WO1994024289A1 - Procede d'adressage de proteines dans les peroxysomes de levures - Google Patents

Procede d'adressage de proteines dans les peroxysomes de levures Download PDF

Info

Publication number
WO1994024289A1
WO1994024289A1 PCT/FR1994/000438 FR9400438W WO9424289A1 WO 1994024289 A1 WO1994024289 A1 WO 1994024289A1 FR 9400438 W FR9400438 W FR 9400438W WO 9424289 A1 WO9424289 A1 WO 9424289A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
yeast
strain
peptide
sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1994/000438
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Marc Nicaud
Nathalie Labat
Hisao Ito
Alain Raynal
Daniel Pardo
Shinichi Sugimoto
Original Assignee
Eurolysine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eurolysine filed Critical Eurolysine
Priority to AU66810/94A priority Critical patent/AU6681094A/en
Publication of WO1994024289A1 publication Critical patent/WO1994024289A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates in particular to a process intended to allow an accumulation in yeasts of peptides or proteins which are unstable or which are toxic in cytoplasmic or secreted form.
  • yeasts in particular Saccharomyces cerevisae, either in cytoplasmic form or in secreted form in the culture medium.
  • This drawback is not limited to yeasts but is also present in bacteria.
  • the present invention is based on the demonstration of the fact that it is possible to accumulate and stabilize unstable or toxic proteins by addressing them in the peroxisomes of yeasts.
  • Peroxisomes are spherical organelles made up of a simple membrane and which contain numerous enzymes which allow the use of acetate, fatty acids or which participate in the glyoxylate cycle.
  • Proteins or peptides are essentially products of expression of a DNA sequence obtained by recombinant DNA techniques.
  • protein peptides or polypeptides which may be prepared within the framework of the present invention, it is of course necessary to mention more particularly the products which are unstable either because of their size or because of their particular structure, as well as the peptides or proteins that are toxic when directed elsewhere than in peroxisomes.
  • This process relates more particularly to the preparation of proteins, polypeptides or non-peroxisomal peptides, that is to say molecules which naturally must not be directed or be found inside the peroxisomes of the strain in question.
  • They may be homologous or heterologous products, ie polypeptide proteins or peptides which are produced naturally by the host strain in question or, on the contrary, which are of different origins but which come from the expression of a sequence introduced by recombinant techniques.
  • heterologous DNA sequences is intended to denote DNA sequences which do not appear as such in the chromosomal equipment of yeast at the origins, even if it is a DNA sequence which has the same function but which comes from a different strain or in any case a DNA sequence introduced by recombinant techniques.
  • the technology for expressing DNA sequences in yeasts using the recombinant DNA technique is known; it essentially uses either autonomous replication vectors of the plasmid type, or integration vectors. All of these techniques are known both for Saccharomyces yeasts and for other types of yeast such as Kluyveromyces.
  • the protein sequences allowing addressing in peroxisomes require the presence of these sequences either at the N-terminal end or at the C-terminal end of the protein of interest. It is also possible in certain cases to provide addressing sequences appearing in the internal part of the protein. These addressing sequences are called PTS (Peroxisomal Targeting Seqences). There are essentially three types.
  • the type I addressing sequences that is to say which are located in the C terminal position, are of the Ser-Lys-Leu type and it is possible to admit variations of this motif in particular (Ser / Ala / Cys-Lys / Arg / His-Leu).
  • an addressing sequence obviously corresponds to the presence of a DNA sequence corresponding respectively to the 3 'and 5' end of the DNA coding for the peptide or protein. It should be understood that it is not absolutely necessary for the addressing sequence to be contiguous with the sequence of the protein, in certain cases provision may be made for intermediate sequences which may facilitate recovery, for example.
  • cleavage sites corresponding to specific enzymes will be provided, for example the Lys-Arg sites or else corresponding to chemical cleavages with cyanogen bromide when the protein of interest is devoid of methionine, in particular placing this amino acid at the top of the protein.
  • the method according to the present invention therefore makes it possible to obtain yeast strains in which the peroxisomes contain significant amounts of a protein obtained by the technique of recombinant DNAs.
  • the yeast thus obtained can be treated in order to extract the protein-rich peroxisomes from which the protein itself will then be extracted, according to a technology of the type which has been developed for the preparation of proteins in £ Coli using the technology. refractile bodies.
  • the yeast itself at the level of the peroxisomes with a protein polypeptide or peptide rich in certain essential amino acids such as, for example, the sulfur-containing amino acids methionine or cysteine and of directly using the strain of yeast obtained as food additive or as food.
  • the heterologous DNA sequence is the sequence coding for the intermediate 12kDa protein for processing the 2S protein.
  • the ELE protein and its polymers which are described in FIG. 2.
  • it may be particularly advantageous to use as host cell lysine-rich yeasts this is particularly the case for the strain Saccharomyces ELY M8 , as well as its progeny obtained by crossing which are rich in lysine, in particular the strains obtained by crossing with baker's yeasts such as ELY S3.
  • these strains lead to food additives also rich in sulfur amino acids.
  • Prototrophic yeast strain lysine producer with a total lysine content greater than 10%. This strain was isolated after crossing of the ELY M8 strain with a bakery strain in such a way as to combine the lysine production capacities and the capacities to grow in an industrial environment with a growth rate and a high sugar / biomass yield.
  • the present invention therefore also relates to the strains obtained as well as their application, in particular as a food additive as well as to the methods using the strains thus obtained to extract the peroxisomes and then the corresponding peptide proteins or polypeptides.
  • FIG. 1 represents the protein sequence corresponding to the synthetic gene for the precursor of Brazil nut 12kDa and sequence of the oligonucleotides used for the construction of the synhetic gene
  • FIG. 2 shows the protein sequence of peptides E (SEQ.ID No. 2) and ELE (SEQ, ID No. 3).
  • the sequence of the oligonucleotides used for the construction of the synthetic genes is indicated below (E1 line 2, E2 line 3 for the peptide E).
  • the different oligonucleotides used are symbolized by arrows ("and").
  • FIG. 3 shows the structure of the expression vectors pYEL1 and pYEL45 for the yeast S. cerevisiae.
  • the plasmid pYEL1 is derived from the plasmid yMC45 (Francingues-Gaillard, Thèse, 1990) into which a 1786 bp fragment containing the promoter and the terminator of the PGK has been inserted.
  • the EcoRI-HindIII fragment is derived from the plasmid pBR322 and contains the ⁇ -lactamase gene and an origin of replication for £ coli (black box).
  • the BamHI-EcoRI fragment contains the URA3 marker and a sub-fragment of the 2 ⁇ plasmid.
  • the HindIII-SalI fragment corresponds to the PGK promoter and terminator.
  • the SalI-BamHI fragment corresponds to the ntpl1 gene placed between the promoter and the terminator of ⁇ -glucosidase.
  • Figure 4 shows the radioactivity profile (Methionine 35 S) incorporated into the yeast proteins.
  • Control ABYS86-C13 yeast containing the plasmid pYEL1; BZN: yeast ABYS86-C13 containing the plasmid pYEL44; BZN-PTS: yeast ABYS86-C13 containing the plasmid pYEL75.
  • - Figure 5 shows the stability results of the BZN and BZN-PTS proteins.
  • FIG. 7 shows the plasmids pKM2, pKM127 and pKM129 of Example 9.
  • the Brazil nut (Bertholletia excelsia) storage protein has a high methionine and cysteine composition (18% and 13% respectively). It is composed of two subunits (9 and 3kDa) coming from the maturation of a single precursor. This complex maturation involves several stages; after the synthesis of an 18kDa precursor, the cleavage of the signal sequence during translocation in the Endoplasmic Reticulum (ER) is carried out (intermediate of 15kDa). Maturation continues with the cleavage of ATPF and CTPF (intermediate of 12kDa). This polypeptide undergoes a final stage of maturation to give the two subunits which are accumulated in the "Proteins bodies" in the seed of the plant.
  • ER Endoplasmic Reticulum
  • a synthetic gene corresponding to the 12kDa intermediate has been constructed.
  • This synthetic gene presents; in 5 ′ an Xhol site, a sequence upstream of the initiating ATG responding to the consensus of the strongly expressed genes, the initiating ATG, a serine codon to respond to the law of the 2 * * amino acid and in 3 ′ a site BglII for cloning facilities and the addition of addressing signals.
  • the desired protein sequence is shown in Fig. l. 8
  • the construction of the synthetic gene was carried out using ten oligonucleotides BZN1 to BZNIO, with a size ranging from 62 to 71 bases, the sequence of which was chosen using the codon of S. cerevisiae of the highly expressed proteins. .
  • the oligonucleotides were phosphorylated with the exception of BZN1 and BZN6.
  • the oligonucleotides, purified on polyacrylamide gel, were resuspended in TE (Tris EDTA) at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml. Hybridization mixtures containing 10 ⁇ l of each complementary oligonucleotide were heated for 5 min.
  • IV ligation with V 0.5 ⁇ l of IV, 0.5 ⁇ l of V in a final volume of 25 ⁇ l.
