WO1995007293A1 - Peptide inhibant la phospholipase c - Google Patents

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WO1995007293A1
WO1995007293A1 PCT/JP1994/001486 JP9401486W WO9507293A1 WO 1995007293 A1 WO1995007293 A1 WO 1995007293A1 JP 9401486 W JP9401486 W JP 9401486W WO 9507293 A1 WO9507293 A1 WO 9507293A1
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leu
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Motoo Yamasaki
Genkichi Ishikawa
Yoshimi Honma
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides that inhibit phospholipase C (hereinafter, referred to as PLC) activity.
  • PLC for example, inositol phospholipid PLC (hereinafter referred to as PI-PLC) has been separated and purified from various tissues, and ⁇ , ⁇ ⁇ y, (5-4 the presence of type nine Aisozaimu have been revealed. 7 ⁇ as the type, and 7 and 2 of the two is known [SG Rhee et al., Science (Science), 244, 546-550 ( 1989) Y. Homma et al., Biochemical. Journal (Biochem. J.), 269, 13-18 (1990)], both of which have been shown to play important roles in growth factor signaling.
  • PI-PLC inositol phospholipid PLC
  • the structural features of the ⁇ - and S-types are characterized by the inclusion of the oncogenic src-related regions, the SH2 and SH3 (SH2 / SH3) regions between the I and II regions common to 3, 7, and ⁇ .
  • SH2 and SH3 SH2 / SH3
  • the y-type SH2 domain is essential for interaction with receptor tyrosine kinases [D.
  • N-formyl-methionyl-leucylaffine-l-alanine is known to cause inflammation via granulocytes and polymorphonuclear leukocytes (PMN). It has been reported that PLC is involved in the signal transduction system of this receptor (Science, 232, 97-100 (1986)), and platelet-derived growth factor (PDGF) (Science, 248, 1009 (1990)), and PLC-72 is present as a component in the PDGF-dependent vascular smooth muscle cell proliferation signal transduction system.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • J 'and J 2 is or represents hydrogen, or J 1 and J 2 are together a connexion single Represents a bond
  • W represents hydrogen, substituted or unsubstituted alkanol, substituted or unsubstituted aroyl or cumaryl
  • X represents a single bond
  • Y may represent a single bond or one Pr 0 -V a1 —
  • Z represents hydroxy or amino.
  • the substituted or unsubstituted alkanoyl has 1 to 20 carbon atoms, for example, formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutylyl, norkeryl, isopalleryl, bivaloyl, caprylyl, lauroyl, miroyl Examples include restyl, palmitoyl, and stearoyl.
  • the substituent include carboxy, alicyclic alkyl, and phenyl.
  • Examples of the alicyclic alkyl include those having 3 to 8 carbon atoms, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl.
  • Examples of the substituted or unsubstituted aroyl include benzoyl and naphthoyl.
  • the substituent include hydroxy having 1 to 3 substituents.
  • Trt Trityl
  • Table 1 shows specific examples of the compound (I). ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ Mouth arrangement
  • Compound (I) is synthesized by a solid phase synthesis method using an automatic peptide synthesizer.
  • the peptide-bound solid support obtained by the solid phase method is treated with hydrogen fluoride or TFA to release the peptide from the solid support and at the same time remove the protecting group of the amino acid side chain.
  • Amidation of C-terminal amino acids can be performed using a peptide synthesizer manufactured by Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, USA (hereinafter referred to as ABI) using P-methyl-benzhydrylamine (BHA). ) —Use resin (manufactured by ABI).
  • a linkamide resin or a linkamide-MBHA (4-methylbenzhydrylamine) resin (Calbiochem-Nova Piochem Japan).
  • a carboxylic acid component and a condensing reagent for example, PyBOPZHOB t / NMM] are used in the same manner as in elongation of the peptide chain. Or condensation using an activated carboxylic acid such as an acid anhydride or an acid chloride of the carboxylic acid component.
  • the above reaction is carried out on a synthetic resin, and after completion of the reaction, the desired peptide derivative is cut out from the resin.
  • the thus obtained crude product of the peptide is purified by high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) using a reversed phase column to obtain a pure product.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the cyclic peptide having an SS bond can be obtained by oxidizing the linear peptide obtained as described above with an air solution in an aqueous solution of a weak base, or by oxidizing such as potassium ferrosyanide or oxidized glutathione. Obtained by oxidizing
  • the compound (I) obtained by the present invention exhibits excellent PLC inhibitory activity, cell growth inhibitory activity and antibacterial activity.
