Nouvelles nitrones utilisables pour le piégeage des radicaux libres-
La présente invention concerne des dérivés de nitrones cycliques utilisables comme pièges à radicaux libres.
Un certain nombre de nitrones cycliques capables de piéger des radicaux libres sont connus à cette date : La 5, 5-diméthyl-pyrroline-N-oxyde (DMPO) est commercialisé en Europe par différentes sociétés, telles qu'ALDRICH, FLUKA et SIGMA. Ce composé, capteur de radicaux libres, est utilisé uniquement dans des expé- riences de Résonance Paramagnétique Electronique. Son application dans les domaines pharmaceutique et cosméto- logique est limitée en raison de son instabilité, de sa faible solubilité dans les milieux biologiques, ainsi que de l'instabilité de ses adduits de piégeage. M.J. TURNER et G.M. ROSEN décrivent par ailleurs, dans leur article paru dans J. Med. Chem. 7___ (12), 2439-2444 (1986), trois nitrones cycliques qui se sont révélées des pièges à radicaux libres plus efficaces que le DMPO, à savoir la 5-butyl-5-méthyl-l-pyrroline-l- oxyde (BMPO), la 5,5-dipropyl-l-pyrroline-l-oxyde (DPPO) et la 2-aza-2-cyclopentènespirocyclopentane-2-oxyde (CPPO). Toutefois, la solubilité de ces composés dans les milieux biologiques est insuffisante au vu de leurs propriétés lipophiles très supérieures à celles du DMPO. On a maintenant découvert de nouvelles nitrones cycliques présentant une grande stabilité, une meilleure solubilité dans les milieux biologiques, et conduisant à la formation d'adduits de piégeage compara¬ tivement plus stables. L'invention a pour objet des nitrones cycliques de formule générale I :
Rx représente un phényle ou bien un (C.-C18)alkyle, R2 représente un atome d'hydrogène, de deuterium, un groupe phényle, (C.-C18)alkyle, un radical Z de formule 0
dans laquelle : A est une simple liaison, un groupe méthylène, ou un groupe oxamethylene (où 1'atome d'oxygène est lié à 1'atome de phosphore du radical Z ), Y représente un atome d'oxygène et R représente un atome d'hydrogène, un (C
x- C
18)alkyle ou un (C
6-C
18)aryle, ou bien Y représente un groupe méthylène et R représente un atome d'hydrogène, un (Ci-Ci,)alkyle, ou un (C
6-C
18)aryle.
R3, R4 et R5 représentent indépendamment 1'un de 1'autre un atome d'hydrogène, de deuterium, un groupe phényle ou (Ci-CiβJalkyle, et R6 représente un atome d'hydrogène, de deuterium, un groupe phényle, ou un radical
A représentant une simple liaison et Y et R étant tels que définis précédemment,
R7 représente un atome d'hydrogène, de deuterium ou un groupe méthyle, sous réserve qu'un et un seul des groupes R2 et R6 repré¬ sente le radical Z de formule
R — Y j, T? — A— Z R— Y-^ O
A représentant une simple liaison, un groupe méthylène ou un groupe oxamethylene (où 1'atome d'oxygène est lié à 1'atome de phosphore du radical Z), et R et Y étant tels que définis précédemment, ainsi que leurs sels correspondants physiologiquement acceptables obtenus par action d'une base minérale ou organique.
Un groupe de composés de formule I préférés est constitué par les composés de formule II suivante :
dans laquelle : R représente un atome d'hydrogène, un
ou un
(C6-C18)aryle,
R-L représente un phényle ou bien un (C--C18)alkyle,
R
3, R
4, R
5 et R
6 représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, de deuterium, un groupe phényle ou un
et
R7 représente un atome d'hydrogène, de deuterium ou un groupe méthyle.
