WO1996024064A1 - Procede destine a la detection d'infections a chlamydia par mise en evidence d'anticorps - Google Patents

Procede destine a la detection d'infections a chlamydia par mise en evidence d'anticorps Download PDF

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WO1996024064A1
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chlamydia
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infection
infections
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PCT/FR1996/000172
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Didier Mairey
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Didier Mairey
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56927—Chlamydia

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of Chlamydia infections. It relates, in particular, to a process intended for the detection of Chlamydia infections by detection of antibodies produced by the immune system associated with the mucous membranes against this germ.
  • Chlamydiae targeted by the present invention are, in particular, Chlamydiae trachomatis, pneumoniae and psitacci.
  • Chlamydiae are known to develop inside host cells, such as those of the cylindrical epithelium type for Chlamydia trachomatis or in macrophages for Chlamydia pneumoniae, forming a cytoplasmic inclusion.
  • infectious particle or elementary body enters phagocytosis into the host cell, it is then contained in a vacuole.
  • This infectious particle or elementary body is transformed into a reticulated body capable of binary division to give a Morula.
  • the fusion between the lysosome and the vacuole is inhibited.
  • the inclusion increases in size, breaks and frees the elementary bodies which will parasitize new cells.
  • Chlamydia infections relate, for example, to equipment for detecting these infections.
  • Chlamydia spreads more easily in some people than others. It is claimed that there would be reinfection with additional germ supply or existence of more invasive serotypes than others, or even individual susceptibility or different immune systems.
  • Chlamydiae Several techniques are currently used to detect Chlamydiae. One uses in particular the culture of the germs. However, this technique is difficult to implement because the germ is fragile. In addition, the time to obtain the result is long since it is approximately forty-eight hours. The material is heavy and expensive and it is possible to obtain false negatives.
  • Genomic amplification of RNA or DNA can also be used.
  • this technique is delicate and expensive.
  • a positive result can be obtained after treatment.
  • this technique does not allow to know if the germ multiplies and therefore if it will be affected by an antibiotic.
  • Chlamydia is a multiplication of the germ and therefore a sensitivity to antibiotics.
  • the problem is to know where the cycle is blocked: is it at the level of the elementary body or the reticulated body?
  • elementary bodies are found in relatively small quantities in a patient, one may wonder if he is sick or if he carries the germ in the dormant state.
  • Chlamydia is an intracellular multiplication germ, the antibodies produced are therefore not opsonizing and are probably not protective. It is likely that if there are antibodies, there is probably also the germ in the body.
  • Chlamydia infections are a problem of Public Health and Sociology. In fact, official statistics on Chlamydia infections are inconsistent or nonexistent; they are in any case underestimated. However, it is certain that Chlamydia is a real public health problem, as has been confirmed in the USA. It is estimated that 40 million people will be infected in the year 2000 worldwide.
  • Chlamydia trachomatis infections are considered to be sexually transmitted diseases. They are a source of conflict in a couple and a taboo subject. So we prefer not to talk about it. This blocking of information is further accentuated by professional secrecy.
  • Chlamydia infections are considerable, and this, especially in cases of chronicity or high infection such as salpingitis, perihepatitis, infertility or neonatal infection.
  • the object of the invention is to provide a method intended for the diagnosis of Chlamydia infections, in particular of Chlamydiae trachomatis, pneumoniae or psitacci, which is both simple, effective and rapid to implement and which gives more reliable and fairer than those obtained by the processes existing to date.
  • this is achieved by detecting and possibly quantifying antibodies produced by the immune system associated with the mucous membranes against Chlamydia sp.
  • Chlamydia sp represents Chlamydia specie, that is to say the species Chlamydia without precision.
  • IgA immunoglobulin class A
  • IgAs immunoglobulin class As, secretory A
  • IgM immunoglobulin class
  • IgG immunoglobulin class G
  • IgE immunoglobulin class E
  • CP Chlamydia pneumoniae
  • CT Chlamydia trachomatis
  • BK Koch bacillus.
  • the antibodies are denoted Ac; the antigens are noted Ag.
  • human or animal samples, other than blood, obtained in the fluid state or resuspended in a liquid medium are brought into contact with the whole Chlamydia antigen or with part of the germ, in particular under form of elementary bodies or inclusions in cells, antigen linked to a support which can be the well of a slide.
  • a fluorescent optical microscope can be used.
  • the anti-IgM is marketed by BIOS GmbH Labor Diagnostik.
  • the anti-IgA, -IgG or -IgE are marketed by BIOS GmbH Labor Diagnostik or TAGO Incorporation, the anti-IgE being marketed under the brand name DAKO®.
  • a secretory antiparty is marketed by Immunotech.
  • very good quality distilled water is used for dilutions.