  • a solution having the composition shown in Table 2 was prepared on ice in advance, and the reaction was started by heating to 37 ° C. After incubation for 10 minutes, the reaction was stopped by adding 2 ml of a mixed solution of chloroform and methanol (2: 1, V / V). The generated inositol phosphate was extracted with 0.5 ml of IN hydrochloric acid. Centrifuged (2000 ⁇ g, 3 minutes) by the two-phase partition, measured scintillation of 3 H amount contained in the supernatant 0.7 ml.
  • Table 3 shows the concentrations of the peptides and aqueous solutions used in the test.
  • Table 3 shows the inhibition rates of the obtained test peptides.
  • the medium was changed again with serum-free DMEM medium, and the labeling reagents 5-bromo-2, -deoxyperidine (BrdU) and 5-fluoro-2'-deoxyperidine (FdU) [10: 1] were diluted 1000-fold with the same medium. 0.5 ml was added to each well and cultured for 2 hours. Next, the medium was removed, and the cells were fixed with an acetic acid-ethanol solution. The fixed cells were stained according to the method of a cell proliferation detection kit manufactured by Amersham, and further stained with 1% Giemsa solution (Merck).
  • the cell growth inhibition rate (X) was determined from the following equation, where A is the proliferation activity when no peptide is added, and B is the proliferation activity when the test peptide is added.
  • Table 4 shows the inhibition rates of the obtained test peptides.
  • Antibacterial activity is measured by agar dilution method using a medium (pH 7.0) consisting of 3 g / l of Pacto Tripton (manufactured by Difco), lg / 1 of meat extract, lg / 1 of dulkose, and 16 g / l of agar. did.
  • a medium pH 7.0
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of compound (I-13) and compound (I-14) was 166 g / ml.
  • Examples 1 to 4 are examples of peptide synthesis using the Shimadzu Peptide Synthesizer PS SM8 and operating the synthesizer according to the company's synthesis program using Shimadzu's reagents and solvents. Show. Amino acid condensation reactions were carried out under standard conditions by the Fmoc method (Basic and Experimental Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al. (Maruzen)).
  • Fmoc-Cys (Trt) was synthesized on the carrier.
  • step (4) a condensation reaction is performed in step (4) using Fmoc-Val-OH, and then the washing step of (5) is performed.
  • Fmoc-Val-Cys (Trt) was synthesized on a carrier resin.
  • steps (1) to (3) were sequentially repeated to obtain a carrier resin to which the protective peptide was bound.
  • step (4) 300 / mol of Fmoc-Pro-0H, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pmc )-0H, Fmoc-Met-0H, Fmoc-Lys (t-Boc) -0H, Fmoc-Arg (Pmc) -0H, Fmoc-Tyr (t-Bu) -0H, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH was used.
  • the obtained carrier resin was thoroughly washed with methanol and butyl ether, and then dried under reduced pressure for 2 hours.
  • 1 ml of 10% TFAZ methylene chloride was placed in the reaction vessel containing the dried carrier resin, stirred, and allowed to drop naturally from the bottom of the reaction vessel, and the liquid was recovered.
  • 1 ml of 20% TFAZ methylene chloride was added, and the above operation was repeated twice.
  • the solvent was distilled off from the recovered solution that was naturally reduced by an evaporator, and the peptide was cut out from the resin. Furthermore 8 2.
  • a peptide having a phospholipase C inhibitory activity can be provided.
  • Xaa at position 1 represents N— (n—force prill) —L—cysteine.
  • Xaa at position 13 represents L-cysteinamide.
  • Xaa at position 1 is N— (n—caprylyl) —L— C for cysteine.
  • Xaa at position 13 represents L_cysteinamide.