  • the ligation mixture (I / II) + (III) + (IV / V) is then cloned into a KS + 10 vector (plasmid derived from the bluescript KS + vector, STRATAGENE, where a BglII adapter of sequence GGAAGATCTTCC was introduced to the site Hindll) opened by the enzymes XhoJ and BglII to give the plasmid KS + 17.
  • Transformants of the DH5 ⁇ strain were obtained by electroporation and selection on LB ampiciline medium (100 ⁇ g / ml).
  • Clones containing the desired construct were identified by PCR using the pair of oligonucleotides BZN1 / BZN6 which allow the amplification of a band of 339bp. The amplification products were analyzed on polyacrylamide gel. The final vector KS + 17 containing the synthetic gene was sequenced by the Sanger method on the two strands using as primer the oligonucleotides T3 and T7 of the bluescript.
  • a synthetic gene coding for a peptide of 58 amino acids, rich in essential amino acids and mainly in methonine has been constructed.
  • This synthetic gene has: at 5 'an Xhol site, a sequence upstream of the initiating ATG responding to the consensus of highly expressed genes, the initiating ATG, a serine codon to respond to the law of the 2nd amino acid and in 3' a BglII site for cloning facilities and the addition of addressing signals.
  • the protein sequence is presented in Figure 2.
  • the construction of the synthetic gene was carried out in two stages using oligonucleotides whose sequence was chosen using the codon of S. cerevisiae of the highly expressed proteins.
  • the first step allowed the construction of peptide E, using oligonucleotides E1 and E2, 81 bases.
  • the two oligonucleotides E1 and E2 were purified on polyacrylamide gel and resuspended in TE (Tris EDTA) at a concentration of 0.5 ⁇ g / ⁇ l, then hybridized. For this, the oligonucleotides were heated 5 min. at 85 ° C, then cooled to 37 ° C and stored at -20 ° C before use.
  • the oligonucleotides thus hybridized (0.5 ⁇ l) were cloned into the vector KS + 10 opened by the enzymes -Xhol and BglII to give the plasmid pE
  • This vector was sequenced by the Sanger method on the two strands using as primer the oligonucleotides T3 and T7 from bluescript.
  • the second step allowed the construction of a DNA sequence corresponding to an ELE homodimer.
  • the DNA fragment corresponding to peptide E was ligated to the adapter L
  • the adapter L (BglII-Xhol) was produced by the hybridization of the oligonucleotides L1 (GATCGCTAAGATGAAG) and L2 (TCGACTTCATCTTAGC).
  • E, LEL, ELE, LELEL The different forms obtained (E, LEL, ELE, LELEL) were separated on polyacrylamide gel.
  • the band corresponding to ELE was eluted and then cloned into the vector KS + 10 opened by the enzymes Xhol and BglII to give the plasmid pELE.
  • Transformants of the DH5 ⁇ strain were obtained by electroporation and selection on LB ampicillin medium (100 ⁇ g / ml).
  • the white clones on LB ampicillin Xgal were analyzed by restriction with the enzymes Xhol and BglII. Clones with the expected 177bp band were checked in sequence.
  • the basic vectors pYEL1, pYEL45 and pYEL107 are replicative £ coli - S. cetevisia vectors, of the two micron type (FIG. 3).
  • the vector pYEL1 contains;
  • the vector pYEL1 results from the insertion of a 1786bp fragment containing the characteristics (D) into the vector yMC45 (Francingues-gaillard, thesis 1990) containing the characteristics (A, B, C).
  • An Xhol site has. was created upstream of the ATG of the PGK gene, a BglII site was created upstream of the TAA stop so as to allow optimal fusion of the sequences to be expressed with the promoter and terminator sequences of the PGK gene.
  • the vector pYEL45 additionally contains:
  • E- A 1.8 kb region which contains the nptll gene placed under the control of the promoter and terminator of the ⁇ -glucosidase of K. fragilis conferring resistance to G418 on the transformed yeast (A. Raynal et al., 1987).
  • This Resistance cassette was produced according to the following steps: A 1250bp HinDIII-AsuII fragment containing the npt11 gene (castilho et al., 1984) is introduced into the vector KS + 10 opened by the enzymes HinDIII and ClaI. The resulting vector pYEL35 was used to perform PCR mutagenesis.
  • a BamHI site was introduced in front of the initiating ATG using the mutagenic oligonucleotide (GATGGATCCGCATGATTGAACAAGATGGA).
  • the modified fragment was cloned at the HindII site of the KS + 10 vector to give the vector pYEL38.
  • the BamHI-BglII fragment of the plasmid pYEL38 containing the npt11 gene was then inserted into the BamHI site of the plasmid yBG47 (Francingues-gaillard, thesis 1990) between the promoter and terminator of the ⁇ -glucosidase gene.
  • This expression cassette (Sall-Sphl fragment treated with Klenow) was then introduced into the BamHI site (treated with Klenow) of the plasmid pYEL1.
  • the vector pYEL107 is derived from the vector pYEL45 where the BglII sites located in the promoter of the ⁇ -glucosidase gene have been modified by PCR to conserve a unique BglII site in the vector.
  • the vector pYEL44 contains the synthetic BZN gene isolated from the plasmid KS-17 (fragment XhoI-BglII) inserted at the corresponding sites of the vector pYEL1.
  • the vector pYEL93 was constructed by exchange of the Xhol-Sall fragment of the plasmid pYEL45 with the Xhol-Sall fragment of the plasmid pYEL44 containing the synthetic gene BZN and the terminator PGK.
  • the vector pYEL34 contains the synthetic ELE gene isolated from the plasmid pELE (fragment XhoI-BglII) inserted at the corresponding sites of the vector pYEL1.
  • the vector pYEL127 was constructed by exchange of the Bgl1-Bglll fragment of the plasmid pYEL34 with the Bgll-Bglll fragment of the plasmid pYEL107.
  • the adapter produced by hybridization of the oligonucleotides PTScl and PTSc2, was introduced into the vector pYEL44 opened by the enzyme BglII.
  • the ligation was carried out in the presence of the enzyme BglII in order to enrich in the vector having incorporated the adapter.
  • the 1 £ coli transformants were tested by PCR using the pairs PTScl / PGKter and PTSc2 / PGKter in order to determine the orientation (PGKter is an oligonucleotide corresponding to the 3 'region of the PGK gene downstream of the TAA).
  • the vector with the desired orientation called pYEL75, which contains the gene coding for the protein BZN-PTS, was checked by sequencing.
  • the vector pYEL108 contains the region coding for the BZN-PTS protein isolated from the plasmid pYEL75 (Xhol-SalI fragment) inserted at the corresponding sites of the vector pYEL45.
  • the insertion of the adapter was carried out, as previously, in the vector pYEL127.
  • the vector with the desired orientation was checked by sequencing and called pYEL129. This vector codes for the ELE-PTS peptide.
  • the yeast strain ABYS86-C13 (Mata pral prbl prcl cpsl ura3 leu2 his3, Schuller and Entian, 1988, Gene, 67: 247-257) was transformed by the method of Dohmen et al. (Dohmen et al., 1991, Yeast, 7: 691-692) with the plasmids pYEL1 (control vector), pYEL44 (carrying the BZN gene) and pYEL75 (carrying the BZN-PTS gene) and the transformants were selected for complementation of the Ura- auxotrophy.
  • yeast proteins are separated by electrophoresis on polyacrylamide gel in Tricine-SDS-PAGE buffer.
  • the protein profiles are then analyzed after staining with coomassie blue and after autoradiography.
  • acrylamide gel after staining with coomassie blue the presence of a protein in the cell extracts of the strains transformed by the plasmids pYEL44 and pYEL75 whose size corresponds to that expected for the BZN protein (pYEL44) and for the BZN- protein.
  • PTS pYEL75
  • the level of expression was estimated according to the following protocol: after labeling for 5 min. in the presence of 50 ⁇ cu / ml of [S35] Methionine, analysis of the proteins on gel and drying of the acrylamide gel, the radioactivity is measured using a Beckman LS6000IC counter for 1 or 2 minutes.
  • the radioactivity profiles presented in Fig. 4 show that a low radioactivity is observable in the region of the molecular weight marker of 14.3 kDa (bands 30 to 35) for the control vector, against a strong radioactivity is observable for the strain containing the plasmid pYEL44 and the strain containing the plasmid pYEL75 (Fig. 4).
  • the radioactivity in the band corresponding to BZN and to BZN-PTS represents approximately 15% of the total radioactivity. This indicates that the BZN protein and the BZN-PTS protein represent 1.5% of the proteins synthesized. This estimate is based on a peptide containing 20% methionine and the yeast proteins 1.4% methionine.
  • the results presented in Fig. 5 show that the BZN protein has a half-life of 20 min. while a half-life of 140 min. is obtained for the protein BZN-PTS.
  • the yeast strain ABYS86-C13 (Mata pral prbl prcl cpsl ura3 leu2 his3, Sch ⁇ ller and Entian, 1988, Gene, 67: 247-257) was transformed with the plasmids pYEL1 (control vector), pYEL127 (carrying the ELE gene ) and pYEL129 (carrying the ELE-PTS gene) and the transformants were selected for complementation of the Ura- auxotrophy.
