WO1996026960A1 - Facteur de croissance de fibroblaste de base de poisson, adn et son utilisation - Google Patents

Facteur de croissance de fibroblaste de base de poisson, adn et son utilisation Download PDF

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WO1996026960A1
WO1996026960A1 PCT/JP1996/000436 JP9600436W WO9626960A1 WO 1996026960 A1 WO1996026960 A1 WO 1996026960A1 JP 9600436 W JP9600436 W JP 9600436W WO 9626960 A1 WO9626960 A1 WO 9626960A1
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fish
bfgf
protein
dna
growth factor
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PCT/JP1996/000436
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Inventor
Junichiro Hata
Chisako Segawa
Shinya Yamashita
Original Assignee
Nippon Suisan Kaisha, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention includes a fish basic fibroblast growth factor (hereinafter sometimes abbreviated as “bFGF”) protein, a DNA having a base sequence encoding the protein, and the DNA.
  • bFGF fish basic fibroblast growth factor
  • the present invention relates to a vector, a transformant carrying the vector, a method for producing fish bFGF by culturing the transformant, and a use of fish bFGF.
  • b FGF was initially found as a factor that has a strong growth-promoting effect on fibroblasts, such as BALB / c 3 T 3 cells, from the pituitary gland of mammals [D. Gospodarowicz, nature , 249, 123 (1 979)]. Subsequently, it was found to have a growth stimulating effect on most mesodermal lineage-derived cells and an angiogenic effect. Since bFGF has such an effect, it is expected to be used as a prophylactic agent such as an angiogenesis promoter or a wound healing agent.
  • fibroblasts such as BALB / c 3 T 3 cells
  • the problem to be solved by the present invention is to clone the bFGF b gene of fish, and to prove the existence of bFGF in fish.
  • Fish b F G F having a biological activity such as a cell proliferation promoting effect is expected to be used as a healing promoter for fish wounds generated during breeding and transportation.
  • Fish, especially farmed fish are susceptible to skin damage because they are confined to a small environment.
  • due to underwater life there are countless bacterial and microbial organisms in the surrounding area, and once a wound is made, it easily progresses to infection.
  • the occurrence of scars is a major problem.
  • the number of cases of transporting fish has increased due to improvements in the transport technology for live fish, etc., but the damage associated with transport has become a problem.
  • the use of bFGF derived from fish is more effective than the previously reported bFGF of humans, etc., when the species specificity of bFGF is considered.
  • An object of the present invention is to provide rainbow trout basic fibroblast growth factor, DNA and uses thereof.
  • the present invention relates to an expression vector containing a cloned rainbow trout basic fibroblast growth factor, a DNA having a nucleotide sequence encoding the protein, a recombinant DNA having the nucleotide sequence, and a recombinant DNA.
  • the object of the present invention is to provide a transformant transformed by an expression vector, a method for producing the protein, a therapeutic agent for wounds of fish containing the protein as an active ingredient, and a method for rearing and transporting fish in the presence of the protein.
  • the mammalian bFGF protein is encoded using a cDNA library prepared from the pituitary gland of fish, rainbow trout. CDNA having high homology to the nucleotide sequence was cloned. Furthermore, they have found that the obtained protein encoded by cDNA has a growth-promoting effect on fish cells, and as a result of further research based on these findings, they have completed the present invention.
  • the present invention relates to (1) a fish basic fibroblast growth factor (bFGF) protein, (2) a DNA having a nucleotide sequence encoding the protein of the above (1), and (3) a DNA of the above (1). And (4) an expression vector containing the recombinant DNA of (3) above, and (5) a transformation transformed by the expression vector of (4) above. (6) a method for producing the protein of (1), wherein the transformant of (5) is cultured in a medium, and (7) treatment of a fish wound comprising the protein of (1) as an active ingredient. (8) A method of breeding or transporting fish in the presence of the protein of (1) above.
  • bFGF fish basic fibroblast growth factor
  • rainbow trout bFGF which has been successfully cloned for the first time in fish.
  • fish growth hormones have been cloned and analyzed from more than 10 species of fish, including salmon, rainbow trout, pu-ri, perch, eel, and flounder. Have.
  • the rainbow trout bFGF gene cloned this time is also very good in other fishes. It is thought that the bFGF gene of other fishes can be easily cloned using the information of the rainbow trout bFGF gene.
  • the cDNA sequence of FGF has been determined in humans, pests, African frogs and the like.
  • a PCR primer for cloning bFGF from rainbow trout was created mainly around the region of high homology.
  • CDNA was synthesized from rainbow trout pituitary gland mRNA, and PCR was performed with mixed primers to obtain a band of the desired size. This band was incorporated into pSK vector and the nucleotide sequence was determined. As a result, the fragment showed high homology with human bFGF. Therefore, this fragment was estimated to be rainbow trout bFGF.
  • CDNA was prepared again from mRNA of the pituitary gland pituitary gland, and PCR was performed using the above-mentioned Braima-EF1 / EF2. As a result, the desired 470 bp fragment was amplified. This fragment was inserted into the EcoRI site of the pSK vector, and the nucleotide sequence was determined. The nucleotide sequence was completely identical to the amino acid coding region in Table 1. The obtained plasmid was designated as pSK-FGF-W.
  • a method for producing a fish bFGF protein which comprises culturing a transformant in a medium.
  • the transformant retaining pKK-FGF-W was cultured in L-br0thh at 37 with 0D660 to about 0.6, induced by IPTG, and further cultured for 3 hours. After centrifugation, the culture is suspended in buffer A (10 mM Tris—HCL pH 7.5, ImM EDTA, ImM DTT), and T was added to a final concentration of 0.1%. Add riton X-100 and let stand on ice for 10 minutes. Next, the cells are disrupted by ultrasonication, and the supernatant obtained by centrifugation is applied to heparin sepharose CL-6B which has been equilibrated with buffer 1A in advance. After washing with buffer A containing 0.5 M NaCl, elute with buffer A containing 2.0 M NaCl.
  • bFGF is a factor that promotes fibroblast proliferation.
  • the cell growth factor activity of rainbow trout bFGF produced using E. coli was examined in BALB 3/3 mouse-derived fibroblasts and RBCF-1 fin-derived fibroblasts from goldfish, and both cells were proliferated by rainbow trout bFGF.
  • the target of wound healing is ornamental fish such as cultured fish, parent fish for cultured seedlings, carp, goldfish, and tropical fish.
  • bFGF When used as a therapeutic agent, bFGF can be used at a concentration of from 0.01 ng / ml to LOOng / ml.
