WO1995013809A1 - Utilisation de photosensibilisateurs derives du noyau phorbine pour la decontamination du sang infecte par des parasites et/ou des virus - Google Patents

Utilisation de photosensibilisateurs derives du noyau phorbine pour la decontamination du sang infecte par des parasites et/ou des virus Download PDF

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WO1995013809A1
WO1995013809A1 PCT/FR1994/001317 FR9401317W WO9513809A1 WO 1995013809 A1 WO1995013809 A1 WO 1995013809A1 FR 9401317 W FR9401317 W FR 9401317W WO 9513809 A1 WO9513809 A1 WO 9513809A1
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phorbine
blood
parasites
viruses
blood products
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PCT/FR1994/001317
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Joseph Schrevel
Philippe Grellier
René SANTUS
Jean-Claude Maziere
Shimon Gatt
Arie Dagan
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods

Definitions

  • the present invention relates to the use of photosensitizing compounds derived from the phorbine nucleus for the implementation of methods for decontaminating blood products liable to be infected by parasites and / or viruses.
  • the invention also relates to the use of these photosensitizers for obtaining medicaments intended for the treatment of pathologies due to the infection of individuals by parasites and / or viruses.
  • Photodynamic photosensitizers are molecules which, when excited by light of appropriate wavelength, are capable of transferring part of the light energy absorbed to molecular oxygen (photodynamic effect), generating thus singlet oxygen (IO2), an extremely reactive species capable of reacting with the main cellular constituents (lipids, proteins, nucleic acids), leading to the destruction of illuminated tissues (Weisberger et al., (1976) Cancer Res. 36, 2326; Mazière et al., (1990) J. Photochem. Photobiol. 6, 61).
  • photosensitizers The main current therapeutic application of photosensitizers is photochemotherapy of tumors (Kessel, D. (1984), Photochem. 39, 851; Mazière et al., (1992) Cr. Soc. Chim. Biol. 186, 88), based on preferential retention by tumor tissues of certain photosensitizers derived from the porphyrin nucleus.
  • the photosensitizer is first injected into the patient, and the tumor secondarily illuminated using a laser source.
  • the main photosensitizer currently used is Photofrin II (registered trademark) (Lederlé), a complex derivative of hematoporphyrin.
  • PCT application WO-A-88 10087 (BAYLOR RESEARCH FOUNDATION) relates to a method of treatment of human body tissues to eradicate infectious pathogenic biological contaminants such as viruses, bacteria, malaria parasites, trypanosomes and other parasites.
  • the products used are mixtures of water-soluble and liposoluble products derived from hematoporphyrin, the chemical structure of which is not clearly defined.
  • the light absorption spectrum of these products is too close to that of hemoglobin, which requires the use of too high concentrations or very large incident doses of light to counteract the screen effect of hemoglobin, especially in erythrocyte concentrates.
  • Photochemotherapy has also been envisaged for the elimination of possible viral contamination at the level of Blood Transfusion Centers (Matthews et al., (1988) Transfusion 28, 81).
  • the object of the present invention is precisely to provide a new method for decontaminating blood products infected by parasites and / or viruses, this method being reliable and applicable on a large scale.
  • the invention relates to any method for decontaminating blood products infected by parasites and / or viruses capable of causing the appearance of human or animal pathologies, with the exception of tumors of viral origin, characterized in that it includes:
  • one or more lipophilic photosensitizing compounds in particular derivatives of the phorbine nucleus, having a tropism for the blood cells infected by the above-mentioned parasites and / or viruses, and / or the free forms of the latter, and having the property of generating singlet oxygen, or any other activated toxic form of oxygen, when they are excited by light of suitable wavelength
  • a step of irradiating the blood products thus treated using a light source of intensity and wavelength such as the above-mentioned photosensitizer compound (s) are activated so that there is formation singlet oxygen, or any other toxic activated form of oxygen, in an amount sufficient to destroy said parasites and / or viruses.
  • the invention relates to any process for decontaminating blood products infected with parasites capable of causing the appearance of human or animal pathologies, characterized in that it comprises:
  • one or more lipophilic photosensitizing compounds in particular derivatives of phorbine nucleus, having a tropism for the blood cells infected by the above-mentioned parasites, and / or the free forms of the latter, and having the property of generating singlet oxygen, or any other activated toxic form of oxygen, when 'they are excited by light of appropriate wavelength
  • a step of irradiating the blood products thus treated using a light source of intensity and wavelength such as the above-mentioned photosensitizer compound (s) are activated so that there is formation singlet oxygen, or any other toxic activated form of oxygen, in an amount sufficient to destroy said parasites.
  • the water-soluble or partially water-soluble compounds are therefore excluded.
  • the invention relates to any method for decontaminating blood products infected with viruses capable of causing the appearance of human or animal pathologies, with the exception of tumors of viral origin, characterized in that it comprises:
  • one or more lipophilic photosensitizing compounds in particular derivatives of the phorbine nucleus, having a tropism for the blood cells infected by the above viruses, and / or the free forms of the latter, and having the property of generating singlet oxygen, or any other activated toxic form of oxygen, when they are excited by light of suitable wavelength
  • a step of irradiating the blood products thus treated using a light source of intensity and wavelength such as the above-mentioned photosensitizer compound (s) are activated so that there is formation singlet oxygen, or any other toxic activated form of oxygen, in an amount sufficient to destroy said viruses.
  • the aforementioned photosensitizing compounds for parasitic decontamination are chosen from the derivatives of the phorbine nucleus corresponding to the following formula (I)
  • R 2 represents an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, -CH 2 -OH, or -CHO (formyl),
  • R3 and R4 which are identical or different, represent -H, -OH, -COOR, R representing -H or an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms,
  • R 5 represents - (CH 2 ) 2-CO-NH- (CH2) m - (Y) n - (CH2) pZ, OH S SH O
  • Y represents -O-, -CH-, -C-, -CH-, -C-NH, and -S-
  • Z is chosen from -OR, -COOR, -SR, R representing H or an alkyl group from 1 to 6 carbon atoms, -CH3, -SO3 " , or PO3 " , and m is an integer from 1 to 12, n represents 1 or zero, and p is an integer from 1 to 6 or is zero, or R5 represents - (CH2) r -C02-R, r being an integer from 1 to 6, in particular 2, and R representing -H or an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms,
  • R and R7 represent a hydrogen atom, or form a double bond in association, provided that when n represents 1, p is different from 0.
  • the invention also relates to a method for decontaminating blood products infected with viruses, capable of causing the appearance of human or animal pathologies, with the exception of tumors of viral origin, characterized in that it comprises:
  • R2 represents an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, -CH 2 -OH, or -CHO (formyl),
  • R3 and R4 which are identical or different, represent -H, -OH, -COOR, R representing -H or an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms,
  • R 5 represents - (CH 2 ) 2-CO-NH- (CH 2 ) m - (Y) n- (CH2) pZ, OH S SH O
  • Y represents -O-, -CH-, -C-, -CH-, -C-NH, and -S-
  • Z is chosen from -OR, -COOR, -SR, R representing an alkyl group of 1 with 6 carbon atoms, -CH3, -SO3 " , or PO3 "
  • m is an integer from 1 to 12
  • n represents 1 or zero
  • p is an integer from 1 to 6 or is zero
  • R6 and R7 represent a hydrogen atom, or form a double bond in association, provided that when n represents 1, p is different from 0, -
  • These compounds having a tropism for the blood cells infected by the above viruses, and / or the free forms of the latter, and having the property of generating singlet oxygen, or any other activated toxic form of oxygen, when 'they are excited by light of appropriate wavelength,
  • a step of irradiating the blood products thus treated using a light source of intensity and wavelength such as the above-mentioned photosensitizer compound (s) are activated so that there is formation singlet oxygen, or any other toxic activated form of oxygen, in an amount sufficient to destroy said viruses.
  • Derivatives of the phorbine nucleus which are particularly preferred in the context of the present invention are chosen from those of formula (I) in which R5 represents the group - (CH2) 2-CO-NH- (CH2) m l-Z ⁇ , in which Z ⁇ represents
  • -OH an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, or -CH3, and m is an integer from 1 to 8.
  • the aforementioned phorbine ring derivatives are chosen from those corresponding to the following formula (la)
  • m is an integer from 1 to 12, and more particularly the compound of formula (la) in which m represents 4, namely ethenyl-9-ethyl-14- (methoxycarbonyl) -21-tetramethyl-4, 8J3 J8-oxo-20- (hydroxybutyl-4) - N-propanamide-3-phorbine (also designated below by the expression PH4OH), and the compound of formula la in which m represents 6, namely ethenyl -9- ethy 1- 14- (methoxycarbony l) -21 -tetramethyl-4, 8,13,18-oxo-20- (hydroxyhexy 1-6) - N-propanamide-3-phorbine (also designated below) by the expression PH ⁇ OH).
  • Another derivative of the phorbine nucleus which is particularly preferred in the context of the present invention, corresponds to acetyl-9-ethyl-14-dihydro-13J4- (methoxycarbonyl) -21 -tetramethyl-4, 8, 13, 18-oxo- 20- (hydroxybutyM) -N- propanamide-3 -phorbine of formula (Ib) below
  • COOCH3 Another derivative of the phorbine nucleus preferred in the context of the present invention corresponds to ethenyl-9-ethyl-14-tetramethyl-4,8J3J8-oxo-20- (hydroxyhexyl-6) -N- ⁇ ropanamide-3-phorbine following formula (s)
  • Z represents -COOH (derivative hereinafter designated PH2COOH), -CH3 (derivative hereinafter designated PH2CH3), -SH (derivative hereinafter designated PH2SH), or - SO3 "(derivative hereinafter designated PH2SO3 " ) .
  • PH2COOH -COOH
  • PH2CH3 derivative hereinafter designated PH2CH3
  • PH2SH derivative hereinafter designated PH2SH
  • - SO3 - SO3
  • Plasmodium falciparum P. falciparum
  • P. vivax P. ovale
  • P. malariae P. malariae
  • T. b. gambiense Trypanosoma brucei gambiense responsible for sleeping sickness
  • T. cruzi responsible for Chagas disease
  • the agents responsible for viral diseases capable of being eliminated from the blood products within the framework of the implementation of the method of the invention, there will be mentioned more particularly the enveloped viruses, in particular, the viruses responsible for the various hepatitis, cytomegalovirus and HIV type viruses responsible for AIDS.
  • the blood products capable of being decontaminated within the framework of the implementation of a method according to the invention correspond to blood drawn from mammals, humans or animals, and stored in an appropriate packaging, in particular in bags for infusion. , or correspond to preparations of blood cells, and more particularly of erythrocytes, rid of all or part of the other constituents of the blood.
  • the concentration of photosensitizing compounds in the blood products to be treated from approximately 0J ⁇ mole / 1 to approximately 100 ⁇ mole / 1, and advantageously from approximately 0J ⁇ mole / 1 to approximately 10 ⁇ mole / 1.
  • the dose of incident light energy used in the context of the process according to the invention is from approximately 1 to approximately 100 Joules (wavelength from approximately 660 nm to approximately 800 ⁇ m).
  • the invention also relates to the use of lipophilic photosensitizing compounds, and more particularly photosensitizing compounds according to formula (I) above, for obtaining a medicament intended for the treatment by the extracorporeal route of the blood of mammals, humans or animals, likely to be carriers of parasites and / or viruses, themselves likely to be present in the blood, this treatment comprising a step of exposing a determined quantity of the blood of these mammals containing these photosensitizing compounds, to a light source capable of exciting these photosensitizing compounds.
  • a subject of the invention is also blood compositions comprising lipophilic photosensitizing compounds, in particular derivatives of the phorbine nucleus, and more particularly at least one of the compounds according to general formula (I) above, in admixture with a blood product corresponding to blood taken from humans or animals, or to blood cell preparations as defined above.
  • the invention also relates to blood compositions as described above, irradiated using a light source according to the above-mentioned method of the invention.
  • the invention also relates to the use of blood compositions as defined above, for obtaining a medicament intended for the extracorporeal treatment of pathological conditions in mammals, humans or animals, due to the infection of these the latter by parasites and / or viruses.
  • the pathological conditions due to the infection of individuals by parasites are in particular the following:
  • the pathological conditions due to infection of individuals by viruses are in particular the following:
  • a determined quantity of the photosensitizing compound is added to the blood put into extracorporeal circulation, then this blood containing this photosensitizing compound is exposed to the light source.
  • the quantity of the photosensitizing compound added to the blood put into extracorporeal circulation is such that the concentration of this compound in the blood is from approximately 0J ⁇ mol / 1 to approximately 100 ⁇ mol / 1, and advantageously from approximately 0J ⁇ mole / 1 to about 10 ⁇ mole / 1, and in that the dose of light energy is as described above.