Description

明 細 書
ホスホリパ一ゼ c阻害ペプチド
技術分野
本発明はホスホリパーゼ C (以下、 PLCという） 活性を阻害する新規べプチ ド類に関する。
背景技術
細胞内情報伝達の解明を目的に、 各種組織より PLC、 例えばイノシトールリ ン脂質 PLC (以下、 P I— PLCという） の分離、 精製が行われ、 これまでに α、 βヽ y、 （5の 4タイプ 9種のアイソザィムの存在が明らかにされてきた。 7タイプとしてァ ,と 72の 2種が知られており 〔S. G. Rhee et al.，サイエンス (Science), 244, 546-550(1989); Y. Homma et al., バイオケミカル . ジャーナル (Biochem. J. ), 269, 13-18(1990)〕 、 両者とも増殖因子の情報伝達に重要な役割を 果たすことが明らかにされている。 βヽ ァおよび Sタイプの構造上の特徴は 3、 7、 δに共通の I . I I領域の間に癌遺伝子 src 関連領域、 S H 2および S H 3 (SH 2/SH 3) 領域を含むことであるが、 yタイプの SH 2領域は受容体型 チロシンキナーゼとの相互作用に必須である 〔D. Anderson et al.，サイエンス (Science), 250, 979-982(1990)〕 。 ァタイプの S H 3領域の機能は明らかではな いが、 細胞骨格系との相互作用に重要であろうと推測されている。 そして、 SH 2および SH 3 (SH 2ZSH 3) 領域のみを持ち、 キナーゼ領域を持たない癌 遺伝子 crkが発見されるに至り、 7の SH 2および SH 3 (SH 2ノ SH 3) 領 域を介する調節の乱れ （P I一 PLCの活性異常） や細胞増殖の異常が癌化を引 き起こす可能性がクローズアップされてきている。 また、 その他に PLCの昂進 が病態と関連する報告として、 トロンビンによる血小板活性化系に P L Cが関与 しているという報告 〔ジャーナル ·ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー （ J. Biol. Chem. )，261， 16838- 16847(1986)〕 、 ヒスタミンの遊離に P L C活性が関与 しているという報告 〔ジャーナル 'ォブ 'セル 'バイオロジー（J. Cell Biol. ), 105, 2745-2750(1987)] 、 顆粒球、 多形核白血球 （PMN) 経由で炎症を惹起す るものとして、 N—ホルミル一メチォニル一ロイシルーフヱ二ルァラニンが知ら れており、 このレセプターのシグナル伝達系に P L Cが関与しているという報告 〔サイエンス（Science), 232, 97-100(1986)) 、 動脈硬化巣に血小板由来成長因子 (PDGF)yS鎖が多量に発現しており 〔サイエンス（Science), 248， 1009(1990)) 、 PDG F—依存的血管平滑筋細胞の増殖のシグナル伝達系に P L C— 7 2が構成 成分として存在し、 平滑筋細胞の増殖系に PLC— 7 2が大きく関わっていると いう報告 〔バイオケミカル 'アンド ·バイオフィジィカル · リサーチ ' コミュニ ケイシヨンズ （Biochem. Biophys. Res. Commun. ), 156.846-854(1988)、 バイオ ケミカル ' ジャーナル（Biochem. J. ) 290，649- 653(1993)〕 、 アルツハイマー病態 時に P L Cが昂進しているという報告 〔ァメリカン ' ジャーナル 'ォブ'パソロ ジ一（Am. J. Pathol.), 139, 737-742(1991)] などがあげられる。 そこで P L C活 性を阻害することにより、 これらの病態を改善できることが期待され、 PL Cの 活性を阻害する薬剤が求められている。
P L C活性を阻害するべプチドとしては、
Ser- Leu- Va卜 Glu- Leu- Va卜 Ser- Tyr- Tyr- Glu- Lys- His- Ala- Leu- Tyr- Arg- Lys- Met- Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val,
Ser- Tyr- Tyr- Glu- Lys- His- Ala-Leu- Tyr- Arg- Lys- Met,
Glu - Lys - His - Ala- Leu- Tyr- Arg- Lys - Met,
Glu- Lys- His - Ala- Leu - Tyr- Arg - Lys - Met - Arg - Leu- Arg - Tyr - Pro- Val，
Leu - Tyr- Arg - Lys - Met - Arg - Leu - Arg - Tyr - Pro- Val，
Tyr - Arg - Lys - Met - Arg - Leu - Arg - Tyr，
Arg- Lys - Met - Arg - Leu - Arg
で示されるぺプチドが、 ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル · ケミストリー
[ (J. Biol. Chem. ), 267, 21844-21849(1992) ] に開示されている。
発明の開示
本発明によれば、 式 （I )
J ' '
W- Cys- X- Tyr- Arg- Lys- Met- Arg- Leu- Arg- Tyr- Y- Cys- Z ( I )