  • bFGF is known to be stabilized by combined use with heparin and to be effective at low concentrations. This effect can be used when applied to fish that can be used as it is when dissolved in water.
  • the activity of recombinant fish bFGF is enhanced by co-presence of heparin.
  • the recombinant fish bFGF exerts its effects effectively in smaller amounts due to the presence of heparin.
  • FIG. 1 is a drawing showing a comparison between the bFGF sequence of a human / African toad frog and the sequence of rainbow trout bFGF.
  • FIG. 2 is a photograph of electrophoresis showing that bFGF is expressed by induction of IPTG.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing the growth promoting effect of rainbow trout bFGF on a cultured cell line.
  • FIG. 4 is a drawing showing a process of excision of the caudal fin of red sea bream to examine the effect of bF G F on regeneration, and a photograph of the morphology of the organism showing the caudal fin of red sea bream.
  • Fig. 5 is a photograph of the morphology of the creature showing the regeneration of the caudal fin of red sea bream in the control plot.
  • FIG. 6 is a photograph of the morphology of an organism showing the effect of bFGF on the regeneration of the caudal fin of red sea bream.
  • FIG. 7 is a drawing showing the intensity of bFGF activity by heparin.
  • Example 1 Example 1
  • RNA was extracted from about 500 mg of rainbow trout pituitary gland according to a conventional method. About 20 g of poly RNA was purified from the obtained total RNA using an oligotex column (Takara Shuzo).
  • a synthetic mix primer (F1 / F2) for a region of high homology to the previously reported human and African frog bFGF gene was prepared [F1; TA (T / C) TG].
  • cDNA (Stratagene, First Strand Synthesis Kit) synthesized from pituitary gland mRNA as type I was subjected to PCR under the following conditions. 94. The cycle of 30 seconds at C, 45 seconds at 45 ° C, and 72 ⁇ 120 seconds was repeated 30 times. The composition of the reaction solution was in accordance with the method of Behringer, Inc. As a result of the PCR, a band considered to be of a desired size was detected. As a result of integrating this band into the pSK vector and determining the nucleotide sequence, high homology was observed with human bFGF, and thus the inserted fragment was presumed to be digima trout bFGF.
  • FIG. 1 shows the result of comparison between the bFGF sequence of human / African clawed frog and the sequence of rainbow trout bFGF.
  • the homology between human and African frogs was about 85%, whereas the bFGF of rainbow trout and human or African frogs was only about 75% homologous.
  • CDNA was prepared again from mRNA of the rainbow trout pituitary gland, and PCR was performed using the above-mentioned primers EF1 / EF2. As a result, the desired 470 bp fragment was amplified. This fragment was inserted into the EcoRI site of the pSK vector and the nucleotide sequence was determined. The nucleotide sequence was completely consistent with the amino acid coding region in Sequence Listing 1.
  • the resulting plasmid was named pSK-FGF-W.
  • the E. coli strain carrying this recombinant plasmid was named NS-101 (Escherichia coli NS-101).
  • the EscoRI fragment of pSK-FGF-W was inserted into an expression vector pKK222-2 (manufactured by Pharmacia) in order to express bFGF in large amounts in E. coli.
  • the orientation of the obtained recombinant was confirmed, and PKK-FGGF-W was obtained.
  • the transformant retaining pKK-FGF-W was cultured in L-broth at 37 ° C until OD660 reached about 0.6, induction with IPTG was performed, and the culture was further continued for 3 hours.
  • the bFGF fragment was incorporated into the E. coli expression vector pKK233-2 to prepare a producing bacterium. It can be seen that bFGF is expressed by induction of IPTG (Fig. 2).
  • bFGF has a very high affinity for heparin like aFGF (acid fibroblast growth factor).
  • aFGF acid fibroblast growth factor
  • the MTT method was used for evaluating the activity of promoting cell proliferation.
  • RBCF1 cells a fish-derived fibroblast cell line, were isolated and recovered by trypsinization, and then were added to a serum-free medium (1 mg of BSA, 0.1 lm in a 1: 1 mixed medium of DME and F-12).
  • 4 x 10 3 cells were rolled in per well of a 96-well multiplate. The medium volume was 100 liters per well, and each concentration of bFGF was added.
  • FIGS. 5 and 6 The results of the fin regeneration rate in each test plot are shown in FIGS. 5 and 6.
  • the regeneration rate of the bFGF treated group 2 days after the immersion treatment tended to be higher than that of the control group.
  • Regeneration of the resected fins of the control fish proceeds from the vertical and horizontal intersection of the resected fins (Fig. 5).
  • regeneration of bFGF-treated plots is progressing not only at the intersection but also over a wide area (Fig. 6). This means that bFGF is effectively acting on red sea bream, closing the wound of the fin early, shortening the contact time between the wound and the external environment, and preventing the invasion and infection of the pathogen from the wound. It indicates that there is.
  • Example 3 Example 3
  • RBCF1 cells a fish-derived fibroblast cell line
  • a serum-free medium (1 mg / liter BSA in a 1: 1 mixed medium of DME and F-12).
  • resuspended ⁇ Four hundred and three cells were rolled in per well of the coated 96-well multiplate.
  • the medium volume was 100 liters per well, and each concentration of bFGF was added together with heparin.
  • 5 g Z-liter of MTT solution was added at 10 ⁇ liters per well, and the reaction was carried out at 37 for 4 hours, and the resulting formazan was added to 0.04 NHC 1
  • the absorbance at a wavelength of 570 nm was measured at a reference wavelength of 655 nm.
  • Recombinant fish b FGF reduced the active concentration by more than an order of magnitude in the presence of heparin. This indicates that the presence of heparin allows the recombinant fish bFGF to exert its effect in smaller amounts.
  • Effect of bFGF on rainbow trout burn healing 5 On a rainbow trout body with a length of about 8 cm, burn instantaneously with a soldering iron with a flat tip and a diameter of 3 mm. As a result, the epidermis of the body is peeled off, and a damaged area with a diameter of 4 mm is formed.
  • This wound-treated rainbow trout was divided into two groups, one group was added at a concentration of bFGFlOnggZml in a two-liter aquarium, and the other group was added in a two-liter aliquot-free tank. For 30 minutes each. After that, each group was transferred and raised in a 20 liter aquarium.
