WO1996016977A1 - Novel anti-hiv agent - Google Patents

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WO1996016977A1
WO1996016977A1 PCT/JP1995/002453 JP9502453W WO9616977A1 WO 1996016977 A1 WO1996016977 A1 WO 1996016977A1 JP 9502453 W JP9502453 W JP 9502453W WO 9616977 A1 WO9616977 A1 WO 9616977A1
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hydroxyl group
terminal
hiv
active ingredient
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PCT/JP1995/002453
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Akira Kaji
Hideko Kaji
Original Assignee
Akira Kaji
Hideko Kaji
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the present invention relates to a phosphorothioate-linked or phosphodiester-linked oligodoxynucleotide which exhibits excellent antiviral activity in diseases caused by HIV (Human Immunodeficiency Virus) as an active ingredient. On anti-HIV drugs.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • the present inventors have conducted various studies on the reduction of the molecular weight of an oligonucleotide compound having an inhibitory effect on HIV proliferation, and have previously conducted a short-chain sequence of 4 to 8 bases.
  • Godokin guanylic acid PCTZ JP 95 No. 00543
  • short-chain oligogoguanylic acid of 2 to 8 bases were found to have an inhibitory effect on HIV proliferation (PCT / JP 95 01456).
  • the present inventor has newly found phosphorothioate-linked and short-chain phosphorylated phosphorylated phospholinates of the 3′-terminal and / or 5′-terminal.
  • Godeoxy guanylic acid has an excellent inhibitory effect on HIV proliferation in both early infection and chronic infection.
  • the present inventor has conducted intensive studies on the anti-HIV activity of a homooligoma, which is a diester conjugate of A, G, C, and T, when the chain length was shortened.
  • C and ⁇ have anti-HIV activity even in a small molecule (short chain) such as a 4-base conjugate in spite of their lack of activity at 15 bases, and in G, their 5'-lin
  • the activity was enhanced by oxidation and 3'-phosphorylation, and this time, the anti-HIV activity was also observed in the new compound whose both ends of the oligomer were phosphorylated. Is found to be enhanced.
  • the present invention has been made based on each of these findings.
  • the present invention relates to a phosphorothioate-bonded or 3′-terminal and Z or 5 ′ represented by the general formulas (I :) to (V) described in the following items a) to e). Characterized in that it contains, as an active ingredient, one or more species selected from oligodeoxynucleotides linked to phosphorylated phosphorothioate at the terminal end.
  • New anti-HIV agents and 3'- and 5'-terminal phosphorylated phosphodiester-bonded oligodeoxynucleotides represented by general formula (V) described in (e) It is intended to provide a novel anti-HIV agent characterized in that it is contained as an active ingredient.
  • G represents a deoxyguanosine structure
  • s represents a phosphorothiophosphate residue forming an ester bond with an adjacent G
  • each s represents the left side of the formula.
  • G represents an ester bond with the 3′-hydroxyl group thereof, and G on the right-hand side forms an ester bond with the 5′-hydroxyl group.
  • -N represents an integer of 2 to 7.
  • G represents a deoxyguanosine structure
  • s represents a phosphorothiophosphoric acid residue forming an ester bond with an adjacent G
  • each s represents In the formula, G on the left side forms an ester bond with the 3′-hydroxyl group, G on the right side forms an ester bond with the 5′-hydroxyl group, and p on the right end indicates the adjacent G
  • G represents a deoxyguanosine structure
  • s represents a phosphorothiophosphate residue forming an ester bond with an adjacent G
  • each s represents G on the left side forms an ester bond with its 3′-hydroxyl group
  • G on the right side forms an ester bond with its 5′-hydroxyl group
  • P on the left end is an ester bond with an adjacent G.
  • n represents an integer of 2 to 7).
  • G represents a deoxyguanosine structure
  • s represents a phosphorothiophosphate residue forming an ester bond with an adjacent G
  • each s represents In the formula, G on the left is the 3'-hydroxyl group, and G on the right is the These are those that form an ester bond with the hydroxyl group at the 5'-position, and P at both ends represent a phosphoric acid residue that forms an ester bond with the adjacent G, and each is at the 5'-position of the terminal G. It forms an ester bond with a hydroxyl group (left end) and a hydroxyl group at the 3′-position of the terminal G (right end), and n represents an integer of 1 to 5.
  • E It is characterized by containing, as an active ingredient, a 3'- and 5'-terminal phosphorylated phosphodiester-bonded oligonucleotide represented by the following general formula (V): Anti-HIV drugs.
  • G represents a deoxyguanosine structure
  • p represents a phosphoric acid residue forming an ester bond with an adjacent G
  • each p at the terminal represents a terminal G
  • G Forms an ester bond with the 5'-hydroxyl group (left end) and the 3'-hydroxyl group (right end) of the terminal G, and each p located between the two Gs is directed toward the formula.
  • G on the left side is a 3′-hydroxyl group and G on the right side is an ester bond with the 5′-hydroxyl group.
  • the oligodeoxynucleotides represented by the above general formulas (I) to (V), which are the active ingredients of the anti-HIV agent of the present invention, are generally used in the synthesis of oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 18 5433; Daraha and 0gi1vie, can be formed by conventional methods used. Methods in Mol. Biol. 2081; see Eckstein, Ann. Rev. Biochem 54 367). Preferred synthetic methods for synthesizing the above oligodeoxynucleotides, which are the active ingredients of the anti-HIV agent of the present invention, are referred to as [Synthetic Method A] to [Synthetic Method E]. Examples are given below.
  • the 3'-terminal nucleotide of the target DNA is bound to a commercially available support such as Conto-GlupoGlass (CPG).
  • CPG Conto-GlupoGlass
  • the starting material is used as a starting material, and the 4,4′-dimethoxytriethyl group, which is a protecting group for the 5′-hydroxyl group of this nucleotide, is removed with trichloroacetic acid or the like.
  • the unreacted 5′-hydroxyl group is preferably protected by acetic anhydride, dimethylaminopyrrolidine or the like, or by acetylation.
  • the 3'-terminal phosphorylation reagent (2— (4,4'-dimethoxycitroxy) ethylsulfonyl] ethynolesuccinic acid) is a commercially available control pore gel.
  • the starting material is one bound to a support such as styrene (CPG), and the 4,4 'dimethyloxytrityl group, which is the protecting group, is removed with trichloroacetic acid or the like.
  • tetramidazole is used as a condensing agent, and the amino acid group of a nucleic acid base as a commercially available monomer is protected with an isobutyl group [5'— o — Condensation of dimethoxy citrate 3'-methodine, ⁇ -diisopropylamino phosphine deoxy guanosine.
  • an isobutyl group [5'— o — Condensation of dimethoxy citrate 3'-methodine, ⁇ -diisopropylamino phosphine deoxy guanosine.
  • it is preferable to protect the unreacted hydroxyl group by introducing an acetylated group with acetic anhydride, dimethylaminopyridine, or the like.
  • the phosphoric acid portion is oxidized to a tri-ester form using iodine, and is a protecting group for the hydroxyl group at the 5'-position of the deoxynucleotide corresponding to the 3'-terminal 4 , Removes the 4 'dimethoxy trityl group.
  • the second amidite reagent from the 3'-terminal side is compacted using tetrazole as a condensing agent, and then tetraethylthiuram disulfide (or Alternatively, sulfuration of the phosphorus moiety is carried out using 3-1-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide) to produce phosphorothiotries.
  • this nucleotide is used as a starting material.
  • the 4.4'-dimethoxytrityl group which is a protecting group for the hydroxyl group at the 5'-position, is removed with trichloroacetic acid or the like, and the second unit from the 3'-terminal end is a unit for sale.