〔式中、 J ' および J 2 は水素を表すか、 もしくは J 1 と J 2 が一緒になつて単 結合を表し、 Wは水素、 置換もしくは非置換のアルカノィル、 置換もしくは非置 換のァロイルまたはクマリルを表し、 Xは単結合、 — L e u—または— S e r— L e u - V a 1一 G l u-L e u-V a 1一 S e r— Ty r— Ty r— G l u - L y s -H i s -A 1 a— L e u— (該 N末側からの 1〜 1 4アミノ酸残基の少 なくとも 1個のアミノ酸残基が欠失されていてもよい） を表し、 Yは単結合また は一 P r 0 -V a 1—を表し、 Zはヒ ドロキシまたはアミノを表す〕 で表される ホスホリパーゼ C阻害ペプチド 〔以下、 化合物 （I ) という〕 を提供することが できる。
化合物 （ I ) の定義において、 置換もしくは非置換のアルカノィルは、 炭素数 1〜2 0の、 例えばホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 ブチリル、 イソブチリ ル、 ノくレリル、 イソパレリル、 ビバロイル、 カプリ リル、 ラウロイル、 ミ リスト ィル、 パルミ トイル、 ステアロイルなどがあげられる。 置換基としては、 カルボ キシ、 脂環式アルキル、 フ ニルなどがあげられる。 脂環式アルキルとしては、 炭素数 3〜 8の、 例えばシクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シク 口へキシルなどがあげられる。 置換もしくは非置換のァロイルとしては、 ベンゾ ィルまたはナフトイルなどがあげられる。 置換基としては置換数 1〜3のヒ ドロ キシなどがあげられる。
本明細書において使用したァミノ酸およびその保護基に関する略号は、 生化学 命名に関する IUPAC- IUB委員会 （IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature) の勧告 〔バイオケミストリ一 （Biochemistry), ϋ， 1726(1972) 〕 に従つた
以下の略号は対応する下記のァミノ酸および保護基を表す。
Val:L—バリン
Leu： L—口イシン
Lys:L—リジン
Met:L—メチォニン
Arg:L—アルギニン
Tyr: L—チロシン Cys: L一システィン
Pro: L—プロリ ン
t-Boc: t—ブチルォキシカルボニル
t-Bu： t一ブチル
Fmoc： 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル
Pmc： 2 , 2， 5， 7， 8—ペンタメチルクロマン一 6—スルホニル
Trt： トリチル
以下の略号は対応する下記の側鎖保護ァミノ酸を表す。
Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH ： Να 一 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー Ο _ t—ブチル一 L—チロシン
Fmoc-Lys(t-Boc)-0H： Να — 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル— N f ― t—ブチルォキシカルボ二ルー L—リジン
Fmoc-Arg(Pmc)- 0H： Νβ - 9—フルォレニルメチルォキシカルボニル— Ν 5— 2, 2， .5， 7 , 8—ペンタメチルクロマン一 6 _スルホ二ルー L—アルギニン
Fmoc-Cys(Trt)-0H: Νβ - 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二ルー S—ト リチル一L—システィン
以下の略号は対応する下記の反応溶媒および反応試薬を表す。
PyBOP：ベンゾトリアゾールー 1—ィルーォキシ一トリス一ピロリジノ一フォ スフォニゥムへキサフルオロフォスフヱート
HOBt： N—ヒ ドロキシベンゾトリアゾール
NMM ： N—メチルモルホリン
DMF ： N, N—ジメチルホルムアミ ド
TFA ： トリフルォロ酢酸
N末端修飾に使用した力ルボン酸の製造会社は以下のとおりである。
n—力プリル酸：東京化成
化合物 （ I ) の具体例を第 1表に示す。 化^ ¾ ^口 配 列
■Φ口 _嗣q
番 番"^
(I- 1) 1 H-Cys-Leu-Tyr-Arg-Lys-Met-Arg-Leu-Arg-Tyr-Pro-Val-Cys-NH2
(1-2) 2 H- Cys- Leu- Tyr- Arg- Lys- Met- Arg- Leu-Arg- Tyr- Pro- Val- Cys- NH2
(1-3) 3 CH3(CH2)6C0- Cys- Leu- Tyr- Arg- Lys- Met- Arg- Leu- Arg- Tyr- Pro- Va卜 Cys- NH2
(1-4) 4 CH3(CH2)6C0- Cys- Leu- Tyr- Arg- Lys- Met- Arg- Leu- Arg- Tyr- Pro- Va卜 Cys- NH2