Avantageusement, Rx représente un groupe méthyle et R7 est un atome d'hydrogène ou de deuterium. Parmi ces composés préférés, on peut citer les suivants : la 5-diéthoxyphosphoryl-5-méthyl-l-pyrroline-l-oxyde
(DEPMPO) , la 5-phosphono-5-méthyl-l-pyrroline-l-oxyde, et la 5-diéthoxyphosphoryl-5-méthyl-(2,3,3-2H3)-l-pyrro-
1ine-1-oxyde (DEPMPOD).
Par groupe (C^C^)alkyle et (C^C^alkyle, on entend les groupes à chaîne linéaire ou ramifiée possé¬ dant respectivement de 1 à 17 atomes de carbone ou de 1 à 18 atomes de carbone.
Par groupe (C6-C18)aryle, on entend des composés mono- ou polycycliques aromatiques comprenant de 6 à 18 atomes de carbone.
Les sels physiologiquement acceptables sont ceux formés par action d'une base minérale ou organique sur les composés de formule I ou II.
Comme sels préférés, on peut citer les sels de sodium des acides phosphoniques de formule I ou II.
Les composés de 1'invention peuvent être préparés par un procédé qui consiste à oxyder au moyen d'un agent oxydant approprié un composé de formule générale III :
dans laquelle Rx, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis ci-dessus.
Dans cette réaction, l'agent oxydant peut être avantageusement un peracide organique tel que l'acide m-chloroperbenzoïque, un oxydant minéral tel que le tungstate de sodium, ou bien toute combinaison d'oxyde minéral et de peroxyde d'hydrogène tel que l'oxyde de sélénium en présence de peroxyde d'hydrogène, ou bien encore un agent oxydant organique tel que le diméthyl dioxiranne.
Les conditions réactionnelles dépendent de la nature de l'agent oxydant sélectionné, et il est à la portée de 1 'homme du métier de les déterminer à 1 'aide de ses connaissances générales de base. Ainsi, lorsque l'oxydation a lieu par action d'un peracide organique, on choisira un solvant inerte comme par exemple le dichlorométhane ou le chloroforme. Lorsque l'oxydant est le peroxyde d'hydrogène en solution aqueuse en présence d'un oxyde minéral, on optera pour un solvant aprotique polaire, comme par exemple l'acétone.
La température peut varier en fonction de la nature du composé de formule III. Elle est avantageuse¬ ment comprise entre 0°C et la température de reflux du solvant. Les composés de formule générale III dans laquelle R2 représente le radical
où R et Y sont tels que définis précédemment, peuvent être préparés par un procédé qui consiste à faire réagir une halogénocétone de formule générale IV :
IV
R, — C— C— C CH—X
O R3 R6
dans laquelle X représente un halogène tel que le chlore, le brome ou l'iode, et Rlf R3, R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis ci-dessus, sous réserve que le groupe R6 ne représente pas le radical
R— Y
P- A—
II
R —Y' O
A représentant une simple liaison et R et Y étant tels que définis précédemment, avec un composé de formule V :
P — Y— R
/ \
H
où Y et R ont la même signification que ci-dessus, en présence de NH3.
Là encore les conditions réactionnelles dépendent de la nature des réactifs de formule IV et V et peuvent être aisément déterminées par 1'homme du métier. On conduit généralement la réaction dans un solvant protique polaire. Avantageusement, le solvant sera l'éthanol. La température pourra être comprise entre la température ambiante et la température de reflux du solvant. Les composés de formule IV et V sont des composés disponibles dans le commerce ou pouvant être préparés par 1'homme du métier à 1'aide de méthodes connues.
Les composés de formule générale III dans laquelle R2 représente un radical
R— Y,
peuvent être préparés par un procédé qui consiste à a) faire réagir sur le composé correspondant de formule VI
dans laquelle Rlf R3, R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis précédemment, sous réserve que le groupe R6 ne représente pas le radical
P— A-
II
R- O
A représentant une simple liaison et R et Y étant tels que définis précédemment, et Pr est un groupe protecteur de la fonction amine, comme par exemple le groupe benzyloxycarbonyle, un dérivé du phosphore de formule P(YR)3 où Y et R sont tels que définis précédemment, b) puis déprotéger la fonction amine secon¬ daire par 1'une des méthodes connues de 1'homme du métier.