  • Amidite reagent in which the amino group of the nucleic acid base as a dimer is protected with an isobutyl group (5'-o-dimethyl trimethyl 3 '-methoxy Condensation of diisopropylaminophosphine nucleoside) with tetrazole as a condensing agent. At this time, it is desirable to protect the unreacted 5′-terminal hydroxyl group by acetylation with acetic anhydride, dimethylaminopyrrolidine or the like.
  • a phosphorylating reagent [2— (4,4′—dimethoxycitroxyl) ethylsulfonyl- (2—cyanoethyl)
  • N, N-diisopropyl) -phosphoramidite After condensing N, N-diisopropyl) -phosphoramidite, the phosphorous portion is oxidized using iodine, leading to a phosphoric acid triester.
  • Each of the internucleotides is converted from a triester to a diester by the annealing treatment, and the base is simultaneously removed with the ammonia treatment after the separation from the support.
  • a protecting group is formed, and thus the target phosphorylated phosphorothioate-linked phosphoryl at the 5'-terminal is targeted. How to get Gododeux nucleotides.
  • 3'-terminal phosphorylation reagent [2— (4,4'-dimethylmethoxylethyl) ethylsulfonyl] ethylsuccinate) is a commercially available control pore glass (CPG). ), Etc., as a starting material, and the protective group of this, 4,4'-dimethoxycitryl, is removed with trichloroacetic acid or the like, and tetrazole is used.
  • 3'-terminal phosphorylation reagent [2— (4,4'-dimethoxycitroxy) ethinoresnolephonyl) ethynolesuccinic acid) is a commercially available control
  • Starting materials are those bound to a support such as Cholepore Glass (CPG), and the 4,4'-dimethoxycitryl group, which is the protective group, is used as a starting material.
  • CPG Cholepore Glass
  • Amidite reagent (5′-diamine) in which the amino group of the nucleobase as a commercially available monomer is protected with an isobutyl group as a condensate of tetrazole as a condensate Methoxy trityl 1 '— methoxy ⁇ , ⁇ — Condensation of diisopropylamino phosphine guanosine. Unreacted hydroxyl groups are preferably protected by acetic anhydride, dimethylamino pyridine or the like, or by acetylation. After this, the phosphoric acid portion is oxidized using iodine, leading to a triester.
  • a phosphorylation reagent (2— [2_ (4,4 ')-dimethoxytrityloxy) is added to the 5' end. Condensation of tylsulfonyl- (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoramigite), followed by oxidation of the phosphorus portion using iodine, Then, each of the nucleotides is converted from a triester to a diester by a thiophenol treatment, followed by an ammonia treatment.
  • the base moiety is deprotected at the same time as being cleaved from the support, and the target phosphorylated phosphodiester-linked oligodiester at the 3′- and 5′-positions represented by the above general formula (V) is obtained. How to get a nucleoside.
  • each short-chain oligodoxysuccinic acid which is an active ingredient of the anti-HIV agent of the present invention, is a commercially available product (Oligoetse, Wilsonville, Oregon, United States of America). (Synthesis, purification, etc.) can also be used.
  • the effect is not recognized with the short base of 6 nucleotides of phosphorothioate-linked oligodoxyadenylic acid, deoxythidic acid, and oligomidoxy nucleoside thymidine.
  • the phosphorothioate-linked or phosphodiester-linked oligodeoxyguanylic acid of the present invention is remarkably effective.
  • ⁇ 9 ⁇ cells (Science, 224, 497, 1984), cells that are chronically infected with HIV and constantly release HIV in the culture medium, are placed in a 96-well microplate at 5 ⁇ 10 4 cells. Per well, and phosphorothioate-linked oligodeoxynucleotide was added thereto, and the cells were cultured at 37 ° C under 5% carbon dioxide for 5 days. Oligonucleotide was added three times only on the first day or every two days. The amount of HIV released into the culture was measured using the p24 antigen atskit (Coulter). In addition, live cells were measured by the MTT method in order to examine the damage of the oligonucleotides to the cells. Table 3 shows the results.
  • the active components of the anti-HIV agent of the present invention are phosphorothioate-conjugated type and 5'-terminal phosphorylated phosphorothioate-linked oligodeoxy.
  • Ngua The four bases of nitric acid showed an inhibitory effect on chronically infected HIV-1 at a concentration that did not show cytotoxicity. It has been evaluated for its excellent properties as an AIDS therapeutic.
  • the four bases of the 5'-terminal phosphorylated phosphorothioate conjugated oligodoxy guanylate act during the HIV-1 infection growth cycle to show anti-HIV activity.
  • the test was performed. After the H9 cells HIV- 1 infected, inoculated in an amount of 5 xl O 4 cells well in 96 Anama I click opening up rate, phospho Rochioe preparative coupled Oh Li Godoki in g Aniru acid per various times After adding 100 / ig / ml, the cells were cultured at 37 ° C under 5% carbon dioxide for 48 hours. The amount of HIV released into the culture was measured using a p24 antigen atskit (Coulter).
  • the 4-base conjugate of the 5'-terminal phosphorylated phosphorothioate-linked oligodeoxyguanylic acid of the present invention shows the highest effect immediately after infection, and the effect is slightly increased by the subsequent addition. Sufficient effects were observed even after 20 hours of addition, although thin.
  • the active ingredient of the present invention, the phosphorothioate-linked oligodeoxyguanylic acid, particularly its 4-base conjugate can be used in at least two HIV-1 infection processes (early infection and early HIV infection). It is suggested that the virus gene acts in the late stage of the integration of the virus gene into the host cell gene), and thus, as a multi-step drug, the emergence of drug-resistant virus, which is a therapeutic problem, occurs. It is also expected to have a difficult effect.
  • l No mortality was observed in oral administration of OO rag Z kg, confirming that the product was highly safe.
  • novel anti-HIV agent according to the present invention is particularly useful as a therapeutic agent for retroviral infections such as AIDS, and there is no particular limitation on the mode of administration, and the compound or its compound is not particularly limited.
  • an appropriate dosage form is selected and used using a known pharmaceutical carrier, and examples thereof include tablets, capsules, granules, fine granules, and powders. It can be any oral dosage form or parenteral dosage form such as injections, infusions and suppositories.
  • the required dosage as an oral preparation depends on the age, weight, and degree of the disease of the patient, but the dosage for adults is usually divided into several doses of O.lg to 6 g. Take.
  • oral preparations such as tablets, capsules and granules
  • a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity enhancer, a flavoring agent, a coloring agent, a fragrance, etc. are appropriately selected and used in addition to the above-mentioned excipients. can do. Specific examples are as follows.
  • Starch hydroxypropyl propyl starch, carboquine methyl cenorreose sodium, calcium carboxymethyl cellulose, carboxymetyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl phenolate phenol .
  • Talc raw materials, hydrogenated vegetable oil, sucrose fatty acid ester, magnesium stearate, polyethylene glycol.
  • the oligodeoxynucleotide represented by the above general formula (I) may also be administered as a suspension, emulsion, syrup or elixir. These various dosage forms can contain flavoring agents and coloring agents.
  • Intravenous, infusion It is administered by intravenous, subcutaneous, or intramuscular injection.
  • This parenteral preparation can be manufactured by a conventional method.
  • the diluents generally include distilled water for injection, saline, aqueous solution of glucose, vegetable oil for injection, sesame oil, laccase oil, soybean oil, corn oil, propylene oil. Lenght call, polyethylene glycol, etc. can be used.
  • fungicides, preservatives and stabilizers can be added if necessary. From the viewpoint of stability, this parenteral preparation is filled in a vial or the like, frozen, and the water is removed by a conventional freeze-drying technique. Solution can be re-prepared. In formulating, if necessary, an isotonic agent, a stabilizer, a preservative, an analgesic agent and the like can be appropriately added.