  • human or animal anti-immunoglobulin Abs as the case may be, of IgAs, IgA, IgM, IgG or other nature, conjugated with a particular FITC-type marker, then reading the signal obtained, after washing, in particular the reading of fluorescent spots obtained under the microscope.
  • the label FITC type is used to label a fluorescein isothiocyanate fluorescence.
  • a human sample such as a sample from the throat, nose, ears - from a conjunctiva, sputum, bronchial aspiration, d '' a urethra, urine, endocervix, transcellular fluid, dermis or others.
  • Liquid sampling is implemented. If the sample is on a swab, it is resuspended in one milliliter of sterile liquid.
  • Chlamydia material of the same serotype as that hosted by the patient should improve the sensitivity of the technique, especially at the beginning of the infection where the Ac produced appear to be only antiserotypes. Furthermore, the use of Chlamydiae in the state of inclusions rather than elementary bodies facilitates the reading and elimination of artefacts.
  • the method according to the invention has the advantage of giving a clear, frank and unambiguous response. Indeed, the result is a signal given by a mood and not by a germ with a heterogeneous location, the quantity of which is dependent on the sample. Furthermore, the method according to the invention is not very dependent on the presence of rheumatoid factors. It is also independent of the much less heterologous Ab than in the blood. It is noted that a possible elimination of IgG by an absorbent can be carried out before assay of IgA or IgM.
  • the method according to the invention also has the advantage of being simple and inexpensive. In addition, it can be carried out in a delayed manner over time.
  • the method can be implemented automatically. We can, in particular, use a method known per se, namely an Elisa type analysis method "Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay". A coating of Ag of Chlamydia or a part of it is carried out. You can use surface Ag or part of the genome.
  • a quantification can be carried out by weighing the sample and dilution, by considering that the sample has a density close to one and by working with successive dilutions.
  • the result can be expressed as the inverse of the dilution where the test is still positive.
  • For carrying out the test in the urine one can express a quantitative result compared to a substance which controls glomerular filtration and therefore flow rate, such as creatinine.
  • the signal is proportional to the amount of Chlamydiae that permeates the surrounding tissue of the host.
  • the test can be used for an epidemiological investigation by comparing the results obtained with different serotypes.
  • the method according to the invention comprises a one-time incubation with mixing of the sample and the conjugate.
  • the presence of anti-Chlamydia antibodies - of one or more classes - is correlated with an active infection in the subject sampled.
  • the quantity of the signal obtained is correlated with the quantity of Chlamydiae impregnating the tissues neighboring the sample and with the severity of the infection in the host.
  • Example 1 Chlamydia pneumoniae pericarditis
  • a patient has significant inflammatory signs in his blood test. 11,600 white blood cells per cubic millimeter are highlighted, a fibrin level of 6 and a sedimentation rate of 22 to 42.
  • the PCR is 104 whereas, normally, this index must be less than 10.
  • Antibodies against Chlamydia trachomatis positive +++ were revealed by the implementation of the method according to the invention. Again, the diagnosis made by this method is reliable and correct.
  • the method according to the invention has also been used for other patients by following the protocol described above. It has been shown that the presence of antibodies, even weakly positive, in the urine, was, a priori, correlated with obvious clinical signs. A large decrease in the amount of antibodies produced in the urine was observed in one of the patients after treatment.
  • Bacteriological samples were taken from a patient with acne breakouts since adolescence. The following were observed: many polyneutrophils, few Gram-stained bacteria. Anti CP + IgA, and on classic cultures, few staph. epidermidis.
  • Chlamydia pneumoniae is one of the candidates for the etiology of acne.
  • Example 5 Sampling of the mouth (a) Canker sores were taken from the gum tissue in a patient. We have thus diagnosed the following: (a) Canker sores were taken from the gum tissue of a patient. We have thus diagnosed the following:
  • the method according to the invention can also be implemented on mouth samples.
  • Chlamydia pneumoniae is a candidate for the etiology of Behcet's disease, starting from the analysis of recurrent mouth ulcers, canker sores, uveitis, synovitis, cutaneous vasculitis and meningoencephalitis.
  • Synovial fluid was taken from a patient. The results are expressed below:
  • cytology 40,000 red cells; 27,500,000 nucleated elements per milliliter, of which 70% are polyneutrophils, 8% eosinophils and 23% macrophages,
  • transcellular liquid can also be used to carry out the method according to the invention.
  • transcellular liquid can also be used to carry out the method according to the invention.
  • Example 9 Urethra and endocervix This time, we started with urethra and endocol samples, to implement the method according to the invention. In fact, we started with fifty samples of urethra and endocols.
  • the examples show that the method according to the invention is effective for the detection of infections with Chlamydia trachomatis, pneumoniae and psitacci.
  • anti-Chlamydia antibodies produced by the immune system associated with the mucous membranes can be detected and possibly quantified, and this on fluid or rendered fluid samples of humans or animals, other than blood, for the purpose of medical diagnosis.