  • a determined quantity of the blood of mammals, to which a suitable quantity of the photosensitizing compound has previously been administered is put into extracorporeal circulation and is exposed to the light source.
  • the amount of the photosensitizer compound administered to the mammal is from about 0.3 mg to about 3 mg per kg of body weight per day, and in that the dose of light energy is as described above.
  • Figure 1 Labeling of human red blood cells with PH ⁇ OH
  • Figure 2 Effect of the PH4OH derivative on parasitaemia in an in vitro culture of human red blood cells infected with Plasmodium falciparum.
  • the cells are incubated with the drug for 2 hours at 37 ° C. in RPMI medium supplemented with 10% human serum, washed and then irradiated at 670 nm for variable times (1 to 15 minutes).
  • the parasitaemia is measured 48 hours after irradiation by counting the parasites after staining with May-Giemsa- Grunwald. One minute of irradiation corresponds to approximately 11 Joules.
  • Figure 3 Effect of the PH4OH derivative on the parasitaemia of whole blood infected with Plasmodium falciparum, as a function of the concentration of the drug.
  • the blood is incubated for 2 hours at 37 ° C with the drug.
  • the irradiation is carried out at 670 nm for 5 minutes.
  • the parasitaemia is measured 48 h after irradiation by counting the parasites after staining with May-Giemsa-Griinwald.
  • Figure 4 Effect of PH4OH on the survival of epimastigote forms of Trypanosoma cruzi in culture (LIT medium supplemented with 5% fetal calf serum) depending on the concentration of the drug. Incubation with the drug is carried out for 2 hours at 27 ° C. After washing, the irradiation is carried out at 670 nm for 5 minutes. Parasitaemia is measured 48 hours after irradiation by counting the parasites at the Malassez cell.
  • Figures 5A. 5B. 5C DR5 in vitro activity tests. MACE. PH ⁇ OH
  • DR5 Figure 5A
  • MACE Figure 5B
  • PH4OH Figure 50
  • Each PH derivative (A: PH4OH, B: PH 2 CH 3 , C: PH 2 SO 3 -, D: PH2COOH) is incubated for 30 minutes at 37 ° C, in the dark, in a 25 cm 2 flask with 5 ml of an asynchronous culture (3% parasitaemia) of Plasmodium falciparum.
  • the final concentration of photosensitizing compound is 0.5 ⁇ M for each compound.
  • the cells are then irradiated for 5 minutes, washed in RPMI medium and re-cultured at 37 ° C. in the dark.
  • Parasitic red cells were mixed with 2 weeks old whole blood (2% final parasitaemia). 500 ⁇ l aliquots of this mixture to which the photosensitizing compounds (PH4OH, PH2CH3) are added were placed in a 24-well dish. Each dish is incubated at 37 ° C, in the dark, for 2 hours. They are then irradiated for 5 minutes, after which the cells are washed twice by centrifugation (600 g, 5 minutes) with RPMI. The cell pellet is then re-cultured in 5 ml of medium in 25 cm 2 flasks and in the dark. After 3 days, parasitaemia is estimated on blood smears stained with Diff-Quick. At the same time, witnesses containing the drug but not irradiated are made.
  • the photosensitizing compounds PH4OH, PH2CH3
  • the column is eluted with 300 ml of dichloromethane , then with 200 ml of acetonitrile and finally with 400 ml of dichloromethane: methanol (8: 2)
  • the product was obtained in the eluate of dichloromethane: methanol
  • the fractions containing the product were identified by thin layer chromatography silica gel 60 E. Merck on aluminum foil plates; the chromatography solvent is: chloroform: methanol: 0.01 N sulfuric acid (80: 20: 2).
  • the yield is 200 ⁇ mol (80%).
  • Example 1 The method of Example 1 above is applied except that 500 ⁇ moles of 6-aminohexanol have been substituted for 4-aminobutanol.
  • the yield of the desired product is 190 ⁇ moles (75%).
  • the organic phase is dried with magnesium sulfate and the solvent evaporated.
  • the residue is dissolved in 10 ml of dichloromethane and deposited on a column of silica gel of 2 x 40 cm (E. Merck silica gel 60 (70-230 mesh)) prepared in dichloromethane.
  • the column is eluted with 200 ml of dichloromethane, then with 200 ml of dichloromethane: methanol (9: 1), 200 ml of dichloromethane: methanol (4: 1) and 400 ml of dichloromethane (7: 3).
  • the fractions contained in the product, as detected by TLC, are grouped.
  • the TLC plates are silica gel 60 E. Merck on aluminum foil.
  • the chromatography solvent is dichloromethane: methanol: sulfuric acid 0.02 N 85: 15:15.
  • the yield is 200 ⁇ moles (66%).
  • bacteriophorebide a 100 ⁇ moles of bacteriophorebide a are dissolved in 5 ml of chloroform contained in a flask with a circular bottom of 25 ml, and cooled in an ice bath and protected from humidity by argon atmosphere 100 ⁇ moles of 1-hydroxybenzotriazole hydride are added and the mixture is stirred for 15 minutes. 300 ⁇ moles of dicyclohexylcarbodiimide are then added and stirred continuously for two hours. The chloroform evaporates and the residue is dissolved in 5 ml of 2-propanol. To the magnetically stirred solution is added a solution of 0.5 mmol of 4-aminobutanol in 5 ml of 2-propanol.
  • the mixture is stirred for 5 hours, then transferred separately to a separatory funnel with 40 ml of dichloromethane.
  • the mixture is extracted with 2 x 40 ml of water and the organic phase is dried with magnesium sulfate.
  • the solvent is evaporated on a rotary evaporator, the residue is taken up in 5 ml of dichloromethane, and deposited on a 2x20 cm column of silica gel (E Merck silica gel 60 (70-230 mesh)).
  • the column was eluted with 200 ml of dichloromethane, then with 200 ml of acetonitrile, then with 300 ml of dichloromethane: methanol (1: 1).
  • the fractions containing the product are identified by TLC on silica gel E. Merck on aluminum foil plates. The yield is 55 ⁇ moles (55%).
  • the instrument used is the Waters Delta Prep 3000, using a DELTA PAK 15 ⁇ C 18 -100 ⁇ column of 10 x 300 mm.
  • the solvent system is composed of 75% acetonitrile, 25% triethylamine phosphate buffer at a pH of 3.2.
  • the flow rate is 20 ml per minute.
  • the detection was carried out by light absorbance at 410 mm. A 10 mg sample, dissolved in 5.0 ml of acetonitrile is injected.
  • the peak of the major product (area 47.4%) has a retention time of 36.97 minutes.
  • This fraction (volume, 72 ml) was distributed between 450 ml of dichloromethane and 400 ml of water. The dichloromethane layer is separated, then washed with 5 parts of 400 ml of additional water, dried with sodium sulfate and evaporated to give 1.25 mg of the product.
  • Mass spectrometry shows a molecular ion at m / z, 692 daltons (M +), C 1 H49N 5 ⁇ 5 corresponds to 692.
  • Example 5 The same instrument and column as in Example 5 are used.
  • the solvent is methanol: water (88 parts MeOH for 12 parts HoO, by volume).
  • the flow rate is 20 ml / minute. Detection was carried out by light absorbance at 410 mm. A 10.2 mg sample, dissolved in 10 ml of said methanol: water mixture, and filtered, is injected.
  • the peak of the major product (area 80.8%) has a retention time of 80.8 minutes.
  • the main fraction of the product (about 125 ml) is concentrated on an evaporator (bath temperature below 40 ° C). When most of the methanol is removed, a green solid is separated. The solid is dissolved in dichloromethane and the dichloromethane layer is separated and evaporated by a stream of dry nitrogen. After drying with phosphorus pentoxide in vacuo, the product has a weight of 3.7 mg (recovery, 44.9%).
  • Mass spectrometry shows a molecular ion at m / z 664 daltons (M + ). C39H 4 5N 5 O 5 corresponds to 664.
  • the phorbine ring derivatives described in the context of the present invention, and more particularly those prepared according to the examples described above, can be treated with a metal compound, for example, a metal halide, in a suitable solvent, with heating, to produce metalophorbine complexes in which the metal replaces the two hydrogens bonded to the nitrogen atoms in the phorbine nucleus.
  • a metal compound for example, a metal halide
  • Metals representative of the formation of such complexes include Si, Mn, Fe, Co, Ni, Zn, Ga, In, Sn, Sm, Eu, Gd, Te and Tl. III) Materials and methods
  • the Plasmodium falciparum strain FcBl from Colombia (chloroquine resistant strain), is maintained in peak in vitro on human erythrocytes according to the method of Trager and Jensen (Trager, W. and Jensen, JB Human malaria parasites in continuous culmre. Science 193: 673-675, 1976).
  • This basic medium is supplemented with 7.5% (V / V) of decomplemented human plasma.
  • Plasmodium falciparum is cultured at 37 ° C, with a hematocrit of 2 to 5% of human red blood cells (collected on dextran citrate and used in the 3 weeks following the collection), under an atmosphere of 3% CO2, 6% O2 and 91% N2.
  • the medium is changed daily by aspiration, while for heavy parasitaemia (greater than 10%), it is renewed several times a day.
  • the cultures with high parasitaemia (15%) are diluted with new red cells previously washed with culmre medium.
  • Parasitaemia is determined on blood smears stained with May-Griinwald-Giemsa or Diff-Quick (Merz + Dade, D ⁇ dingen, Switzerland) by counting 1000 cells.
  • a fine synchronization over 4 hours can be carried out from an asynchronous in vitro peak of Plasmodium falciparum, by implementing a technique of selective lysis of infected red blood cells containing aged stages of Plasmodium falciparum (trophozoites, schizonts) by incubation in D- Sorbitol 5% (W / V) in distilled water according to the method of Lambros and Vanderberg (Lambros, C. and Vanderberg, JP Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stage in culmre.
  • a population of ring forms obtained after treatment with sorbitol 5% (W / V) is brought back to growth for growth.
  • the red blood cells infected with these older forms are concentrated by Plasmagel and brought back to peak with fresh red cells at 20% parasitaemia.
  • the release of merozoites and the formation of new rings are monitored regularly on blood smears. 4 hours after the release of the first merozoites, treatment with sorbitol makes it possible to eliminate the old forms and to obtain a population of ring forms synchronized over a window of 4 hours.
  • an estimate of the number of living parasites during recovery can be made from the parasitaemia determined after several days of in vitro peaking of the aliquots taken, and from the multiplication factor of the FcBl / Colombia strain, which is on average of 4 per 48 hour endoerythrocyte cycle.
  • D is used to estimate the percentage of living parasites at the time of recovery, where A represents the parasitaemia obtained after several days of peaking, D the initial parasitaemia (1.75%), n the number of cycles carried out, and k the average multiplication factor of the Plasmodium falciparum strain concerned.
  • A represents the parasitaemia obtained after several days of peaking
  • D the initial parasitaemia (1.75%)
  • n the number of cycles carried out
  • k the average multiplication factor of the Plasmodium falciparum strain concerned.
  • a determination of the parasitic parasites and a count of the red cells on Malassez cells makes it possible to know the number of parasites present in l ⁇ l of solution. Therefore, it is possible to calculate the number of parasites surviving in l ⁇ l at the time when they are brought back to peak, and to extrapolate to the quantity of living parasites in a blood bag (400 ml) stored under the same conditions.
  • MACE monoaspartylchlorine E6
  • DR5 corresponds to the derivative of the following formula:
  • Stock solutions with 10 mM of MACE or DR5 are produced in DMSO and stored at 4 ° C.
  • the 2mM stock solutions of the PH derivatives (PH4OH, PH 2 CH, PH 2 SO 3 -, PH 2 COOH, PH 2 SH) are produced in absolute ethanol and stored at -20 ° C. In all cases, these stock solutions are stored in the dark.
  • the manipulations are carried out on 0.1 ml of the cultures, so as to obtain 10 ⁇ cells, so that the cell pellet is visible.
  • the photosensitizing compound is added to the mother solution of cells (10 * 7 .ml "l) so as to obtain a final concentration of compound of 10 ⁇ M.
  • These solutions are incubated at 37 ° C, in the dark, with shaking.
  • 3 aliquots of lOO ⁇ l (10 ⁇ cells) are removed and washed twice by centrifugation (10,000 g, 1 minute) in 500 ⁇ l of PBS.
  • Each cell pellet is then lysed with 1 ml of 2% Triton X 100 (W / V) in double distilled water.
  • the sample is again diluted with the Triton solution to have the equivalent of 5.1 ⁇ 4 cells per ml, concentration of red blood cells at which the fluorescence of the compound is not masked by the screen effect.