  • the level of expression was estimated as for example 5.
  • the radioactivity in the bands corresponding to the ELE peptide and to the ELE-PTS peptide represents approximately 15% of the total radioactivity incorporated into the yeast proteins. This indicates that these peptides represent 1.5% of the proteins synthesized.
  • the stability of the ELE and ELE-PTS peptides was estimated by measuring the radioactivity incorporated into the peptides at times t ⁇ O, 5, 10, 20, 40mn and represented as a percentage relative to the methionine incorporated in the peptides at time T ⁇ O mn.
  • the ELE peptide has a half-life of 11 min. while half a life of
  • the yeast strain ELYM8 prototrophic yeast strain, lysine overproducer was transformed by the method of Dohmen et al. (Dohmen et al., 1991, Yeast, 7: 691-692) with the plasmids pYEL45 (control vector ) .
  • pYEL93 component the BZN gene
  • pYELlO ⁇ component the BZN-PTS gene
  • the transformants were selected for resistance to G418 on rich YPD medium (yeast extract, 10g / l; bactopeptone, 10g / l; glucose 20g / l) added with 200 ⁇ g / ml of G418.
  • Expression levels were estimated according to the protocol described above.
  • the transformed yeasts were cultivated in a YPD rich medium supplemented with G418 (150 ⁇ g / ml) to a cell concentration of between 4 and 5 units (DO600). These precultures were used to seed cultures in YPD at a cell concentration of 0.5 DO600 unit. After 3 hours of incubation, the cells were collected by centrifugation, washed twice in YNB minimum medium, then labeled in YNB medium for 5 minutes in the presence of 50 ⁇ cu / ml of [S35] Methionine. The yeast proteins are analyzed on acrylamide gel after staining with coomassie blue.
  • the radioactivity incorporated in the total proteins and in the Brazil nut is measured.
  • the radioactivity in the fragments corresponding to BZN and to BZN-PTS represents approximately 30 and 40% of the total radioactivity respectively. This indicates that the BZN protein and the BZN-PTS protein respectively represent 4 and 5% of the proteins synthesized.
  • precultures of the transformants were carried out in YPD rich medium supplemented with G418 (150 ⁇ g / ml) up to a cell concentration between 1 and 3 units (DO600). These precultures were used to seed YPD cultures at an initial cell concentration of
  • the analysis of the free and total amino acid content of the yeast is carried out using the Beckman System 6300 amino acid analyzer.
  • the total amino acid composition of the transformed yeasts was determined after acid hydrolysis. Beforehand, methionine was transformed into methionine sulfone by oxidation with performic acid.
  • the free amino acid composition of the transformed yeasts was determined after incubation at 100 ° C. for 10 minutes of a corresponding cell suspension. The values obtained at times T- 40 hours are presented in Table 1.
  • a significant increase of 30% in total methionine is obtained for the strain containing the plasmid pYELlO ⁇ coding for the protein BZN-PTS. This increase in total methionine does not affect the accumulation of lysine, 6.9 and 6.8% respectively.
  • the yeast strain ELYM8 containing the plasmid pYEL 108 (poning the gene coding for the protein BZN-PTS) was cultured in YPD medium in the presence of G418 150 ⁇ g / ml.
  • the equivalent of about 2000 units of cells (2000 units- DO600) were collected by centrifugation at 3200 RPM for 5 minutes, then washed twice with 25 ml of SP buffer (spheroplatization buffer; 50mM potassium phosphate buffer, pH 7.5; 1M sorbitol).
  • the BZN-PTS protein is mainly localized in fractions 3 to 1 1 corresponding to the peroxisomes. A fraction of the BZN-PTS protein are observed in the fraction t 1 probably corresponding to a low ponion localized BZN-PTS protein in the cytoplasm in the form of aggregates.
  • the Kluyveromyces marxianus yeast was used. From the diploid homothallic strain ATCC 12424, mutants ura3 "were isolated. In the present example, the mutant FI 47 was used for all the transformations.
  • the ARS2 sequence isolated from a library of the strain ATCC 12424 and carried by a KpnI / ClaI fragment, was cloned at the Aatll site of the plasmid pRS306 (SIKORSKI R.S. and HIETER P. (1989).
  • This plasmid carries sequences £ coli (Ori and Bla gene from pBR322), the URA3 gene from S. cerevisiae, as well as the multisite of cloning of Bluescript vectors.
  • the resulting plasmid is named pKM2.
  • the origin of ARS2 replication is effective in both Kluyveromyces marxianus and Kluyveromyces lactis.
  • the FI 47 strain of K. marxianus was transformed with the plasmids pKM127 and pKM129 using the technique developed by Iborra (1993) allowing a high transformation rate to be obtained, and the transformants were selected as URA3 colonies.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L'invention a pour objet un procédé de stabilisation d'un peptide ou d'une protéine non péroxysomale instable chez une levure ou toxique pour ladite levure et obtenue par expression dans ladite levure d'une séquence d'ADN hétérologue caractérisée en ce que ledit peptide ou ladite protéine est exprimée avec une séquence d'adressage dans les péroxysomes de façon à stabiliser ou détoxifier le peptide ou la protéine dans les péroxysomes de ladite levure. Elle concerne également une souche de levure, un peptide ou une protéine qui peuvent être obtenus par la mise en ÷uvre de ce procédé, ainsi qu'un additif alimentaire les contenant.

Description

PROCEDE D ' ADRESSAGE DE PROTEINES DANS LES PEROXYSOMES DE LEVURES
La présente invention concerne notamment un procédé destiné à permettre une accumulation chez les levures de peptides ou de protéines instables ou bien qui sont toxiques sous forme cytoplasmique ou sécrétée.
Un grand nombre de protéines homologues et hétérologues ont été exprimées dans les levures notamment Saccharomyces cerevisae, soit sous forme cytoplasmique, soit sous forme sécrétée dans le milieu de culture.
Un des facteurs limitant l'accumulation de peptide ou polypeptide ou protéine dans la levure est leur stabilité.
Ceci est paticulièrement vrai pour les peptides ou polypeptides de petite taille c'est à dire de 10 à 200 acides aminés qui ont tendance à être dégradés très vite chez les levures.
Cet inconvénient n'est pas limité aux levures mais est également présent chez les bactéries.
Afin d'éviter cet inconvénient, plusieurs solutions ont été proposées ; essentiellement la polymérisation, la fusion avec des protéines stabilisantes ou la co-expression avec une protéine formant des aggrégats. Des méthodes mettant en oeuvre la polymérisation ont été décrites par CAREY ( 1980) pour la stabilisation d'un poly-L-Aspartyl-L- phénylalanine chez Escherichia coli ; SHEN (1982) pour la stabilisation de la proinsuline humaine chez les bactéries ; FERRARI (1986) dans le cas de polymères de protéines pour la levure et Bacillus subtills.
Des techniques mettant en oeuvre la fusion avec des protéines stabilisantes ont été décrites par COUSENS (1987) pour l'expression de la proinsuline utilisant la superoxidismutase humaine comme protéine de fusion ; SABIN et al. ( 1989) pour l'expression de protéines humaines utilisant l'ubiquitine comme protéine de fusion.
La co-expression avec une protéine formant des aggrégats a été décrite chez E. Coli. Dans ce micro-organisme l'accumulation de protéines sous forme d'aggrégats insolubles dit corps réfractiles a été largement décrite, toutefois cette technologie est peu développée pour l'instant chez les levures.
On a également proposé pour permettre l'accumulation de protéines chez les levures d'utiliser les mécanismes de compartimentation. Ainsi on a essayé d'accumuler les protéines sous forme de protéine retenue dans les différents compartiments de la voie secrétoire (KURODA, 1992 ; CORAGGIO, 1988). Les désavantages des compartiments sécrétoires (réticulum endoplasmique ou appareil de golgi) sont :
- la présence de protéases spécifiques ; - la modification possible de la protéine en particulier la glycosylation et,
- si l'accumulation intracellulaire est désirée, celle-ci peut être difficile à réaliser dans un système de sécrétion.
Différents documents ont également décrits l'accumulation dans les vacuoles ou les mitochondries. La présente invention repose sur la mise en évidence du fait qu'il est posssible d'accumuler et de stabiliser des protéines instables ou toxiques en les adressant dans les péroxysomes des levures.
Il s'agit en particulier d'un procédé de stabilisation d'un peptide ou d'une protéine non péroxysomale instable chez une levure ou toxique pour la dite levure et obtenue par expression dans la dite levure d'une séquence d'ADN hétérologue caractérisée en ce que ledit peptide ou la dite protéine est exprimée avec une séquence d'adressage dans les péroxysomes de façon à stabiliser ou détoxifier le peptide ou la protéine dans les péroxysomes de la dite levure. Les péroxysomes sont des organites de forme sphérique constituées d'une membrane simple et qui contiennent de nombreuses enzymes qui permettent l'utilisation de l'acétate, des acides gras ou qui participent au cycle du glyoxylate.