  • parenteral preparations examples include liquid preparations for external use, liniments such as plasters, suppositories for rectal administration, and the like, all of which can be produced by a conventional method.
  • magnesium stearate 2 0.5% by weight magnesium stearate
  • This tablet contains 20 mg of pGsGsGsGsG in a single tablet. This tablet is taken in 4 divided doses of 4 to 8 tablets per adult.
  • G s G s G s G s G s G s G, G s G s G s G p, p G p G p G P G p G p, and p G s G s G s G s G p are also obtained by the prescription of Example 1 above.
  • One tablet of 200 mg was obtained.
  • a total of 100 parts by weight According to the above formula, 1, 2 and 5 are mixed until homogenous, kneaded by a conventional method, extruded, and dried and crushed by a granulator. This was mixed with (3) and (4), and the mixture was compression-molded with a tableting machine to obtain a tablet of 200 mg per tablet.
  • This tablet contains pGsGsGsG 20 mg strength ⁇ . This tablet is divided into 4 to 8 tablets for adults 1 It is taken.
  • GsGsGsG, GsGsGsGp, pGpGpGpGp and pGsGsGsGp was also prepared according to the formulation of Example 2 above. 200 mg tablets were obtained.
  • novel anti-HIV agent according to the present invention is effective for treating diseases caused by HIV (AIDS virus), AIDS and ARC.
  • FIG 1 shows the results of an anti-HIV activity test with various drugs added at various times after HIV-1 infection.

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Description

明 細 書
新規抗 H I V剤
産業上の利用分野
本発明は、 H I V (Human Immunodeficiency Virus)に よ る疾患において、 優れた抗ウ ィ ルス作用を示すホスホ ロ チォエー ト結合型 も し く はホスホ ジエステル結合型ォ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドを有効成分とする抗 H I V剤 に関する ものである。
背景技術
D N Aのオ リ ゴホモデォキ シ ヌ ク レオチ ドに関する従 来の知見と しては、 15塩基および 20塩基のホスホ ロチォ エー ト結合体に H I V増殖阻止作用があ るこ とがア グラ ヮル等によ り報告され、 その効果は鎖長に起因 し、 塩基 の種類に依存 しないと報告されている （Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 85, 7079, 1988) 0
ま た、 マツ ク ラ等によ り 28塩基のデォキ シ シチ ジ ンホ スホ ロ チォエー ト結合体に H I V増殖阻止作用がある こ と力、'報告されている （Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7706. 1987) 。 さ らに最近、 ワ イ ア ッ ト等によ り 8塩基 のホスホロ チォエー ト桔合体に H I V増殖阻止作用があ る こ と力 報告された（Pro Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1356. 1994) 。
他方、 ホスホ ジエステル結合型のホモオ リ ゴマーに関 する従来の知見と しては、 2'—デォキ ンアデノ シ ン （以 下、 A と略記する） 、 2'—デォキ シ グア ノ シ ン （以下、 G と略記する） 、 2'—デォキ シ シ ト シ ン （以下、 C と略 記する） および 2'—デォキ シ シチ ジ ン （以下、 Τ と略記 する） の 15塩基が H I Vの増殖に対 して有効である こ と がア グラ ヮ ル等によ り報告され、 その有効性については 鎖長の長いホモオ リ ゴマーである こ とか ら、 逆転写酵素 の铸型と して有利に働き、 Η I Vの核酸と競合する こ と に基づ く と推定 した と報告されている （前掲論文） 。
マ ジ ユ ンダル等も、 Cのホスホ ジエステル型結合体で あ る 28塩基が H I Vの増殖に対 して有効である こ とを報 告 している （Biochemistry. 28, 1340, 1989) 。
ク ロ ーケは、 これらを総括 して、 ホモポ リ マーの活性 は、 Cが最も強 く 、 T と Aでは、 Tがやや強いこ と、 そ の活性は、 じ の 28塩基を例示 して、 鎖の長さ に依存 して いる と述べている ( Anti Cancer Drug Design, 6, 609, 1991) 。 しか し、 上記従来、 H I V増殖阻止作用があ る と されている ヌ ク レオチ ドは、 いずれも 8塩基ある いは それ以上の長鎖ヌ ク レオチ ドのため、 これを調製する上 で問題があ り 、 ま た、 生体内に投与 した場合の吸収性、 安定性の点において も問題がある。
本発明者は、 かかる問題点を解決するために、 H I V 増殖抑制作用を有するオ リ ゴヌ ク レオチ ド化合物の低分 子化について種々 研究を重ね、 先に 4〜 8塩基の短鎖ォ リ ゴデォキ ン グァニル酸（PCTZ JP 95ノ 00543) および 2 〜 8塩基の短鎖オ リ ゴグァニル酸が H I V増殖阻止作用 有する こ とを見出 した（PCT/ JP 95 01456)。 本発明者は、 更に研究を重ねた結果、 新たにホスホ ロ チォエ ー ト桔合型および 3'位末端および ま たは 5 '位末 端 リ ン酸化ホスホ ロ チォエー ト桔合型短鎖オ リ ゴデォキ シ グァニル酸が初期感染および慢性感染のいずれにおい て も優れた H I V増殖阻止作用 を有する こ と を見出 し た。
さ らに本発明者は、 A 、 G 、 C 、 Tの ジエステル結合 体であ る ホモオ リ ゴマ一において鎖長を短 く した場合に ついての抗 H I V活性につき、 鋭意研究 した結果、 先に A 、 C 、 Τでは、 15塩基で活性がないに もかかわ らず、 Gでは、 4 塩基結合体とい う 低分子 （短鎖） ものにおい て も抗 H I V活性を有 し、 その 5'— リ ン酸化および 3'— リ ン酸化によ り 活性が増強する こ とを見い出 したが、 さ らに今回新たにオ リ ゴマーの両末端が リ ン酸化された化 合物において も抗 H I V活性が増強される こ とを見い出 した。 本発明は、 こ れ らの各知見に基づいてな された も のであ る。