  • the method implements immunolabeling, in particular indirect immunofluorescence.
  • the second Ab used can be an anti-IgA, an anti-PS, an anti-IgM, an anti-IgG or others.
  • IgA immunoglobulins
  • IgM immunoglobulins
  • the quantity of antibodies obtained is apparently correlated with the quantity of germs present in tissues close to that of the sample, and with the severity of the infection. It is noted that carrying out the test in the urine seems to be remarkably practicable.
  • the examples show that the method according to the invention can be used in a simple, reliable and effective manner on different types of samples, in order to reveal a Chlamydia infection.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé pour le diagnostic in vitro d'infections à Chlamydia du type trachomatis, pneumoniae ou psitacci. L'originalité de ce procédé réside dans la mise en évidence et, éventuellement, la quantification d'anticorps produits par le système immunitaire associé aux muqueuses contre Chlamydia sp..

Description

PROCEDE DESTINE A LA DETECTION D'INFECTIONS A CHLAMYDIA PAR MISE EN EVIDENCE D'ANTICORPS
L'invention a pour objet un procédé destiné à la détection d'infections a Chlamydia. Elle vise, en particulier, un procédé destiné à la détection d'infections a Chlamydia par mise en évidence d'anticorps produits par le système immunitaire associé aux muqueuses contre ce germe.
Les Chlamydiae visées par la présente invention sont, notamment, les Chlamydiae trachomatis, pneumoniae et psitacci.
Il est connu que les Chlamydiae se développent à l'intérieur de cellules hôtes, telles que celles du type épithélium cylindrique pour Chlamydia trachomatis ou dans les macrophages pour Chlamydia pneumoniae, en formant une inclusion cytoplasmique.
La particule infectieuse ou corps élémentaire pénètre par phagocytose dans la cellule hôte, elle est alors contenue dans une vacuole. Cette particule infectieuse ou corps élémentaire se transforme en corps réticulé capable de division binaire pour donner une Morula. Il y a inhibition de la fusion entre le lysosome et la vacuole. L'inclusion augmente de taille, se rompt et libère les corps élémentaires qui vont parasiter de nouvelles cellules.
Il existe plusieurs incertitudes concernant les infections a Chlamydia. Elles portent, par exemple, sur le matériel de détection de ces infections. En particulier, on met en cause les différences importantes de sensibilité entre les techniques de diagnostic direct ou encore la faiblesse de la technique d'immuno-fluorescence directe dont la validité peut toujours être attaquée par un scientifique.
On met également en cause les statistiques à l'égard de ces infections et les différences importantes dans les chiffres de prévalence des infections a Chlamydia trachomatis.
On se demande également s'il est possible de retrouver le germe après le traitement et s'il existe des infections chroniques résistantes aux traitements alors que le germe est toujours sensible aux antibiotiques in vitro.
On comprend mal aussi pourquoi Chlamydia dissémine plus facilement chez certaines personnes que d'autres. On prétend qu'il y aurait réinfection avec apport supplémentaire de germe ou existence de sérotypes plus envahissants que d'autres ou encore une susceptibilité individuelle ou bien des systèmes immunitaires différents.
D'autres questions restent également en suspens comme l'existence d'un portage sain asymptomatique ou d'un blocage du cycle. On ignore d'ailleurs à quel stade. Reste également à déterminer l'intérêt de la sérologie : les anticorps sont peut-être témoins d'infection. Quelle est la fréquence des anticorps de classe IgM et IgA et existe-t-il des Chlamydiae morts inertes in vivo gardant leurs propriétés antigéniques ?
Plusieurs techniques sont actuellement mises en œuvre pour détecter les Chlamydiae. On utilise notamment la culture des germes. Toutefois, cette technique est difficile à mettre en œuvre car le germe est fragile. De plus, le temps d'obtention du résultat est long puisqu'il est de quarante-huit heures environ. Le matériel est lourd et onéreux et il est possible d'obtenir de faux négatifs.
On peut aussi mettre en évidence l'Ag Chlamydia. Cette technique présente l'avantage de faire appel à des réactifs relativement bon marché. Toutefois, on ne peut pas conclure quant à la vie ou à la mort du germe. On peut encore moins connaître l'état du cycle.
On peut aussi utiliser l'amplification génomique de l'ARN ou de l'ADN. Toutefois, cette technique est délicate et onéreuse. De plus, un résultat positif peut être obtenu après le traitement. Par ailleurs, cette technique ne permet pas de savoir si le germe se multiplie et donc s'il sera touché par un antibiotique.
En dépit des doutes relatifs aux infections a
Chlamydia évoqués précédemment, on s'accorde sur plusieurs points.