1 1 化合物（I)はべプチド自動合成機を用いた固相合成法により合成される。 固相 法により得られるぺプチドの結合した固相担体はフッ化水素または TF Aで処理 し、 ぺプチドを固相担体より遊離させると同時にァミノ酸側鎖の保護基を除去す る。 C末アミノ酸のアミ ド化はアプライ ドバイオシステムズ（Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, USA；以下、 AB Iという） 社製ペプチド合成 機を用いる場合は P—メチル一ベンズヒ ドリルァミ ン（BHA)—レジン （AB I 社製） を使用する。 島津製作所製ペプチド合成機を用いる場合、 リ ンクアミ ドー レジンあるいはリ ンクアミ ド一 MBHA (4—メチルーベンズヒ ドリルァミ ン） 一レジン （カルビオケム一ノバピオケムジャパン社製） を用いる。 また、 N末ァ ミノ酸の修飾 （ァシル化） については、 N末アミノ酸保護基を脱保護後、 ぺプチ ド鎖の延長と同様にカルボン酸成分と縮合試薬 〔例えば、 PyBOPZHOB t /NMM] を用いて縮合するか、 あるいはカルボン酸成分の酸無水物、 酸クロラ ィ ドなどのカルボン酸活性化物を用いて縮合を行う。 尚、 上記反応は合成樹脂上 で反応を行い、 反応終了後に目的とするぺプチド誘導体を樹脂から切り出して得 る。 このようにして得られるペプチドの粗生成物を、 逆相系カラムを用いた高速 液体クロマトグラフィー （以下、 HPLCという） で精製して純品を得る。
さらに、 S— S結合を有する環状べプチドは、上記のようにして得られる直鎖 状のペプチドを、 弱塩基の水溶液中で空気酸化するか、 またはフエロシアン化力 リウムあるいは酸化型グルタチオンなどの酸化剤により酸化することにより得ら 本発明により得られる化合物 （ I ) は優れた PLC阻害活性、 細胞増殖阻害活 性および抗菌作用を示す。
次に化合物 （ I ) の PLC阻害活性、 細胞増殖阻害活性および抗菌作用につい て実験例 1、 2および 3で説明する。
実験例 1 PLC阻害活性
ゥシ胸腺より Y.Ho難 a et al. バイオケミカル ' ジャーナル 〔（Biochem. J. ), 269,13(1990)) に記載の方法に従って試料 （PLC—ァ！） を製造した。
あらかじめ氷上で第 2表に記載の組成を有する溶液を調製し、 37°Cに加温する ことによって反応を開始した。 10分間インキュベートした後、 2ml のクロ口ホル ム—メタノール （2:1， V/V) 混合溶液を加えて反応を停止した。 生成したイノシ トールリン酸を 0.5ml の IN塩酸で抽出した。 遠心分離 （2000xg， 3 分間） により 二相分配し、 その上清 0.7ml に含まれる3 H量をシンチレーシヨン測定した。
第 2 表 液 液量（ β 1 )
試料 （0.2 の精製 PI- PLC-ァ， 標品） 10
反応液 30
DIM MES ) NaOH緩衝液（pH 6.0) 2.5
2) lmM CaCh 5
3) 20mg/ml ゥシ血清アルブミン 2.5
4)試験べプチド水溶液（b) 20
10
(a> 2-(N- モルホリノ） エタンスルホン酸
<b) 試験に供したぺプチドおよび水溶液の濃度は第 3表に記す。
(c) 500 tig ホスファチジルイノシトール 4， 5-ビスリン酸 （PIP2) 、 150 ng ホスファチジルエタノールァミン、 37kBq[:'H]PIP2 を あらかじめ少量のクロ口ホルムで混合する。 窒素気流下で脂質 を乾固させたのち、 0.1M KC1を lml 加え超音波処理する。 得られた比放射能の値を Aとし、 試験べプチド水溶液のかわりに同量の水を加 えた場合の比放射能の値を Bとし、 試料および試験べプチド水溶液のかわりに同 量の水を加えた場合の比放射能を Cとして、 次式より阻害率 （X) を求めた。
X (%) - (A-C) / (B-C) X 1 0 0
得られた試験べプチドの阻害率を第 3表に示す。
第 3 表 化合物 濃度 （//M ) 阻害率 （％)
( 1 - 2 ) 240 65
( I - 4 ) 220 56 実験例 2 細胞増殖阻害活性
アマシャム （Amersham) 社製の細胞増殖検出キッ トを用いて、 以下のように行 つた o
まず、 細胞 [KM S― 4 ； M. Nanba et al. , International Journal of Cancer, 32, 697(1983) 〕 を 1 0 %牛胎児血清含有 DM EM培地 （日水製薬製） に加え、 1〜2 X 1 04 個 Zmlの濃度に調整後、 2 4穴プレート （コ一二ング社製） の 1穴当たり上記細胞懸濁液 1 m 1を加え、 C02 インキュベーター （3 7°C、 5 % C02 ) で 2日間培養した。 ついで、 1 0 %牛胎児血清含有 D MEM培地で培地 交換後、 被検ペプチドを添加し、 1 7時間培養した。 再び、 無血清 DMEM培地 で培地交換し、 標識試薬 5-ブロモ -2，-デォキシゥリジン（BrdU)および 5-フルォロ -2'-デォキシゥリジン（FdU) [10:1] を同培地で 1000倍希釈した液 0.5ml を各穴に 加え、 2時間培養した。 ついで、 培地を除去し、 酢酸一エタノール液で細胞を固 定した。 固定された細胞についてアマシャム社製細胞増殖検出キッ 卜の方法に従 つて染色し、 さらに 1 %ギムザ液 （メルク社製） で追染色した。 ついで、 顕微鏡 1視野 （細胞数約 2 0 0個） 内で BrdUを取り込んだ細胞数ならびに全細胞数を測 定し、 .1視野当たりの染色細胞数割合 （％) を算出した。 さらに、 同操作を 1 0 回行い、 その平均値をもって細胞増殖活性 （％) とした。 細胞増殖阻害活性は次のようにして算出した。 ぺプチド無添加の場合の増殖活 性を Aとし、 被検ペプチド添加の場合の増殖活性を Bとして、 次式より、 細胞増 殖阻害率 （X) を求めた。