すなわち、 本発明は、 下記ィ）〜ホ）項に記載の一般式 ( I ：)〜（V )で示される ホスホロ チォエ ー ト結合型 も し く は 3 '位末端および Zま たは 5'位末端 リ ン酸化ホスホ ロ チ ォエ ー 卜結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドか ら各々 選 択される 1 種又は 2 種以上を有効成分と して含有する こ と を特徴 とす る新規な抗 H I V剤、 およびホ）項に記載 の一般式（ V )で示される 3'位および 5'位末端 リ ン酸化ホ スホ ジエステル結合型オ リ ゴデォキ ン ヌ ク レオチ ドを有 効成分と して含有する こ とを特徴とする新規な抗 H I V 剤を提供する ものであ る。
ィ ） 下記一般式（ I )で示されるホスホロ チォエ ー ト結合 型オ リ ゴデォキシ ヌ ク レオチ ドか ら選択される 1 種又 は 2種以上を有効成分と して含有する こ とを特徴とす る抗 H I V剤。
Figure imgf000006_0001
(式中、 Gはデォキ シグア ノ シ ン構造を表 し、 s は隣 接する G とエステル結合を形成 している ホスホロ チォ リ ン酸残基を表 し、 各 s は、 式中向かって左側の G と はその 3'位水酸基と、 ま た右側の G とはその 5'位水酸 基とそれぞれエステル結合を形成している ものであ り - n は 2〜 7 の整数を表わす。 ）
口） 下記一般式（ I I )で示 される 3' 位末端 リ ン酸化ホス ホロ チォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキ ン ヌ ク レオチ ドか ら選択される 1種ま た 2種以上を有効成分と して含有 する こ とを特徴とする抗 H I V剤。
( G s ) „G p ( II)
(式中、 Gはデォキ シ グア ノ シ ン構造を表わ し、 s は 隣接する G とエステル結合を形成 している ホスホ ロ チ オ リ ン酸残基を表わ し、 各 s は、 それぞれ式中向かつ て左側の G と はその 3'位水酸基と、 ま た右側の G と は その 5'位水酸基とそれぞれエステル結合を形成 してい る ものであ り 、 右端の p は隣接する G とエステル結合 を形成 している リ ン酸残基を表わ し、 3'位末端水酸基 とエステル結合を形成 している ものであ り 、 n は 2 ~ 7 の整数を表わす。 ）
ハ） 下記一般式（ I I I )で示される 5' 位末端 リ ン酸化ホス ホ ロ チォェ一 ト結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドか ら選択される 1 種ま たは 2種以上を有効成分と して含 有する こ とを特徴とする抗 H I V剤。
p (G s )n G ( III)
(式中、 Gはデォキ シ グア ノ シ ン構造を表 し、 s は隣 接する G とエステル結合を形成 している ホスホ ロ チォ リ ン酸残基を表 し、 各 s は、 式中向かって左側の G と はその 3'位水酸基と、 ま た右側の G とはその 5'位水酸 基とそれぞれエステル結合を形成 している も のであ り 左端の P は隣接する G とエス テル結合を形成 している リ ン酸残基を表 し、 5'位末端水酸基とモ ノ エス テル結 合を形成 している ものであ り 、 n は 2 ない し 7 の整数 を表す） 。
二） 下記一般式（IV)で示 される 3'位および 5'位末端 リ ン 酸化ホスホ ロ チォエー ト結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レ ォチ ドから選択さ れる 1 種ま たは 2種以上を有効成分 と して含有する こ とを特徴とする抗 H I V剤。
p G s ( G s ) n G p ( IV)
(式中、 Gはデォキ シ グア ノ シ ン構造を表 し、 s は隣 接する G とエ ス テ ル結合を形成 している ホスホ ロ チォ リ ン酸残基を表 し、 各 s は、 それぞれ式中向かっ て左 側の G と はその 3'位水酸基と、 ま た右側の G と はその 5'位水酸基とそれぞれエステル結合を形成 している も のであ り 、 両端の P は隣接する G とエステル結合を形 成 している リ ン酸残基を表 し、 それぞれ末端 Gの 5'位 水酸基 （左端） および末端 Gの 3'位水酸基 （右端） と エステル結合を形成 している ものであ り 、 n は 1 ない し 5の整数を表わす。 ）
ホ） 下記一般式（V )で示 される 3'位および 5'位末端 リ ン 酸化ホスホ ジエステル結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオ チ ドを有効成分 と して含有する こ と を特徴 とする抗 H I V剤。
p G p G p G p G p ( V )
(式中、 Gはデォキ シグア ノ シ ン構造を表わ し、 p は、 隣接する G とエス テル結合を形成 している リ ン酸残基 を表わ し、 末端の各 p はそれぞれ末端 Gの 5'位水酸基 (左端） および末端 Gの 3'位水酸基 （右端） とエステ ル結台を形成 してお り 、 2個の Gの間に位置 している 各 p は、 それぞれ式中向かって左側の G とはその 3'位 水酸基と、 また右側の G とはその 5'位水酸基とそれぞ れエステル結合を形成 している ものであ る。 ）
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の抗 H I V剤の有効成分であ る上記一般式（ I ) 〜（ V )で示されるオ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ド類は、 一 般に、 オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ド合成に用い られる常 用の手法によ り 台成する こ とができ る （Scari ngeら . Nucleic Acids Res. 18 5433 ； D a ra h aと 0 g i 1 v i e， Methods in Mol . Biol. 20 81； Eckstein, Ann. Rev. Biochem 54 367参照） 。 本発明の抗 H I V剤の有効成分 であ る上記各オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ド類の合成法と して好ま しい代表的合成法を 〔合成法 A〕〜〔合成法 E〕と して、 以下に例示する。
〔合成法 A〕
ホスホア ミ ダイ ト法で固相合成する場合には、 目的 と する D N Aの 3'位末端ヌ ク レオ シ ドが、 市販のコ ン ト 口 —ルポァ グラ ス （ C P G ) 等の支持体に結合 した ものを 出発原料と し、 こ のヌ ク レオ シ ドの 5'位水酸基の保護基 である 4, 4'ー ジメ ト キ シ ト リ エチル基を ト リ ク ロ 口酢酸 等で除 く 。 3'位末端側からの 2番目に相当する単量体と しての核酸塩基のァ ミ ノ 基をイ ソ ブチル基で保護 した市 販のア ミ ダイ ト試薬 （5'— 0 — ジメ ト キ シ ト リ エチルー 3' — メ ト キ シ 一 Ν, Ν— ジイ ソ プロ ピルア ミ ノ ホ ス フ ィ ン デォキ シ ヌ ク レオ シ ド） を、 テ ト ラ ゾールを縮合剤と し て、 先の ものに縮合 させる。 こ の際未反応の 5'位水酸基 は、 無水酢酸、 ジメ チルァ ミ ノ ピ リ ジ ン等によ り 、 ァセ チル化等によ り 保護 してお く こ とが好ま しい。 こ の後、 テ ト ラ ェチルチ ウ ラ ム ジ スル ヒ ド （ま たは 3Η— 1， 2— ベ ンゾジチオル一 3 —オ ン 1.1一 ジォキサイ ド） を用いて リ ン部分の硫化を行ない、 次いでホスホロ チォ ト リ エス テル体に導 く 。 以上の手順を目的とする鎖長のオ リ ゴヌ ク レオチ ドとな る まで繰 り返 した後、 最終的にチォフ エ ノ ール処理によ り 、 各イ ン タ ー ヌ ク レオチ ドを ト リ エス テル体か ら ジエステル体に変換 した後、 ア ンモニア処理 によ り 、 支持体よ り 脱離させる と同時に塩基部の脱保護 基を行ない、 目的とする ホスホロチォエ ー 卜結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ド とする方法。
