにして得られたクローンは、 組み換え H I Vベクター製造のために利 用できる。 任意のベクタープラスミ ドを該パッケージング細胞に対して公知の方 法により トランスフヱクシヨンすることにより任意の組み換え H I Vベクターを 調製することができる。 例えば、 マーキング等の基礎実験のために使用される組 み換え H I Vベクター、 薬物遗伝子を細胞に導入するための遺伝子治療用の組み 換え H I Vベクター等を調製するために使用される。 また、 該パッケージング細 胞株に対してレポーター遗伝子を配列中に含むヘルパーブラスミ ドをトランスフユ クションあるいはヘルパーブラスミ ドとレポーター遗伝子をコトランスフヱクショ ンした後レポーター遺伝子に対応する選択法で選択を行うことで、 ベクターブラ スミ ドをも細胞内に安定的に保持した新規のパッケージング細胞株を樹立するこ ともできる。 このパッケージング細胞を用いれば、 組み換え H I Vベクターを調 製する際にトランスフエクシヨンを行う必要がない。
上述のパッケージング細胞の具体例としては、 H C N— 3 4 8として日本国茨 城県つくば市東 1丁目 1番 3号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、 ブタぺ スト条約のもとで受託番号 F E RM B P— 5 4 6 7 (国内寄託の受託番号は F E RM P— 1 4 8 3 4 ) として、 1 9 9 5年 3月 1 5日付の国内寄託から、 1 9 9 6年 3月 1 1日付で国際寄託に移管されているものが挙げられる。
以下、 実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。 実施例 1 (プラスミ ドの構築）
すべてのブラスミ ドの構築に関する操作は一般的な遺伝子組み換え操作法を用 いて行った。 ヘルパープラスミ ド C G P E (—） は図 1に示すように、 野生型 H I Vゲノム配列の g a g、 p o e n v遺伝子の上流にこれらの遺伝子をドラ イブするためのプロモーター配列であるサイ トメガロウィルス由来のプロモータ 一 （CMN) を配置し、 さらに上記の遺伝子の下流にレポーター遺伝子としてネ ォマイシン耐性遗伝子 （n e 0) とヒト単純へルぺスウィルス由来チミジンキナ ーゼのプロモーター （TK) を配置した遺伝子群を、 アンピシリン耐性遺伝子 (amp) および S V40の複製開始点 （SV40 o r i ) を含む発現ベクター に組み込むことにより構築したものである。
ベクタ一プラスミ ド HXN (図 2) は、 野生型 H I Vゲノム配列中の g a g、 p o l、 e n v遺伝子を欠失させ、 この領域にレポーター遺伝子としてネオマイ シン耐性遗伝子 （n e o) とその上流にこれをドライブするためのプロモーター としてヒ ト単純へルぺスウィルス由来チミジンキナーゼ （TK) を挿入し、 これ らの遺伝子群をアンピシリン耐性遺伝子 （amp) および S V40の複製開始点 (S V400 r i ) を含む発現ベクターに組み込むことにより構築したものであ る。 実施例 2 (ヘルパープラスミ ドの H e L a細胞へのトランスフヱクシヨンと薬剤 によるトランスフヱクタン卜の選択）
トランスフヱクションは通常のリン酸カルシウム法で行った。 実施例 1によつ て得た CGPE (—） 10/ gに滅菌精製水および塩化カルシウム溶液を添加し て全量を 0. 5m 1にした。 この混合液を 0. 5m lの HB S P緩衝液中に振と うしながら滴下し、 30分間室温で放置してプラスミ ドーリン酸カルシウム共沈 物を得た。 9 c mの培養皿で約 50%コンフルェン卜の状態に培養された H e L a細胞の培養液中に上記共沈物を添加して C 02インキュベーター内で 4時間ィ ンキュベートした後、 新鮮な培養液に置換してさらに 2日間ィンキュベートした c 次に、 細胞中に上記の外来性 DNAが安定的に保持されたトランスフ クタント のみを選択するために、 培養液中にネオマイシンの類縁物質である G 418を最 終濃度が 1000 μ gZm 1になるように添加し 10日間ィンキュベーションを 続けた。 生き残った細胞集団 （コロニー） を一つずつ分離し、 1000 g/m 】の濃度の G 418を含む新鮮な培養液中でさらにィンキュベーシヨンを続ける ことによってネオマイシン耐性細胞株を得た。 