On sait par exemple que, pour une infection aiguë, tous les stades du cycle sont en phase et touchés en même temps par l'antibiotique, la quantité de germe dans le prélèvement est importante. Dans ce cas, le pronostic est bon et l'on a de fortes chances de trouver peu de particules après traitement : elles sont probablement évacuées lors de la desquamation ultérieure de la cellule hôte.
On sait également que, lors d'infections à bas bruit, les particules ne sont plus en phase. Il y a contamination des cellules voisines de la cellule hôte ;
1'éradication est beaucoup plus difficile, l'infection devient chronique.
A priori, les cellules qui hébergent Chlamydia ont une durée de vie longue, qu'il s'agisse de l'épithélium cylindrique monocouche ou du macrophage. Ceci concourt à leur pérennité in situ.
En général, il est nécessaire de dire au clinicien s'il y a Chlamydiose et non s'il y a des Chlamydiae dont le cycle peut être bloqué in vivo. La Chlamydiose correspond à une multiplication du germe et donc à une sensibilité aux antibiotiques.
Le problème est de savoir où le cycle est bloqué : est-ce au niveau du corps élémentaire ou du corps réticulé ? En particulier, si l'on trouve des corps élémentaires en quantité relativement faible chez un patient, on peut se demander s'il est malade ou s'il porte le germe à l'état dormant. On peut également s'interroger sur l'opportunité de parler de contaminant alors que les corps élémentaires peuvent rester intracellulaires et inertes. Chlamydia est un germe à multiplication intracellulaire, les anticorps produits ne sont donc pas opsonisants et ne sont sans doute pas protecteurs. Il est probable que s'il existe des anticorps, il y a sans doute aussi le germe dans l'organisme.
Les infections a Chlamydia constituent un problème de Santé Publique et de Sociologie. En fait, les statistiques officielles sur les infections a Chlamydia sont incohérentes ou inexistantes ; elles sont en tout cas sous-estimées . Il est toutefois certain que les Chlamydioses sont un véritable problème de Santé Publique, comme cela a été confirmé aux USA. On prévoit 40 millions d'individus contaminés en l'an 2000 dans le monde.
Sur le plan médico-légal, on ignore quelle technique doit être utilisée et si la culture doit rester la méthode de référence.
Quoi qu'il en soit, il y a désinformation sur les infections a Chlamydia trachomatis. Ces infections sont considérées comme étant des maladies sexuellement transmissibles. Elles sont une source de conflits dans un couple et un sujet tabou. On préfère donc ne pas en parler. Ce blocage de l'information est d'ailleurs accentué par le secret professionnel.
Il existe pourtant des Chlamydioses infracliniques chez certains sujets qui ne présentent pas d'effets pathologiques . Ces personnes ne doivent pas être inquiétées par le corps médical.
Les dépenses de Santé occasionnées par les infections a Chlamydia sont considérables, et cela, surtout en cas de chronicité ou d'infection haute comme la salpingite, la périhépatite, la stérilité ou l'infection néonatale.
L'invention a pour but de fournir un procédé destiné au diagnostic des infections a Chlamydia, en particulier de Chlamydiae trachomatis, pneumoniae ou psitacci, qui soit à la fois simple, efficace et rapide à mettre en œuvre et qui donne des résultats plus fiables et plus justes que ceux obtenus par les procédés existant à ce jour.
On y parvient, selon l'invention, par la mise en évidence et éventuellement la quantification d'anticorps produits par le système immunitaire associé aux muqueuses contre Chlamydia sp.
Chlamydia sp représente Chlamydia specie, c'est- à-dire l'espèce Chlamydia sans précision.
Il s'agit d'une mise en évidence et éventuellement d'une quantification par un procédé d'immuno-marquage des anticorps (Ac) ou partie d'Ac (de nature IgA, IgAs, IgM, IgG, igE ou autres) contre le germe Chlamydia ou une partie de ce germe sur des prélèvements humains ou animaux autres que le sang. Le procédé d'immuno-marquage peut être une immuno- fluorescence, une immuno-enzymologie ou autres. Par ailleurs, le germe Chlamydia ou la partie du germe peut être notamment de l'espèce trachomatis, pneumoniae ou psitacci. On entend par Ig de l'immunoglobuline,
On entend par IgA de l'immunoglobuline de classe A,
On entend par IgAs de l'immunoglobuline de classe As, A sécrétoire, On entend par IgM de l'immunoglobuline de classe
M,
On entend par IgG de l'immunoglobuline de classe G,
On entend par IgE de l'immunoglobuline de classe E,
CP signifie Chlamydia pneumoniae, CT signifie Chlamydia trachomatis, BK signifie bacille de Koch.
Les anticorps sont notés Ac ; les antigènes sont notés Ag.