Les composés de formule VI peuvent être préparés en deux étapes à partir des composés suivants de formule VIII :
VIII
dans laquelle R-, R
3, R
4, R
5, R
6, R
7 et Pr sont tels que définis pour le composé VI.
Dans une première étape, on fait réagir un composé de formule VIII avec du diacétate de mercure ; la deuxième étape, qui consiste à traiter le produit résultant, successivement par de l'iodure de potassium puis de l'iode, conduit directement au composé de formule VI correspondant.
Les composés de formule VIII sont facilement préparés par l'homme du métier à l'aide de méthodes connues à partir de composés disponibles dans le commer¬ ce.
Les composés de formule générale III dans laquelle R2 représente un radical
R— Y.
P— o— CH,_ n o
peuvent être préparés par un procédé qui consiste à : a) faire réagir sur le composé correspondant de formule IX
dans laquelle R
l f R
3, R
4, R
5, R
6, R
7 et Pr sont tels que définis précédemment, sous réserve que le groupe R
6 ne représente pas le radical
A représentant une simple liaison et R et Y étant tels que définis précédemment, un composé de formule X
R Y^
P— X X R —Y^ 0
dans laquelle X représente un halogène tel que le chlore et R et Y sont tels que définis précédemment. b) puis déprotéger la fonction amine secon- daire par l'une des méthodes connues de l'homme du métier.
La préparation des composés de formule IX est réalisée en deux étapes à partir des composés correspon¬ dants de formule VIII : On fait réagir dans un premier temps le composé de formule VIII avec un diacétate de mercure. Dans la deuxième étape, le produit résultant est traité par de 1'oxygène en présence d'un hydrure tel que le borohydrure de potassium, pour conduire au composé attendu de formule IX.
La préparation des composés de formule I dans laquelle R6 représente un radical
où R et Y sont tels que définis précédemment, peut être réalisée au moins de deux façons différentes. Un premier procédé de synthèse consiste à
traiter par de 1'hydrure de sodium le composé de formule XI correspondant :
dans laquelle Rx, R2, R3, R4, R5 et R7 sont tels que définis précédemment, sous réserve que R2 ne représente pas un groupe
R et Y étant tels que définis précédemment et A repré¬ sentant une simple liaison, un groupe méthylène ou un groupe oxamethylene (où l'atome d'oxygène est lié à 1'atome de phosphore du radical Z), puis à faire réagir le sel de sodium résultant avec un composé de formule X. Dans le second procédé de synthèse, un composé de formule XI est successivement traité par la N-bromo-succinimide et un composé de formule P(YR)3 dans laquelle Y et R sont tels que définis précédemment. Lorsque le composé de formule I visé est tel que Y est un atome d'oxygène, cette réaction est connue sous le nom de réaction d'Arbuzov.
Les composés de formule XI sont préparés au moyen d'un agent oxydant à partir des composés correspon¬ dants de formule III. La méthode utilisée a été détaillée ci-dessus.
Les composés de formule générale I pour lesquels Y est un atome d'oxygène et R est un atome d'hydrogène peuvent être obtenus à partir des composés correspondants de formule I dans laquelle R est un alkyle par action d'un halogénure de triméthylsilyle tel que le bromure de triméthylsilyle dans des conditions anhydres, puis hydrolyse aqueuse. Dans cette réaction, un solvant inerte aprotique pourra être utilisé. On peut citer le dichlorométhane et le chloroforme comme solvants préfé- rés. La température dépend du composé de formule I considéré et pourra varier entre la température ambiante et la température de reflux du solvant.