  • Each point of kinetics corresponds to the average of the 3 values plus or minus the standard deviation.
  • two series of controls are treated identically: the first consists of cells without photosensitizer compound and the second contains the culmre medium and the photosensitizer compound.
  • the healthy red blood cells and the globules infected by the different stages of Plasmodium falciparum, strain FcBl, are incubated for 30 minutes, at 37 ° C., in a culmre medium with from 0.2 ⁇ M to 100 ⁇ M of each PH derivative and from 10 to 500 ⁇ M of MACE and DR5.
  • the cells are then washed twice by centrifugation (600 g, 5 minutes) with culmre medium at 7.5% serum.
  • the observation of the marking was carried out using a Nikon Optiphot epifluorescence microscope, equipped with a mercury arc of 100 Watts (100 X immersion objective).
  • the excitation and emission wavelengths used are 420 nm ⁇ exc ⁇ 485nm and ⁇ em > 520 nm respectively.
  • the rapid extinction of the fluorescence of the compounds is attenuated by the use of a filter limiting the light source to 1/32.
  • the recording of the images on video cassettes is obtained by a low light level LHESA 4036 camera (electronic LHESA, Cergy Pontoise) coupled with a Sony "U" -matic V05850-P VCR. After selecting the images from the recording tapes, the latter are processed using the Sapphire system (Quantel, Ltd Berkshire, GB). The photographs are then produced on Ilford PAN F film using the VIP3 "Video printer” from Polaroid (Polaroid Corporation, Cambridge, USA).
  • the irradiation table is composed of 2 Tungsten-Iodine lamps emitting wavelengths of 670 nm and a water circulation system making it possible to maintain the culture dishes at 37 ° C. while avoiding overheating of the sample.
  • the system is designed so that the lighting of the plate is uniform (3mW / cm 2 ).
  • Parasitic red cells from in vitro culms were mixed with whole blood to obtain a final parasitaemia of 1 to 5%.
  • This parasitized whole blood is aliquoted in 24-well plates (500 ⁇ l / well) and the photosensitizing compound added to each well to obtain the desired concentration. Each plate is then incubated at 37 ° C. in the dark, for 2 hours, then subjected to different irradiation times (from 0 to 10 minutes). After exposure to light, the cells of each well are washed 2 times with RPMI without Phenol red (GIBCO BRL, Cergy Pontoise), and brought back to maturity in the dark, in a 25 cm 2 bottle, in 5 ml of medium. .
  • the first consists of parasitized whole blood without photosensitizing compound subjected to the different irradiation times
  • the second of whole blood incubated with the different concentrations of photosensitizing compounds but not irradiated.
  • the hemolytic effect of the photosensitizing compounds is determined by measuring the absorbance of the top supernatants at 575 nm, a wavelength corresponding to the absorbance of the theme of the hemoglobin released into the medium during the lysis of the red blood cells.
  • This study was carried out with RPMI culmre medium without phenol red because it absorbs at 575 nm. 400 ⁇ l of culmant supernatant are diluted to half with distilled water and the absorbance read with a UVIKON 930 spectrophotometer (KONTRON INSTRUMENT) at 575 nm.
  • the basic reference corresponding to 0% lysis is determined in measuring the absorbance of the culmre medium diluted by half with distilled water.
  • the 100% lysis is obtained by lysing the pellet of washed red blood cells, extracted from 80 ⁇ l of whole blood, in 1 ml of distilled water and diluting it half with the culmre medium.
  • the absorption curve at 575 nm as a function of cell lysis shows a linearity between 0 and 50% of lysis.
  • Healthy red cells or cells infected with the trophozoite and schizont stages of Plasmodium falciparum, strain FcBl are incubated in the culmre medium containing the compound at a final concentration of 10 ⁇ M for MACE and DR5, and 1 ⁇ M for PH4OH.
  • the kinetics of incorporation into healthy and parasitized red cells show a saturation plateau within 30 minutes for PH4OH and 1 hour for DR5.
  • a low incorporation of DR5 is observed in the parasitized red blood cells, compared to healthy red blood cells, despite the strong parasitaemia of the culmre (60% of trophozoites and schizonts).
  • PH4OH appears to be more efficiently incorporated than DR5 and MACE by parasitized red cells, which confirms the previous results on the kinetics of incorporation of the compounds.
  • FIG. 5 presents the curves obtained with the DR5 (FIG. 5 A), the MACE (FIG. 5B), the PH4OH (FIG. 5C).
  • Table 2 presents the minimum concentrations of compound allowing the total elimination of the parasites from the culmers for different irradiation times.
  • Table 2 Calculation of ICIQQ ( Concentration inhibiting 100% of parasitic development) on asynchronous in vitro cultures of Plasmodium falciparum - strain FcBl.
  • PH4OH is approximately 1000 times more active than DR5 and 200-250 times more active than MACE for 5 minutes and 10 minutes of irradiation.
  • no effect on the parasitaemia was demonstrated during the manipulations in the two control culmers (culmers in the absence of compound but irradiated, and culmres with the different concentrations of compounds but not irradiated).
  • the activity of the various PH derivatives is summarized in FIG. 6. Under our experimental conditions (30 minutes of incubation, 0.5 ⁇ M of compound and 5 minutes of irradiation), 2 compounds lead after 2 days of culture 100% d inhibition, PH4OH and PH2CH3. 84% inhibition is obtained with PH2SO3 " . The other derivatives are less effective (inhibitions less than 40%). The inhibition values observed were confirmed after 6 days of peak.
  • Plasmodium falciparum preferentially uses the lipids of the HDL fraction for its maturation (Grellier et al., Induction in vitro of the schizongonia of Plasmodium falciparum by high density human lipoproteins (HDL). des Sciences de Paris, 311 (3): 361-367, 1990; Grellier et al., Lipid traffic between high density lipoproteins and Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Journal of Cell Biology, 112 (2): 267-277 ' , 1991).
  • the compound PH4OH has also proved to be effective for the destruction of Trypanosoma cruzi, practically total eradication being obtained for a concentration of the order of 2 ⁇ M, ie 1 mg / 1 (FIG. 4).
  • the HIV used for the infection was prepared from supernatants of H9V3-beta cells cultured in protein-free medium. Three 0J ml samples of viral suspension were obtained by 1/10 dilution of the mother solution of HIV: one constitutes the non-irradiated control, the other two are subjected to irradiation at 670 nm for 1 or 4 minutes ( either 1.3 or 5.2 Joules, respectively). The final concentration of photosensitizer (PH4OH) in viral samples is 10 ⁇ 6M. After irradiation of the viral suspensions, the H9 cells (T4 line derived from a human lymphoma) are infected with the various viral samples (irradiated or non-irradiated as described above).
  • the infection is carried out by incubation of the cells (4x10 ⁇ ) with a viral suspension having a reverse transcriptase activity ("reverse transcriptase: RT in FIG. 8) of 12,000 cpm.
  • the incubation of the cells with viral samples is continued for 48h, at 37 ° C., in an atmosphere at 5% CO 2.
  • the cells are then washed so as to eliminate all traces of virus in the medium, and it is then determined at different times after infection (6, 10, 13 and 15 days), on the one hand, the number of viable cells ( Figure 8, part A), and on the other hand RT activity ( Figure 8, part B), the latter reflecting viral multiplication.
  • the red cells of an in vitro culmre of B. divergens parasitized at 50% were added to freshly drawn whole blood (A +) to obtain a parasitaemia of 0.5%. Aliquots of this parasitized whole blood were placed in a 24-well plate (200 ⁇ l per well) and different concentrations of photosensitizer were added thereto (final concentrations of 2, 4 and 8 ⁇ M). Two points are made for each concentration. The samples were incubated for 2 hours, at 37 ° C, in the dark, then irradiated for 2 to 30 min depending on the plates. The wavelength used is 670 nanometers.
  • the eradication of the parasites is estimated on smears stained with Giemsa by counting 1000 cells, 4 days and 10 days after culmination.
  • the Photofrin II is made up of a mixture of molecules whereas the PH4OH used is a product purified by HPLC.
  • the concentrations of Photofrin II used were calculated by taking an average molecular mass in monomers of its various components, this mass being 660.
  • the comparison of the 2 photosensitizers was carried out on several concentrations ( 2, 4 and 8 ⁇ M).
  • Total eradication of the parasite is obtained with PH4OH for a concentration of 2 ⁇ M and 10 min of irradiation, and for a concentration of 4 ⁇ M and 2 min of irradiation.
  • With Photofrin II only 70% of eradication is observed for a concentration of 4 ⁇ M and 30 min of irradiation.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de composés photosensibilisateurs dérivés du noyau phorbine pour la décontamination de produits sanguins susceptibles d'être infectés par des parasites et/ou virus, et pour l'obtention de médicaments destinés au traitement extracorporel de pathologies parasitaires ou virales.

Description

UTILISATION DE PHOTOSENSIBILISATEURS DERIVES DU NOYAU PHORBINE POUR LA DECONTAMINATION DU SANG INFECTE PAR DES PARASITES ET/OU DES VIRUS
La présente invention a pour objet l'utilisation de composés photosensibilisateurs dérivés du noyau phorbine pour la mise en oeuvre de procédés de décontamination de produits sanguins susceptibles d'être infectés par des parasites et/ou des virus.
L'invention concerne également l'utilisation de ces photosensibilisateurs pour l'obtention de médicaments destinés au traitement de pathologies dues à l'infection d'individus par des parasites et/ou des virus.
Les photosensibilisateurs de type "photodynamique" sont des molécules qui, lorsqu'elles sont excitées par une lumière de longueur d'onde appropriée, sont susceptibles de transférer une partie de l'énergie lumineuse absorbée à l'oxygène moléculaire (effet photodynamique), générant ainsi de l'oxygène singulet (IO2), une espèce extrêmement réactive susceptible de réagir avec les principaux constituants cellulaires (lipides, protéines, acides nucléiques), en entraînant la destruction des tissus illuminés (Weishaupt et al., (1976) Cancer Res. 36, 2326; Mazière et al., (1990) J. Photochem. Photobiol. 6, 61).
La principale application thérapeutique actuelle des photosensibilisateurs est la photochimiothérapie des tumeurs (Kessel, D. (1984), Photochem. 39, 851; Mazière et al., (1992) Cr. Soc. Chim. Biol. 186, 88), basée sur la rétention préférentielle par les tissus tumoraux de certains photosensibilisateurs dérivés du noyau porphyrinique.
Dans ce type d'application, le photosensibilisateur est tout d'abord injecté au patient, et la tumeur secondairement illuminée à l'aide d'une source laser.
Le principal photosensibilisateur utilisé actuellement est le Photofrin II (marque déposée) (Lederlé), dérivé complexe de l'hématoporphyrine.
La demande PCT WO-A-88 10087 (BAYLOR RESEARCH FOUNDATION) concerne une méthode de traitement des tissus corporels humains pour éradiquer les contaminants biologiques pathogènes infectieux tels que les virus, les bactéries, les parasites du paludisme, les trypanosomes et autres parasites. Dans cette demande, les produits utilisés sont des mélanges de produits hydrosolubles et liposolubles dérivés de l'hématoporphyrine dont la structure chimique n'est pas distinctement définie. De plus, le spectre d'absorption lumineuse de ces produits est trop proche de celui de l'hémoglobine, ce qui oblige à utiliser des concentrations trop importantes ou des doses incidentes de lumière très grandes pour contrecarrer l'effet d'écran de l'hémoglobine, notamment dans les concentrés érythrocytaires.
Ce type de technique a été également proposé pour le traitement des leucémies (Fibach et al., (1992) Leuk. Res. 16, 453).
La photochimiothérapie a aussi été envisagée pour l'élimination de la contamination virale éventuelle au niveau des Centres de Transfusion Sanguine (Matthews et al., (1988) Transfusion 28, 81).
Enfin, quelques essais de décontamination du sang infecté par des parasites ont été tentés avec des produits colorants photosensibilisateurs tels que la mérocyanine (Smith et al., (1991), The Journal of Infectious Diseases, 163, 1312-1317), et le violet de gentiane (Docampo et al. , (1988), Molecular and Biochemical Parasitology, 27, 241-248). Toutefois, les propriétés spectrales de ces composés présentent certains inconvénients en ce qui concerne l'absorbance propre des érythrocytes.
La présente invention a précisément pour but de fournir un nouveau procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites et/ou des virus, ce procédé étant fiable et applicable à grande échelle.
L'invention concerne tout procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites et/ou des virus susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites et/ou virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites et/ou virus.
L'invention concerne tout procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites.