Ces Ac sont produits par le système immunitaire associé aux muqueuses. Il s'agit d'une zone de contact avec les Ag et un système relativement autonome. La présence d'IgA et/ou IgM, éventuellement d'IgG ou autres anti-Chla ydiae, in situ, semble contemporaine de la phase active de l'infection. De plus, la quantité d'Ac produits semble corrélée avec la gravité de l'infection et avec la clinique. En effet, des quantités faibles d'Ac existent apparemment chez des individus sains, mais aussi chez ceux qui portent d'authentiques chlamydioses patentes.
Avantageusement, on réalise une mise en contact de prélèvements humains ou animaux, autres que le sang, obtenus à l'état fluide ou remis en suspension dans un milieu liquide, avec l'antigène Chlamydia entier ou avec une partie du germe, en particulier sous forme de corps élémentaires ou bien d'inclusions dans des cellules, antigène lié à un support qui peut être le puits d'une lame.
En tant que matériel, on peut utiliser un microscope optique à fluorescence. On peut mettre en œuvre, comme lames Chlamydia trachomatis et pneumoniae en inclusions, en particulier celles commercialisées par BIOS GmbH Labor Diagnostik sous la marque BIOS®.
On peut également utiliser des conjugués marqués disponibles dans le commerce. En particulier, l'anti-lgM est commercialisée par BIOS GmbH Labor Diagnostik. De même, l'anti-IgA, -IgG ou -IgE sont commercialisées par BIOS GmbH Labor Diagnostik ou TAGO Incorporation, l'anti- IgE étant commercialisée sous la marque DAKO®. De même encore, une antipièce sécrétoire est commercialisée par Immunotech. Par ailleurs, on utilise une eau distillée de très bonne qualité pour les dilutions.
Plus avantageusement, on effectue, après une incubation et un lavage, la mise en contact avec le premier complexe Ag-Ac formé, des Ac anti-immunoglobulines humaines ou animales selon le cas, de nature IgAs, IgA, IgM, IgG ou autres, conjugués avec un marqueur en particulier de type FITC, puis la lecture du signal obtenu, après lavage, en particulier la lecture de spots fluorescents obtenus au microscope.
On appelle marqueur de type FITC, un marqueur donnant lieu à une fluorescence fluorescein isothiocyanate.
Pour mettre en œuvre le procédé conforme à l'invention, on utilise un prélèvement humain tel qu'un prélèvement provenant de la gorge, du nez, des oreilles - d'une conjonctive, d'un crachat, d'une aspiration bronchique, d'un urèthre, de l'urine, de l'endocol, d'un liquide transcellulaire, du derme ou autres.
On met en œuvre le prélèvement liquide. Si le prélèvement est sur écouvillon, on le remet en suspension dans un millilitre de liquide stérile.
Après centrifugation, on dépose une goutte de surnageant sur un puits d'une lame tapissée d'inclusions de Chlamydia en cellules ou de corps élémentaires. On note que la qualité des lames est primordiale. On laisse incuber trente minutes ou plus à 37°C, on lave avec un tampon adéquat.
On dépose une goutte d'Ig animale et anti-IgA humaine ou une antipièce sécrétoire ou anti-IgM ou anti- IgG ou autres, marquée au FITC. Si la deuxième Ig ne peut être obtenue conjuguée, une troisième étape est nécessaire avec une Ig marquée anti-lg animale. La dilution optimale du conjugué doit être trouvée par le manipulateur. On laisse incuber trente minutes ou plus à 37°C, on lave et on sèche. On effectue la lecture au microscope à fluorescence; des inclusions de couleur vert pomme montrent la positivité du test.
L'utilisation de matériel Chlamydia de même sérotype que celui hébergé par le patient devrait améliorer la sensibilité de la technique, surtout au début de l'infection où les Ac produits semblent être uniquement des antisérotypes. Par ailleurs, l'emploi de Chlamydiae à l'état d'inclusions plutôt que de corps élémentaires facilite la lecture et l'élimination des artefacts.
Le procédé selon l'invention présente l'avantage de donner une réponse claire, franche et sans ambiguïté. En effet, le résultat est un signal donné par une humeur et non par un germe à localisation hétérogène dont la quantité est dépendante du prélèvement. Par ailleurs, le procédé selon l'invention est peu dépendant de la présence de facteurs rhumatoïdes. Il est également indépendant des Ac hétérologues beaucoup moins nombreux que dans le sang. On note qu'une élimination possible des IgG par un absorbant peut être réalisée avant dosage des IgA ou des IgM.
Le procédé selon l'invention présente aussi l'avantage d'être simple et peu onéreux. De plus, il peut être réalisé de manière différée dans le temps.
Le procédé peut être mis en œuvre de manière automatisée. On peut, en particulier, faire appel à une méthode connue en soi, à savoir une méthode d'analyse de type Elisa "Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay". On réalise un coating de l'Ag de Chlamydia ou d'une partie de celui-ci. On peut utiliser les Ag de surface ou une partie du génome.