Les composés de formule I pour lesquels un ou plusieurs des radicaux choisis parmi R2, R3, R4, R5, R6 et R7 représentent un atome de deuterium sont préparés à partir des composés de même formule dans lesquels les atomes de deuterium sont remplacés par des atomes d'hydrogène, par action de deutéroxyde de sodium (NaOD) dans 1'eau lourde (D20) . La température réactionnelle dépend de la nature du composé considéré de formule I. Elle pourra être choisie indifféremment entre 0βC et la température de reflux de 1'eau lourde.
Les composés de 1'invention sont utilisables comme pièges à radicaux libres. En tant que tels, et du fait de leurs propriétés physico-chimiques, ils trouvent une application en cosmétologie et dans le domaine médical.
Dans le milieu biologique humain, plusieurs espèces oxygénées réactives, des prooxydants du type 02 ", HO-, H00-, peuvent être formées à partir de l'oxygène véhiculé dans l'organisme par la respiration. En situa¬ tion normale, une concentration stationnaire faible de ces espèces est contrôlée par une série d'antioxydants, enzymatiques ou non enzymatiques, qui assurent leur élimination.
Une situation de stress oxydatif s'établit lorsqu'il existe entre antioxydants et prooxydants un déséquilibre local en faveur de ces derniers. Des situa¬ tions de stress oxydatif ont été mises en évidence dans le cas de diverses pathologies cardio-vasculaires telles que 1'ischémiecoronarienne, 1'artériosclérose, 1'infarc¬ tus, ainsi que dans le cas de circulation extracorporelle mise en oeuvre en chirurgie vasculaire ou encore lors de processus inflammatoires, infectieux ou de vieillissement cellulaire.
Les composés selon 1'invention sont des pièges efficaces à radicaux libres qui peuvent être utilisés en cosmétologie comme capteurs des espèces pro¬ oxydantes responsables du vieillissement cellulaire. En médecine, et plus particulièrement dans le domaine du diagnostic, les composés selon l'invention sont utiles dans l'évaluation du stress oxydatif. La détection directe des radicaux libres 02", H00- et HO- générés in vivo n'est pas possible par Résonnance Paramagnétique Electronique (RPE), malgré leur magnétisme de spin non nul, du fait de leur instabilité : ces radicaux présentent en effet une durée de demi-vie de l'ordre de 10"5 à 10~3 seconde.
Le spin-trapping est la technique utilisée pour la détection de ces radicaux. Son principe est le suivant : le milieu biologique à tester est placé en présence d'un piège à radicaux libres P. Si des radicaux libres tels que 02 ~, HO' ou H00- sont présents dans le milieu, ils se combinent au piège P pour former un adduit (P—02) ~, (P—OH)- ou (P—00H)-. Cet adduit est paramagné¬ tique de manière persistante et peut donc être détecté par Résonance Paramagnétique Electronique (RPE).
Vis-à-vis des radicaux libres, les composés selon 1'invention se sont révélés des pièges efficaces permettant la détection par RPE des radicaux libres pro-
oxydants dans les milieux biologiques.
L'utilisation des composés selon l'invention comme capteurs ou pièges à radicaux libres offre de nombreux avantages. On citera la stabilité de ces composés et leur solubilité dans les milieux biologiques.
Les inventeurs ont également pu démontrer que la cinétique de piégeage de radicaux libres tels que HOO- par les composés de 1'invention est bien plus rapide que dans le cas de la 5,5-diméthyl-pyrroline-N-oxyde (DMPO) de l'état de la technique.
La réaction de capture du radical H00" par la DMPO est lente et caractérisée par une constante de vitesse du second ordre, k, de 10 M"1 s"1 ; la formation in vivo du radical superoxyde est par conséquent diffici- lement détectée par la DMPO. A l'inverse, la vitesse de capture du radical H00- par la 5-diéthoxy-phosphoryl-5- méthyl-1-pyrroline-l-oxyde (DEPMPO), composé selon l'invention, est 2,5 fois plus rapide.
D'autre part, lors de la détection de HOO- par la DMPO, plusieurs auteurs ont signalé la décomposi¬ tion de l'adduit (DMP0--00H)- en adduit (DMP0--0H)-. Il en résulte une faible fiabilité des expériences de spin- trapping réalisées à partir de la DMPO.