X (%) = (1 -B/A) 1 0 0
得られた試験べプチドの阻害率を第 4表に示す。
第 4 表 化合物 濃度 （ M ) 阻害率 （％)
(1 - 2) 5 59
(1 - 4) 6 61 実験例 3 抗菌作用
抗菌活性はパクトトリプトン （ディフコ社製） 3g/l 、 肉エキス l g/1 、 ダル コース lg/1 、 寒天 1 6g/l の組成からなる培地 （pH7.0)を用いて寒天希釈法で 測定した。
試験菌としてプロテウス ブルガリス（ Proteus vulgaris ) ATCC6897 を用 いたときの化合物 （I一 3) および化合物 （ I一 4) の最小生育阻止濃度 （MIC) は 1 6 6〃g/mlであった。
発明を実施するための最良の形態
以下の実施例で示される理化学的性質は次の機器類によって測定した。
•質量分析： 日本電子 JMS-HX110A
•ァミノ酸分析： Waters pico tag
以下の実施例 1〜4は島津製作所のぺプチド合成機 P S SM 8を用い、 島津製 作所の試薬および溶媒を用いて同社の合成プログラムにより合成機を運転してぺ プチドを合成した例を示す。 アミノ酸の縮合反応は Fmoc法 〔ペプチド合成の基礎 と実験、 泉屋信夫ら （丸善） 〕 により、 標準の条件で行った。
なお.、 必要に応じて、 アミノ酸保護体、 試薬は国産化学、 ペプチド研究所、 力 ルビオケム一ノバピオケムジャパン社の製品も用いた。 実施例 1 化合物 （ I一 1 ：配列番号 1 ) の合成
4 -（2， 4 - Dimethoxypheny卜 Fmoc - ami議 ethyl) - Phenoxyの担体樹脂 60mgを自動合 成機の反応器に入れ、 島津製作所の合成プログラムに従い次の処理、 洗浄を行つ た。
( 1 ) DMFによる洗浄 （3分）
(2) 3 0 %ピベリジンを含む DMF溶液処理 （ 4分 X 2回）
(3 ) DMF洗浄 （ 1分 X 5回）
(4) (1 ) 〜 （3) の工程で得られたアミノメチル基の結合した担体樹脂に、 Fmoc- Cys(Trt)- OH 300/zmol 、 PyBOP 30 l 、 HOBT 300^ mo 1 および NMM 450 mol を加え、 3 0分間撹拌した。
(5) DMF洗浄 （1分 X 5回）
こうして、 Fmoc-Cys(Trt)が担体上に合成された。
次に、 上記 （1 )〜（3) の洗浄、 脱保護工程を行った後、 （4) の工程で Fmoc -Val-OH を用いて縮合反応を行い、 次いで （5) の洗浄工程を得て Fmoc- Val- Cys (Trt) を担体樹脂上に合成した。 以下、 工程 （1 ) 〜 （3) を順次繰り返して保 護べプチドの結合した担体樹脂を得た。
尚、 工程 （4) には順次 300 /molの Fmoc - Pro- 0H、 Fmoc- Tyr(t- Bu)- 0H、 Fmoc - Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Leu- OH 、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Met- 0H、 Fmoc- Lys(t - Boc)-0H 、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Tyr(t- Bu)-0H 、 Fmoc- Leu- OH 、 Fmoc-Cys (Trt)-OHを用いた。
得られた担体樹脂をメタノール、 ブチルエーテルでよく洗浄した後、 減圧下 2 時間乾燥した。 乾燥した担体樹脂の入っている反応容器に 1 0 %TFAZ塩化メ チレンを 1 m 1入れて撹拌し、 そのまま反応容器の下部より自然滴下させてその 液を回収した。 同様に 2 0 %TF AZ塩化メチレンを 1 m 1加えて、 上記操作を 2回繰り返した。 その自然適下した回収液をエバポレーターで溶媒を留去し、 樹 脂よりペプチドを切り出した。 さらに 8 2. 5 %TFA、 5 %H20、 5 %チォ ァニソ一ル、 2. 5 %エタンジチオール、 3 %ェチルメチルサルファイ ド、 2 % チォフエノールの混合液 1 m 1を加え室温で 8時間放置し、 脱保護を行った。 得 られた溶液におよそ 2 m 1のエーテルを加えて、 生じる沈澱を粗ぺプチドとして 52.6mg回収した。 この粗製品全てを逆相カラム （NUCLEOSIL 5C18 20x250mm)を 用いた HPLCで精製した。 0. 1 %TF Aとァセトニトリルを用いた直線濃度 勾配法で溶出し 2 2 0 nmで検出し標記化合物を含む画分を得た。 この画分を凍 結乾燥して標記化合物 （ I一 1 ) 16.5mgを得た。
質量分析： M+H = 1699
アミノ酸分析： Arg 3.1(3)， Pro 1.0(1), Tyr 2.0(2), Val 0.9(1), Met 1.0 (1)， Leu 2.0(2)， Lys 1.1(1)， Cys 1.8(2)
実施例 2 化合物 （ I一 2 ：配列番号 2 ) の合成
化合物 （ 1 — 1 ) 15.6mgを水 15.6mlに溶解した。 さらに 200mM リン酸緩衝液 (PH7.0) 1.56ml、 10mMグルタチオン （酸化型） 0.32mlを加え 4 °Cで 19時間環化 反応を行った。 この環化反応品を HPLC精製し標記化合物 （ 1— 2) 3.6mgを得た。 質量分析： M+H = 1697