〔合成法 B〕
3'位末端 リ ン酸化試薬 （ 2 — 〔 2 — （4, 4'ー ジメ ト キ シ ト リ チ ロ キ シ） ェチルスルホニル〕 ェチノレコ ハ ク酸） が、 市販の コ ン ト ロ ールポア グラ ス （ C P G ) 等の支持 体に結合 した ものを出発原料と し、 こ の も のの保護基で ある 4, 4' ジ メ ト キ シ ト リ チル基を ト リ ク ロ 口酢酸等で除 いた後、 テ ト ラ ゾ一ルを縮合剤と して、 市販の単量体と しての核酸塩基のア ミ ノ 基をイ ソプチ リ ル基で保護 した ア ミ ダイ ト試薬 〔5' — o — ジ メ ト キ シ ト リ チルー 3'— メ ト キ シ 一 Ν , Ν— ジイ ソプロ ピルア ミ ノ ホスフ ィ ンデォキ シ グア ノ シ ン） を縮合させる。 こ の際未反応の水酸基は、 無水酢酸、 ジメ チルァ ミ ノ ピ リ ジ ン等によ る ァセチル化 基の導入等によ り 保護 してお く こ とが好ま しい。 こ の後、 ヨ ウ素を用いて リ ン酸部分の酸化を行ない ト リ エステル 体と した後、 3'位末端に相当するデォキ シ ヌ ク レオチ ド の 5'位水酸基の保護基である 4, 4' ジメ ト キ シ 卜 リ チル基 を除去する。 次に、 3'位末端側か らの 2番目 に相当する ア ミ ダイ ト試薬を、 テ ト ラ ゾールを縮合剤 と して縮台 さ せた後、 テ ト ラ ェチルチウ ラ ム ジスルヒ ド （ま たは 3Η 一 1 , 2—ベン ゾジチオル一 3 —オ ン 1 , 1ー ジオキサイ ド） を用いて リ ン部分の硫化を行い、 ホスホ ロ チォ ト リ エス テル体とする。 こ の後、 た とえば上記一般式（II)の n が 3〜 7 の各オ リ ゴヌ ク レオチ ドについては、 以上の反応 を目的 とする鑌長にな る まで繰 り返 した後、 最終的には チオフ ヱ ノ ール処理によ り 、 各ィ ンタ ー ヌ ク レオチ ドを ト リ エステル体から ジエステル体に変換 し、 その後、 ァ ンモニァ処理によ り 、 支持体よ り切 り 出すと同時に塩基 部の脱保護を行ない、 目的とする 3'位末端 リ ン酸化ホス ホ ロ チォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドを得 る方法。
〔合成法 C〕
目的 とする D N Aの 3'位末端ヌ ク レオ シ ドが、 市販の コ ン ト ロ ールポア グラ ス （ C P G ) 等の支持体に結合 し た ものを出発原料と し、 こ の ヌ ク レオ シ ドの 5'位水酸基 の保護基であ る 4.4'— ジ メ ト キシ ト リ チル基を ト リ ク ロ 口酢酸等で除き、 3'位末端側か らの 2番目 に相当する巿 販の単量体と しての核酸塩基のァ ミ ノ 基をィ ソ ブチル基 で保護 したア ミ ダイ ト試薬 （ 5'— o — ジメ ト キ シ ト リ チ ルー 3' — メ ト キ シ 一 Ν, Ν— ジイ ソプロ ピルァ ミ ノ ホスフ イ ンデォキ シ ヌ ク レオ シ ド） を、 テ ト ラ ゾールを縮合剤 と して縮合させる。 こ の際、 未反応の 5'位末端水酸基は 無水酢酸、 ジ メ チルァ ミ ノ ピ リ ジ ン等によ る ァセチル化 等によ り 保護 してお く こ とが望ま しい。 つぎに、 テ ト ラ ェチルチウ ラ ム ジスルヒ ド （または 3 Η— 1 , 2—べンゾジ チォルー 3 —オ ン 1.1ー ジオキサイ ド） を用いて リ ン部 分の硫化を行ない、 ホスホ ロ チォ ト リ エステル体に導 く こ の後、 上記一般式（ I I I )の nが 3〜 8の各オ リ ゴヌ ク レオチ ドの場合については、 以上の反応を目的とする鎖 長にな る ま で繰 り返 した後、 最終的には、 5'位末端に リ ン酸化試薬 （ 2 — 〔 2 — (4, 4'— ジメ ト キ シ ト リ チ ロ キ シ〕 ェチルスルホニルー （ 2 — シァ ノ エチル） 一 （ N, N— ジイ ソ プロ ピル） 一 ホスホラ ミ ダイ ト） を縮合させた後、 ヨ ウ素を用いて リ ン部分の酸化を行ない、 リ ン酸 ト リ エ ステル体に導き、 次にチオフ ヱ ノ ール処理に よ り 、 各ィ ンタ ー ヌ ク レオチ ドを ト リ エステル体か ら ジエステル体 に変換 し、 ま た、 ア ンモニア処理によ り 、 支持体からの 離脱と同時に塩基部の脱保護基を行ない、 か く して、 目 的とする 5'位末端 リ ン酸化ホスホ ロ チォエー ト結合型ォ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドを得る方法。
〔合成法 D〕
3'位末端 リ ン酸化試薬 （ 2 — 〔 2 — (4， 4'— ジメ ト キ シ ト リ チ ロキ シ） ェチルスルホニル〕 ェチルコハ ク 酸） が市販の コ ン ト ロ ールポア グラ ス （ C P G ) 等の支持体 に結合 した ものを出発原料と し、 こ の ものの保護基であ る 4, 4'— ジメ トキ シ ト リ チル基を ト リ ク ロ 口酢酸等で除 き テ ト ラ ゾールを縮合体と して市販の単量体 と しての核 酸塩基のァ ミ ノ 基をイ ソ プチ リ ル基で保護 したァ ミ ダイ ト試薬 （ 5'— ジメ ト キ シ ト リ チル一 3'— メ ト キ シ 一 N, N ー ジイ ソ プロ ピルァ ミ ノ ホスフ ィ ンデォキ ン グア ノ シ ン） を縮合させる。 未反応の水酸基は、 無水酢酸、 ジ メ チル ア ミ ノ ピ リ ジ ン等を用いてァセチル化等によ り 保護 して お く こ とが好ま しい。 こ の後、 テ ト ラ ェチルチウ ラ ム、 ジスルヒ ド （または 3H— 1 , 2—ベンゾジチオル一 3 —ォ ン 1, 1— ジオキサイ ド） を用いて リ ン部分の硫化を行な い、 ホスホロ チォ ト リ エステル体に導 く 。 以上の反応を 目的 とする鎖長にな る まで繰 り返 した後、 5'位末端に リ ン酸化試薬 （ 2 — 〔 2 — (4， 4'— ジメ ト キ シ ト リ チ ロキ シ〕 ェチルスルホニル一 （ 2 — シァ ノ エチル） 一（N, N— ジイ ソ プロ ピル） 一 ホスホラ ミ ダイ ト） を縮合 させる。 こ の後、 ヨ ウ素を用いて リ ン部分の酸化を行ない、 リ ン 酸 ト リ エステル体に導 く 。 次にチオフ ヱ ノ ール処理によ り 、 各イ ン夕 一 ヌ ク レオチ ドを ト リ エステル体から ジェ ステル体に変換 し、 その後、 ア ンモニア処理によ り 、 支 持体よ り切 り 出すと同時に塩基部の脱保護を行ない、 目 的とする上記一般式（IV)で表わされる 3'位および 5'位末 端 リ ン酸化ホスホロ チォエー ト結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドを得る方法。
〔合成法 E〕