  • Wound treatment On the 1st and 2nd days, the injured site was photographed at the same magnification, and the area of the injured site for each individual was image-analyzed. Table 1 shows the results. From these results, it was shown that bFGF had an effect of promoting the healing of the damaged site by a simple method when added to breeding water. Healing promotion effect of b FGF on the 1st and 2nd days
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism g: rainbow trout (Oncorunynchus mykiss)
  • GAG CCC AAG AGG TTG TAC TGT AAA AAT GGA GGC TAC TTC TTG AGG ATA 566

Landscapes

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Description

明 现 曞
魚類塩基性繊維芜现胞増殖囟子、 D NAおよびその甚途
技術分野
本発明は、 魚類の塩基性繊維芜现胞増殖因子 以䞋、 「b F G F」 ず 略称するこずもある。  蛋癜質、 該蛋癜質をコヌ ドする塩基配列を有す る D NA、 該 D NAを含むベクタヌ、 該ベクタヌを保持する圢質転換䜓 、 該圢質転換䜓を培逊するこずによる魚類 b F G Fの補造法、 および魚 類 b F G Fの甚途に関する。
背景技術
b F G Fは、 圓初哺乳類であるゥシの䞋垂䜓から B A L B/c 3 T 3 现胞などの繊維芜现胞に察しお匷い増殖促進䜜甚を瀺す因子ずしお芋い た *された [D. G o s p o d a r o w i c z , n a t u r e , 249 1 23 ( 1 979 ) ] 。 その埌殆どの䞭胚葉系由来现胞に察しお増殖刺 激䜜甚を有するず同時に血管新生䜜甚を有するこずが刀明した。 b F G Fがこうした䜜甚を有するこずから、 血管新生促進剀や創傷治癒剀など の予防薬ずしおの甚途が期埅されおいる。
—方、 ゥシ b F G Fをコヌ ドする遺䌝子は J . A. A b r a h a mら によっおクロヌニングされおおり [S c i e n c e , 233, 545 ( 1 986 ) ] 、この他に哺乳類ではヒ 卜、ラッ ト、マりスの遺䌝子がク口 —ニングされおいる。 たた、 䞡生類では力゚ルの b F G Fをコ䞀 ドする 遣䌝子が D. K i m e l m a nらによっおクロヌニングされおいる [ S c i e n c e , 242, 1 053 (1 988) ] 。 組換え D N A技術を 甚いおクロヌン化されたヒ ト b F G F遗䌝子を埮生物や動物现胞で発珟 させ、 b F G Fを倧量生産する方法も開発されおいる [ F E B S L e t t e r s , 2 1 3 , 1 89 ( 1 98 7 ) , ペヌロッパ特蚱出願公 開第 237, 9 66号公報参照] 。 発明の開瀺
哺乳類および䞡生類の b F G Fの遗䌝子は既にクロヌニングされおい るにもかかわらず、 魚類の b F G F遺䌝子はいただにクロヌニングされ おいない。 本発明が解決すべきこずは魚類の b F G F遗䌝子をクロヌニ ングするこずにあり、 魚類における b F G Fの存圚を蚌明するこずにあ る。
现胞増殖促進䜜甚などの生物孊的掻性を有する魚類 b F G Fは、 飌育 䞭および茞送時に生ずる魚䜓の創傷に察する治癒促進剀などの利甚が期 埅される。 魚類、 特に逊殖魚は、 狭い環境に閉じ蟌められおいるため皮 膚に傷が生じやすい。 たた、 氎䞭生掻のため、 呚蟺には無数の现菌ゃ埮 生物が存圚し、 䞀床できた傷から容易に感染症ぞず進行する。 すなわち 、 逊殖魚業では、 傷の発生が倧きな問題ずなっおいる。 特に、 近幎、 掻 魚等の茞送技術の向䞊により、 魚を運搬するケヌスが増えおいるが、 茪 送に䌎う傷が問題ずなる。 これらの創傷に察し、 既に報告されおいるヒ ト等の b F G Fを甚いるよりも魚類由来の b F G Fを甚いる方が b F G Fの皮特異性を考えた堎合、 有効に働く ず考えられる。
たた、 組換え D N A技術による魚類 b F G Fの倧量生産法の確立は、 治療薬、 詊薬などずしおの䜿甚の際に重芁な課題ずなる。
本発明はニゞマス塩基性繊維芜现胞増殖因子、 D N Aおよびその甚途 の提䟛を目的ずする。 詳现には本発明はクロヌニングされたニゞマス塩 基性繊維芜现胞増殖因子、 その蛋癜質をコヌ ドする塩基配列を有する D NA、 その塩基配列を有する組換え DNA、 組換え D NAを含む発珟べ クタ䞀、 発珟ベクタヌにより圢質転換された圢質転換䜓、 䞊蚘蛋癜質の 補造方法、 䞊蚘蛋癜質を有効成分ずする魚類創傷治療薬および䞊蚘蛋癜 質の存圚䞋で魚類を飌育 ·運搬する方法の提䟛を目的ずする。
魚類においおは b F G Fは芋いだされおいない。 そこで、 既にクロヌ ニングされおいる哺乳類の b F G F蛋癜質をコヌ ドする塩基配列をもず に、 魚類であるニゞマスの䞋垂䜓より調敎した c D NAラむブラリ䞀よ り哺乳類の b F G F蛋癜質をコヌ ドする塩基配列ず盞同性の高い c D N Aをクロヌニングした。 さらに、 この取埗した c D N Aがコヌ ドする蛋 癜質が魚類现胞に察しお増殖促進䜜甚を有するこずを芋いだし、 これら の知芋をもずにさらに研究した結果、 本発明を完成するに至った。
本発明は、 1 )魚類の塩基性繊維芜现胞増殖因子 b F G F) 蛋癜質 、 2 )䞊蚘1 )の蛋癜質をコ— ドする塩基配列を有する DN A、 3 )侊 蚘1 )の蛋癜質をコヌドする塩基配列を有する組換え DNA、 4)䞊蚘 (3 )の組換え DN Aを含む発珟ベクタヌ、 5 )䞊蚘4)の発珟べクタ䞀 により圢質転換された圢質転換䜓、 6)䞊蚘5 )の圢質転換䜓を培地に 培逊するこずを特城ずする䞊蚘1 )の蛋癜質の補造方法、 7)䞊蚘1 ) の蛋癜質を有効成分ずする魚類創傷治療薬、 8)䞊蚘1 )の蛋癜質の存 圚䞋で魚類を飌育あるいは運搬する方法である。