Compte tenu de la nature lipophile des composés utilisés dans l'invention, les composés hydrosolubles ou partiellement hydrosolubles sont, de ce fait, exclus.
L'invention concerne tout procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des virus susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits virus, et/ ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits virus.
Avantageusement, les composés photosensibilisateurs susmentionnés pour la décontamination parasitaire sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante
Figure imgf000006_0001
dans laquelle:
. X représente C = O ou CH-OH,
. R] représente -CH=CH2, -COCH3, ou -CH(CH3)-O-(CH2)q-CH . dans laquelle q est un nombre entier de 0 à 6, notamment 5,
. R2 représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle),
. R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone,
. et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n-(CH2)p-Z, OH S SH O
dans lequel Y représente -O-, -CH-, -C-, -CH-, -C-NH, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3", ou PO3", et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro, ou R5 représente -(CH2)r-C02-R, r étant un nombre entier de 1 à 6, notamment 2, et R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone,
. R et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1, p est différent de 0.
L'invention concerne également un procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des virus, susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des tumeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante:
Figure imgf000007_0001
dans laquelle:
. X représente C=O ou CH-OH,
. Ri représente -CH=CH2 ou -COCH3,
. R2 représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle),
. R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone,
. et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n-(CH2)p-Z, OH S SH O
dans lequel Y représente -O-, -CH-, -C-, -CH-, -C-NH, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3", ou PO3", et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro,
. R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1, p est différent de 0, - ces composés ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits virus.
Par l'expression "dérivés du noyau phorbine", on entend tout composé constitué du noyau suivant (dans lequel les positions ont été numérotées suivant la nomenclature internationale):
Figure imgf000008_0001
Des dérivés du noyau phorbine particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention, sont choisis parmi ceux de formule (I) dans laquelle R5 représente le groupe -(CH2)2-CO-NH-(CH2)ml-Zι, dans lequel Z\ représente
-OH, un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou -CH3, et m est un nombre entier de 1 à 8.
De préférence, les dérivés du noyau phorbine susmentionnés sont choisis parmi ceux répondant à la formule (la) suivante
Figure imgf000009_0001
COOCH3
dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 12, et plus particulièrement le composé de formule (la) dans laquelle m représente 4, à savoir l'éthényl-9- éthyl-14-(méthoxycarbonyl)-21-tétraméthyl-4,8J3 J8-oxo-20-(hydroxybutyl-4)- N-propanamide-3-phorbine (encore désigné ci-après par l'expression PH4OH), et le composé de formule la dans laquelle m représente 6, à savoir l'éthényl-9- éthy 1- 14-(méthoxycarbony l)-21 -tétraméthyl-4 ,8,13,18-oxo-20-(hydroxy héxy 1-6)- N-propanamide-3-phorbine (encore désigné ci-après par l'expression PHόOH).
Un autre dérivé du noyau phorbine particulièrement préféré dans le cadre de la présente invention, correspond à l'acétyl-9-éthyl-14-dihydro-13J4- (méthoxycarbonyl)-21 -tétraméthyl-4 ,8 , 13 , 18-oxo-20-(hydroxybutyM)-N- propanamide-3 -phorbine de formule (Ib) suivante
Figure imgf000009_0002
COOCH3 Un autre dérivé du noyau phorbine préféré dans le cadre de la présente invention correspond à l'éthényl-9-éthyl-14-tétraméthyl-4,8J3J8-oxo-20- (hydroxyhexyl-6)-N-ρropanamide-3-phorbine de formule (le) suivante
Figure imgf000010_0001
Parmi les dérivés de formule (I) dans laquelle Z représente -COOH, -CH3 ou -SO3"", on citera plus particulièrement les dérivés de formule (Id) suivante:
Figure imgf000010_0002
COOCH3
dans laquelle Z représente -COOH (dérivé ci-après désigné PH2COOH), -CH3 (dérivé ci-après désigné PH2CH3), -SH (dérivé ci-après désigné PH2SH), ou - SO3" (dérivé ci-après désigné PH2SO3"). Parmi les agents responsables de maladies parasitaires susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, on citera plus particulièrement:
- les agents responsables du paludisme, et plus particulièrement Plasmodium falciparum (P. falciparum), P. vivax, P. ovale et P. malariae,
- les agents responsables des trypanosomiases, notamment Trypanosoma brucei gambiense (T. b. gambiense) responsable de la maladie du sommeil, et T.cruzi responsable de la maladie de Chagas,
- les helminthes, notamment les filaires responsables des filarioses lymphatiques,
- les leishmanies, notamment Leishmania donovani et L. major, responsables des leishmanioses,
- Babesia divergens responsable de babesioses bovines ou humaines (individus splenectomisés).
Parmi les agents responsables de maladies virales susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, dans le cadre de la mise en oeuvre du procédé de l 'invention, on citera plus particulièrement les virus à enveloppe, notamment, les virus responsables des différentes hépatites, les cytomégalovirus et les virus du type HIV responsables du SIDA.
Les produits sanguins susceptibles d'être décontaminés dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, correspondent au sang prélevé sur des mammifères, humains ou animaux, et conservé dans un conditionnement approprié, notamment dans des poches pour perfusion, ou correspondent à des préparations de cellules sanguines, et plus particulièrement d'érythrocytes, débarrassées de tout ou partie des autres constituants du sang.
Selon un mode de réalisation préférée du procédé selon l'invention, la concentration en composés photosensibilisateurs dans les produits sanguins à traiter d'environ 0J μmole/1 à environ 100 μmole/1, et avantageusement d'environ 0J μmole/1 à environ 10 μmole/1.
De préférence la dose d'énergie lumineuse incidente utilisée dans le cadre du procédé selon l'invention, est d'environ 1 à environ 100 Joules (longueur d'onde d'environ 660 nm à environ 800 irai).
A titre d'illustration, 1 minute d'irradiation avec des radiations lumineuses de longueur d'onde 670 ± 10 nm, dans des boîtes de 25 cm2 (contenant environ 5 ml de sang), correspond à 11,2 Joules d'énergie lumineuse incidente.
L'invention vise également l'utilisation de composés photosensibilisateurs lipophiles, et plus particulièrement des composés photosensibilisateurs selon la formule (I) ci-dessus, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement par voie extra-corporelle du sang de mammifères, humains ou animaux, susceptibles d'être porteurs de parasites et/ ou de virus, eux-mêmes susceptibles d'être présents dans le sang, ce traitement comprenant une étape d'exposition d'une quantité déterminée du sang de ces mammifères contenant ces composés photosensibilisateurs, à une source de lumière susceptible d'exciter ces composés photosensibilisateurs.
L'invention a également pour objet des compositions sanguines comprenant des composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, et plus particulièrement au moins un des composés selon la formule générale (I) ci-dessus, en mélange avec un produit sanguin correspondant à du sang prélevé chez l'homme ou l'animal, ou à des préparations de cellules sanguines telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne également les compositions sanguines telles que décrites ci-dessus, irradiées à l'aide d'une source lumineuse selon le procédé susmentionné de l'invention.
L'invention vise également l'utilisation de compositions sanguines telles que définies ci-dessus, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement extra-corporel des états pathologiques chez les mammifères, humains ou animaux, dus à l'infection de ces derniers par des parasites et/ou des virus.
Les états pathologiques dus à l'infection d'individus par des parasites, et susceptibles d'être traités dans le cadre des utilisations susmentionnées, sont notamment les suivants:
- le paludisme,
- les trypanosomiases,
- les filarioses,
- les leishmanioses,
- les babesioses.
Les états pathologiques dus à l'infection d'individus par des virus, et susceptibles d'être traités dans le cadre des utilisations susmentionnées, sont notamment les suivants:
- les différentes hépatites,
- les pathologies dues à l'infection par les cytomégalovirus,
- le SIDA.
Selon un mode de réalisation de la méthode de traitement par voie extra¬ corporelle susmentionnée, une quantité déterminée du composé photosensibilisateur est ajoutée au sang mis en circulation extra-corporelle, puis ce sang contenant ce composé photosensibilisateur est exposé à la source de lumière. De préférence, la quantité du composé photosensibilisateur ajoutée au sang mis en circulation extra-corporelle, est telle que la concentration de ce composé dans le sang est d'environ 0J μmole/1 à environ 100 μmole/1, et avantageusement d'environ 0J μmole/1 à environ 10 μmole/1, et en ce que la dose d'énergie lumineuse est telle que décrite ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation de la méthode de traitement par voie extra-corporelle susmentionnée, une quantité déterminée du sang des mammifères, auxquels a été préalablement administrée une quantité appropriée du composé photosensibilisateur, est mise en circulation extra-corporelle et est exposée à la source de lumière.
De préférence, la quantité du composé photosensibilisateur administrée au mammifère est d'environ 0,3 mg à environ 3 mg par kg de poids corporel par jour, et en ce que la dose d'énergie lumineuse est telle que décrite ci-dessus.
La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de composés de l'invention et de leur utilisation dans le cadre de la décontamination de produits sanguins infectés par P. falciparum.
I. Description des figures:
Figure 1 : Marquage des globules rouges humains par le PH^OH
Une aliquote (2 ml) d'une culture in vitro de Plasmodium falciparum (parasitémie de l'ordre de 10%) est incubée à 37 °C, dans l'obscurité, pendant 2 heures avec la drogue constituée par PH4OH (concentration finale de 10 μM). Après lavage des cellules par centrifugation (600 g, 5 minutes) dans du milieu de culture, le culot de cellules est repris dans ce même milieu. Une goutte de cette suspension est montée entre lame et lamelle, et observée au microscope à fluorescence (objectif à immersion x 100, filtre 420 nm < λexc < 485 nm et λem > 520 nm). (Figures a, b: formes "anneaux"; c, d, e: formes trophozoïtes; f: formes schizontes; g: mérozoïtes).
Figure 2: Effet du dérivé PH4OH sur la parasitémie dans une culture in vitro de globules rouges humains infectés par Plasmodium falciparum. Les cellules sont incubées avec la drogue pendant 2 heures à 37 °C en milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum humain, lavées, puis irradiées à 670 nm durant des temps variables (1 à 15 minutes). La parasitémie est mesurée 48 h après l'irradiation par comptage des parasites après coloration au May-Giemsa- Grunwald. Une minute d'irradiation correspond à environ 11 Joules. Figure 3: Effet du dérivé PH4OH sur la parasitémie d'un sang total infecté par Plasmodium falciparum, en fonction de la concentration de la drogue. Le sang est incubé pendant 2 heures à 37 °C avec la drogue. L'irradiation est réalisée à 670 nm pendant 5 minutes. La parasitémie est mesurée 48 h après l'irradiation par comptage des parasites après coloration au May-Giemsa-Griinwald .
Figure 4; Effet du PH4OH sur la survie des formes épimastigotes de Trypanosoma cruzi en culture (milieu LIT supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal) en fonction de la concentration de la drogue. L'incubation avec la drogue est réalisée pendant 2 heures à 27 °C. Après lavage, l'irradiation est réalisée à 670 nm pendant 5 minutes. La parasitémie est mesurée 48 h après l'irradiation par comptage des parasites à la cellule de Malassez.
Figures 5A. 5B. 5C: Tests d'activité in vitro du DR5. MACE. PH^OH
Les drogues, DR5 (Figure 5A), MACE (Figure 5B), et PH4OH (Figure 50 ont été additionnées à des aliquotes de 5 ml de culture in vitro de Plasmodium falciparum en flacons de 25 cm2, parasitémie de 3% pour DR5 et MACE et 1,5% pour le PH4OH. Ces flacons sont remis en culture à 37°C, dans l'obscurité pendant 2 heures. Chaque flacon est ensuite irradié pendant différents temps: 0, 1, 5, 10 minutes pour le DR5 et le PH4OH (courbes a, b, c, d respectivement). Après irradiation, les boîtes sont remises à incuber à 37 °C, dans l'obscurité. Après 2 jours, la parasitémie est déterminée par comptage de 1000 cellules sur frottis sanguins colorés au Diff-Quick.
Figure 6: Comparaison in vitro des différents dérivés PH.
Chaque dérivé PH (A: PH4OH, B: PH2CH3, C: PH2SO3-, D: PH2COOH) est incubé, pendant 30 minutes à 37 °C, à l'obscurité, en flacon de 25 cm2 avec 5 ml d'une culture asynchrone (3% de parasitémie) de Plasmodium falciparum. La concentration finale en composé photosensibilisateur est de 0,5μM pour chaque composé. Après incubation les cellules sont ensuite irradiées pendant 5 minutes, lavées dans du milieu RPMI et remises en culture à 37°C dans l'obscurité. Après 2 jours, l'inhibition de la croissance des parasites de chaque flacon par rapport aux témoins avec drogue mais non irradiés, est estimée en calculant la parasitémie sur frottis sanguins colorés au Diff-Quick. Figur 7: Comparaison sur du sang total des dérivés PH fPH^OH. PH CH3 sur des globules rouges infectés par Plasmodium falciparum.