アミノ酸分析： Arg 3.1(3)， Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2), Val 0.9(1)， Met 1.0 (D.Leu 2.0(2), Lys 1.1(1)， Cys 1.8(2)
実施例 3 化合物 （ I一 3 ：配列番号 3 ) の合成
実施例 1と同様にして担体樹脂 60mgを用い、 N—保護アミノ酸として、 Fmoc - Cys(Trt)- 0H、 Fmoc-Val-0H, Fmoc- Pro- 0H、 Fmoc- Tyr(t- Bu)- OHヽ Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Leu- 0H、 Fmoc- Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc-Met- 0H、 Fmoc- Lys (卜 Boc)- OHヽ Fmoc - Arg(Pmc)- 0H、 Fmoc- Tyr (t-Bu)-0H、 Fmoc- Leu- 0H、 Fmoc- Cys(Trt)- 0H、 n—力プ リル酸を用いて縮合を行った。 実施例 1と同様にして樹脂からペプチドを切り出 し、 脱保護を行い粗製品 62.4mgを得た。 このうち 25.4mgを HPLC精製し 21.5mgを得 質量分析： M + H = 1825
アミノ酸分析： Arg 3.0(3), Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2)， Val 0.9(1)， Met 1.0 (l),Leu 2.0 (2), Lys 1.0(1)， Cys 2.0(2)
実施例 4 化合物 （ I一 4 ：配列番号 4 ) の合成
化合物（1— 3) 9. Omgを水 9mlに溶解した。 さらに 200mMリン酸緩衝液（pH7.0) lml 、 lOmMグルタチオン （酸化型） 0.4ml、 9M尿素 18mlを加え 4 °Cで 45時間環化 反応を行った。 この環化反応品を HPLC精製し標記化合物 （ 1— 4) 4.1mgを得た。 質量分析： M+H = 1823
アミノ酸分析： Arg 3.0(3), Pro 1.0(1)， Tyr 2.0(2), Val 0.9(1)， Met 1.0 (1)， Leu 2.0(2), Lys 1.0(1)， Cys2.0(2)
産業上の利用可能性
本発明によれば、 ホスホリパーゼ C阻害活性を有するぺプチドを提供すること ができる。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modified- site
存在位置： 1 3
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 3の Xaa はいシスティンアミ ドを表す。 配列
Cys Leu Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val Xaa 1 5 10
配列番号： 2
配列の長さ ： 13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Disulfied-bonds
存在位置： 1..13
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： Modified - site
存在位置： 1 3
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 3の Xaa はいシスティンアミ ドを表す。 配列
Cys Leu Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val Xaa
1 5 10
配列番号： 3
配列の長さ ： 13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
配列の特徴：
特徴を表す記号： Modified- site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N— (n—力プリ リル） —L—システィンを表 す。
特徵を表す記号： Modified- site
存在位置： 1 3
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 3の Xaa は L—システィンアミ ドを表す。
配列
Xaa Leu Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val Xaa
1 5 10
配列番号： 4
配列の長さ ： 13
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド '
配列の特徵：
特徴を表す記号： Disulfied- bonds 存在位置： 1..13
特徴を決定した方法： E
特徴を表す記号： Modified- site
存在位置： 1
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1の Xaa は N— (n—カプリリル）— L—システィンを表す c 特徵を表す記号： Modified- site
存在位置： 1 3
特徴を決定した方法： E