以䞋、 本発明を説明する。
(1 )魚類の b F G F蛋癜質
本発明が具䜓的にクロヌニングしたものは二ゞマスの b F G Fであり 、 これが魚類においお初めおクロヌニングに成功したものである。 たず えば、 魚類の成長ホルモンに぀いおは珟圚、 サケ、 ニゞマス、 プリ、 ゥ ナギ、 ヒラメ等 1 0皮以䞊の魚皮から遗䌝子がクロヌニングされ、 解析 されおいるが、 それぞれ非垞に高い盞同性を有しおいる。 同様に今回ク ロヌニングしたニゞマスの b F G F遺䌝子も他の魚類においお非垞に良 く保存されおいるず考えられ、 ニゞマス b F G F遗䌝子の情報を甚いれ ば容易に他魚類の b F G F遗䌝子をクロヌニングするこずができる。 b F G Fは、 ヒ ト、 ゥシ、 アフ リカッメガ゚ル等でその c D N Aの配列が 決定されおいる。 これらの配列間には非垞に高い盞同性が認められおい るため、 ニゞマスから b F G Fをクロヌニングするための P C Rプラむ マヌを盞同性の高い領域を䞭心ず しお䜜成した。 ニゞマス脳䞋垂䜓の m RNAから c DNAを合成し、 ミ ッ クスプラむマヌで P C Rを行ったず ころ目的の倧きさのバン ドを埗た。 このバン ドを p S Kべクタヌに組み 蟌み塩基配列を決定した結果、 ヒ 卜 b F G Fず高い盞同性を瀺したので 、 この断片はニゞマス b F G Fず掚定された。
(2 )魚類の F G F蛋癜質をコヌ ドする塩基配列を有する D N A 次にニゞマス b F G F c DNAの党長をクロヌニングを行うために、 ニゞマス脳䞋垂䜓のラむブラ リ䞀を䜜成しスク リ䞀二ングしポゞティ ブ クロヌンを埗た。 埗られたクロヌンの塩基配列を決定したずころ 960 b pよりなる配列で、 オヌプンリヌディ ングフレヌムを取り埗るァミ ノ 酞配列の怜玢結果から 1 55個の塩基性ァミ ノ酞に富む倕ンパク質であ るこずがわかった。 ヒ トヌアフ リカッメガ゚ル間の盞同性が玄 85 %で あるのに察しおニゞマスずヒ 卜あるいはァフリカツメガ゚ルの b F G F には玄 75 %の盞同性しか認められなかった。
ヒ 卜の b F G Fに関する報告は倧量に発衚され、 アミ ノ酞配列の䞭で どの郚分がどのような機胜を持っおいるかに぀いお、 倉異䜓の解析や立 䜓構造の解析から明らかにされおいる。 このような重芁な機胜を持぀ァ ミ ノ酞配列は、 䞀般的には進化の過皋でよく保存されるものであるが、 ヒ 卜ずニゞマスの b F G F配列の比范を行っおみるず、 F G Fレセプタ —ず b F G Fが結合するず考えられる領域に違いが認められる  122 番目の T SWが PMEに倉化 。 たた、 b F G Fの立䜓構造の維持に関 連しおいるず考えられる C末端のアミ ノ酞 K S ( リ ゞン䞀セリ ン R R (アルギニン䞀アルギニン に倉わっおいる。 このように皮々の生物皮 のァミ ノ酞 E列を比范し重芁な配列を掚枬し、 構造を倉化させる倉異䜓 の創造はいわゆるプロティ ン゚ンゞニア リ ング的な研究ずしお重芁芖さ れおいる。 このような配列の違いに泚目しおニゞマス b F G F遺䌝子に 倉異を導入し生物掻性を䞊昇させるこずが期埅される。
(3 )魚類の b F G F蛋癜質をコヌ ドする塩基配列を有する組換え D N
A
簡䟿に b F G Fの発珟を行わせるために、 配列衚 1の b F G F党長の 遺䌝子配列のうち、 N末端偎ず C末端偎に察応する合成プラむマ䞀を䜜 成した。 N末端プラむマヌには E c o R lサむ トず N c o lサむ トを、 C末端偎にはス トップコ ドンのあずに E c o R Iサむ トを導入し、 E F 1 (GAA TT C C C A TG G C C A C A G GAG A A A T C A C C A) , E F 2 (GAA TT C T C A G C G T C T G G C T G A CAT G G G) ずした。
二ゞマス脳䞋垂䜓の m R N Aから再床 c D N Aを䜜成し䞊蚘ブラィマ — E F 1 / E F 2を甚いお P C Rを行った。 その結果目的ずした 470 b pのフラグメ ン トが増幅した。 このフラグメ ン トを p S Kベクタヌの E c o R Iサむ 卜に挿入し塩基配列を決定したずころ Ÿ列衚 1のアミノ 酞をコヌ ドする領域ず完党に䞀臎した。 この埗られたプラスミ ドを p S K侀 F G F—Wず名付けた。
(4)魚類の b F G F蛋癜質をコ— ドする塩基配列を有する組換え D N Aを含む発珟べクタ䞀
次に、 倧腞菌䞭で b F G Fを倧量発珟させるために発珟べクタ䞀 p K K 223 - 2に先の p S K— F G F— Wの E c o R I断片を挿入した。
( 5 )発珟べクタ䞀により圢質転換された圢質転換䜓 ニゞマス b F G Fの倧腞菌を甚いお生産するために、 倧腞菌発珟べク タヌである P K K 233— 2に b F G F断片を組み蟌み生産菌を䜜成し た。
( 6 )圢質転換䜓を培地に培逊するこずを特城ずする魚類の b F G F蛋 癜質の補造方法
p K K- F G F—Wを保持する圢質転換䜓を L侀 b r 0 t h䞭、 37 でで 0 D 660が玄 0· 6たで培逊し I P T Gによる誘導を行いさらに 3時間培逊を継続した。 培逊液を遠心分離埌、 バッファ— A ( 1 0 mM T r i s— H C L p H 7. 5 I mM E D TA, I mM D TT) に 懞濁し、 さらに終濃床 0. 1 %になるように T r i t o n X— 1 00を 添加し、 氷䞭で 1 0分間静眮する。 次に超音波により菌䜓を砎砕し遠心 分雠の䞊枅を、 あらかじめバッファ䞀 Aで平衡化したぞパリ ンセファロ ヌス C L— 6 Bにアプラむする。 0. 5M N a C l を含むバッファ䞀 Aで掗浄埌、 2. 0M N a C 1を含むバッファ䞀 Aで溶出する。