Une quantification peut être effectuée par pesée du prélèvement et dilution, en considérant que le prélèvement a une densité voisine de un et en travaillant avec des dilutions successives. On peut exprimer le résultat comme étant l'inverse de la dilution où le test est encore positif. Pour la réalisation du test dans les urines, on peut exprimer un résultat quantitatif par rapport à une substance témoin de la filtration glomérulaire et donc du débit, comme la créatinine.
Apparemment, le signal est proportionnel à la quantité de Chlamydiae qui imprègne les tissus environnants de l'hôte. Le test peut servir à une enquête épidémiologique par comparaison des résultats obtenus avec différents sérotypes.
De préférence, le procédé selon l'invention comprend une incubation en un temps avec mélange du prélèvement et du conjugué.
Plus préférentiellement, il comprend une immuno- capture permettant d'éliminer un facteur rhumatoïde éventuel. Selon un mode de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention, on corrèle la présence d'anticorps anti-Chlamydia - d'une ou de plusieurs classes - avec une infection active chez le sujet prélevé.
De préférence, on corrèle la quantité du signal obtenu, c'est-à-dire la quantité d'anticorps, avec la quantité de Chlamydiae imprégnant les tissus voisins du prélèvement et avec la gravité de l'infection chez l'hôte.
L'invention pourra être mieux comprise à l'aide des exemples non limitatifs qui suivent et qui constituent des modes de mise en œuvre avantageux du procédé selon l'invention.
Exemple 1 : Péricardite a Chlamydia pneumoniae
Un patient, né en 1925, a été hospitalisé en août 1990 pour précordialgies fébriles. Il avait eu plusieurs antécédents, à savoir une tuberculose pulmonaire très ancienne qui avait été traitée. Il avait également souffert d'une listériose neuro-méningée, qui avait présenté une évolution favorable. Il avait souffert encore de douleurs articulaires d'origine arthrosique.
Le début clinique remonte à 1988 avec des douleurs rétro-sternales ainsi qu'un syndrome inflammatoire récurrent. Il y a eu alors suspicion de lithiase vésiculaire à l'échographie biliaire. Le diagnostic était le suivant :
. la fièvre montait à 38 , 8°C ; . la radiographie pulmonaire indiquait un épanchement pleural minime. Par ailleurs, les analyses de sang montraient que le taux de globules blancs était de 10 700 dont 9 000 polyneutrophiles ; . la vitesse de sédimentation était de 44 en première heure; le taux de fibrine de 6,66. La protéine C réactive (PCR) était à 218 alors que normalement, ce taux doit être inférieur à 10. On observait également des sérologies de tuberculose, de listériose et d'entérovirus négatives ;
. l'échographie montrait des signes de péricardite ; . la ponction pleurale était négative en culture. On avait prescrit un traitement anti-inflammatoire puisqu'une péricardite récurrente bénigne avait été diagnostiquée. On a prescrit, comme médicament, du Cebutid®, commercialisé par les Laboratoires Boots- Dacour.
En 1992, tous les syndromes avaient repris, sauf la fièvre. Par conséquent, une analyse de crachat a été effectuée en octobre 1992. On a mis en évidence des IgAs anti CP+++, le reste de la bactériologie étant négatif. Un traitement au Rulid® commercialisé par Roussel Uclaf a été prescrit. Les symptômes ont cédé sous le traitement, le diagnostic a ainsi été établi. Ce traitement est maintenant intermittent, avec un acrolide ou une cycline. Ainsi, les symptômes régressent, le bilan inflammatoire se normalise et la sérologie de Chlamydia pneumoniae sanguine diminue. A l'arrêt du traitement, tous les signes réapparaissent en quelques mois.
Par conséquent, grâce au procédé selon l'invention, on a pu détecter de manière fiable et manifestement juste, une infection a Chlamydia.
Exemple 2 : Uréthrite a Chlamydia trachomatis Un patient a été contaminé par Chlamydia trachomatis en 1986 lors d'un rapport sexuel avec une femme elle-même contaminée. Une uréthrite s'est déclarée. Trois semaines de cycline lui a été prescrite. Des prélèvements uréthraux sont effectués dans différents laboratoires, qui se révèlent négatifs. Mais, l'écoulement persiste.
A la fin de l'année 1990, les symptômes sont réapparus alors qu'il n'y avait pas eu de recontamination. En 1991, on a réalisé différents prélèvements uréthraux. On a observé Chlamydia à l'examen direct, c'est-à-dire par immuno-fluorescence directe ; accompagnée d'une leucocyturie. Les analyses de sang ont montré que la quantité de globules blancs a varié dans l'année de 9 000 à 12 000 par millimètre cube.
En 1992, on a effectué un prélèvement uréthral dans le cadre du procédé selon l'invention. On a ainsi révélé des IgAs anti CT+.