On a constaté selon la présente invention qu'il était possible d'accumuler des protéines ou peptides instables dans la levure dans les péroxysomes en augmentant leur stabilité. De même, si ces peptides ou protéines sont toxiques notamment au-delà d'une certaine concentration, il est néanmoins possible de les accumuler dans les péroxysomes sans endomager la levure. Les protéines ou peptides sont essentiellement des produits d'expression d'une séquence d'ADN obtenus par des techniques d'ADN recombinants. Parmi les protéines peptides ou polypeptides qui pourront être préparés dans le cadre de la présente invention, il faut citer bien entendu plus particulièrement les produits qui sont instables soit à cause de leur taille soit à cause de leur structure particulière, ainsi que les peptides ou protéines qui sont toxiques lorsqu'elles sont dirigées ailleurs que dans les péroxysomes.
Ce procédé concerne plus particulièrement la préparation de protéines, polypeptides ou peptides non péroxysomales c'est à dire des molécules qui naturellement ne doivent pas se trouver dirigées ou se trouver à l'intérieur des péroxysomes de la souche en cause.
Il peut s'agir de produits homologues ou hétérologues c'est à dire de protéines polypeptides ou peptides qui sont produites naturellement par la souche hôte en cause ou bien au contraire qui sont d'origines différentes mais qui proviennent de l'expression d'une séquence introduite par des techniques recombinantes.
Il doit être compris que par séquences d'ADN hétérologues on entend désigner des séquences d'ADN ne figurant pas tel quel dans l'équipement chromosomique de la levure aux origines, même s'il s'agit d'une séquence d'ADN qui présente la même fonction mais qui provient d'une souche différente ou en tout état de cause une séquence d'ADN introduite par des techniques recombinantes.
La technologie d'expression des séquences d'ADN chez les levures par la technique des ADN recombinants est connue ; elle utilise essentiellement soit des vecteurs à replication autonome de type plasmidique, soit des vecteurs d'intégration. Toutes ces techniques sont connues tant pour les levures Saccharomyces que pour d'autres types de levure tels que Kluyvéromyces.
Les séquences protéiques permettant l'adressage dans les péroxysomes nécessitent la présence de ces séquences soit à l'extrémité N- terminale soit à l'extrémité C- terminale de la protéine d'intérêt. Il est également possible de prévoir dans certains cas des séquences d'adressage figurant dans la partie interne de la protéine. Ces séquences d'adressage sont appelées PTS (Péroxysomales Targeting Seqences). On en distingue essentiellement trois types.
Les séquences d'adressage du type I c'est à dire qui sont situées en position C terminale sont du type Ser-Lys-Leu et il est possible d'admettre des variations de ce motif notamment (Ser/Ala/Cys-Lys/Arg/His-Leu).
Cette séquence a été mise en évidence pour la première fois en extrémité C terminale de la Luciférase (Gould 1987). Il est également possible d'utiliser des séquences de type II, séquences fixées en extrémité N- terminale. Celles-ci ne présentent pas de consensus, elles existent et dépendent du type de protéine dirigée. Elles ont été mises en évidence pour la thiolase chez Saccharomyces cerevisae. II est également possible d'utiliser des séquences introduites à l'intérieure de la protéine qui permettent également cet adressage.
La présence à l'extrémité C- ou N- d'une séquence d'adressage correspond évidement à la présence d'une séquence d'ADN correspondant respectivement à l'extrémité 3' et 5' de l'ADN codant pour le peptide ou la protéine. Il doit être entendu qu'il n'est pas absolument nécessaire que la séquence d'adressage soit contigϋe de la séquence de la protéine, dans certains cas on peut prévoir des séquences intermédiaires qui pourront faciliter la récupération par exemple.
Dans les procédés selon la présente invention, il est possible par exemple de prévoir entre les séquences d'adressage et la protéine d'intérêt, des sites de clivage qui permettront de libérer la protéine mature.
Dans certains cas en particulier lorsqu'on utilise des séquences de type II, celles-ci peuvent être clivées dans les péroxysomes. Lorsque ceci n'est pas le cas on prévoiera des sites de clivage correspondant à des enzymes spécifiques, par exemple les sites Lys-Arg ou bien correspondant à des clivages chimiques au bromure de cyanogène lorsque la protéine d'intérêt est dépourvue de méthionine, en plaçant cet acide aminé en tête de la protéine. Le procédé selon la présente invention permet donc d'obtenir des souches de levure dans lesquelles les péroxysomes comportent des quantités importantes d'une protéine obtenue par la technique des ADN recombinants.
La levure ainsi obtenue peut être traitée afin d'en extraire les péroxysomes riches en protéines dont on extraira ensuite la protéine elle- même, suivant une technologie du type de celle qui a été développée pour la préparation des protéines dans £ Coli en utilisant la technologie des corps réfractiles.
Toutefois comme cela sera démontré dans les exemples suivants, il est possible, par le biais du procédé selon la présente invention, d'enrichir la levure elle-même au niveau des péroxysomes avec une protéine polypeptide ou peptide riche en certains amino-acides essentiels comme par exemple les acides aminés soufrés méthionine ou cystéine et d'utiliser directement la souche de la levure obtenue comme additif alimentaire ou comme aliment. Ainsi il est intéressant d'exprimer la protéine 2S de la protéine de stockage de la noix du Brésil qui est riche en amino-acides soufrés. Dans ce cas la séquence d'ADN hétérologue est la séquence codant pour la protéine de 12kDa intermédiaire de maturation de la protéine 2S.
On peut aussi prévoir l'expression de gènes synthétiques codant pour des peptides ou protéines ayant un équilibre particuUer en amino- acide, c'est le cas par exemple de :
* la protéine E et de ses polymères, et
* la protéine ELE et de ses polymères, qui sont décrits à la figure 2. Dans ce cadre, il peut être particulièrement intéressant d'utiliser comme cellule hôte des levures riches en lysine, c'est le cas particulièrement de la souche Saccharomyces ELY M8, ainsi que ses descendances obtenues par croisement qui sont riches en lysine, notamment les souches obtenues par croisement avec des levures de boulangerie tel que ELY S3. Par transformation à l'aide du procédé selon la présente invention, ces souches conduisent à des additifs alimentaires également riches en acides aminés soufrés.
Les souches en cause présentent les caractéristiques suivantes :
* ELY M8 Souche de levure prototrophe, productrice de lysine dont le contenu en lysine totale peut atteindre jusqu'à 8 - 9% ;
* ELY S3
Souche de levure prototrophe, productrice de lysine dont le contenu en lysine totale est supérieur à 10%. Cette souche a été isolée après croisement de la souche ELY M8 avec une souche de boulangerie de telle manière à combiner les capacités de production de lysine et les capacités à pousser en milieu industriel avec un taux de croissance et un rendement sucre/biomasse élevé. De ce fait la souche ELY S3 est une souche utilisable au niveau industriel. Ces souches ont été déposées le 19 Avril 1993 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 28 rue du Docteur Roux, 75015 PARIS sous le numéro : S. cerevisae ELY M8 ***** I - 1299 S. cerevisae ELY S3 = I - 1300
Ces souches sont disponibles par l'intermédiaire d'un expert.
La présente invention concerne donc également les souches obtenues ainsi que leur application, notamment à titre d'additif alimentaire ainsi que les procédés mettant en oeuvre les souches ainsi obtenues pour en extraire les péroxysomes puis les protéines peptides ou polypeptides correspondants.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après dont certains seront décrits en se référant aux figures ci-annexées comme suit : - La Figure 1 représente la séquence protéique correspondant au gène synthétique pour le précurseur de 12kDa de la noix du Brésil et séquence des oligonucléotides utilisés pour la construction du gène synhétique
(SEQ_ID N° 1).
- La Figure 2 représente la séquence protéique des peptides E (SEQ.ID N° 2) et ELE (SEQ, ID N° 3). La séquence des oligonucléotides utilisés pour la construction des gènes synthétiques est indiquée en dessous (El ligne 2, E2 ligne 3 pour le peptide E). Les différents oligonucléotides utilisés sont symbolisés par des flèches (» et «).
- La Figure 3 représente la structure des vecteurs d'expression pYELl et pYEL45 pour la levure S. cerevisiae.
Le plasmide pYELl dérive du plasmide yMC45 (Francingues-Gaillard, Thèse, 1990) où un fragment de 1786 pb contenant le promoteur et le terminateur de la PGK a été inséré. Le fragment EcoRI-HindIII dérive du plasmide pBR322 et contient le gène de la β-lactamase et une origine de replication pour £ coli (boîte noire).
Le fragment BamHI-EcoRI contient le marqueur URA3 et un sous- fragment du plasmide 2μ. Le fragment HindIII-SalI correspond au promoteur et terminateur PGK. Le fragment SalI-BamHI correspond au gène ntpll placé entre le promoteur et le terminateur de la β-glucosidase. - La Figure 4 montre le profil de radioactivité (Methionine 35S) incorporée dans les protéines des levures. Contrôle : levure ABYS86-C13 contenant le plasmide pYELl ; BZN : levure ABYS86-C13 contenant le plasmide pYEL44 ; BZN-PTS : levure ABYS86-C13 contenant le plasmide pYEL75. - La Figure 5 représente les résultats de stabilité des protéines BZN et BZN- PTS.