(7 )魚類の b F G F蛋癜質を有効成分ずする魚類創傷治療薬 クロヌニングした遺䌝子を基にしお倧腞菌を甚いお b F G Fを倧量生 産し魚類の創傷治療薬ずしおの開発を怜蚎した。 魚類、 特に逊殖魚は、 狭い環境に閉じ蟌められおいるため皮膚に傷が生じやすい。 たた、 æ°Žäž­ 生掻のため、 呚蟺には無数の现菌や埮生物が存圚し、 䞀床できた傷から 容易に感染症ぞず進行する。 䟋えば、 高玚魚の代衚である トラフグの逊 殖においおはフグの特性である 「喰み合い」 によるヒ レ、 皮麿の損傷か ら、 现菌感染症に進展するケヌスが倚く、 フグの逊殖を困難なものにし おいる。 このように、 逊殖魚業では、 傷の発生が倧きな問題ずなっおい る。 たた、 近幎、 掻魚等の茞送技術の向䞊により、 魚を運搬するケヌス が増えおいるが、 茪送に䌎う傷も問題ずなる。 たた、 逊殖技術の発展に 䌎い、 高玚魚の芪魚を倧切に保管する必芁がある。 このような高䟡倀魚 の治療ずいう点からも b F G Fは有甚ずいえる。 さらに、 珟圚ブヌムに なっおいる熱垯魚をはじめずする芳賞魚の飌育においおも、 傷の治療薬 は倧いに求められおおり、 b F G Fの応甚が期埅される。
b F G Fは、 繊維芜现胞の増殖を促進する因子である。 今回倧腞菌を 甚いお生産したニゞマス b F G Fの现胞増殖因子掻性をマりス由来繊維 芜现胞 B A L B 3 /3およびキンギペのヒレ由来繊維芜现胞 R B C F - 1にお怜蚎したずころ、 äž¡ 现胞ずもニゞマス b F G Fによっお増殖が 濃床䟝存的に誘起された。 现胞によっお最倧掻性濃床が異なるが、 1〜 数 1 0 n gZm 1で有意な増殖を瀺した。 たた、 魚類であるニゞマスの b F G Fがほ乳類であるマりスの现胞に察しおもその掻性を発揮できる こずも明らかずなった。 創傷治療薬の察象ずなるのは逊殖魚、 逊殖皮苗 甚芪魚、 コィ、 金魚、 熱垯魚等の芳賞魚である。
治療薬ずしお甚いる堎合、 b F G Fは 0. 0 1 n g/m l 〜 L O O n g/m 1の濃床で甚いるこずができる。
b F G Fを魚類の創傷治療薬ずしお甚いる堎合の利点を挙げるず以䞋 の通りである。
(i)ヒ 卜に b F G Fを甚いる堎合、 投䞎方法に぀いお工倫が必芁にな るが、 魚類に甚いるには氎に溶かしおそのたた䜿うこずができる。
(ϊ)今回埗られた b F G Fは氎溶性の高い蛋癜質であったので、 ラッ 卜の b F G Fで知られおいるような䞍溶性のものずは異なりそのたた修 食するこずなく䜿うこずができる。
(i)b F G Fはぞパリンずの䜵甚により安定化され、 䜎濃床で有効ず なるこずが知られおいる。 氎に溶かしおそのたた b F G Fを䜿える魚類 ぞの適甚においおはこの効果を利甚できる。
(8 )魚類の b F G F蛋癜質の存圚䞋での魚類の飌育 ·運搬方法。 b F G Fを魚類め創傷治療薬ずしお甚いる堎合の利点は䞊蚘のずおり であり、 b F G Fを飌育 ·運搬氎䞭に添加するだけで、 傷の治癒を早め
、 感染症に察する抵抗性を䞎える。
たた、 本発明の魚類の飌育あるいは運搬方法は、 ぞパリ ン共存䞋で行 うこずにより組換え䜓魚類 b F G Fの掻性が增匷される。 組換え䜓魚類 b F G Fは、 ぞパリ ンの存圚によっお、 より少ない量で効果的にその䜜 甚を発揮する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒ ト /アフ リ カッメ ガ゚ルの b F G F配列ずニゞマス b F G Fの配列の比范を瀺す図面である。
第 2図は、 I P T Gの誘導によっお b F G Fが発珟しおいるこず瀺す 電気泳動の写真である。
第 3図は、 培逊现胞株に察するニゞマス b F G Fの増殖促進効果を衚 す説明図である。
第 4図は、 b F G Fの再生に及がす効果を調べるためのマダむの尟鰭 の切陀凊理を瀺す図面ならびにそのマダむの尟鰭を瀺す生物の圢態の写 真である。
第 5図は、 察照区のマダむの尟鰭の再生状態を瀺す生物の圢態の写真 である。
第 6図は、 マダむの尟鰭の再生に及がす b F G Fの効果を瀺す生物の 圢態の写真である。
第 7図は、 ぞパリ ンによる b F G F掻性の增匷を瀺す図面である。 発明を実斜するための最良の圢態
本願発明の詳现を実斜䟋で説明する。 本願発明はこれら実斜䟋によ぀ お䜕ら限定されるものではない。 実斜䟋 1
( R N Aの調敎
ニゞマス脳䞋垂䜓玄 500 m gから垞法に埓っお R N Aを抜出した。 埗られた トヌタル RN Aからオリゎテッ クスカラム 宝酒造瀟補 を甚 いお玄 20 gのボリ A RN Aを粟補した。
(クロヌニング
すでに報告されおいるヒ ト、 アフリカッメガ゚ルの b F G F遺䌝子の 盞同性の高い領域に察する合成のミ ッ クスプラむマ—  F 1 /F 2 ) を 䜜成した 〔 F 1  TA (T/C ) T G (T/C ) A A ( A / G ) A A ( T / C ) G G (A/G/C/T) G G (A/G/C/T) T T (T/C ) TT, F 2  C AT (A/G/C/T) G G (A/G/C/T) A ( A/G ) ( A/G ) A A (A/G/C/T) A (A/G) (A/G/T) AT (A/G/C/T) G C (T/C ) T T (T/C ) TG〕 o
このプラむマヌを甚いお脳䞋垂䜓由来の mRN Aを铞型ずしお合成し た c DNA (ス トラタゞヌン瀟、 ファヌス トス トラ ン ド合成キッ ト を 以䞋の条件で P C Rを行った。 94。C 30秒 4 5°C 60秒 72^ 1 20秒のサむクルを 30回繰り返した。 反応液の組成はべ䞀リ ンガ䞀瀟 の方法に埓った。 P C Rの結果目的の倧きさず考えられるバンドが怜出 された。 このバン ドを p S Kベクタ—に組み蟌み塩基配列を決定した結 果、 ヒ トの b F G Fず高い盞同性が認められたため、 この挿入断片が二 ゞマスの b F G Fず掚枬された。
次にニゞマス b F G Fの党長遺䌝子をクロヌニングするために、 ニゞ マス脳䞋垂䜓のポリ A R N Aを铞型ずしお䜜補した c D NAラむブラ リ䞀を、 先に埗た b F G F断片をプロヌブずしおスク リヌニングした。 その結果、 ポゞティブクロヌンを埗るこずができた。 埗られたクロヌン を挿入断片の塩基配列を決定した。 最終的なニゞマス b F G F c DN A の塩基配列及び予枬されるァミ ノ酞配列を配列衚 1に瀺す。