Des hématies parasitées ont été mélangées à du sang total âgé de 2 semaines (parasitémie finale de 2%). Des aliquotes de 500 μl de ce mélange auxquels sont rajoutés les composés photosensibilisateurs (PH4OH, PH2CH3) ont été placés en boîte 24 puits. Chaque boîte est incubée à 37 °C, dans l'obscurité, pendant 2 heures. Elles sont ensuite irradiées pendant 5 minutes, après quoi les cellules sont lavées 2 fois par centrifugation (600 g, 5 minutes) avec du RPMI. Le culot cellulaire est ensuite remis en culture dans 5 ml de milieu en flacons de 25 cm2 et à l'obscurité. Après 3 jours, la parasitémie est estimée sur frottis sanguins colorés au Diff-Quick. Parallèlement il est fait des témoins contenant la drogue mais non-irradiés.
Figure 8: Exemple reflétant l'activité anti virale du dérivé PHjOH
Voir section 4.6 des exemples.
IL Exemples de synthèse de composés photosensibilisateurs utilisés dans le cadre de la présente invention.
EXEMPLE 1
9-éthény 1- 14-éthyl-21 Jméthoxycarbonvn-4.8.13.18-tetraméthyl-20-oxo- N .4-hydroxybutylV 3-phorbinepropanamide PH^OH^
250 μmoles de phéophorbide a, sont dissous dans 25 ml de dichlorométhane dans un flacon au fond circulaire, protégés de l'humidité par un flux d'azote et refroidis dans un bain de glace. 260 μmoles de N- hydroxysuccinimide sont ajoutés à la solution, puis 350 μmoles de dicyclohexylcarbodiimide. Le mélange est agité pendant 4 heures par un mélangeur magnétique. Le solvant est alors éliminé sur un évaporateur rotatif et le résidu gras dissout dans 30 ml d'acétonitrile. 500 μmoles de 4-aminobutanol, dissous dans 30 ml d'un mélange 2-propanol : eau, 1: 1, sont ajoutés goutte à goutte à la solution mélangée pendant une période de 30 minutes à température ambiante. Le mélange est agité pour une durée supplémentaire de 4 heures et ensuite transféré dans une ampoule à décanter et réparti entre 150 ml de dichlorométhane et 50 ml d'eau. Après lavage avec deux parties de 50 ml d'eau, la phase organique est séchée au sulfate de magnésium, filtrée et évaporée jusqu'au séchage total. Le résidu est dissout dans 10 ml de dichlorométhane et déposé sur une colonne de gel de silice de 2 x 30 cm (E. Merck gel de silice 60 (70-230 mesh) préparée sous dichlorométhane. La colonne est éluée avec 300 ml de dichlorométhane, puis avec 200 ml d'acétonitrile et enfin avec 400 ml de dichlorométhane : methanol (8:2). Le produit a été obtenu dans l'éluat de dichlorométhane : methanol. Les fractions contenant le produit ont été identifiées par chromatographie en couche mince de gel de silice 60 E. Merck sur plaques de papier aluminium; le solvant de chromatographie est: chloroforme : methanol : acide sulfurique 0.01 N (80:20:2). Le rendement est de 200 μmoles (80%).
EXEMPLE 2
9-éthény 1- 14-éthy 1-21 -dnéthoxycarbony 1V4.8.13.18- tetraméthy 1-20-oxo-N- (6-hydroxyhexyl)-3-phorbinepropanamide) (PH^OH)
Le procédé de l'exemple 1 ci-dessus, est appliqué à l'exception du fait que 500 μmoles de 6-aminohexanol ont été substitués au 4-aminobutanol. Le rendement du produit désiré est de 190 μmoles (75%).
EXEMPLE 3
9-éthényl-14-éthyl-4.8J3J8Jetraméthyl-20-oxo-N-C6-hydroxyhexyn-3- phorbine propanamide (PyPH^OH)
200 μmoles de pyrophéophorbide a sont convertis en éther activé avec du N-hydroxysuccinimide et du dicyclohexylcarbodiimide comme décrit ci-dessus pour le phéophorbide a dans l'exemple 1. Cet intermédiaire dissout dans 50 ml d'acétonitrile, est ajouté au goutte à goutte à la solution agitée de 300 μmoles de 6-aminohexanol dans 50 ml de 2-propanol, contenus dans un flacon de 250 ml muni d'un mélangeur magnétique. Le mélange est agité pendant 4 heures, puis transféré dans une ampoule à décanter de 500 ml, avec 100 ml de dichlorométhane. La solution est extraite avec 4 x 50 ml d'eau. La phase organique est séchée avec du sulfate de magnésium et le solvant évaporé. Le résidu est dissout dans 10 ml de dichlorométhane et déposé sur une colonne de gel de silice de 2 x 40 cm (E. Merck gel de silice 60 (70-230 mesh)) préparée dans du dichlorométhane. La colonne est éluée avec 200 ml de dichlorométhane, puis avec 200 ml de dichlorométhane : methanol (9:1), 200 ml de dichlorométhane : methanol (4:1) et 400 ml de dichlorométhane (7:3). Les fractions contenues dans le produit, telles que détectées par TLC, sont regroupées. Les plaques de TLC sont du gel de silice 60 E. Merck sur du papier aluminium. Le solvant de chromatographie est le dichlorométhane : methanol : acide sulfurique 0.02 N 85: 15: 15. Le rendement est de 200 μmoles (66%).
EXEMPLE 4
9-acétyl- 14-éthy 1 - 13 J 4-dihydro-21 -fméthoxycarhony 1V4.8.13.18- tetraméthyl-20-oxo-N-C4-hydroxybutylV3-phorbinepropanamide (BPH/jOH)
100 μmoles de bactériophéophorbide a sont dissous dans 5 ml de chloroforme contenu dans un flacon au fond circulaire de 25 ml, et refroidis dans un bain de glace et protégés de l'humidité par atmosphère d'Argon 100 μmoles d'hydrure de 1-hydroxybenzotriazole sont ajoutés et le mélange est agité pendant 15 minutes. 300 μmoles de dicyclohexylcarbodiimide sont ensuite ajoutés et agités de façon continue pendant deux heures. Le chloroforme s'évapore et le résidu est dissout dans 5 ml de 2-propanol. A la solution agitée magnétiquement, est ajoutée une solution de 0.5 mmole de 4-aminobutanol dans 5 ml de 2-propanol. Le mélange est agité pendant 5 heures, puis transféré séparément dans une ampoule à décanter avec 40 ml de dichlorométhane. Le mélange est extrait avec 2 x 40 ml d'eau et la phase organique est séchée par du sulfate de magnésium. Le solvant est évaporé par un évaporateur rotatif, le résidu est repris dans 5 ml de dichlorométhane, et déposé sur une colonne 2x20 cm de gel de silice (E Merck silica gel 60(70-230 mesh)). La colonne a été éluée avec 200 ml de dichlorométhane, ensuite avec 200 ml d'acétonitrile, puis avec 300 ml de dichlorométhane : methanol (1:1). Les fractions contenant le produit sont identifiées par TLC sur gel de silice E. Merck sur des plaques en papier aluminium. Le rendement est de 55 μmoles (55%).
EXEMPLE 5
Purification de PH^OH
L'instrument employé est le Waters Delta Prep 3000, utilisant une colonne DELTA PAK 15 μ C18-100Â de 10 x 300 mm. Le système de solvant est composé de 75% d'acétonitrile, 25% de tampon phosphate triéthylamine à un pH de 3.2. Le débit est de 20 ml par minute. La détection a été réalisée par absorbance de lumière à 410 mm. Un échantillon de 10 mg, dissout dans 5.0 ml d'acétonitrile est injecté.
Le pic du produit majeur (superficie 47.4%) a un temps de rétention de 36.97 minutes. Cette fraction (volume, 72 ml) a été répartie entre 450 ml de dichlorométhane et 400 ml d'eau. La couche de dichlorométhane est séparée, puis lavée avec 5 parties de 400 ml d'eau supplémentaires, séchée par du sulfate de sodium et évaporée pour donner 1.25 mg du produit.
Une analyse HPLC montre que ce produit est pur à 99.4% .
La spectrométrie de masse montre un ion moléculaire à m/z, 692 daltons (M+), C 1H49N5θ5 correspond à 692.
EXEMPLE 6
Purification de PH^OH
Les mêmes instrument et colonne que dans l'exemple 5 sont utilisés. Le solvant est methanol : eau (88 parties MeOH pour 12 parties HoO, par volume). Le débit est de 20 ml/minute. La détection a été réalisée par absorbance de lumière à 410 mm. Un échantillon de 10.2 mg, dissout dans 10 ml dudit mélange methanol : eau, et filtré, est injecté.
Le pic du produit majeur (superficie 80,8%) a un temps de rétention de 80.8 minutes. La fraction principale du produit (environ 125 ml) est concentrée sur un évaporateur (température du bain inférieure à 40°C). Lorsque la majorité du methanol est éliminée, un solide vert est séparé. Le solide est dissout dans du dichlorométhane et la couche de dichlorométhane est séparée et évaporée par un flux d'azote sec. Après séchage par du pentoxide de phosphore in vacuo, le produit a un poids de 3.7 mg (récupération, 44.9%).
Une analyse HPLC montre que ce produit est pur à 97.3% .
Une spectrométrie de masse montre un ion moléculaire à m/z 664 daltons (M+). C39H45N5O5 correspond à 664.
Les dérivés du noyau phorbine décrits dans le cadre de la présente invention, et plus particulièrement ceux préparés selon les exemples décrits ci- dessus, peuvent être traités avec un composé métallique, par exemple, un halogénure métallique, dans un solvant approprié, avec chauffage, pour produire des complexes de metalo-phorbine dans lesquels le métal remplace les deux hydrogènes liés aux atomes d'azote dans le noyau phorbine. Les métaux représentatifs de la formation de tels complexes incluent Si, Mn, Fe, Co, Ni, Zn, Ga, In, Sn, Sm, Eu, Gd, Te et Tl. III) Matériel et méthodes
1. Culmre in vitro de Plasmodium falciparum
1 J . Conditions de culmre
La souche de Plasmodium falciparum, FcBl de Colombie (souche résistante à la chloroquine), est maintenue en culmre in vitro sur érythrocytes humains selon la méthode de Trager et Jensen (Trager, W. and Jensen, J.B. Human malaria parasites in continuous culmre. Science 193: 673-675, 1976). Le milieu de base est le RPMI (Roswell Park Mémorial Institute) 1640 (Gibco BRL, Cergy Pontoise) additionné de 25 mM HEPES pH = 7,5, de 27,5 mM de NaHCθ3, de 11 mM de glucose, de 100 UI.mH de Pénicilline et de 100 μg.mH de Streptomycine. Ce milieu de base est supplémenté avec 7,5 % (V/V) de plasma humain décomplémenté. Plasmodium falciparum est cultivé à 37°C, avec un hématocrite de 2 à 5% de globules rouges humains (recueillis sur citrate dextran. et utilisés dans les 3 semaines consécutives au prélèvement), sous une atmosphère de 3 % CO2, 6% O2 et 91 % N2. Pour une parasitémie comprise entre 1 et 10%, le milieu est changé quotidiennement par aspiration, alors que pour les fortes parasitémies (supérieures à 10%), il est renouvelé plusieurs fois par jour. Les cultures à parasitémie élevée (15%) sont diluées avec de nouvelles hématies préalablement lavées avec du milieu de culmre. La parasitémie est déterminée sur frottis sanguins colorés au May-Griinwald- Giemsa ou au Diff-Quick (Merz + Dade, Dϋdingen, Suisse) par comptage de 1000 cellules.
Σ Hématies parasitées Calcul du pourcentage de parasitémie (P): P = X 100
Σ Hématies totales
1.2 Synchronisation sur 4 heures des cultures in vitro
Une synchronisation fine sur 4 heures peut être réalisée à partir d'une culmre in vitro asynchrone de Plasmodium falciparum, par la mise en oeuvre d'une technique de lyse sélective des hématies infectés contenant des stades âgés de Plasmodium falciparum (trophozoïtes, schizontes) par incubation dans le D- Sorbitol 5% (P/V) dans l'eau distillée selon la méthode de Lambros et Vanderberg (Lambros, C. and Vanderberg, J.P. Synchronisation of Plasmodium falciparum erythrocytic stage in culmre. Journal of Parasitology 65: 418-420, 1979), et par une technique de sélection des stades érythrocytaires âgés (trophozoïtes âgés et schizontes) par flottaison sur gélatine (PLASMAGEL, Laboratoire Roger Bellon, Neuilly) selon Pas vol et al. (Pas vol et al., Séparation of viable schizont infected red blood cell of Plasmodium falciparum from human blood. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 72: 87-88, 1979).