3'位末端 リ ン酸化試薬 （ 2 — 〔 2 — ( 4， 4' — ジ メ ト キ シ ト リ チ ロ キ シ） ェチノレスノレホニル〕 ェチノレコハ ク酸） が市販の コ ン ト ロ ールポア グラ ス （ C P G ) 等の支持体 に結合 した ものを出発原料と し、 こ の ものの保護基であ る 4, 4'— ジ メ ト キ シ ト リ チル基を ト リ ク ロ 口酢酸等で除 きテ ト ラ ゾールを縮合体と して市販の単量体と しての核 酸塩基のア ミ ノ 基をイ ソ プチ リ ル基で保護 したア ミ ダイ ト試薬 （ 5' — ジ メ ト キシ ト リ チル一 3' — メ ト キシ一 Ν, Ν — ジイ ソプロ ピルァ ミ ノ ホスフ ィ ンデォキ シ グア ノ シ ン） を縮合させる。 未反応の水酸基は、 無水酢酸、 ジ メ チル ア ミ ノ ビ リ ジ ン等によ り 、 ァセチル化等によ り 保護 して お く こ とが好ま しい。 こ の後 ヨ ウ素を用いて リ ン酸部分 の酸化を行ない、 ト リ エステル体に導 く 。 以上の反応を 目的とする鎖長にな る ま で繰 り返 した後、 5 '末端に リ ン 酸化試薬 （ 2 — 〔 2 _ ( 4 , 4 ' — ジメ ト キ シ ト リ チロキ シ〕 ェチルスルホニル一 （ 2 — シァ ノ エチル） 一（ N, N— ジィ ソプロ ピル） 一ホスホラ ミ グイ ト ） を縮合させる。 こ の 後、 ヨ ウ素を用いて リ ン部分の酸化を行ない、 リ ン酸 ト リ エステル体に導 く 。 次にチオフ ヱ ノ ール処理によ り 、 各ィ ン 夕 ー ヌ ク レオチ ドを ト リ エステル体か ら ジエステ ル体に変換 し、 その後、 ア ンモニア処理によ り 、 支持体 よ り切 り 出すと同時に塩基部の脱保護を行ない、 目的 と する上記一般式（V )で表わされる 3 '位および 5 '位末端 リ ン酸化ホスホ ジエステル結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオ チ ドを得る方法。
ま た本発明の抗 H I V剤の有効成分である各短鎖オ リ ゴデォキ シ グァニル酸は、 市販の もの （ァ メ リ カ 台衆国 オ レ ゴン州 ウ ィ ルソ ン ビル、 オ リ ゴエ ト セ ト ラ社な どに よ り 合成、 精製） を使用する こ と もでき る。
次に実験例を挙げ、 本発明を さ らに詳 し く 説明する力 本発明の趣旨は こ れ ら実験例によ り制約される ものでは ない。
実験例 1 く MT - 4細胞（T細胞系）を用いた抗 H I V活性試 験〉
予め段階希釈 した各種オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドが 入っ ている 96穴マイ ク 口プレー 卜 に MT- 4細胞を 6 X 104 細胞ノ穴の量で撒き 、 さ ら にエイ ズウ イ ルス 〔H I V- 1 (IIIB )ま たは HI V- 2 (ROD) ： 約 50TCID 50 ( 50 %培養細胞感 染濃度） Z穴〕を感染させ、 37°C、 5 %二酸化炭素下で 5 日間培養 した。 感染によ る細胞障害抑制判定は、 5 日間 培養後の生細胞を MT T法 （J. Virol. Methods, 20, 309, 1988 ) で測定する こ とによ り求めた。 こ の結果を 表 1 および表 2 に示す。 表中、 表示 した各オ リ ゴヌ ク レ ォチ ドにおいて、 式中、 Aはデォキ シアデノ シ ン、 Cは デォキ シ シチ ジ ン、 Tはチ ミ ジ ンを表 し、 G、 p および s は、 前述の定義と同一の意味を表す。
HIV- 1に対する ED50
(50%細胞障害抑制濃度） CD 50 SI
G s G 100/ig/ml以上
Figure imgf000016_0001
G s G s G s G & 5 1
GsGsGsGsG 2.6^g/ml
AsAsAsAsAsA 100/igZml以上
C sCs C sC s C sC 100/igZral以上
TsTsTsTsTsT lOO/igZml以上
G s Gp lOOlig/ml以上
Figure imgf000016_0002
GsGsGsGp 4.9/igZml
Figure imgf000016_0003
pG sGsGsG 3.4/ig/ml
pGsGsGsGsGsG s G s G 1. /ig/ml
AsAsAsAsAsA 100/ig/mlJ¾±
C s C s Cs C sC sC lOO/zgZral以上
TsTsTsTsTsT 100/ig/ml以上
pG s G s Gp 52.3pg/ml
pGsGsGsGp 10.3/ig/ml
GpGpGp ΙΟΟί/g/ml以上 100/ig/ml以上 pGpGpGpGp 40.0/ig/ml lOO/igZml以上 2.5以上 表 1 に示されている とお り、 本発明の抗 H I V剤の有 効成分である前記一般式（ I )~ (V )で示されるホスホロ チォエ ー ト結合型 も し く はホスホ ジエステル型オ リ ゴグ ァニル酸は、 HI V- 1に対 して極めて優れた抗 H I V作用 を示すこ とが認め られた。
一方、 ホスホ ロ チォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキシアデ ニル酸、 デォキ ンチ ジ ン酸、 チ ミ ジ ン酸オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドの 6塩基の短鎖の ものでは効果は認め られ ないこ とか らみて、 本発明のホスホロ チォェ一 ト結合型 も し く はホスホ ジエステル結合型オ リ ゴデォキ シグァニ ル酸の有効性が際だっている こ とを示 している。
表 2
HIV-2に対する ED50
(50%細胞障害抑制濃度） p G s G s G s G 7. lp / ml 表 2 に示されている とお り 、 本発明の 5 ' 位末端 リ ン 酸化ホスホ ロ チォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキ シグァニル 酸の 4塩基体は H I V— 2 に対 して も極めて優れた効果 が認め られた。
なお、 本発明の上記表 1 および表 2 に示された各化合 物においては、 100 /( g m 1の濃度においていずれも細胞 毒性は示さなかっ た。
実験例 2 〈HI V- 1慢性感染細胞を用いた抗 H I V活性試 験〉
本発明の抗 H I V剤の有効成分の 1 つである ホスホ ロ チォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキ シ グァニル酸の 4塩基体 について急性感染および慢性感染に対する活性試験を行 つ た
H I Vが慢性的に感染 してお り培養液中に常に H I V を放出 している細胞である Η9ΖΙΠΒ細胞（Science, 224, 497, 1984) を 96穴マイ ク ロ プ レー ト に 5 X 104細胞/穴 の量で撒き、 そ こ にホスホ ロチォエー ト結合型オ リ ゴデ ォキ シ ヌ ク レオチ ドを添加 して、 37°C、 5 %二酸化炭素 下で 5 日間培養 した。 オ リ ゴヌ ク レオチ ドは初日 のみ、 あ るいは 2 日毎に計 3回添加 した。 培養液中に放出 され た H I V量を p24抗原ア ツ セィ キ ッ ト （コ ールタ ー社） を 用いて測定 した。 ま たオ リ ゴヌ ク レオチ ドの細胞への障 害を調べるため生細胞を M T T法で測定 した。 こ の結果 を表 3 に示す。
表 3
投与澳度 p24量
(tfg/ml) 投与回数 （対照群に対する％) 生細胞数 usbsGsu 100 x 1 75
25 x 3 89
50 x 3 59
pGsGsiiSb 100 x 1 34 85
25 x3 61 95 50 x3 24 82
TsTsGsGsGsGsTsT 100 x 1 97 76
50 x3 110 78 表 3 に示されている と お り 、 本発明の抗 H I V剤の有 効成分であ る ホスホロ チォエー ト桔合型および 5'位末端 リ ン酸化ホスホロ チォエー ト結合型オ リ ゴデォキ ン グァ ニル酸の各 4塩基体は、 慢性感染 HIV- 1に対 して も、 細 胞毒性を示さない濃度で抑制効果が認め られた。 こ の こ と は、 A I D S治療剤と して優れた特性を もつこ とを評 価される ものである。 さ らに表 3 に示される よ う に、 ま た、 ワ イ ア ッ ト等 も報告 している よ う にホスホ ロチォェ 一 ト結合型オ リ ゴチ ミ ジ ン酸デォキシ グァニル酸 8塩基 体（T s T s G s G s G s G s T s T ) は 100/ig/ mlの濃 度で 3 回投与 して も抑制効果は認め られず、 慢性感染に 対 して無効であ り 、 本発明の 4塩基体がワ イ ア ツ 卜のそ れよ り も格段に有効である こ とが示された。