9 60 b pよりなる配列で、 オヌプンリ䞀ディ ングフ レヌムを取りか えるア ミ ノ酞配列の怜玢結果から 1 5 5個の塩基性ァミ ノ酞に富む倕 ン パク質であるこずがわかった。 この c D N A配列から予想されるァミ ノ 酞配列を配列衚 1に瀺しおいるが、 ヒ ト /アフ リカッメガ゚ルの b F G F配列ずニゞマス b F G Fの配列を比范した結果を第 1図に瀺す。 ヒ ト 䞀アフ リカッメガ゚ル間の盞同性が玄 8 5 %であるのに察しおニゞマス ずヒ トあるいはァフ リカッメガ゚ルの b F G Fには玄 75 %の盞同性し か蚀忍められなかった。
(倧腞菌における b F G Fの発珟
簡䟿に b F G Fの発珟を行わせるために、 配列衚 1の b F G F党長の 遗䌝子配列のうち、 N末端偎ず C末端偎に察応する合成プラむマヌを䜜 成した。 N末端プラむマヌには E c o R Iサむ 卜ず N c o Iサむ トを、 C末端偎にはス ト ップコ ドンのあずに E c 0 R I サむ トを導入し、 E F 1 ( G A A TT C C C A T G G C C A C A G GA G A A A T C A C C A) , E F 2 ( G A A TT C T C A G C G T C T G G C T G A C A T G G G) ずした。
ニゞマス脳䞋垂䜓の mRN Aから再床 c D N Aを䜜成し䞊蚘プラむマ 侀 E F 1 /E F 2を甚いお P C Rを行った。 その結果目的ずした 470 b pのフラグメ ン トが増幅した。 このフラグメ ン 卜を p S Kベクタヌの E c 0 R Iサむ トに挿入し塩基配列を決定したずころ配列衚 1のァミ ノ 酞をコヌ ドする領域ず完党に䞀臎した。 この埗られたプラスミ ドを p S K侀 F G F— Wず名付けた。 この組換えプラスミ ドを保持する倧腞菌株 を N S— 1 0 1 (Escherichia coli NS-101) ず名付けた。 この圢質転 換䜓 Escherichia coli NS-101) は、 平成 7幎  1 99 5幎 2月 2 0曰に寄蚗した 寄蚗機関の名称通商産業省 工業技術院 生呜工孊 工業技術研究所 特蚱埮生物寄蚗センタヌ' 受蚗番号 F E RM P - 14777) 。 この原寄蚗より平成 8幎  1 99 6幎 2月 1 3日に囜 際寄蚗圓局 通商産業省工業技術院生呜工孊工業技術研究所 日本囜茚 城県぀くば垂東 1䞁目 1番 3号ぞ囜際寄蚗を請求し、 受蚗番号 F E R M B P— 5387で受領された。
次に、 倧腞菌䞭で b F G Fを倧量発珟させるために発珟べクタ䞀 p K K 2 23 - 2 (フアルマシァ瀟補 に先の p S K— F G F— Wの E c o R I断片を挿入した。 埗られた組み替え䜓の方向を確認し P K K- F G F— Wを埗た。 p K K— F G F—Wを保持する圢質転換䜓を L— b r o t h䞭、 37°Cで 0 D 6 60が玄 0. 6たで培逊し I P T Gによる誘導 を行いさらに 3時間培逊を継続した。
培逊液を遠心分離埌、 バッ ファヌ A ( 1 0 mM T r i s -H C L p H 7. 5, 1 mM E D T A, 1 mM D TT) に懞濁し、 さらに終濃床 0. 1 %になるように T r i t o n X- 1 00を添加し、 氷䞭で 1 0分 間静眮する。 次に超音波により菌䜓を砎砕し遠心分離の䞊枅を、 あらか じめバッ ファ䞀 Aで平衡化したぞパリ ンセファ ロヌス C L— 6 Bにァプ ラむする。 0. 5 M N a C 1 を含むバッ ファ— Aで掗浄埌、 2. 0 N a C 1を含むバッ ファ䞀 Aで溶出する。
以䞊の通り、 ニゞマス b F G Fの倧腞菌を甚いお生産するために、 倧 腞菌発珟べクタヌである p KK 233— 2に b F G F断片を組み蟌み生 産菌を䜜成した。 I P T Gの誘導によ぀お b F G Fが発珟しおいるこず がわかる 第 2図 。
b F G Fは a F G F (酞性繊維芜现胞増殖因子 ず同様ぞパリ ンに察 する芪和性が非垞に高いこずが知られる。 この性質を利甚しおぞパリ ン セファロヌスカラムにより、 倧腞菌菌䜓抜出物からワンステップで目的 の F G Fたんぱく質を粟補するこずが可胜である。 このようにしお粟 補した、 ニゞマス b F G Fは、 蚈算䞊の分子量 1 7000ずほが同様な 䜍眮に S D S _ P A G E䞊で確認できた。
〔組換え䜓魚類 b F G Fの现胞増殖促進䜜甚〕
现胞増殖促進䜜甚の掻性評䟡には MTT法を甚いた。 魚類由来繊維芜 现胞株である R B C F 1现胞を卜 リプシン凊理にお剝離回収埌、 無血枅 培地 DMEず F— 1 2の 1  1混合培地に 1 m g リ ツ 卜ルの B S A 、 0. l m gZリ ッ トルのァプロチニン、 1 0 m g /リ ッ トルの 卜ラ ン スフ ã‚š リ ン、 5 m g/リ ッ トルのフ ァむブロネクチンを添加した培地 で遠心掗浄した埌、 再懞濁し、 コラヌゲン ' コ— 卜凊理した 96穎マル チプレヌ 卜の 1穎圓たりに 4 X 1 03现胞づっ捲蟌んだ。 培地量は 1ç©Ž 圓たり 1 00 リ ツ トルずし、 これに各濃床の b F G Fを加えた。 37 で 3日間培逊埌、 5 gZリ ツ トルの MTT溶液を 1穎圓たり 1 0 リ ッ トルづっ加え 37° Cで 4時間反応させ、 生成されたホルマサンを 0 . 04 N H C 1 /ã‚€ ゜プロ ピルアルコヌルにお抜出 .溶解埌、 570 n mの波長の吞光床をリ ファ レンス波長 655 n mにお枬定した。 その 結果を第 3図に瀺した。 組換え䜓魚類 b F G Fは 0 * l〜 1 0 n g/m 1の濃床で R B C F 1现胞の增殖を有意に促進した。 実斜䟋 2
ニゞマス由来塩基性繊維芜现胞增殖因子のマダィに察する鰭再生効果 確認実隓 ニゞマス由来 b F G Fが海産魚であるマダむに察し、 鰭再生 促進効果を有するか吊かを確認した。 1 52日霢のマダむを䟛詊魚ずし た。 実隓開始時の平均魚䜓重は 40 gであった。 実斜䟋 1で生産した b F G Fを甚いた。 詊隓区は第 4図に瀺すように尟鰭の䞀郚を削陀し、 b F G F 1 0 n g/m 1濃床に調敎した海氎に 1時間浞朰凊理する区 F G F— 1 0) 、 20 n g/m 1濃床に調敎した海氎に 1時間浞挬凊理す る区 F G F— 2 0 ) 、 通垞の海氎に浞挬する区 察照区、 C n し ) の蚈 3区を蚭定した。