Désormais, le patient est suivi par son médecin généraliste. Différents antibiotiques sont essayés, la quantité de globules blancs diminue dans la prise de sang. Son état de santé s'améliore. A l'arrêt des médicaments, l'infection reprend, la quantité de globules blancs remonte. Cet état a duré un an sans qu'il y ait guérison.
Par conséquent, on a pu, sur ce patient encore, et grâce au procédé selon l'invention, diagnostiquer justement une infection a Chlamydia.
Exemple 3 : Prélèvement d'urine
Un patient présente des signes inflammatoires importants dans sa prise de sang. On met en évidence 11 600 globules blancs par millimètre cube, un taux de fibrine de 6 et une vitesse de sédimentation de 22 à 42. La PCR est de 104 alors que, normalement, cet indice doit être inférieur à 10. On observe, en outre, un - 170 000 hématies par millilitre,
- 10 800 000 leucocytes par millilitre,
- une absence de germes à la coloration de Gram,
- des cultures classiques négatives, et - des anticorps anti-Chlamydia trachomatis positif+++.
Les anticorps anti-Chlamydia trachomatis positif+++ ont été révélés par la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Là encore, le diagnostic réalisé au moyen de ce procédé est fiable et juste. Le procédé selon l'invention a d'ailleurs été utilisé pour d'autres patients en suivant le protocole décrit ci-dessus. On a montré que la présence d'anticorps, même faiblement positifs, dans les urines, était, a priori, corrélée avec des signes cliniques patents. Une forte baisse de la quantité d'anticorps produits dans les urines a pu être observée chez un des patients après traitement.
Donc, la détection d'infections a Chlamydia à l'aide du procédé selon l'invention est reproductible.
Exemple 4 : Prélèvement 'acné
On a effectué des prélèvements bactériologiques sur une patiente présentant des poussées d'acné depuis 1'adolescence. On a observé les éléments suivants : de nombreux polyneutrophiles, de peu nombreuses bactéries à la coloration de Gram. IgA anti CP+, et sur cultures classiques, de peu nombreux staph. épidermidis.
Il s'avère donc que Chlamydia pneumoniae est un des candidats à l'étiologie de l'acné.
Exemple 5 : Prélèvement de bouche (a) On a effectué des prélèvements d'aphtes au niveau de la gencive chez une patiente. On a ainsi diagnostiqué ce qui suit : (a) On a effectué des prélèvements d'aphtes au niveau de la gencive chez une patiente. On a ainsi diagnostiqué ce qui suit :
- peu nombreux polyneutrophiles, - des IgA IgM anti-herpès négatives,
- des cultures classiques négatives en germe pathogène, et
- de l'IgA anti CP négative, de l'IgM anti CP positive.
Donc, le procédé selon l'invention peut également être mis en œuvre sur des prélèvements de bouche.
(b) On a effectué des prélèvements au niveau des gencives, chez un patient. On a ainsi diagnostiqué ce qui suit :
- d'assez nombreux polyneutrophiles, - une absence de germe pathogène en culture classique,
- une absence de trichomonas tenax, de rares Candida albicans, et
- de l'IgA anti-Chlamydia psitacci positive.
Les anticorps liés à l'infection a Chlamydia peuvent donc être révélés sur des prélèvement de bouche au moyen du procédé selon l'invention. Chlamydia pneumoniae est un candidat à l'étiologie de la maladie de Behcet, et cela en partant de l'analyse d'aphtes buccaux récidivants, d'aphtes génitaux, d'uvéite, de synovite, de vascularite cutanée et de méningo-encéphalite.
Exemple 6 : Conjonctivite
Une patiente âgée avec une conjonctivite aiguë à chaque œil et pouvant à peine ouvrir les yeux, a subi des prélèvements. On observe qu'un œil de cette patiente est plus rouge et plus enflammé que l'autre, les IgA anti CP sont plus fortes sur cet œil que sur l'autre. Elles sont donc bien sécrétées in situ. D'autres recherches effectuées sont négatives sur les deux yeux : cultures classiques, IgA anti-mycoplasma, IgA anti-adénovirus, IgA anti-herpès. Par conséquent, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre sur des prélèvements provenant des yeux. On peut, également par ce type de prélèvement, mettre en évidence une infection a Chlamydia.
Exemple 7 : Sécrétions nasales
Un patient a subi un lavage de nez avec recherche d'éosinophilie. A cette occasion, il a été détecté par cytologie, de nombreux polyneutrophiles formant du pus, avec absence d'éosinophile. En bactériologie, on a observé des IgA anti CP++ avec cultures classiques négatives.