Une population de formes anneaux obtenue après traitement au sorbitol 5 % (P/V) est remise en culmre pour croissance. Dès que les parasites les plus âgés ont atteint le stade de schizonte mature, les globules rouges infectés par ces formes âgées sont concentrés par Plasmagel et remis en culmre avec des hématies fraîches à 20% de parasitémie. La libération des mérozoïtes et la formation de nouveaux anneaux sont suivis régulièrement sur frottis sanguins. 4 heures après la libération des premiers mérozoïtes, un traitement au sorbitol permet d'éliminer les formes âgées et d'obtenir une population de formes anneaux synchronisée sur une fenêtre de 4 heures.
1 .3 Estimation de la survie du narasite dans du sang total maintenu à 4°C
Des hématies infectées par des formes anneaux de Plasmodium falciparum provenant de culmre in vitro et synchronisées sur 4 heures, ont été mélangées à du sang total (cellules et plasma extraits de poches de transfusion) et laissées à 4°C. La parasitémie initiale est de 1,75% . Afin d'estimer la survie du parasite, des aliquotes de 200μl sont prélevés à différents temps et mis en culmre dans des flacons de 25 cm2, avec 5 ml de milieu. La parasitémie est déterminée après plusieurs cycles de multiplication. Ainsi une estimation du nombre de parasites vivants lors de la remise en culmre peut être effectuée à partir de la parasitémie déterminée après plusieurs jours de culmre in vitro des aliquotes prélevés, et du facteur de multiplication de la souche FcBl/Colombie, qui est en moyenne de 4 par cycle endoérythrocy taire de 48 heures. La formule suivante:
100x(D-Δ) Kn S =
D permet d'estimer le pourcentage de parasites vivants au moment de la remise en culmre, où A représente la parasitémie obtenue après plusieurs jours de culmre, D la parasitémie initiale (1,75%), n le nombre de cycles effectués, et k le facteur moyen de multiplication de la souche de Plasmodium falciparum concernée. D'autre part, une détermination des paras itémies et un comptage des hématies sur cellules de Malassez, permettent de connaître le nombre de parasites présents dans lμl de solution. De ce fait, il est possible de calculer le nombre de parasites survivants dans lμl au moment où ils sont remis en culmre, et d'extrapoler à la quantité de parasites vivants dans une poche de sang (400 ml) stockée dans les mêmes conditions.
2. Les composés photosensibilisateurs.
2J Solutions stocks.
Le MACE correspond au monoaspartylchlorine E6, le DR5 correspond au dérivé de formule suivante:
Figure imgf000021_0001
DR-5
Les solutions mères à lOmM de MACE ou de DR5 sont réalisées dans du DMSO et conservées à 4°C. Les solutions stocks de 2mM des dérivés PH (PH4OH, PH2CH , PH2SO3-, PH2COOH, PH2SH) sont réalisées dans de l'éthanol absolu et conservées à -20 °C. Dans tous les cas, ces solutions mères sont stockées à l'obscurité. Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission pour le MACE et le DR5 sont de λexc=410 nm et λem=666 nm et de 400 et 666 nm pour les dérivés PH.
Chaque manipulation doit être effectuée en lumière atténuée afin de préserver l'intégrité des molécules. 2.2 Cinétique d'incorporation des composés photosensibilisateurs par les hématies saines et les hématies parasitées par Plasmodium falciparum.
2.2.1 "Effet écran" .
A partir d'une solution mère de 10- globules rouges sains par ml, différentes concentrations de cellules sont testées. Pour chaque concentration cellulaire, des aliquotes sont prélevées, centrifugées (600 g, 5 minutes), et le culot cellulaire lysé avec une solution de Triton X 100 à 2% (P/V) dans de l'eau bidistillée contenant une concentration fixe de composé photosensibilisateur (≈ 1.5 nM). Après centrifugation (15000 g, 15 minutes), la fluorescence du surnageant est mesurée sur un spectrofluorimètre Perkin Elmer LS5 pour une longueur d'onde d'excitation de 410 nm et une longueur d'onde d'émission de 666 nm.
2.2.2. Cinétique d'incorporation des composés photosensibilisateurs.
Ces études ont été réalisées comparativement avec des globules rouges sains et des globules rouges infectés par des formes âgées trophozoïtes âgés et schizontes) de Plasmodium falciparum, obtenues après concentration avec la technique du Plasmagel (Lambros, C. and Vanderberg, J.P. Synchronisation of Plasmodium falciparum erythrocytic stage in culmre. Journal of Parasitology 65: 418-420, 1979) (parasitémie >60%). Les cellules sont comptées sur cellule de Malassez et leur concentration ramenée, avec du milieu de culmre, à 10^ cellules. ml" 1. Pour chaque temps de la cinétique d'incorporation, les manipulations sont effectuées sur 0,1 ml des cultures, de façon à obtenir 10^ cellules, afin que le culot cellulaire soit visible. Au temps t0 de la cinétique, le composé photosensibilisateur est ajouté à la solution mère de cellules (10*7 .ml"l) de façon à obtenir une concentration finale de composé de 10μM. Ces solutions sont mises à incuber à 37 °C, à l'obscurité, sous agitation. A chaque temps de la cinétique, 3 aliquotes de lOOμl (10^ cellules) sont prélevées et lavées 2 fois par centrifugation (10 000 g, 1 minute) dans 500 μl de PBS. Chaque culot cellulaire est ensuite lysé avec 1 ml de Triton X 100 à 2% (P/V) dans de l'eau bidistillée. L'échantillon est de nouveau dilué avec la solution de Triton pour avoir l'équivalent de 5.1θ4 cellules par ml, concentration de globules rouges à laquelle la fluorescence du composé n'est pas masquée par l'effet d'écran. Les lysats sont centrifugés 15 minutes, à 15000 g, et la fluorescence mesurée à l'aide d'un spectrofluorimètre Perkin Elmer LS5 à des longueurs d'ondes λexc=410 nm et λem=666 nm pour le MACE et le DR5 et de 400 et 666 nm pour le PH et ses dérivés. Chaque point de la cinétique correspond à la moyenne des 3 valeurs plus ou moins l'écart type. Pour chaque mesure, deux séries de témoins sont traitées de façon identique: la première est constituée de cellules sans composé photosensibilisateur et la seconde contient le milieu de culmre et le composé photosensibilisateur.
2.3 Localisation des photosensibilisateurs par vidéo microscopie à fluorescence.
Les globules rouges sains et les globules infectés par les différents stades de Plasmodium falciparum, souche FcBl, sont incubés pendant 30 minutes, à 37 °C, dans un milieu de culmre avec de 0,2μM à lOOμM de chaque dérivé PH et de 10 à 500μM de MACE et DR5. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois par centrifugation (600 g, 5 minutes) avec du milieu de culmre à 7,5 % sérum. L'observation du marquage a été réalisée à l'aide d'un microscope à épifluorescence Optiphot de Nikon, équipé d'un arc au mercure de 100 Watts (objectif à immersion 100 X). Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission utilisées sont respectivement de 420 nm < λexc < 485nm et λem > 520 nm. L'extinction rapide de la fluorescence des composés (de l'ordre de la seconde) est atténuée par l'utilisation d'un filtre limitant la source lumineuse à l/32iéme. L'enregistrement des images sur vidéo cassettes est obtenu par une caméra LHESA 4036 à bas niveau de lumière (LHESA électronique, Cergy Pontoise) couplée à un magnétoscope Sony "U"-matic V05850-P. Après sélection des images des bandes d'enregistrement, ces dernières sont traitées à l'aide du système Sapphire (Quantel, Ltd Berkshire, GB). Les photographies sont ensuite réalisées sur film PAN F Ilford en utilisant le "Vidéo printer" VIP3 de Polaroid (Polaroid Corporation, Cambridge, USA).
3. Test d'activité des composés photosensibilisateurs.
3.1 Matériel d'irradiation.
La table d'irradiation est composée de 2 lampes Tungstène-Iode émettant des longueurs d'ondes de 670 nm et d'un système de circulation d'eau permettant de maintenir les boîtes de cultures à 37 °C en évitant une surchauffe de l'échantillon. Le système est conçu pour que l'éclairage du plateau soit uniforme (3mW/cm2).
3.2 Sélection des composés photosensibilisateurs in vitro.
Ces tests ont été effectués à partir de cultures in vitro de Plasmodium falciparum asynchrones avec une parasitémie comprise entre 1 et 3 % et à un hématocrite de 5 % . Pour chaque concentration de composé photosensibilisateur, 5 ml de culmre ont été incubés, en présence des molécules, de 30 minutes à 2 heures, à 37°C dans des flacons de 25 cm2 puis irradiés pendant différents temps et remis en culmre à 37 °C, dans l'obscurité. La parasitémie a été déterminée 2 jours et 6 jours après l'irradiation. Parallèlement, deux séries de témoins ont été effecmées: la première est constituée de culmres en l'absence de composé photosensibilisateur mais soumises aux différents temps d'irradiation, la seconde, de culmres en présence des différentes concentrations en composés photosensibilisateurs mais non irradiées.
3.3 Détermination de l'efficacité des composés photosensibilisateurs sur du sang total infecté par Plasmodium falciparum.
Des hématies parasitées provenant de culmres in vitro ont été mélangées à du sang total pour obtenir une parasitémie finale de 1 à 5% . Ce sang total parasité est aliquoté en plaques de 24 puits (500μl/puits) et le composé photosensibilisateur ajouté dans chaque puits pour obtenir la concentration désirée. Chaque plaque est ensuite incubée à 37°C. dans l'obscurité, pendant 2 heures, puis soumise à différents temps d'irradiation (de 0 à 10 minutes). Après exposition à la lumière, les cellules de chaque puits sont lavées 2 fois avec du RPMI sans rouge de Phénol (GIBCO BRL, Cergy Pontoise), et remises en culmre à l'obscurité, en flacon de 25cm2, dans 5 ml de milieu. Puis, 2 jours et 6 jours après l'irradiation, 600μl de suspension cellulaire sont prélevés dans chaque flacon et centrifugés à 600 g, pendant 5 minutes. Pour chaque flacon, la parasitémie sera déterminée sur le culot cellulaire et la lyse des globules rouges sur le surnageant. Parallèlement, 2 séries de témoins sont réalisées: la première est constituée de sang total parasité sans composé photosensibilisateur soumis aux différents temps d'irradiation, la seconde, de sang total incubé avec les différentes concentrations en composés photosensibilisateurs mais non-irradié.
3.4 Effet hémolytique des composés photosensibilisateurs.
L'effet hémolytique des composés photosensibilisateurs est déterminé en mesurant l'absorbance des surnageants de culmre à 575 nm, longueur d'onde correspondant à l'absorbance de Thème de l'hémoglobine libérée dans le milieu lors de la lyse des globules rouges. Cette étude a été réalisée avec du milieu de culmre RPMI sans rouge de phénol car celui-ci absorbe à 575 nm. 400 μl de surnageant de culmre sont dilués au demi avec de l'eau distillée et l'absorbance lue au spectrophotomètre UVIKON 930 (KONTRON INSTRUMENT) à 575 nm. La référence de base correspondant à 0% de lyse est déterminée en mesurant l'absorbance du milieu de culmre dilué de moitié avec de l'eau distillée. Le 100% de lyse est obtenu en lysant le culot de globules rouges lavés, extrait de 80 μl de sang total, dans 1 ml d'eau distillée et le diluant au demi avec le milieu de culmre. La courbe d'absorption à 575 nm en fonction de la lyse cellulaire montre une linéarité entre 0 et 50% de lyse.
Vr> Résultats et discussion.