浞溃埌、 魚を各詊隓区ごずに 1 0 0 リ ツ トルのパンラむ ト氎槜に移し 飌育を行った。 各詊隓区の䟛詊魚は 3尟ずし、 たたこの時の飌育氎枩は 、 2 3 ± 2 Ÿであった。 サンプリ ングは浞挬凊理しおから 2日埌に行い 、 魚の尟鰭の写真撮圱ず、 ホルマリ ン暙本を䜜補し、 再生率を算出した 再生率 =再生面積 ÷切陀面積 X 1 0 0
各詊隓区の鰭再生率の結果を第 5図および第 6図に瀺した。 浞挬凊理 2日埌の b F G F凊理区の再生率は、 察照区に比べ高い傟向を瀺した。 察照区魚の切陀した鰭の再生は、 切陀した鰭の瞊暪亀差郚䜍から進行 しおいる 第 5図 。 それに察し b F G F凊理区の再生は、 亀差郚䜍だ けではなく、 広範囲にわたり進行しおいる 第 6図 。 このこずは b F G Fがマダむに有効に䜜甚しおいるこず、 早期に鰭の傷口を塞ぎ、 傷ず 倖環境ずの接觊時間を短瞮し、 傷からの病原䜓の䟵入 ·感染を防ぐこず に有効であるこずを瀺しおいる。 実斜䟋 3
æ°Ž 1 リ ッ トルを入れた氎槜を 2぀甚意しお、 片方には 1 0 n g Z m 1 濃床の b F G Fを添加し、 片方は無添加、 ここに玄 2 gの金魚を 1 0å°Ÿ づっ入れる。 この 1 0尟づ぀の金魚の尟鰭は、 䞀郚飌育開始盎前に切陀 されおいる。
このように金魚に尟鰭切断、 1 0å°Ÿ Z 1 リ ツ トルずいう過密状態のス トレスをかけお飌育を継続した。 その結果、 1週間埌には b F G F添加 区では 2尟の死亡にずどた぀たが、 無添加区では 8尟が死亡した。 このような苛酷な環境での飌育は、 䞀般逊殖業のモデルずなり埗るず 考えられ、 ヒレの切陀に起因する感染症の防埡に b F G Fが圹立぀こず が瀺された。 実斜䟋 4
(ぞパリ ン共存䞋での組換え䜓魚類 b F G F掻性增匷
ぞパリ ンが組換え䜓魚類 b F G Fず共存するこずによっお、 組換え䜓 魚類 b F G Fの掻性が増匷されるこずも明らかずした。 掻性評䟡には前 述ず同様に M T T法を甚いた。 すなわち、 魚類由来線維芜现胞株である R B C F 1现胞をト リプシン凊理にお剝雠回収埌、 無血枅培地 D M E ず F— 1 2の 1  1混合培地に 1 m g /リ ツ 卜ルの B S A、 0 . 1 m g リ ッ トルのァプロチニン、 1 O m g Zリ ッ トルの トラ ンスフヱ リ ン、 5 m g /リ ツ トルのファむブロネクチンを添加した培地 で遠心掗浄し た埌、 再懞濁し、 コラヌゲン · コ䞀 ト凊理した 9 6穎マルチプレヌ ト 1 穎圓たりに 4 1 0 3现胞づっ捲蟌んだ。 培地量は 1穎圓たり 1 0 0 リ ッ トルずし、 これに各濃床の b F G Fをぞパリ ンず共に加えた。 3 7 でで 3日間培逊埌、 5 g Zリ ツ トルの M T T溶液を 1穎圓たり 1 0 ^ リ ッ トルず぀加え 3 7でで 4時間反応させ、 生成されたホルマザンを 0 . 0 4 N H C 1ノむ゜プロピルアルコヌルにお抜出 '溶解埌、 5 7 0 η mの波長の吞光床をリ フ ァ レンス波長 6 5 5 n mにお枬定した。
その結果を第 7図に瀺した。
組換え䜓魚類 b F G Fはぞパリ ンずの共存䞋においお掻性濃床が 1桁 以䞊枛少した。 このこずはぞパリ ンの存圚によっお、 組換え䜓魚類 b F G Fがより少ない量で効果的に䜜甚を発撣するこずを瀺しおいる。 ニゞマス火傷治癒における b F G Fの効果 5 䜓長玄 8 c mのニゞマス䜓衚に、 先端が偏平で盎埄 3 mm円圢なはん だごおにお瞬間的に火傷を぀くる。 これによ぀お䜓衚皮は剝がれ、 盎埄 4 mm円圢な損傷郚䜍が圢成される。 この創傷凊理を行぀たニゞマスを 2矀に分け、 1矀を b F G F l O n gZm l の濃床で加えた 2 リ ッ トル 氎槜䞭で、 もう 1矀を察象ずしお無添加 2 リ ッ トル氎槜䞭にお各々 30 分間静眮した。 この埌、 各矀を 20 リ ッ トル氎槜でそれぞれ移し飌育し た。 創傷凊理 1 2日目に損傷郚䜍を等倍率にお撮圱し、 各個䜓ごずの損 傷郚䜍面積を画像解析した。 その結果を衚 1に瀺した。 この結果から、 b F G Fは飌育氎䞭に添加するずい぀た簡易な方法によっお、 損傷郚䜍 の治癒を促進する効果を有するこずが瀺された。 火傷凊理 1 2日目での b F G Fの治癒促進効果
創傷面積  c m2) 平均明床 2 56階調 察照 1 9.5 2 1 5
察照 2 8.8 204
察照 3 8.2 229
察照 4 1 0.6 220
察照 5 7.3 2 1 1
平均土 S E 8.9 ± 0.6* 2 1 6 ± 4 " 凊理 1 8. 1 1 89
凊理 2 9.7 1 77
凊理 3 5.2 1 87
凊理 4 6.4 1 66
凊理 5 4.6 2 14
平均土 S E 6.8± 0.9* 1 87 ± 8 "
* (P < 0.05) " (P < 0.01 ) 産業䞊の利甚可胜性
ニゞマス塩基性繊維芜现胞増殖因子 b F G F、 その蛋癜質をコヌ ドす る塩基配列を有する D N A、 その塩基配列を有する組換え D N A、 組換 え D N Aを含むベクタヌ、 ベクタヌを保持する圢質転換䜓、 䞊蚘蛋癜質 の補造方法および䞊蚘蛋癜質を有効成分ずする魚類創傷治療薬を提䟛す るこずができる。 逊殖技術の発展に䌎い、 高玚魚の芪魚を倧切に保管す る必芁があるが、 このような高䟡倀魚の治療に有効な b F G Fを提䟛す るこずが出来る。 傷の治癒を早め、 感染症に察する抵抗性を䞎える魚類 の飌育 ·運搬方法を提䟛するこずができる。
配列衚 1
配列番号 1
配列の長さ  9 60
配列の型栞酞
鎖の数二本鎖
ト ポロ ゞヌ  盎鎖状
配列の皮類 c D N A
ハむポセテ ィ カノレ  N o
ア ンチセ ンス  N o
起源
生物 g  二ゞマス (Oncorunynchus mykiss)
組織脳䞋垂䜓
配列の特城
特城を衚す蚘号 m a t p e p t i d e
存圚䜍眮 438— 902
特城を決定した方法 S 蚘列