実施例 3 (—次スクリーニング： p 24蛋白の EL I S A法による定量） 実施例 2で得られたネオマイシン耐性細胞株を 3.5 cmの培養皿に播種し、 2日間培養した。 各細胞株の培養上清液を分取し、 上清液に含まれる p 24蛋白 の濃度を EL I S A法により定量した。 陰性対照群として、 実施例 1および実施 例 2に示した操作を行わなかった He L a細胞の培養上清についても定量を行つ た。 結果を図 3に示す。 このスクリーニングにより p 24が陽性であった細胞株 を保存した。 実施例 4 (二次スクリーニング：組み換え H I Vベクターの調製および力価の検 定）
実施例 3の一次スクリ一二ングにより選択された細胞株を 9 cmの培養皿に播 種し、 50%コンフレントになるまで培養した。 各細胞株に対して、 図 2に示し たベクターブラスミ ド HXN 10 gをリン酸カルシウム法により トランスフエ クシヨンした。 2日間培養した後、 培養上清を遠心管に移し、 2000 r pmで 10分間遠心した。 得られた上清液 3m 1を分取し、 新鮮な培養液 3m 1と混合 して、 50%コンフレントの状態に培養された CD 4陽性 H e L a細胞に作用さ せた。 陰性対照群として実施例 1および実施例 2の操作を行わなかった H e L a 細胞に対して同様の操作を行った。 2日間培養し、 トリプシン一 EDTA混合液 により細胞を剥離した後、 1000 g/m 1の G418を含む新鮮な培養液に 懸濁し、 9 cmの培養皿に再播種した。 10日間培養後、 得られたコロニーをク リスタルバイオレツ 卜で染色した （図 4)。 陰性対照群ではコロニーが認められ なかったのに対し、 実施例 3で得られた細胞株ではコロニーが認められたことか ら、 本細胞株は組み換え H I Vベクターを調製するためのパッケージング細胞と して機能することが証明された。 産業上の利用の可能性
本発明のヒ ト免疫不全ウィルス産生細胞により、 H I Vベクターをより効率良 く大量に安定して調製することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 少なくともヒ ト免疫不全ウィルスゲノムにコードされている g a g、 p
0 1、 e n v遺伝子の配列を含み、 パッケージングシグナルが欠損している組換 ぇヒ ト免疫不全ウィルスヘルパーブラスミ ドを動物細胞に導入して得られる、 安 定的に該遺伝子が細胞に保持された組換えヒト免疫不全ウィルス産生細胞。
2. 少なくともヒ ト免疫不全ウィルスゲノムにコードされている g a g、 p o l、 e n v遺伝子の配列を含み、 これらの遗伝子配列の上流にプロモーターが 配置されていることを特徴とする、 請求項 1に記載の組換えヒト免疫不全ウィル ス産生細胞を榭立するための組換えヒト免疫不全ウィルスへルパープラスミ ド。
3. 組換えヒ ト免疫不全ウィルスへルパープラスミ ドが、 少なくともヒト免 疫不全ウィルスゲノムにコードされている g a g、 p o 1遗伝子の配列を含みこ れらの遺伝子配列の上流にプロモーターが E置されたプラスミ ドと、 少なくとも ヒト免疫不全ウィルスゲノムにコードされている e n v遗伝子を含みこれらの遗 伝子配列の上流にプロモーターが配置されたプラスミ ドから成ることを特徴とす る請求項 2に記載の組換えヒト免疫不全ウィルスへルパープラスミ ド。
4. 組換えヒ ト免疫不全ウィルスへルパープラスミ ドが、 少なくともヒ ト免 疫不全ウィルスゲノムにコ一ドされている g a g遺伝子の配列を含みこれらの遗 伝子配列の上流にプロモーターが配置されたプラスミ ドと、 少なくともヒ ト免疫 不全ウィルスゲノムにコ一ドされている p 0 1遗伝子を含みこれらの遗伝子配列 の上流にプロモーターが配置されたプラスミ ドと、 並びに、 少なくともヒ ト免疫 不全ウィルスゲノムにコ一ドされている e n v遗伝子の配列を含みこれらの遗伝 子配列の上流にプロモーターが記置されたプラスミ ドから成ることを特徴とする 請求項 2に記載の組換えヒト免疫不全ウィルスヘルパーブラスミ ド。
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