他の情報：存在位置 1 3の Xaa は L_システィンアミ ドを表す。
配列
Xaa Leu Tyr Arg Lys Met Arg Leu Arg Tyr Pro Val Xaa
1 5 10

Claims

請 求 の 範 囲
(1) 式 （ I )
J 1 J 2
I I
W- Cys- X- Tyr- Arg- Lys- Met- Arg- Leu- Arg- Tyr- Y- Cys- Z ( I )
〔式中、 J 1 および J 2 は水素を表すか、 もしくは J 1 と J 2 が一緒になって単 結合を表し、 Wは水素、 置換もしくは非置換のアルカノィル、 置換もしくは非置 換のァロイルまたはクマリルを表し、 Xは単結合、 _L e u—または一 S e r— L e u - V a 1一 G l u -L e u - V a 1 一 S e r— Ty r— Ty r— G l u— Ly s— H i s -A 1 a— L e u— （該 N末側からの 1〜 1 4アミノ酸残基の少 なくとも 1個のアミノ酸残基が欠失されていてもよい） を表し、 Yは単結合また は一 P r o—Va 1—を表し、 Zはヒドロキシまたはァミノを表す〕 で表される ホスホリパーゼ C阻害べプチド。
(2) Xが—L e u—を表し、 Yがー P r o_V a 1 _で表される請求の範囲 (1) 記載のぺプチド。
(3) Zがァミノである請求の範囲 (2)記載のぺプチド。
(4) ぺプチドが、 配列番号 1〜4で表されるァミノ酸配列からなるぺプチドか ら選ばれる請求の範囲 (1)、 （2)または (3)記載のぺプチド。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028466A1 (fr) * 1995-03-10 1996-09-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptides inhibant la phospholipase c
WO2002006307A1 (fr) * 2000-07-17 2002-01-24 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Fk228 reduit et son utilisation

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677420A (en) * 1995-03-10 1997-10-14 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Phospholipase c-inhibiting peptides
US20020107193A1 (en) * 2000-11-09 2002-08-08 Glazner Gordon W. Therapeutic uses for IP3 receptor-mediated calcium channel modulators
US6527912B2 (en) 2001-03-30 2003-03-04 Lam Research Corporation Stacked RF excitation coil for inductive plasma processor

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018062A1 (en) * 1992-03-11 1993-09-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptide which inhibits phospholipase c

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018062A1 (en) * 1992-03-11 1993-09-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptide which inhibits phospholipase c

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biol. Chem., Vol. 267, No. 30 (1992), YOSHIMI HOMMA et al., "Inhibitory Effect of src Homology (SH) 2/SH3 Fragments of Phospholipase C-r on the Catalytic Activity of Phospholipase C Isoforms", pp. 21844-21849. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028466A1 (fr) * 1995-03-10 1996-09-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptides inhibant la phospholipase c
WO2002006307A1 (fr) * 2000-07-17 2002-01-24 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Fk228 reduit et son utilisation
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