CTGGTTCGGC CAACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAGTG AATTCGTGAT AACATTTCAG 60 CGCTTAAGAG TGGAGGAAGA AGACGATGGA AGGTGGAACA CACGAATCCC CATCCAAACT 120 ACACTCGAAT ATCAACTATT AGCACTTTCT TAAAGGAACG AGAAGAGGCC AGTGAGGGGT 180 GGGCCTTGCT GTCGCGGCTA ACAAGCTCCT TTCCAAGTGC TGCTAGCGCT TAGATTCCTC 240 TCTGCTTGGG AGTAGAGGGC ATGCTGCACC CAGAGGGGTG TTCTCAAACA AACTATCTGA 300
CCCTGGGGTT AACTAAAATC AGGCTCTGTG AGGCTCGCTG GGGAAGGGAG GGGACAGCAG 360
TTAGCATAAG GCTACTGTGG GGCTGCTGCA CTGGTAGCAC ACAGCAGCAG CAGGGTAGAG 420
GATAGAGGGA AGAGGAG ATG GCC ACA GGA GAA ATC ACC ACT CTA CCC GCC 470
Met Ala Thr Gly Glu H e Thr Thr Leu Pro Ala
1 5 10
ACA CCT GAA GAT GGA GGC AGT GGC GGC TTC CTT CCA GGA AAC TTT AAG 518
Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gl y Gly Phe Leu Pro Gly Asn Phe Lys
15 20 25
GAG CCC AAG AGG TTG TAC TGT AAA AAT GGA GGC TAC TTC TTG AGG ATA 566
Glu Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg l ie
30 35 40
AAC TCT AAC GGA AGC GTG GAC GGG ATC AGA GAT AAG AAC GAC CCC CAC 614
Asn Ser Asn Gly Ser Val Asp Gly l ie Arg Asp Lys Asn Asp Pro His
45 50 55
AAT AAG CTT CAA CTC CAG GCG ACC TCA GTG GGG GAA GTA GTA ATC AAA 662 Asn Lys Leu Gin Leu Gin Ala Thr Ser Val Gly Glu Val Val l ie Lys
60 65 70 75
GGG GTC TCA GCC AAC CGC TAT CTG GCC ATG AAT GCA GAT GGA AGA CTG 710 Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Asn Ala Asp Gly Arg Leu
80 85 90 TTT GGA CCG AGA CGG ACA ACA GAT GAA TGC TAC TTC ATG GAG AGG CTG 758 Phe Gly Pro Arg Arg Thr Thr Asp Glu Cys Tyr Phe Met Glu Arg Leu
95 100 105
GAG AGT AAC AAC TAC AAC ACC TAC CGC TCT CGA AAG TAC CCT GAA ATG 806 Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Pro Glu Met
110 115 120
TAT GTG GCA CTG AAA AGG ACT GGC CAG TAC AAG TCA GGA TCC AAA ACT 854 Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Ser Gly Ser Lys Thr
125 130 135
GGA CCC GGC CAA AAA GCC ATC CTC TTC CTC.CCC ATG TCA GCC AGA CGC 902 Gly Pro Gly Gin Lys Ala lie Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Arg Arg
140 145 150 155
TGAGCTGAGC TCACCTTGTT TTACTAATCT TAAAACTCAG CCTGGGCTGC AGTGCAAAAA 962
AAAAAAAAAA A 973

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 魚類の塩基性繊維芜现胞増殖因子蛋癜質。
2 . 魚類の塩基性繊維芜现胞増殖因子をコ— ドする塩基配列を有する D N A。
3 . 配列衚 1に瀺す塩基配列のコヌディ ング領域ず 8 0 %以䞊の盞同性 を有する塩基配列である請求項 2の D N A。
4 . 組換え D N Aである請求項 2の D N A。
5 . 請求項 4の組換え D N Aを含む発珟べクタ—。
6 . 請求項 5の発珟べクタヌにより圢質転換された圢質転換䜓。
7 . 請求項 6の圢質転換䜓を培逊液䞭で培逊し、 該培逊液から組換え魚 類の塩基性繊維芜现胞成長因子蛋癜質を採取するこずを特城ずする魚類 の塩基性繊維芜现胞増殖因子の補造法。
8 . 請求項 1の魚類の塩基性繊維芜现胞増殖因子蛋癜質を有効成分ずす る魚類創傷治療薬。
9 . 請求項 1の蛋癜質の存圚䞋で魚類を飌育あるいは運搬するこずを特 埵ずする魚類の飌育あるいは運搬方法。
10. ぞパリ ンを共存させる請求項 9の魚類の飌育あるいは運搬方法。
PCT/JP1996/000436 1995-02-26 1996-02-26 Facteur de croissance de fibroblaste de base de poisson, adn et son utilisation WO1996026960A1 (fr)

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Non-Patent Citations (4)

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