1. Résistance de Plasmodium falciparum à une température de 4°C. Peu de données précises sont disponibles sur la capacité de survie de Plasmodium falciparum à 4°C dans les poches de sang. Bruce-Chwatt (1974) estimait que Plasmodium malariae et Plasmodium falciparum pouvaient survivre à 4°C pendant 10 à 14 jours, préconisant ainsi un stockage des poches de sang d'au moins 2 semaines pour limiter tout risque de contamination lors de transfusion (Bruce-Chwatt, LJ. Transfusion Malaria. Bulletin de l'O.M.S. 50: 337-346, 1974). Au Mexique, il est préconisé d'attendre 10 jours avant de transfuser une poche de sang (Olivares Lόpez et al. , Infecciones transmitidas por transfusion de sangre. Revista Medica del Instimto Mexicano del Seguro Social 26 (1): 41-47, 1988). Pour avoir des données plus précises, a été entreprise une étude de la capacité de survie à 4°C de Plasmodium falciparum, souche chloroquine-résistante FcBl de Colombie, dans le sang total (voir matériel et méthodes). Pour obtenir une meilleure appréciation de la réalité, l'expérience a été faite avec des formes jeunes du parasite, provenant de cultures in vitro synchrones sur 4 heures. Ces formes anneaux sont en effet, essentiellement les formes récoltées lors d'un don de sang. Chez Plasmodium falciparum, ces formes se retrouvent dans la circulation veineuse alors que les globules rouges infectés par les trophozoïtes et les schizontes sont séquestrés dans les capillaires profonds.
La survie du parasite, à 4°C, dans le sang total a été estimée après différents temps de stockage par le développement du parasite en culmre in vitro. Le pourcentage de survie (S) a été calculé à partir de la parasitémie observée in vitro, en tenant compte du facteur de multiplication de la souche FcBl (X4) et du nombre de cycles effectués (voir "matériel et méthode" pour la formule de calcul). Les résultats sont présentés dans le Tableau 1. Tableau 1: Survie du parasite à 4°C déterminée à l'aide de la formule:
lOOx(D-Δ) Kn
D
Temps à 4°C en Pourcentage de Pourcentage de Nombre de Nombre de jours parasites morts parasites vivants parasites parasites vivants/μl (S) vivants/poche
0 0 100 101732 4.1010
3 50,6 49,4 50224 2.1010
7 77 33 23490 9,3.109
10 99 1 1017 4.108
14 99,99 0,01 10 4.106
Ces résultats montrent que plus de la moitié des parasites est incapable de se multiplier après 3 jours de stockage à 4°C. Cependant, après 2 semaines de stockage, 0,01 % des parasites, possèdent encore la capacité de se développer à 37 °C. Bien que la parasitémie initiale soit faible, (1,75%) un stockage de 2 semaines à 4°C ne suffit donc pas à éliminer tous les parasites, et le risque de contamination par transfusion reste présent. Le nombre de parasites de Plasmodium falciparum nécessaires pour être à l'origine d'une infection n'est pas connu. Cependant, bien que faible, le pourcentage de survie à 14 jours (0,01 %) équivaut à 4Jθ parasites viables par poche de sang (400 ml). Il est à noter que pour P. vivax seulement 10 parasites suffisent à induire la maladie (Bruce-Chwatt, L.J. Transfusion Malaria. Bulletin de l'O.M.S. 50: 337-346, 1974). Par ailleurs, en utilisant le test QBC (BECTON DICKINSON, Franklin Lakes, USA), test commercial actuellement le plus sensible pour la détection du paludisme, le taux de 10 parasites par μl est nettement supérieur au seuil minimal de détection de ce test (1 parasite pour 1 μl). Une telle situation est tout à fait compatible avec un risque de contamination transfusionnelle, d'où l'importance des méthodes de décontamination spécifique du sang prélevé dans les régions endémiques du paludisme. 2. Cinétique d'incorporation des photosensibilisateurs.
2J Mise au point des conditions expérimentales: effet écran Dans un premier temps, ont été recherchées les concentrations optimales de globules rouges permettant une mesure précise des composés incorporés, sans interférence avec l'absorption des constituants cellulaires, plus particulièrement de l'hémoglobine (effet d'écran). L'effet d'écran se traduit par une diminution de l'intensité de fluorescence relative (IFR). Elle est observée pour une concentration de cellules de l'ordre de 10-5 cellules. ml" 1. Des courbes similaires ont été obtenues avec le MACE et les dérivés PH. Les mesures de cinétique d'incorporation ont été effecmées sur 10^ cellules afin d'avoir un culot cellulaire visible lors de la manipulation. Mais, pour limiter l'effet d'écran de l'hémoglobine dû à une telle concentration cellulaire, les échantillons sont dilués lors de la lecture avec le tampon de lyse (Triton X 100 2%) pour avoir l'équivalent de 5.10^ cellules. ml" 1.
De plus, il s'est avéré indispensable de travailler avec des tubes coniques siliconés car ces composés photosensibilisateurs très hydrophobes se fixent sur le plastique, ce qui induit des artefacts de mesure. Il est absolument nécessaire d'incuber les cellules en présence de sérum (7,5%) de façon à limiter la précipitation et l'agrégation des molécules photosensibilisatrices utilisées.
2.2 Cinétique d'incorporation des composés photosensibilisateurs.
Les globules rouges sains ou infectés par les stades trophozoïtes et schizontes de Plasmodium falciparum, souche FcBl, sont incubés dans le milieu de culmre contenant le composé à une concentration finale de 10μM pour le MACE et le DR5, et de lμM pour le PH4OH. Les cinétiques d'incorporation dans les hématies saines et parasitées montrent un plateau de saturation dans les 30 minutes pour le PH4OH et 1 heure pour le DR5. Une faible incorporation du DR5 est observée dans les globules rouges parasités, par comparaison aux globules rouges sains, malgré la forte parasitémie de la culmre (60% de trophozoïtes et de schizontes). En revanche, pour le PH4OH, une incorporation 2 fois plus importante est observée dans les globules rouges parasités par rapport aux globules rouges sains pour une parasitémie de 14,5 % de parasites aux stades trophozoïte-schizonte. Aucune différence significative d'incorporation entre les globules rouges parasités et les globules rouges sains n'est observée pour le MACE. Il est à noter que dans la série de témoins sans cellules, une importante précipitation du composé en fonction du temps est observée malgré la présence de sérum dans le milieu d'incubation. Au vu de ces résultats, les tests d'efficacité pour les composés photosensibilisateurs seront effectués avec des temps d'incubation d'au moins 30 minutes pour le PH4OH et de 60 minutes pour les dérivés DR5 et MACE.
2.3 Localisation cellulaire des composés photosensibilisateurs.
Pour la localisation cellulaire, l'extinction très rapide de la fluorescence émise par les composés photosensibilisateurs testés (de l'ordre de la seconde) a nécessité l'utilisation d'un système de vidéo microscopie avec une caméra à bas niveau de lumière Lhesa LH 4036. Un marquage de globules rouges sains ou parasités n'est observé avec le DR5 qu'à des concentrations supérieures à 0,5 mM. Aucun marquage n'a été constaté avec le MACE, contrairement au PH4OH avec lequel les cellules infectées par Plasmodium falciparum sont fortement marquées, à une concentration beaucoup plus faible (jusqu'à 0.2 μM). Il est intéressant de remarquer qu'une fluorescence importante est associée aux parasites intracellulaires, quel que soit leur stade de développement. Il est ainsi possible de différencier les stades anneaux (figure la-c), les trophozoïtes (figure 1 d-e), et les schizontes (figure 1 f). mais aussi les formes infectantes, les mérozoïtes (figure 1 g). Un marquage des parasites est également observé avec les autres dérivés PH (PH2CH3, PH2SO3 ", PH2COOH, PH2SH).
De ces observations le PH4OH apparaît être plus efficacement incorporé que le DR5 et le MACE par les hématies parasitées, ce qui conforte les résultats précédents sur la cinétique d'incorporation des composés.
3. Tests d'efficacité in vitro des différents composés.
3.1 Test in vitro
Les effets des différents composés photosensibilisateurs sur le développement in vitro de Plasmodium falciparum ont été analysés en fonction des différentes concentrations en composés et des différents temps d'irradiation. La figure 5 présente les courbes obtenues avec le DR5 (figure 5 A), le MACE (figure 5B), le PH4OH (figure 5C). Le tableau 2 présente les concentrations minimales de composé permettant l'élimination totale des parasites des culmres pour différents temps d'irradiation. Tableau 2: Calcul des ICIQQ (Concentration inhibant 100% du développement parasitaire) sur des cultures in vitro asynchrones de Plasmodium falciparum - souche FcBl.
DROGUE IC 100 IC 100 IC 100 1 minute 5 minutes 10 minutes
DR5 pas d'effet 100 μM 50 μM
MACE pas d'effet 25 μM 10 μM
PH4OH 0,2 μM 0,1 μM 0,05 μM
Il est à remarquer que le PH4OH est environ 1000 fois plus actif que le DR5 et 200-250 fois plus actif que le MACE pour 5 minutes et 10 minutes d'irradiation. De plus, aucun effet sur la parasitémie n'a été mis en évidence au cours des manipulations dans les deux culmres témoins (culmres en absence de composé mais irradiées, et culmres avec les différentes concentrations en composés mais non irradiées).
L'importante efficacité du PH4OH comparée à celle du MACE et du DR5. nous a donc amenés dans un second temps à comparer l'activité in vitro d'une série de dérivés PH.
3.1 J . Sélection in vitro des différents dérivés de la série PH.
L'activité des différents dérivés PH est résumée sur la figure 6. Dans nos conditions expérimentales (30 minutes d'incubation, 0,5 μM de composé et 5 minutes d'irradiation), 2 composés entraînent après 2 jours de culture 100% d'inhibition, le PH4OH et le PH2CH3. 84% d'inhibition sont obtenus avec le PH2SO3". Les autres dérivés sont moins efficaces (inhibitions inférieures à 40%). les valeurs d'inhibition observées ont été confirmées après 6 jours de culmre.
De cette sélection, il ressort que seulement 2 composés, le PH4OH et le PH2CH3, présentent un intérêt quant à l'élimination des parasites in vitro. Puis les activités du PH4OH et PH2CH3 ont été testées sur des parasites présents dans du sang total.
4. Tests sur du sang "total" parasité,
4.1 Comparaison des dérivés PH: PH jOH. et PHoCH^ sur du "sang total parasité" Sur le sang total parasité, dans de mêmes conditions expérimentales d'incubation et d'irradiation le dérivé PH4OH s'est avéré 5 fois plus efficace que le dérivé PH2CH3. En effet les 100% d'inhibition sont obtenus pour 10 μM de PH2CH3 et seulement 2 μM de PH4OH avec 5 minutes d'irradiation (figure 7). Ces différences d'K- iQO entre *es deux dérivés PH dépendent de leurs caractéristiques physico-chimiques (hydrophobicité...). Pour le PH4OH, les valeurs d'activité sur le "sang total" (figure 7) sont 10 fois inférieures à celles observées sur les tests in vitro (figure 6). Cette différence d'activité pourrait s'expliquer par la différence des concentrations sériques entre les tests in vitro et les tests sur sang total. Une étude ultérieure sera nécessaire pour déterminer s'il existe une séquestration du composé dans les différents composants sériques (HDL, LDL, Sérum albumine...) (Jori, G. In vivo transport and pharmacokinetic behaviour of mmour photosensitizers in: Wiley, Chichester (Ed), Photosensitizing compounds: Their Chemistry, Biology and Clinical Use, vol. 146, pp 78-94. Ciba fondation Symposium, 1989; Kongshaug et al. , The distribution of porphyrins with différent mmours localizing ability among human plasma proteins. Br. J. Cancer, 59: 184-188. 1989). Ce point est important car il est connu que Plasmodium falciparum utilise préférentiellement les lipides de la fraction HDL pour sa maturation (Grellier et al., Induction in vitro de la schizongonie de Plasmodium falciparum par des lipoprotéines humaines de haute densité (HDL). C.R. Académie des Sciences de Paris, 311 (3): 361-367, 1990; Grellier et al. , Lipid traffic between high density lipoproteins and Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Journal of Cell Biology, 112 (2): 267-277 ', 1991). Au niveau expérimental, il existe aussi une différence d'épaisseur de couches de cellules à irradier (monocouche in vitro et une couche de 1 mm pour du sang total). Sur du sang total, la couche de cellules plus épaisse forme un écran opaque absorbant plus de lumière qu'.t. vitro.
4.2. Activité de PH jOH sur des globules rouges.
Une incubation de 30-40 minutes des globules rouges en culmre avec la drogue, suivie d'une illumination de 1 à 5 minutes à 670 nm (longueur d'onde à laquelle l'hémoglobine n'absorbe pas), entraîne une destruction totale et sélective des cellules infectées, pour une concentration de l'ordre de 0,2μM (OJmg/1), ce qui est extrêmement bas et démontre la très grande efficacité du composé, (voir la figure 2). Il est à noter qu'à de telles concentrations, aucune toxicité éventuellement liée à la présence du composé au niveau des poches de sang devrait être observée. 4.3 Activité de PH/jOH sur du sang total .