- La Figure 6 représente les résultats de stabilité des peptides ELE et ELE-
PTS.
- La Figure 7 représente les plasmides pKM2, pKM127 et pKM129 de l'Exemple 9.
EXEMPLE 1
Construction d'un gène synthétique correspondant à la protéine de 12kDa, intermédiaire de maturation de la protéine 2S, riche en methionine, de la protéine de stockage de la noix du Brésil.
La protéine de stokage de la noix du Brésil (Bertholletia excelsia) présente une composition en methionine et cystéine élevée ( 18% et 13% respectivement). Elle est composée de deux sous unitées (9 et 3kDa) provenant de la maturation d'un précurseur unique. Cette maturation complexe fait intervenir plusieurs étapes; après la synthèse d'un précurseur de 18kDa, le clivage de la séquence signal au cours de la translocation dans le Réticulum Endoplasmique (ER) est effectuée (intermédiaire de 15kDa). La maturation se poursuit par le clivage de l'ATPF et du CTPF (intermédiaire de 12kDa). Ce polypeptide subit une dernière étape de maturation pour donner les deux sous-unités qui sont accumulées dans les "Protéines bodies" dans la graine de la plante.
Un gène synthétique correspondant à l'intermédiaire de 12kDa a été construit. Ce gène synthétique présente; en 5' un site Xhol, une séquence en amont de l'ATG initiateur répondant au consensus des gènes fortements exprimés, l'ATG initiateur, un codon serine pour répondre à la loi du 2«*me acide aminé et en 3' un site BglII pour des facilités de clonage et l'addition de signaux d'adressage. La séquence protéique désirée est présentée en Fig. l . 8
La construction du gène synthétique a été réalisée à l'aide de dix oligonucléotides BZNl à BZNIO, d'une taille allant de 62 à 71 bases, dont la séquence a été choisie en utilisant le biais de codon de S. cerevisiae des protéines fortements exprimées. Les oligonucléotides ont été phosphorylés à l'exception de BZNl et BZN6. Les oligonucléotides, purifiés sur gel de polyacrylamide ont été resuspendus en TE (Tris EDTA) à une concentration de 0.5 μg/ml. Des mélanges d'hybridation contenant 10 μl de chaque oligonucléotide complémentaire ont été chauffés 5 min. à 85°C, puis refroidis à 37βC et stockés à -20°C avant utilisation. Ses mélanges correspondent à I (BZNl + BZNIO), Il (BZN2 + BZN9), III (BZN3 + BZN8), IV (BZN4 + BZN7), V (BZN5 + BZN6) (Fig. 1). Les mélanges d'hybridation (0.5 μl) ont été ligués, une heure à température ambiante, successivement selon le protocole suivant:
Ie) Ligation I avec II (0.5 μl de I, 0.5 μl de II dans un volume final de 25 μl).
2") Ligation IV avec V (0.5 μl de IV, 0.5 μl de V dans un volume final de 25 μl).
3e) ligation (I/II) + (III) + (IV/V) l lμl de la ligation (I/II), l lμl de la ligation (IV/V), 0.5 μl de III dans un volume final de 47μl.
Le mélange de ligation (I/II) + (III) + (IV/V) est ensuite clone dans un vecteur KS+ 10 (plasmide dérivant du vecteur bluescript KS+, STRATAGENE, où un adaptateur BglII de séquence GGAAGATCTTCC a été introduit au site Hindll) ouvert par les enzymes XhoJ et BglII pour donner le plasmide KS+17. Des transformants de la souche DH5α ont été obtenus par éléctroporation et sélection sur milieu LB ampiciline (lOOμg/ml). Les clones contenant la construction désirée ont été identifiés par PCR en utilisant le couple d'oligonucléotides BZNl/ BZN6 qui permettent l'amplification d'une bande de 339bp. Les produit d'amplification ont été analysé sur gel de polyacrylamide. Le vecteur final KS+17 contenant le gène synthétique a été séquence par la méthode de Sanger sur les deux brins en utilisant comme amorce les oligonucléotides T3 et T7 du bluescript. EXEMPLE 2
Construction d'un gène synthétique codant pour un peptide riche en méthonine.
Un gène synthétique codant pour un peptide de 58 acides aminés, riche en acides aminés essentiels et principalement en méthonine a été construit. Ce gène synthétique présente: en 5' un site Xhol, une séquence en amont de l'ATG initiateur répondant au consensus des gènes fortement exprimés, l'ATG initiateur, un codon serine pour répondre à la loi du 2ème acide aminé et en 3' un site BglII pour des facilités de clonage et l'addition de signaux d'adressage. La séquence protéique est présentée en Figure 2.
La construction du gène synthétique a été réalisée en deux étapes à l'aide d Oligonucléotides dont la séquence a été choisie en utilisant le biais de codon de S. cerevisiae des protéines fortement exprimées. La première étape a permis la construction du peptide E, à l'aide des oligonucléotides El et E2, 81 bases. Puis les deux oligonucléotides El et E2 ont été purifiés sur gel de polyacrylamide et resuspendus en TE (Tris EDTA) à une concentration de 0.5 μg/μl, puis hybrides. Pour cela, les oligonucléotides ont été chauffés 5 min. à 85°C, puis refroidis à 37°C et stockés à -20°C avant utilisation. Les oligonucléotides ainsi hybrides (0.5 μl) ont été clones dans le vecteur KS+ 10 ouvert par les enzymes -Xhol et BglII pour donner le plasmide pE Ce vecteur a été séquence par la méthode de Sanger sur les deux brins en utilislant comme amorce les oligonucléotides T3 et T7 du bluescript. La deuxième étape a permis la construction d'une séquence d'ADN correspondant à un homodimère ELE. Le fragment d'ADN correspondant au peptide E a été ligué à l'adaptateur L L'adaptateur L (BglII-Xhol) a été réalisé par l'hybridation des oligonucléotides Ll (GATCGCTAAGATGAAG) et L2(TCGACTTCATCTTAGC). Les différentes formes obtenues (E, LEL, ELE, LELEL) ont été séparées sur gel de polyacrylamide. La bande correspondant à ELE a été éluée puis clonée dans le vecteur KS+ 10 ouvert par les enzymes Xhol et BglII pour donner le plasmide pELE. Des transformants de la souche DH5α ont été obtenus par électroporation et sélection sur milieu LB ampicilline ( lOOμg/ml). Les clones blancs sur LB ampicilline Xgal ont été analysés par restriction avec les enzymes Xhol et BglII. Les clones présentant la bande de 177pb attendue ont été contrôlés par séquence.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26] EXEMPLE 3
Construction des vecteurs d'expression.
A) Vecteurs de base.
Les vecteurs de base pYELl, pYEL45 et pYEL107 sont des vecteurs navette £ coli - S. cetevisia , réplicatifs, de type deux micron (Fig.3).
Le vecteur pYELl contient;
A- La région ColEl permettant la replication et le gène bla permettant la sélection avec l'ampiciline dans £ coli
B- La région ORI et STB du plasmide 2 micron permettant la replication chez la levure S. cerevisia .
C- une région de 2Kb contenant le gène URA3 permettant la sélection des transformants par complémentation de l'auxotrophie ura-.
I La région correspondant au promoteur et terminateur PGK avec les sites uniques .Xhol et BglII pour le clonage des régions codantes que l'on veut exprimer.
Le vecteur pYELl résulte de l'insertion d'un fragment de 1786pb contenant les caractéristiques (D) dans le vecteur yMC45 (Francingues- gaillard, thèse 1990) contenant les caractéristiques (A, B, C). Un site Xhol a. été créé en amont de l'ATG du gène PGK, un site BglII a été créé en amont du stop TAA de telle manière à permettre une fusion optimale des séquences à exprimer avec les séquences promotrice et terminatrice du gène PGK.
Le vecteur pYEL45 contient en plus:
E- Une région de 1.8 kb qui contient le gène nptll placé sous le contrôle du promoteur et terminateur de la β-glucosidase de K. fragilis conférant la résistante au G418 à la levure transformée (A. Raynal et coll., 1987). Cette cassette de résistance a été réalisée selon les étapes suivantes: Un fragment HinDIII-AsuII de 1250bp contenant le gène nptll (castilho et coll., 1984) est introduit dans le vecteur KS+10 ouvert par les enzymes HinDIII et Clal. Le vecteur résultant pYEL35 a été utilisé pour réaliser une mutagénèse par PCR. Un site BamHl a été introduit devant l'ATG initiateur grâce à l'oligonucleotide mutagène (GATGGATCCGCATGATTGAACAAGATGGA). Le fragment modifié a été clone au site HindII du vecteur KS+10 pour donner le vecteur pYEL38. Le fragment BamHI- BglII du plasmide pYEL38 contenant le gène nptll a été ensuite inséré au site BamHI du plasmid yBG47 (Francingues-gaillard, thèse 1990) entre le promoteur et terminateur du gène de la β-glucosidase. Cette cassette d'expression ( fragment Sall-Sphl traité à la Klenow) a été ensuite introduit au site BamHI (traité à la Klenow) du plasmide pYELl.