実験例 3 く HI V- 1感染後の種々 の時間での薬物添加によ る抗 H I V活性試験〉
本試験では、 5'位末端 リ ン酸化ホスホロ チォェ一 ト結 合型ォ リ ゴデォキ シ グァニル酸の 4塩基体が HIV- 1感染 増殖生命環の どの過程で作用 して、 抗 H I V活性を示す か試験を行った。 H9細胞を HIV- 1感染させた後、 96穴マ ィ ク 口 プ レー ト に 5 x l O 4細胞 穴の量で撒き、 種々 の 時間ごと にホスホ ロチォエー ト結合型オ リ ゴデォキ ン グ ァニル酸を 100/ig/ml添加 して、 37°C、 5 %二酸化炭素 下で 48時間培養 した。 培養液中に放出 された H I V量を p24抗原ア ツ セィ キ ッ 卜 （コ ールタ ー社） を用いて測定 し た。 対照薬と して作用点の判っ ている 3'— デォキ シ— 3' 一 ア ジ ドチ ミ ジ ン、 硫酸デキス ト ラ ン（分子量 8000)、 HIV-1プロテア一ゼ阻害剤 Ro 31- 8959を比較のため用い た。 こ の試験の結果を後掲図 1 に示す。 図 1 から明 らかな よ う に、 硫酸デキス ト ラ ンは感染直 後においては有効であるが、 感染後 4 時間以降の添加に おいては効果が弱め られた。 3'—デォキ シー 3'—ア ジ ド チ ミ ジ ンは感染後徐々 に効果は薄れ、 1 4時間以降では 1 次感染に対する効果は硫酸デキス ト ラ ンと同様認め ら れな力、つた。 HIV-1プロテアーゼ阻害剤 Ro 31— 8959は 20 時間後の添加まで充分効果を認めた。 本発明の 5'位末端 リ ン酸化ホスホ ロ チォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキ ン グァ ニル酸の 4塩基結合体は、 感染直後で最も高い効果を示 し、 その後の添加によ り やや効果が薄 ら ぐ ものの 20時間 後の添加において も充分な効果が認め られた。 こ のよ う に、 本発明の有効成分である ホスホロ チォエ ー ト結合型 オ リ ゴデォキ ングァニル酸、 特にその 4塩基結合体は、 HI V- 1感染過程の少な く と も 2過程 （感染初期と ウ ィ ル ス遺伝子が宿主細胞遺伝子に統合された後期） において 作用する こ とが示唆 され、 したがっ て多過程に作用する 薬剤と して、 治療上問題になる薬剤耐性ウ ィ ルスの出現 が起こ り難いとい う 効果 も期待される ものである。
以上詳細に述べたよ う に、 本発明の抗 H I V剤の有効 成分であ る一般式（ I )〜（V )で表わされる各オ リ ゴデォ キ ン グァニル酸は、 極めて優れた抗 H I V作用を示 し、 その安全性については、 5'位末端 リ ン酸化ホスホ ロ チォ エ ー ト結合型オ リ ゴデォキ シグァニル酸の 4塩基結合 し た ものを用いてマウ スに 20rag// kgの静脈内投与を行な つ て こ れを確認 した。 ま た、 別の試験において同物質の l O O ra g Z k gの経口投与において死亡例が認め られず安全 性の高い ものである こ とが確認された。
本発明に係る新規な抗 H I V剤は、 A I D S等の レ ト ロ ウ ィ ルス感染症治療剤と して特に有用な ものであ り 、 その投与形態については、 特に制限はな く 、 化合物そ の ま ま 、 あ る いは公知の医薬用担体を用いて適宜の剤形の ものが選択 して使用 され、 その例 と しては、 錠剤、 カブ セル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤な どの経口投与剤や、 注 射剤、 点滴用剤、 坐薬な どの非経口投与剤とする こ とが でき る。
経口剤と しての所要量は、 患者の年齢、 体重、 疾患の 程度に よ り 異な るが、 通常、 成人での投与量は、 O . l g 〜 6 g を 1 曰 に数回に分けて服用する。
上記の錠剤、 カ プセ ル剤、 顆粒剤等の経口投与剤を調 製する には、 例えば、 デンプン、 乳糖、 白糖、 マ ンニ ッ ト、 カ ルボキ シ メ チルセルロース、 無機塩類な どの陚形 剤を用いて常法に従っ て製造する こ とができ る。
こ の種の製剤には、 前記賦形剤の他に適宜、 結合剤、 崩壌剤、 界面活性剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤、 着色剤、 香料等を選択 し、 使用する こ とができ る。 それ ぞれの具体例は、 以下に示す とお り であ る。
〔結合剤〕
デ ンプ ン、 デキ ス ト リ ン、 ア ラ ビア ゴム末、 ゼラ チ ン ヒ ド ロ キ ンプ ロ ピノレス タ ー チ、 メ チルセノレ ロ ー ス、 カ ル ボキ シ メ チルセ ル ロ ー ス ナ ト リ ウ ム、 ヒ ド ロ キ ン プ ロ ピ ノレセ ノレ ロ ー ス 、 結晶セ ノレ ロ ー ス 、 ェチルセ ノレ ロ ー ス、 ボ リ ビニ ノレセ ノレ ロ ー ス 、 マ ク ロ ゴー ル。
〔崩壊剤〕
デ ンプ ン、 ヒ ドロキ シプロ ピルスタ ーチ、 カルボキ ン メ チルセノレロ ースナ ト リ ウ ム、 力ノレボキ シメ チルセル口 ースカルシウ ム、 カ ルボキシメ チルセルロ ース、 低置換 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ノレセ ノレ ロ ー ス。
〔界面活性剤〕
ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ウ ム、 大豆 レ シチ ン、 シ ョ 糖脂肪 酸エ ス テ ル、 ポ リ ソ ノレべー ト 8 0。
〔滑沢剤〕
タルク 、 ロ ウ類、 水素添加植物油、 シ ョ 糖脂肪酸エス テル、 ステア リ ン酸マ グネ シウ ム、 ポ リ エチ レ ング リ コ 一ル。
[流動性促進剤〕
軽質無水ゲイ酸、 乾燥水素化ア ル ミ ニ ウ ム ゲル、 合成 ゲイ酸アル ミ ニウ ム、 ゲイ酸マグネ シウ ム。
前記の一般式（ I )で表わされるオ リ ゴデォキ シ ヌ ク レ ォチ ドは、 懸濁液、 ェマルジ ヨ ン液、 シ ロ ッ プ剤、 エ リ キ シル剤と して も投与する こ とができ、 これ らの各種剤 形に は、 矯味矯臭剤、 着色剤を含有 さ せ る こ と ができ る。
非経口剤と しての所要量は、 患者の年齢、 体重、 疾患 の程度によ って異な るが、 通常、 成人で前記のオ リ ゴヌ ク レオチ ド 1 曰 1 〜； I 0 0 m g程度の量であ り 、 静注、 点滴 静注、 皮下注射、 筋肉注射によ り投与される。
こ の非経口剤は慣用の方法で製造する こ とができ る。 その場合、 希釈剤と しては、 一般に、 注射用蒸留水、 生 理食塩水、 ブ ドウ糖水溶液、 注射用植物油、 ゴマ油、 ラ ッ カセィ 油、 ダイ ズ油、 ト ウモロ コ シ油、 プロ ピ レ ン グ リ コ ール、 ポ リ エチ レ ン グ リ コ ール等を用いる こ とがで き る。 また、 必要に応 じて、 殺菌剤、 防腐剤、 安定剤を 加える こ とができ る。 こ の非経口剤は、 安定性の観点か らは、 バイ アル等に充填 した後、 冷凍 し、 通常の凍結乾 燥技術によ り水分を除去 し、 使用時に、 こ の凍結乾燥物 か ら液剤を再調製する こ とができ る。 製剤化に際 しては 必要に応 じて、 適宜、 等張化剤、 安定剤、 防腐剤、 無痛 化剤等を加える こ と もでき る。
その他の非経口剤の例 と しては、 外用液剤、 钦膏等の 塗布剤、 直腸投与のための坐剤等が挙げられ、 これらは いずれも慣用の方法で製造する こ とができ る。
次に実施例を示 し、 本発明を詳細に説明するが、 下記 の実施例によ り 本発明は制限される も のではない。
実施例 1
処方 ：
① 結晶セルロ ー ス 84 . 5重量部
② ステア リ ン酸マ グネ シ ウ ム 0. 5重量部
③ 力 ノレボキ シメ チルセル口 ス