Exemple 8 : Liquide transcellulaire
On a réalisé un prélèvement de liquide synovial sur une patiente. Les résultats sont exprimés ci-après :
- protides : 29 grammes par litre alors que, normalement, le taux doit être compris entre 15 et 25,
- latex - waaler rose : négatif,
- peu de cristaux d'acide urique, - cytologie : 40 000 hématies ; 27 500 000 éléments nucléés par millilitre dont 70 % de polyneutrophiles, 8 % d'éosinophiles et 23 % de macrophages,
- bactériologie : IgA anti CP++, IgM anti CP+, cultures classiques et BK négatifs. Par conséquent, on peut également utiliser du liquide transcellulaire pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention. Partant d'un tel prélèvement, on peut aussi mettre en évidence une infection a Chlamydia. Exemple 9 : Urèthre et endocol On est parti, cette fois, de prélèvements d'urethres et d'endocols, pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention. On est, en fait, parti de cinquante prélèvements d'urethres et d'endocols.
On a cherché les IgA et IgM anti-Chlamydia trachomatis. On a ainsi obtenu :
- 6 positifs faibles en IgA,
- 6 positifs nets en IgA sans IgM, et - 4 positifs forts en IgA avec IgM faible.
Sur les quatre derniers, on a trouvé deux positifs en culture et il n'y a pas eu d'autres cultures positives par ailleurs. II est arrivé que, sur des prélèvements d'endocol, les IgA IgM anti-Chlamydia trachomatis soient négatives et les IgG, positives, avec une méthode directe de recherche du germe positive.
Les exemples montrent que le procédé selon l'invention est efficace pour la détection d'infections a Chlamydia trachomatis, pneumoniae et psitacci.
Grâce à ce procédé, on peut mettre en évidence et éventuellement quantifier des anticorps anti-Chlamydia produits par le système immunitaire associé aux muqueuses, et cela sur des prélèvements humains ou animaux fluides ou rendus fluides,, autres que le sang, dans un but de diagnostic médical.
Le procédé met en œuvre un immuno-marquage, en particulier une immuno-fluorescence indirecte. Le deuxième Ac utilisé peut être une anti-IgA, une anti-PS, une anti- igM, une anti-IgG ou autres.
Une réponse positive en certaines classes d'immunoglobulines : IgA, IgAs, IgM, éventuellement IgG ou peut-être toutes , semble être corrélée avec la phase active du cycle de multiplication de Chlamydiae, par opposition à une phase de latence ou état dormant.
La quantité d'anticorps obtenus est, apparemment, corrélée avec la quantité de germes présents dans les tissus voisins de celui du prélèvement, et avec la gravité de l'infection. On note que la réalisation du test dans les urines semble être d'une remarguable praticabilité.
Les exemples montrent que le procédé selon l'invention peut être utilisé de manière simple, fiable et efficace sur différents types de prélèvements, afin de révéler une infection a Chlamydia.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le diagnostic in vitro d'infections a Chlamydia du type trachomatis, pneumoniae ou psitacci, caractérisé par la mise en évidence et éventuellement la quantification d'anticorps produits par le système immunitaire associé aux muqueuses contre Chlamydia sp.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par une mise en contact de prélèvements humains ou animaux, autres que le sang, obtenus à l'état fluide ou remis en suspension dans un milieu liquide, avec l'antigène Chlamydia entier ou avec une partie du germe, en particulier sous forme de corps élémentaires ou bien d'inclusions dans des cellules, l'antigène étant lié à un support qui peut être le puits d'une lame.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé, après une incubation et un lavage, par la mise en contact avec le premier complexe Ag-Ac formé, des Ac anti- immunoglobulines humaines ou animales selon le cas, de nature IgAs, IgA, IgM, IgG ou autres, conjugués avec un marqueur, en particulier de type FITC, puis la lecture du signal obtenu, après lavage, en particulier la lecture de spots fluorescents obtenus au microscope.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé par une incubation en un temps avec mélange du prélèvement et du conjugué.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé par une immuno-capture permettant d'éliminer un facteur rhumatoïde éventuel.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on corrèle la présence d'anticorps anti-Chlamydia - d'une ou de plusieurs classes - avec une infection active chez le sujet prélevé.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on corrèle la quantité du signal obtenu, c'est-à- dire la quantité d'anticorps avec la quantité de Chlamydiae imprégnant les tissus voisins du prélèvement et avec la gravité de l'infection chez l'hôte.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0017460A1 (fr) * 1979-04-02 1980-10-15 Research Corporation Méthode d'examen par immunofluorescence et substance utilisée
WO1994011736A1 (fr) * 1992-11-18 1994-05-26 Calypte, Inc. Dosages immunologiques d'anticorps presents dans l'urine diriges contre des micro-organismes associes a des maladies sexuellement transmissibles

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Non-Patent Citations (1)

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Title
J. D. TREHARNE ET AL.: "Antichlamydial antibody in tears and sera, and serotypes of Chlamydia trachomatis isolated from schoolchildren in Southern Tunisia.", BRITISH JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY, vol. 62, no. 8, 1978, pages 509 - 515, XP002004565 *

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