Le vecteur pYEL107 dérive du vecteur pYEL45 où les sites BglII situés dans le promoteur du gène de la β-glucosidase ont été modifiés par PCR pour conserver un site unique BglII dans le vecteur.
B) Vecteurs d'expression du gène synthétique BZN.
Le vecteur pYEL44 contient le gène synthétique BZN isolé du plasmide KS- 17 (fragment XhoI-BglII) inséré aux sites correspondants-dû vecteur pYELl .
Le vecteur pYEL93 a été construit par échange du fragment Xhol-Sall du plasmide pYEL45 avec le fragment Xhol-Sall du plasmide pYEL44 contenant le gène synthétique BZN et le terminateur PGK.
B) Vecteurs d'expression du gène ELE
Le vecteur pYEL34 contient le gène synthétique ELE isolé du plasmide pELE (fragment XhoI-BglII) inséré aux sites correspondant du vecteur pYELl .
Le vecteur pYEL127 a été construit par échange du fragment Bgll-Bglll du plasmide pYEL34 avec le fragment Bgll-Bglll du plasmide pYEL107. EXEMPLE 4
Adressage de peptides/protéines dans les péroxysomes, vecteurs d'expression et d'adressage.
Pour diriger les peptides/protéines dans les péroxysomes, nous avons utilisé la séquence PTS de la protéine luciférase (Gould et coll., 1988, J. Cell. Biol. 107:897-905). Pour cela nous avons utilisé un adapteur composé de deux oligonucléotides PTScl et PTSc2 de séquence;
PTScl GATCAAGGCTAAGAAGGGTGGTAAGTCTAAGTTGTAAT
PTSc2 GATCATTA ^CTTAGACTTAC(^CCCrTCITAGCCπ
qui code pour la séquence protéique KAKKGGKSKL constituant la séquence PTS, séquence minimale connue pour diriger des protéines dans les péroxysomes. Cet adapteur a été introduit au site BglII dans les vecteurs d'expression pYEL44 et ρYEL127.
A. Plasmides d'adressage de la protéine BZN
L'adapteur, réalisé par hybridation des oligonucléotides PTScl et PTSc2 a été introduit dans le vecteur pYEL44 ouvert par l'enzyme BglII. La ligation a été effectuée en présence de l'enzyme BglII afin d'enrichir en vecteur ayant incorporé l'adapteur. Les transformants d1 £ coli ont été testés par PCR en utilisant les couples PTScl/PGKter et PTSc2/PGKter afin de déterminer l'orientation (PGKter est un oligonucléotide correspondant à la région 3' du gène PGK en aval du TAA). Le vecteur présentant l'orientation désirée, appelé pYEL75, qui contient le gène codant pour la protéine BZN-PTS, a été vérifié par séquencage.
Le vecteur pYEL108 contient la région codant pour la protéine BZN-PTS isolé du plasmide pYEL75 (fragment Xhol-Sall) inséré aux sites correspondants du vecteur pYEL45. B. Plasmides d'adressage du peptide ELE
L'insertion de l'adapteur a été réalisée, comme précédemment, dans le vecteur pYEL127. Le vecteur présentant l'orientation désirée a été vérifié par séquencage et appelé pYEL129. Ce vecteur code pour le peptide ELE- PTS.
EXEMPLE 5
Expression et stabilisation de la protéine BZN.
La souche de levure ABYS86-C13 (Mata pral prbl prcl cpsl ura3 leu2 his3, Schuller et Entian,1988, Gène, 67:247-257) a été transformée par la méthode de Dohmen et coll. (Dohmen et coll., 1991 , Yeast, 7:691-692) avec les plasmides pYELl (vecteur de contrôle), pYEL44 (portant le gène BZN) et pYEL75 (portant le gène BZN-PTS) et les transformants ont été sélectionnés pour la complémentation de l'auxotrophie Ura-.
Pour étudier l'expression et la stabilité des peptides produits, des cultures en phase exponentielle en milieu minimum YNBG (Yeast Nitrogene Base 6.7g/l; Glucose 20g/l) supplémenté en histidine et en leucine ont été centrifugées et resuspendues à une concentration cellulaire de 5 unités (DO600). Les cellules ont été marquées 5 minutes en présence de 50 μcu/ml de [S35] Methionine suivie d'une chasse par de la methionine froide, des prélèvements de 200μl sont réalisés aux temps suivants (T=0, T=20, T=40, T=80 et T«120 min.). Après centrifugation les cellules sont resuspendues dans 20μl de tampon de charge. Après incubation lOmn à 95°c, les protéines de levure sont séparées par éléctrophorése sur gel de polyacrylamide en tampon Tricine-SDS-PAGE Les profils protéiques sont ensuite analysés après coloration au bleu de coomassie et après autoradiographie. Nous observons sur gel acrylamide après coloration au bleu de coomassie la présence d'une protéine dans les extraits cellulaires des souches transformées par les plasmides pYEL44 et pYEL75 dont la taille correspond à celle attendue pour la protéine BZN (pYEL44) et pour la protéine BZN-PTS (pYEL75). Ces protéines ne sont pas observées dans l'extrait cellulaire de la souche transformée par le plasmide pYELl.
Le niveau d'expression a été estimé selon le protocole suivant: après un marquage de 5 min. en présence de 50 μcu/ml de [S35] Methionine, analyse des protéines sur gel et séchage du gel d'acrylamide, la radioactivité est mesurée à l'aide d'un compteur Beckman LS6000IC pendant 1 ou 2 minutes. Les profils de radioactivité présentés en Fig. 4 montrent qu'une faible radioactivité est observable dans la région du marqueur de poids moléculaire de 14.3 kDa (bandes 30 à 35) pour le vecteur contrôle par contre une forte radioactivité est observable pour la souche contenant le plasmide pYEL44 et la souche contenant le plasmide pYEL75 (Fig.4). La radioactivité dans la bande correspondant à la BZN et à la BZN-PTS représente environ 15% de la radioactivité totale. Ceci indique que la protéine BZN et la protéine BZN-PTS représente 1.5% des protéines synthétisées. Cette estimation est basée sur un peptide contenant 20% de methionine et les protéines de levure 1.4% de methionine.
La stabilité des protéine BZN et BZN-PTS a été estimée par mesure de densité de l'autoradiogramme en utilisant le densitometre GS300 (HOEFFER). Pour chaque temps de chasse (T=0, 20, 40, 80, 120mn) la surface des pics correspondant à la protéine BZN et à la protéine BZN-PTS a été déterminée et définie les unités arbitraires correspondant à la quantité de ces protéines marquées. Les résultats présentés dans la Fig.5 montre que la protéine BZN présente une demie-vie de 20 min. alors qu'une demie-vie de 140 min. est obtenue pour la protéine BZN-PTS. EXEMPLE 6
Expression et stabilisation du peptide Ei.B-
La souche de levure ABYS86-C13 (Mata pral prbl prcl cpsl ura3 leu2 his3, Schϋller et Entian,1988, Gène, 67:247-257) a été transformée avec les plasmides pYELl (vecteur de contrôle), pYEL127 (portant le gène ELE) et pYEL129 (portant le gène ELE-PTS) et les transformants ont été sélectionnés pour la complémentation de l'auxotrophie Ura-.
Nous observons sur gel acrylamide après coloration au bleu de coomassie la présence d'une protéine dans les extraits cellulaires des souches transformées par les plasmides pYEL127 et pYEL129 dont la taille correspond à celle attendue pour la protéine ELE (pYEL127) et pour la protéine ELE-PTS (pYEL129). Ces protéines ne sont pas observées dans l'extrait cellulaire de la souche transformée par le plasmide pYELl.
Le niveau d'expression a été estimé comme pour l'exemple 5. La radioactivité dans les bandes correspondant au peptide ELE et au peptide ELE-PTS représente environ 15% de la radioactivité totale incorporée dans les protéine de levure. Ceci indique que ces peptides représentent 1.5% des protéines synthétisées.
La stabilité des peptides ELE et ELE-PTS (Fig.6) a été estimée par mesure de la radioactivité incorporée dans les peptides aux temps t≈O, 5, 10, 20, 40mn et représentée en pourcentage par rapport à la methionine incorporée dans les peptides au temps T≈O mn.
Le peptide ELE présente une demie vie de 11min. alors qu'une demie vie de
90 min. est observée pour le peptide ELE-PTS.
EXEMPLE 7
Enrichissement en methionine de la levure ELYM8
La souche de levure ELYM8 ( souche de levure prototrophe, surproductrice de lysine) a été transformée par la méthode de Dohmen et coll. (Dohmen et coll., 1991, Yeast, 7:691-692) avec les plasmides pYEL45 (vecteur de contrôle). pYEL93 (ponant le gène BZN) et pYELlOδ (ponant le gène BZN-PTS) et les transformants ont été sélectionnés pour la résistance au G418 sur milieu riche YPD (extrait de levure, 10g/l; bactopeptone, 10g/l; glucose 20g/l) additionné de 200 μg/ml de G418.