Inversement, dans le cas de la DEPMPO, composé selon l'invention, aucune décomposition de l'adduit (DEPMPO—00H)- en adduit (DMPO—OH)- n'a été observée.
La stabilité des adduits obtenus à partir des composés selon 1'invention est encore prouvée par les expériences qualitative et quantitative suivantes :
Test de congélation - décongélation :
La possibilité de stockage d'échantillons de sang, prélevés sur des patients se trouvant dans diverses
situations pouvant impliquer l'existence de stress oxydatif (en chirurgie cardio-vasculaire avec circulation extracorporelle, ou dans le cas d'infarctus du myocarde) est essentielle en vue d'une utilisation dans le domaine médical. Dans le cas des composés selon l'invention, l'addition du radical piégeur peut être réalisée avant congélation et stockage à 77 K des échantillons de sang, en raison de la grande stabilité des adduits de piégeage, comme le montre 1'expérience suivante : Les adduits de piégeage de la DEPMPO et des radicaux 02 ~ et HOO- ont été analysés par Résonnance Paramagnétique Electronique après stockage à 77K et décongélation. Leur spectre s'est révélé identique à celui des adduits avant congélation, démontrant ainsi leur bonne stabilité.
A l'inverse, la même expérience à partir d'adduits de la DMPO a conduit à 1'apparition de nombreux signaux parasites gênant 1'interprétation des spectres RPE des adduits décongelés.
Etude cinétique de la décomposition des adduits nitrone - (02 " / H0Q-) :
Dans cette expérience, les radicaux (02" / HOO-) ont été produits par irradiation dans le visible en présence du système riboflavine (0,1 mM) - DTPA (4 mM) dans un tampon phosphate 0,1 M (pH = 7) à température ambiante.
Les nitrones étudiées sont ajoutées à la solution irradiée dans une concentration de 0,08 M.
A l'arrêt de l'irradiation, la production des radicaux 02 " / HOO- cesse et la décroissance des adduits [nitrones - (02 ~ / HOO )] est suivie par analyse RPE.
La variation de la concentration en adduits a été étudiée en fonction du temps, dans le cas des
nitrones DMPO (de 1'art antérieur) et DEPMPO (de 1'inven¬ tion) . Les valeurs de la concentration en adduits ont été relevées après 2, 10, 20, 30, et 40 minutes. Ces valeurs sont rapportées au Tableau I.
TABLEAU I
TEMPS Concentration en Concentration en
(Minutes) adduits adduits
(DMP0)-(02 "/H00 ) (DEPMPO)-(02 '/H00-)
0 100 100
2 50 91
10 0 68
20 0 52
30 0 42
40 0 28
Les cinétiques de disparition des adduits sont du premier ordre dans les deux cas. Les constantes de vitesse calculées sont respectivement :
'DMPO 1,4 10"2 s'1
»"DEP PO 1,4 10"3 s"1
II ressort de la présente étude que le temps de demi-vie des adduits [(DEPMPO) - (HOO- / 02")] est dix fois plus grand que celui des adduits [(DMPO) - (HOO- / o,-)].
L'invention a également pour objet une composi¬ tion destinée à être utilisée en cosmétologie, contenant à titre d'ingrédient actif un composé selon l'invention : les produits de formule générale I sont associés à des excipients, des arômes et des colorants adéquats, pour former par exemple des aérosols, solutions, crèmes ou pommades.
Un autre objet de l'invention est un produit de diagnostic utilisable dans l'évaluation du stress oxydatif, comprenant un composé selon l'invention.
Les exemples suivants illustrent 1'invention à titre non limitatif. Dans les données de résonnance magnétique nucléaire (R.M.N. ), les déplacements chimiques δ sont exprimés en p.p.m. par rapport au TMS.