カ ノレ シ ゥ ム 5重量部
④ p G s G s G s G s G 1 0重量部
計 1 00重量部 上記の処方に従って①と④および②の一部を均質にな る まで混合 し、 圧縮成型 した後、 粉砕 し、 こ れに②の残 量と③とを加えて混合 し、 打錠機にて圧縮成型 して、 一 錠 200mgの錠剤を得た。
こ の一錠中には、 p G s G s G s G s G 20mg力 含有 されている。 こ の錠剤は、 成人 1 曰 4〜 8 錠を数回に分 けて服用 される。
G s G s G s G s G、 G s G s G s G p、 p G p G p G p G p および p G s G s G s G p について も上記実施 例 1 の処方によ り 、 一錠 200mgの錠剤を得た。
実施例 2
処方 ：
① 桔晶セ ノレ ロ ー ス 34.5重量部 ② 10 % ヒ ド ロ キ シ プロ ピルセル
ロ ー スエタ ノ一ノレ溶液 50重量部
③ カ ノレボキ シ メ チ ルセ ノレロ ー ス
カ ノレ シ ゥ ム 5重量部
④ ステア リ ン酸マ グネ シ ウ ム 0.5重量部 ⑤ p G s G s G s G 10重量部
計 100重量部 上記の処方に従っ て①と②と⑤とを均質になる まで混 台 し、 常法によ り 捏和 し、 押 し出 し造粒機によ り 、 乾燥 破砕 した後、 こ れに③と④とを混合 し、 打錠機にて圧縮 成型 して、 一錠 200mgの錠剤を得た。
こ の一錠中には、 p G s G s G s G 20mg力 <含有され ている。 こ の錠剤は、 成人 1 曰 4 ~ 8錠を数回に分けて 服用 される。
G s G s G s G、 G s G s G s G p、 p G p G p G p G p および p G s G s G s G p について も上記実施例 2 の処方によ り、 一錠 200mgの錠剤を得た。
実施例 3
処方 ：
① 注射用蒸留水 適量
② ブ ドウ糖 200mg
③ G s G s G s G 10mg
全量 I5ral
①に対し、 ②と③とを溶解させた後、 5 ralのア ンプル に注入し、 121 °Cで 15分間加熱滅菌を行って注射剤を得
G s G s G s G、 G s G s G s G p、 p G s G s G s G p および p G p G p G p G p について も上記実施例 3 の処方によ り注射剤を得た。
発明の効果
本発明に係る新規な抗 H I V剤は、 H I V ( A I D S ウ ィ ルス） に起因する疾患、 A I D S、 A R Cの治療に 有効である。
図面の簡単な説明
図 1 は H I V - 1感染後の種々 の時間での各種薬物添加に よ る抗 H I V活性試験の結果を示 した ものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 下記一般式（ I )で示されるホスホロチォエ ー 卜結合 型オ リ ゴデォキシ ヌ ク レオチ ドから選択される 1 種又 は 2種以上を有効成分と して含有する こ とを特徴とす る抗 H I V剤。
( G s )„G ( I )
(式中、 Gはデォキ シグア ノ シ ン構造を表わ し、 s は 隣接する G とエステル結合を形成しているホスホロチ ォ リ ン酸残基を表わ し、 各 s は、 式中向かって左側の G とはその 3'位水酸基と、 また右側の G とはその 5'位 水酸基とそれぞれエステル結合を形成している もので あ り 、 n は 2 〜 7 の整数を表わす。 ）
2 . 下記一般式（I I )で示される 3'位末端 リ ン酸化ホスホ ロチォエ ー ト結合型オ リ ゴデォキシヌ ク レオチ ドから 選択される 1 種また 2種以上を有効成分と して含有す る こ とを特徴とする抗 H I V剤。
( G s ) „G p ( I I )
(式中、 Gはデォキシ グア ノ シ ン構造を表わ し、 s は 隣接する G とエステル結合を形成しているホスホロチ ォ リ ン酸残基を表わ し、 各 s は、 それぞれ式中向かつ て左側の G とはその 3'位水酸基と、 また右側の G とは その 5'位水酸基とそれぞれエステル結合を形成 してい る ものであ り 、 右端の p は隣接する G とエステ ル結合 を形成している リ ン酸残基を表わ し、 3'位末端水酸基 とエステル結合を形成している ものであ り 、 n は 2 〜 7の整数を表わす。 ）
3. 前記一般式（II)中の nが 3である G s G s G s G p で示される 3'位末端 リ ン酸化ホスホロチォエー ト結合 型オ リ ゴデォキシ ヌ ク レオチ ドを有効成分と して含有 する請求の範囲 2 に記載の抗 H I V剤。
4. 下記一般式（III)で示される 5'位末端 リ ン酸化ホス ホロチォエー ト結合型オ リ ゴデォキシヌ ク レオチ ドか ら選択される 1種または 2種以上を有効成分と して含 有する こ とを特徴とする抗 H I V剤。
p (G s )„G (III)
(式中、 Gはデォキシグア ノ シ ン構造を表わ し、 s は 隣接する G とエステル結合を形成しているホスホロチ ォ リ ン酸残基を表わ し、 各 s は、 式中向かって左側の G とはその 3'位水酸基と、 また右側の G とはその 5'位 水酸基とそれぞれエステル結合を形成 している もので あ り 、 左端の p は隣接する G とエステル結合を形成 し ている リ ン酸残基を表わ し、 5'位末端水酸基とモ ノ エ ステル結台を形成している ものであ り 、 nは 2ない し 7 の整数を表わす） 。
5. 前記一般式（III)の nが 3で示される 5' 位末端リ ン 酸化ホスホロ チォエー ト結合型オ リ ゴデォキシヌ ク レ ォチ ドを有効成分と して含有する請求の範囲 4 に記載 の抗 H I V剤。
6 - 下記一般式（IV)で示される 3'位および 5'位末端 リ ン 酸化ホスホロチォエー ト結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レ ォチ ドから選択される 1種または 2種以上を有効成分 と して含有する こ とを特徴とする抗 H I V剤。
p G s ( G s )nG p (IV)
(式中、 Gはデォキシグア ノ シ ン構造を表わ し、 s は 隣接する G とエステル結合を形成しているホスホロチ ォ リ ン酸残基を表わ し、 各 s は、 それぞれ式中向かつ て左側の Gとはその 3'位水酸基と、 また右側の G とは その 5'位水酸基とそれぞれエステル結合を形成 してい る ものであ り、 両端の p は隣接する G とエステル結合 を形成している リ ン酸残基を表わし、 それぞれ末端 G の 5'位水酸基（左端）および末端 Gの 3'位水酸基（右端） とエステル結合を形成している ものであ り 、 nは 1 な い し 5の整数を表わす。 ）
7. 前記一般式（IV)の nが 2で示される 3'位および 5'位 末端 リ ン酸化ホスホロチォエー ト結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ドを有効成分と して含有する請求の範囲
6 に記載の抗 H I V剤。
8. 下記式（V )で示される 3'位および 5'位末端 リ ン酸化 ホスホジエステル結合型オ リ ゴデォキ シ ヌ ク レオチ ド を有効成分と して含有する こ とを特徴とする抗 H I V 剤。
p G p G p G p G p ( V )
(式中、 Gはデォキシグア ノ シ ン構造を表わ し、 p は 隣接する G とエステル結合を形成している リ ン酸残基 を表わ し、 末端の各 p はそれぞれ末端 Gの 5'位水酸基 (左端） および末端 G の 3 '位水酸基 （右端） とエステ ル結合を形成しており、 2個の Gの間に位置している 各 p は、 それぞれ式中向かって左側の G とはその 3'位 水酸基と、 また右側の G とはその 5 '位水酸基とそれぞ れエステル結合を形成している ものである。 ）
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