Les niveaux d'expression ont été estimés selon le protocole décrit précédemment. Les levures transformées ont été cultivée en milieu riche YPD additionné de G418 (150μg/ml ) jusqu'à une concentration cellulaire comprise entre 4 et 5 unités (DO600). Ces précultures ont été utilisées pour ensemencer des cultures en YPD à une concentration cellulaire de 0.5 unité DO600. Après 3 heures d'incubation les cellules ont été collectées par centrifugation, lavées deux fois en milieu minimum YNB, puis marquées en milieu YNB pendant 5 minutes en présence de 50 μcu/ml de [S35] Methionine. Les protéines de levure sont analysées sur gel d'acrylamide après coloration au bleu de coomassie. Après séchage du gel d'acrylamide, la radioactivité incorporée dans les protéines totales et dans la noix du Brésil est mesurée. La radioactivité dans les fragments correspondants à la BZN et à la BZN-PTS représente environ 30 et 40% de la radioactivité totale respectivement. Ceci indique que la protéine BZN et la protéine BZN-PTS représente respectivement 4 et 5% des protéines synthétisées.
Pour mesurer le niveau d'accumulation des protéines BZN et BZN-PTS en milieu riche et l'enrichissement en methionine de la levure, des précultures des transformants ont été réalisées en milieu riche YPD additionné de G418 ( 150μg/ml ) jusqu'à une concentration cellulaire comprise entre 1 et 3 unités (DO600). Ces précultures ont été utilisées pour ensemencer des cultures en YPD à une concentration cellulaire initiale de
L CEM N (RÈ L 26) 0.15 unité DO600. Des prélèvements ont été réalisés aux temps T=0, T=16, T=24 et T-40 heures après inoculation. L'accumulation des protéines au cours de la croissance est analysée par gel d'éléctrophorèse TRICINE-SDS-PAGE suivie d'une coloration au bleu de coomassie
Nous observons sur gel acrylamide après coloration au bleu de coomassie la présence d'une protéine dans les extraits cellulaires des souches transformées par les plasmides pYEL93 et pYELlOδ dont la taille correspond à celle attendue pour la protéine BZN (pYEL93) et pour la protéine BZN-PTS (pYELlOδ) aussi bien en phase exponentielle ( lôheures) qu'en phase stationnaire. Cependant le niveau d'accumulation de la protéine BZN-PTS est nettement supérieure en phase stationnaire que le niveau d'accumulation observé pour la protéine BZN au même temps. Ces protéines ne sont pas observées dans l'extrait cellulaire de la souche transformée par le plasmide pYEL45.
L'analyse du contenu en acides aminés libres et totaux de la levure est réalisée à l'aide de l'analyseur d'acides aminés Beckman System 6300. La composition totale en acides aminés des levures transformées a été déterminée après hydrolyse acide. Préalablement, la methionine a été transformée en methionine sulfone par oxydation à l'acide performique . La composition en acides aminés libres des levures transformées a été déterminée après incubation à 100°c pendant lOmn d'une suspension cellulaire correspondante. Les valeurs obtenues aux temps T- 40 heures sont présentées dans la Table 1. Une augmentation significative de 30% en methionine total est obtenue pour la souche contenant le plasmide pYELlOδ codant pour la protéine BZN-PTS. Cette augmentation en methionine total n'affecte par l'accumulation de lysine, 6.9 et 6.8 % respectivement.
Tableau 1 : Enrichissement en Methionine.
Pourcentage
Plasmides Protéine Méthonine Lysine d'augmen¬ libre Total totale tation
PYEL 45 - 0,70 0,02 7 -
PYEL 93 BZN 0,78 0,05 6,9 10%
PYEL 108 BZN-PTS 0,94 0,08 6,9 35%
EXEMPLE 8
Localisation de la protéine BZN-PTS dans les péroxysomes.
La souche de levure ELYM8 contenant le plasmide pYEL 108 (ponant le gène codant pour la protéine BZN-PTS) a été cultivée en milieu YPD en présence de G418 150 μg/ml. L'équivalent d'environ 2000 unités de cellules (2000 unité- DO600) ont été collectées par centrifugation à 3200 RPM pendant 5 minutes, puis lavée deux fois avec 25 ml de tampon SP (Tampon de sphéroplatisation; 50mM tampon phosphate de potassium, pH 7.5; 1M sorbitol).
Aux cellules resuspendues dans 10 ml de tampon SP, est ajouté 10 μl de β- Mercapto-ethanol et 20 μl de ZYMOIIASE 100 (200 mg/ml). Après 25 minutes d'incubation à 30°C, les sphéroplastes sont collectés par centrifugation à 4000 RPM pendant 8 minutes. Les sphéroplastes, fraction appelé (SPHERO) sont resuspendus dans 4 ml de tampon MES (en présence d'inhibiteur de protéase ; Aprotinine, PMSF et PEFABLOCK).
Après cassage des cellules au poter, les gros débris et les cellules non cassées sont éliminés par centrifugation à 1000 g pendant 10 minutes. Les fractions subcellulaires sont alors séparées par centrifugation à 20 000 g. Nous avons analysé le profil protéique des différentes fractions cellulaires obtenues après ultracentrifugation, sur gel acrylamide utilisé précédemment dans l'exemple 5. Les fractions cellulaires suivantes ont été étudiées: le surnageant noté (20kg-SN) correspondant au cytoplasme et le culot qui contient les mitochondries et les péroxysomes repris dans du tampon MES (noté 20 kg-P). La protéine BZN-PTS est observée uniquement dans la fraction 20 kg-P. La protéine BZN-PTS n'est pas accumulée dans le cytoplasme sous forfne soluble (absence de bande de 14 kDa dans la fraction cytoplasmique, 20 kg-SN).
L'étude de la localisation de la protéine BZN-PTS a été poursuivie. Pour cela, la fraction 20Kg-P contenant la protéine BZN-PTS a été analysée sur gradient discontinu de NYCODENZ réalisé par addition de solution de Nycodenz en tampon MES;
1 ml d'une solution à 50%
1,4 ml 35%
5 ml 25%
2,2 ml 17%
Puis 400 μl de la fraction 20 Kg-P est déposé sur le gradient et centrifugé à 135 Kg pendant 1 heure à 4°C. Après centrifugation le gradient est récupéré en 31 fractions d'environ 250 μl. La concentration protéique de chaque fraction est déterminée par la méthode de Bradford et les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE ( 15 %) puis visualisées par coloration au bleu de coomassie .
La protéine BZN-PTS est majoritairement localisée dans les fractions 3 à 1 1 correspondant aux péroxysomes. Une fraction de la protéine BZN-PTS est observable dans la fraction 1 correspondant probablement à une faible ponion de la protéine BZN-PTS localisée dans le cytoplasme sous forme d'agrégats. EXEMPLE 9
Expression et stabilisation du peptide FI E chez les levures du genre Kluyveromyces
Souche
On a utilisé la levure Kluyveromyces marxianus. A partir de la souche ATCC 12424, homothallique diploïde, des mutants ura3" ont été isolés. Dans le présent exemple, le mutant FI 47 a été utilisé pour toutes les transformations.
Vecteurs d'adressage
Dans un premier temps, la séquence ARS2, isolée à partir d'une banque de la souche ATCC 12424 et portée par un fragment Kpnl/Clal a été clonée au site Aatll du plasmide pRS306 (SIKORSKI R.S. et HIETER P. (1989).
Ce plasmide porte des séquences £ coli (Ori et gène Bla de pBR322), le gène URA3 de S. cerevisiae , ainsi que le multisite de clonage des vecteurs de Bluescript. Le plasmide résultant est nommé pKM2. L'origine de replication ARS2 est efficace à la fois chez Kluyveromyces marxianus et Kluyveromyces lactis.
A partir des plasmides pYEL127 et pYEL129 précédemment décrits, deux fragments HindIII/Xbal ont été isolés et purifiés. Ces fragments portent les séquences ELE ( 127) et ELE-PTS (129) sous contrôle du promoteur et du terminateur du gène PGK de S. cerevisiae. Ces blocs d'expression ont été clones dans le vecteur pKM2 ouvert par HindIII et Xbal. On a ainsi obtenu les plasmides pKM127 et pKM129 pouvant être transférés chez K. marxian us pour étudier l'expression et la stabilité des peptides correspondants ELE et ELE-PTS. Expression et stabilité
La souche FI 47 de K. marxianus a été transformée avec les plasmides pKM127 et pKM129 en utilisant la technique développée par Iborra (1993) permettant d'obtenir un taux de transformation élevé, et les transformants ont été sélectionnés comme colonies URA3.
On a procédé comme précédemment avec S. cerevisiae à des marquages courts in vivo avec de la methionine S35, suivis d'une chasse utilisant de la methionine non marquée pour étudier la stabilité des peptides produits.