Les mêmes expériences, réalisées sur du sang total (poches de 400 ml obtenues au CNTS), confirment l'intérêt de l'invention, avec une élimination totale des parasites pour une concentration de composé de 2μM (environ lmg/1; temps d'illumination: 5 minutes, voir figure 3).
4.4 Activité de PH |OH sur les formes épimastigotes de Trypanosoma
Enfin, le composé PH4OH s'est avéré également efficace pour la destruction de Trypanosoma cruzi, une eradication pratiquement totale étant obtenue pour une concentration de l'ordre de 2μM, soit lmg/1 (figure 4).
4.5 Activité de PH/jOH sur du sang total en fonction de sa durée de conservation.
Des résultats obtenus avec PH4OH, il ressort que le traitement le plus favorable devra être effectué sur du sang fraîchement prélevé, avec 4 μM de PH4OH et 10 minutes d'irradiation, afin de minimaliser l'effet hémolytique de la drogue sur les globules rouges tout en permettant une destruction totale des parasites.
4.6 Activité de PHjOH sur les virus.
Le VIH ayant servi à l'infection a été préparé à partir de surnageants de cellules H9V3-beta cultivées en milieu dépourvu de protéines. Trois échantillons de 0J ml de suspension virale ont été obtenus par dilution au 1/10 de la solution mère de HIV: l'un constitue le témoin non irradié, les deux autres sont soumis à une irradiation à 670 nm durant 1 ou 4 minutes (soit 1,3 ou 5,2 Joules, respectivement). La concentration finale du photosensibilisateur (PH4OH) dans des échantillons viraux est de 10~6M. Après irradiation des suspensions virales, les cellules H9 (lignée T4 dérivée d'un lymphome humain) sont infectées par les divers échantillons viraux (irradiés ou non irradiés comme décrit ci-dessus). L'infection est réalisée par incubation des cellules (4x10^) avec une suspension virale possédant une activité transcriptase inverse ("reverse transcriptase: R.T. sur la figure 8) de 12 000 cpm. L'incubation des cellules avec des échantillons viraux est poursuivie pendant 48h, à 37°C, en atmosphère à 5 % de CO2. Les cellules sont ensuite lavées de façon à éliminer toute trace de virus dans le milieu, et l'on détermine ensuite à différents temps après l'infection (6, 10, 13 et 15 jours), d'une part le nombre de cellules viables (figure 8, partie A), et d'autre part l'activité R.T. (figure 8, partie B), cette dernière reflétant la multiplication virale.
EXEMPLE 7
Comparaison de l'efficacité du PH4OH et du Photofrin II pour l' eradication des globules rouges humains parasités par Babesia divergens à partir de sang total.
Protocole
Les globules rouges d'une culmre in vitro de B. divergens parasitée à 50%, ont été ajoutés à du sang total fraîchement prélevé (A+) pour obtenir une parasitémie de 0,5%. Des aliquotes de ce sang total parasité ont été mis en plaque de 24 puits (200 μl par puits) et différentes concentrations de photosensibilisateur y ont été ajoutées (concentrations finales de 2, 4 et 8 μM). Deux points sont réalisés pour chaque concentration. Les échantillons ont été incubés 2 heures, à 37°C, dans l'obscurité, puis irradiés de 2 à 30 min selon les plaques. La longueur d'onde utilisée est de 670 nanomètres. Après irradiation, les cellules de chaque puits ont été lavées 2 fois par centrifugation (600 g, 5 min) dans du milieu de culmre (RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain 0+ décomplémenté) puis remises en culmre en flacon de 25 cm2 avec ce même milieu. En parallèle, 2 séries témoins ont été réalisées: 1) une série ne contenant pas de photosensibilisateur mais ayant été irradiée de 2 à 30 min, 2) une série contenant les différentes concentrations de photosensibilisateur n'ayant pas été irradiée.
L' eradication des parasites est estimée sur frottis colorés au Giemsa par comptage de 1 000 cellules, 4 jours et 10 jours après mise en culmre.
Résultats
Parasitémies 4 jours après mise en culture des différents aliquotes Les parasitémies indiquées dans les tableaux correspondent à la moyenne de 2 points. PH4OH
Irradiation
PH4OH 0 2 min 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min
0 15 % 15.5 % 14.7 % 15 % 16 % 15 % 14.3 %
2 μM 14,3 % 1 % 0.6 % 0* 0* 0* 0*
4 μM 16 % 0* 0* 0* 0* 0* 0*
8 μM 16 % 0* 0* 0* 0* ND ND
ND: non déterminé
*: aucun parasite n'est observé également après 10 jours de culmre.
Photofrin II
Photofrin 0 2 min 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min
0 15 % 15.5 % 14.7 % 15 % 16 % 15 % 14.3 %
2 μM 15 % 15.4 % 15.4 % 9 % 11 % 10 % 6 %
4 μM 14 % 8.8 % 9.2 % 7.2 % 8% 8.4 % 4.1 %
8 μM 16 % 6.8 % 6.8 % 8 % 7.2 % ND ND
ND: non déterminé.
Discussion
Il faut noter dans les susdits essais comparatifs, que le Photofrin II est constimé d'un mélange de molécules alors que le PH4OH utilisé est un produit purifié par HPLC. Les concentrations de Photofrin II utilisées ont été calculées en prenant une masse moléculaire moyenne en monomères de ses différents composants, cette masse étant de 660. Afin de minimiser les erreurs dues à cette estimation, la comparaison des 2 photosensibilisateurs a été effecmée sur plusieurs concentrations (2, 4 et 8 μM). Une totale eradication du parasite est obtenue avec le PH4OH pour une concentration de 2 μM et 10 min d'irradiation, et pour une concentration de 4 μM et 2 min d'irradiation. Avec le Photofrin II, seulement 70% d'éradication est observée pour une concentration de 4 μM et 30 min d'irradiation.
Il est à noter que si le PH4OH et le Photofrin II ne sont pas irradiés, ceux- ci ne présentent pas d'effets toxiques sur le parasite et sur les globules rouges sains.
Les contrôles sans photosensibilisateur montrent une augmentation de la parasitémie.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites et/ou des virus susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des mmeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites et/ou virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites, et/ ou virus.
2. Procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des parasites susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits parasites, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits parasites.
3. Procédé de décontamination de produits sanguins infectés par des virus, susceptibles d'entraîner l'apparition de pathologies humaines ou animales, à l'exception des mmeurs d'origine virale, caractérisé en ce qu'il comprend: - une étape de mise en présence de ces produits sanguins avec un ou plusieurs composés photosensibilisateurs lipophiles, notamment des dérivés du noyau phorbine, ayant un tropisme pour les cellules sanguines infectées par les susdits virus, et/ou les formes libres de ces derniers, et ayant la propriété de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée,
- et une étape d'irradiation des produits sanguins ainsi traités à l'aide d'une source lumineuse d'intensité et de longueur d'onde telles que le ou les composés photosensibilisateurs susmentionnés se trouvent activés de telle sorte qu'il y a formation d'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, en quantité suffisante pour détruire lesdits virus.
4. Procédé de décontamination parasitaire de produits sanguins selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en que les composés photosensibilisateurs sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (I) suivante:
Figure imgf000035_0001
dans laquelle:
. X représente C=O ou CH-OH,
. Rj représente -CH=CH2, -COCH3, ou -CH(CH3)-0-(CH2)q- CH3 dans laquelle q est un nombre entier de 0 à 6, notamment 5,
. R2 représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle), . R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, . et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n-(CH2)p-Z, OH S SH O
! Il I I! dans lequel Y représente -O-, -CH-, -C-, -CH-, -C-NH, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3", ou PO3", et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro, ou R5 représente -(CH2)r-C02-R, r étant un nombre entier de 1 à 6, notamment 2, et R représentant H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone,
. R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1 , p est différent de 0.
5. Procédé de décontamination virale de produits sanguins selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisé en que les composés photosensibilisateurs sont choisis parmi les dérivés du noyau phorbine répondant à la formule (1) suivante:
Figure imgf000036_0001
dans laquelle:
. X représente C = O ou CH-OH,
. Rx représente -CH = CH2 ou -COCH3,
. R2 représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH2-OH, ou -CHO (formyle), . R3 et R4 identiques ou différents, représentent -H, -OH, -COOR, R représentant -H ou un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone,
. et R5 représente -(CH2)2-CO-NH-(CH2)m-(Y)n-(CH2)p-Z, OH S SH O
dans lequel Y représente -O-, -CH-, -C-, -CH-, -C-NH, et -S-, Z est choisi parmi -OR, -COOR, -SR, R représentant un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, -CH3, -SO3", ou PO3"", et m est un nombre entier de 1 à 12, n représente 1 ou zéro, et p est un nombre entier de 1 à 6 ou est zéro,
. R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène, ou forment en association une double liaison, sous réserve que lorsque n représente 1, p est différent de 0.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dérivés du noyau phorbine sont choisis parmi ceux de formule (I) dans laquelle R5 représente le groupe -(CH2)2"CO-NH-(CH2)ml- ι , dans lequel Z\ représente -OH, un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, ou -CH3, et m^ est un nombre entier de 1 à 8.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dérivés du noyau phorbine sont choisis parmi ceux répondant à la formule (la) suivante:
Figure imgf000037_0001
COOCH3 dans laquelle m est un nombre entier de 1 à 12, et plus particulièrement le composé de formule (la) dans laquelle m représente 4, à savoir l'éthényl-9- éthy 1- 14-(méthoxycarbony l)-21 -tétraméthyl-4 , 8,13,18-oxo-20-(hy droxybutyl-4)- N-propanamide-3-phorbine, et le composé de formule la dans laquelle m représente 6, à savoir réthényl-9-éthyl-14-(méthoxycarbonyl)-21-tétraméthyl- 4,8,13,18-oxo-20-(hydroxyhexy l-6)-N-propanamide-3-phorbine .
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en que les dérivés du noyau phorbine correspondent à l'acétyl-9-éthyl-14-dihydro-13J4- (méthoxycarbonyl)-21 -tétraméthyl-4, 8 , 13,18-oxo-20-(hydroxybuty l-4)-N- propanamide-3-phorbine de formule (Ib) suivante
Figure imgf000038_0001
COOCH3
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en que les dérivés du noyau phorbine correspondent à l'éthényl-9-éthyl-14-tétraméthyl- 4,8,13 J8-oxo-20-(hydroxyhexyl-6)-N-propanamide-3-phorbine de formule (le) suivante
Figure imgf000039_0001
10. Procédé selon l'une des revendications 1 , 2, 4, 6 à 9, caractérisé en ce que les agents responsables de maladies parasitaires susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, sont:
- les agents responsables du paludisme, et plus particulièrement Plasmodium falciparum (P. falciparum), P. vivax, P. ovale et P. malariae
- les agents responsables des trypanosomiases, notamment Trypanosoma brucei gambiense {T.b. gambiense) responsable de la maladie du sommeil, et T.cruzi responsable de la maladie de Chagas,
- les helminthes, notamment les filaires responsables des filarioses,
- les leishmanies, notamment Leishmania donovani et L. major, responsables des leishmanioses,
- Babesia divergens responsable de babesioses bovines ou humaines (individus splenectomisés).
11. Procédé selon l'une des revendications 1, 3, 5 à 9, caractérisé en ce que les agents responsables de maladies virales susceptibles d'être éliminés des produits sanguins, sont les virus à enveloppe, et plus particulièrement, les virus responsables des différentes hépatites, les cytomégalovirus et les virus du type HIV responsables du SIDA.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les produits sanguins à décontaminer correspondent au sang prélevé sur des mammifères, humains ou animaux, et conservé dans un conditionnement approprié, notamment dans des poches pour perfusion, ou correspondent à des préparations de cellules sanguines, notamment d' erythrocytes, débarrassées de tout ou partie des autres constituants du sang.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la concentration en composés photosensibilisateurs dans les produits sanguins à traiter est d'environ 0J μmole/1 à environ 100 μmole/1, et de préférence d'environ 1 μmole/1 à environ 10 μmole/1.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la dose d'énergie lumineuse utilisée est d'environ 1 à environ 100 Joules.
15. Utilisation de composés photosensibilisateurs lipophiles, en particulier de ceux décrits dans l'une des revendications 2 à 9, susceptibles, lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, de générer de l'oxygène singulet, ou toute autre forme activée toxique de l'oxygène, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement extracorporel des états pathologiques chez les mammifères, humains ou animaux, dus à l'infection de ces derniers par des parasites et/ou des virus.
16. Utilisation d'une composition sanguine comprenant des composés photosensibilisateurs selon la revendication 15, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement extracorporel des états pathologiques chez les mammifères, humains ou animaux, dus à l'infection de ces derniers par des parasites et/ou des virus.
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