EXEMPLE 1
5-diéthoxyphosphoryl«-5-methyl-1-pyrroline-1-oxyde
a) (2-méthylpyrrolidin-2-yl)phosphonate de dié- thyle
Une solution de 11,8 g de 5-chloropentan-2-one et de 14 g de diéthylphosphite dans 50 ml d'éthanol est maintenue à 50°C et sous un flux d'ammoniac pendant 4 heures. Le mélange reactionnel est ensuite filtré et le solvant évaporé. Le résidu est repris par 40 ml d'une solution HC12N puis extrait par du chlorure de méthylène (2 x 50 ml). La phase aqueuse est neutralisée par addition de bicarbonate de sodium et extraite au chloro- forme. Cette phase organique est séchée sur sulfate de
sodium. 'évaporation du solvant sous pression réduite conduit à 13,7 g d'une huile incolore.
b) 5-diéthoxyphosphoryl-5-méthyl-l-pyrroline-l- oxyde
A une solution de 2 g de la pyrrolidine précé¬ dente dans 30 ml de chloroforme refroidie à 0°C, est ajoutée goutte à goutte une solution de 4,4 g d'acide m- chloroperbenzoïque 70% dans 40 ml de chloroforme. Le mélange reactionnel est ensuite lavé avec une solution saturée de bicarbonate de sodium (2 x 15 ml) puis de chlorure de sodium (15 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis concentrée sous pression réduite. Le résidu, chromatographié (silice, CH2C12/E- tOH:85/15), donne 0,4 g d'une huile jaune.
EXEMPLE 2 5-phosphono-5-méthyl-l-pyrroline-l-oxyde
On ajoute à 300 mg de 5-diéthoxyphosphoryl-5- méthyl-1-pyrroline-l-oxyde en solution dans 5 ml de dichlorométhane sec, 0,67 ml de bromure de triméthylsi- lyle. Le mélange est chauffé à reflux pendant 20 heures. Le chlorure de méthylène est évaporé sous pression réduite. Le résidu est hydrolyse par 0,8 ml d'eau dans 6 ml d'acétone. Le précipité est filtré et lavé avec de l'acétone (15 ml) et recristallisé dans le diméthylsul- foxyde pour donner 137 mg d'une poudre blanche.
EXEMPLE 3
5-diéthoxyphosphoryl-2 , 5-diméthyl-l-pyrroline-l- oxyde
A une solution de 8,61 g de 5-diéthoxyphosphoryl- 2,5-diméthyl-l-pyrrolidine et 0,21 g de Se02 dans 72 ml d'acétone, on ajoute goutte à goutte à 0°C, sous argon, 12,06 g d'une solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène 30 %. Après addition, le mélange reactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 30 heures. L'acétone est éliminée sous pression réduite. La phase aqueuse est extraite avec du dichlorométhane. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis concen¬ trée sous pression réduite. Le résidu, chromatographie sur colonne (silice, CH2Cl2/EtOH : 90/10), conduit à 2,1 g d'une huile jaune.
EXEMPLE 4
5 -diéthoxyphosphoryl -5-méthyl- ( 2 , 3 , 3-2H3) -l - pyrroline-1-oxyde (DEPMPO,,)
A une solution de 0,5 g de 5-diéthoxyphosphoryl-
5-méthyl-l-pyrroline-l-oxyde dans 3 ml d'eau lourde, D20, on ajoute lentement une solution de deutéroxyde de sodium (NaOD 8N dans D20, 0,2 ml) dans 10 ml d'eau lourde, D20, préalablement refroidie. La réaction s'effectue sous atmosphère inerte (argon) et isolée de la lumière à température ambiante. On suit la réaction par RMN. Après 24 heures, on note la disparition du signal du proton éthylénique. Le milieu reactionnel est alors extrait au dichlorométhane (3 x 10 ml) fraîchement distillé sur anhydride phosphorique (P205). La phase organique est ensuite évaporée sous pression réduite. On obtient 0,3 g d'une huile résiduelle jaune.