Des extraits cellulaires ont été analysés après 8 minutes de marquage (TO) puis 5, 10, 20, 40 et 60 minutes de chasse (T5, T10, T20, T40, T60). Après séparation sur gel d'acrylamide, traitement des gels et autoradiographie, on peut observer : - Pour les extraits de levure transformée par pKM127, une bande à la taille attendue (6,5 kDa/ELE) à T0 qui est pratiquement absente après 5 minutes de chasse (T5), indiquant une demi-vie inférieure ou égale à
5 minutes pour le peptide ELE ;
Pour les extraits de levure transformée par pKM129, une bande sépcifique à 6,7 kDa, (ELE-PTS) dont l'intensité ne diminue que peu ou pas après 20 minutes de chasse, permettant d'attribuer au peptide ELE- PTS une demi-vie égale ou supérieure à 20 minutes.
Ces résultats montrent clairement comme chez 5. cerevisiae que l'addition de la séquence PTS, signal d'adressage dans les peroxisomes, au peptide ELE conduit chez K. marxianus à une stabilisation du produit d'expression.
FEUILLE DE REFERENCES BIBLIOGRAPHIQjUES
(I) CAREY, N.H., DOEL, M.T., EATON, M., COOK, E.A., LEWIS, H. and PATEL, T., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4575-4592 (2) COUSENS, L.S., SHUSTER, J.R., GALLEGOS, O., KU, L, STEMPLEN, M.M., URDEA, M.S., SANCHEZ-PESCADOR, R., TAYLOR, A., TEKAMP-OLSON,
Figure imgf000024_0001
(3 ) CORAGGIO, L, MARTEGANI, E, COMPAGNO, C, PORRO, D., ALBERGHINA, L, BERNARD, L, FAORO, F., VIOTTI, A., (1988) European J. of Cell. Biol., 47:165-172
(4) DOHMEN, R., STRASSER, A., HÔNER, C, HOLLENBERG, C, (1991) Yeast 7:691-692
(5) FERRARI, F.A., RICHARDSON, C, CHAMBERS, S., CAUSEY, S.C. and POLLOCK, T.S., (1986) Patent application WO 88/03533 (6) FRANCINGUES-GAILLARD pHD (Thesis (1990)
(7) GOULD, S.J., KELLER, G.A., SUBRAMANI, S., (1987) J. Cell. Biol. 105:2923-2931
(8) GOULD, S., KELLER, G.A., SUBRAMANI, S., (1988) J. Cell. Biol. 107:897- 905 (9) IBORA, F., (1993)
(10) KURODA, S., OTAKA, S., MIYASAKI, T., NAKAO, M., FUJISAWA, Y., (1992) J. Biol. Chem. 267:1953-1961
(I I) RAYNAL, A., GERBAUD, C, FRANCINGUES, M., GUERINEAU, M., (1987) Curr Genêt 12:175-184 (12) SABIN, E.A., LEE, N.G., C.T., SHUSTER, J.R., and BARR, P.J., ( 1989) Bio/Technology. 7, 705-709
(13) SCHUTLER, H.J., and ENTIAN, K.D., (1988) Gène 67:247-267
(14) SHEN, S., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4627-4631
(15) SILORSKI, R.S., and HETER, P., (1989) Genetics 122:19-27.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de stabilisation d'un peptide ou d'une protéine non péroxysomale instable chez une levure ou toxique pour la dite levure et obtenue par expression dans la dite levure d'une séquence d'ADN hétérologue caractérisée en ce que ledit peptide ou la dite protéine est exprimée avec une séquence d'adressage dans les péroxysomes de façon à stabiliser ou détoxifier le peptide ou la protéine dans les péroxysomes de la dite levure.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'ADN hétérologue codant pour le peptide ou la protéine est d'origine synthétique ou ne provient pas d'une levure.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est choisie parmi les séquences d'adressage de type I.
4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est choisie parmi : Ser-Lys-Leu Ser/Ala Cys-Lys/Arg/His-Leu.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est de type II.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la séquence d'adressage est celle de la thiolase chez S. Cerevisae.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la protéine en cause est la protéine 2S de la protéine de stockage de la noix du Brésil.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la séquence d'ADN hétérologue et la séquence codable pour la protéine de 12KDa intermédiaire de maturation de la protéine 2S.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la protéine en cause est choisie parmi :
* la protéine E et ses polymères et,
* la protéine ELE et ses polymères.
10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisé en ce que la souche de levure est une souche de Saccharomyces ou de Kluyveromyces.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la souche de levure est une souche de Saccharomyces cerevisae ou de Kluyveromyces marxianus.
12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que la souche est choisie parmi ELY M8 et les souches obtenues par croisement.
13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que la souche est ELY S3 ou une souche obtenue par croisement entre ELY M8 et une souche de boulangerie.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'on sépare les péroxysomes de la souche de levure et on purifie les peptides ou les protéines accumulés dans les péroxysomes.
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'on prévoit un site de clivage de protéine entre le peptide ou la protéine et la séquence d'adressage.
16. Souche de levure obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 15.
17. Peptide ou protéine obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 15.
18. Souche de Saccharomyces cerevisae ELY S3 et les souches obtenues par croisement notamment ELY M8.
19. Additif alimentaire contenant une souche selon l'une des revendications 16 et 18.
PCT/FR1994/000438 1993-04-19 1994-04-19 Procede d'adressage de proteines dans les peroxysomes de levures WO1994024289A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU66810/94A AU6681094A (en) 1993-04-19 1994-04-19 Method for addressing proteins in yeast peroxisomes

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR93/04583 1993-04-19
FR9304583A FR2704237B1 (fr) 1993-04-19 1993-04-19 Procede d'adressage dans les levures.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994024289A1 true WO1994024289A1 (fr) 1994-10-27

Family

ID=9446197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1994/000438 WO1994024289A1 (fr) 1993-04-19 1994-04-19 Procede d'adressage de proteines dans les peroxysomes de levures

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU6681094A (fr)
FR (1) FR2704237B1 (fr)
WO (1) WO1994024289A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999035278A1 (fr) * 1998-01-05 1999-07-15 Monsanto Company Biosynthese de polyhydroxyalcanoates a longueur de chaine moyenne
WO2000071579A2 (fr) * 1999-05-21 2000-11-30 Dsm N.V. Regulation de l'organite de l'homeostasie dans une production de cellule
EP1741721A1 (fr) * 2005-07-07 2007-01-10 DSM IP Assets B.V. Procédé de production de substances dans des cellules eucaryotes
WO2021204338A1 (fr) 2020-04-08 2021-10-14 Københavns Universitet Production de composés dérivés du géranyl diphosphate

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989003887A1 (fr) * 1987-10-20 1989-05-05 Plant Genetic Systems N.V. Procede de production de peptides biologiquement actifs par l'expression de genes de proteines de graines de stockage modifies, dans des plantes transgeniques
DD294279A5 (de) * 1990-05-09 1991-09-26 Zi Fuer Genetik Und Kulturpflanzenforschung Der Adw,De Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989003887A1 (fr) * 1987-10-20 1989-05-05 Plant Genetic Systems N.V. Procede de production de peptides biologiquement actifs par l'expression de genes de proteines de graines de stockage modifies, dans des plantes transgeniques
DD294279A5 (de) * 1990-05-09 1991-09-26 Zi Fuer Genetik Und Kulturpflanzenforschung Der Adw,De Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. DISTEL ET AL: "The carboxyl-terminal tripeptide serine-Lysine-Leucine of firefly luciferase is necessary but not sufficient for peroxisomal import in yeast", THE NEW BIOLOGIST, vol. 4, no. 2, February 1992 (1992-02-01), pages 157 - 165 *
DATABASE WPI Section Ch Week 9209, 26 September 1991 Derwent World Patents Index; Class B04, AN 92-065659, "Accumulate protein vacuole yeast attach vacuole transport signal sequence structure gene express plasmid" *
S.J. GOULD ET AL: "A conserved tripeptide sorts proteins to peroxisomes", THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 108, no. 5, May 1989 (1989-05-01), pages 1657 - 1664 *
SURESH SUBRAMANI: "Mechanisms of transport of proteins into microbodies", NEW COMPREHENSIVE BIOCHEMISTRY, vol. 22, 1992, pages 221 - 229 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999035278A1 (fr) * 1998-01-05 1999-07-15 Monsanto Company Biosynthese de polyhydroxyalcanoates a longueur de chaine moyenne
WO2000071579A2 (fr) * 1999-05-21 2000-11-30 Dsm N.V. Regulation de l'organite de l'homeostasie dans une production de cellule
WO2000071579A3 (fr) * 1999-05-21 2001-03-01 Dsm Nv Regulation de l'organite de l'homeostasie dans une production de cellule
EP1741721A1 (fr) * 2005-07-07 2007-01-10 DSM IP Assets B.V. Procédé de production de substances dans des cellules eucaryotes
WO2021204338A1 (fr) 2020-04-08 2021-10-14 Københavns Universitet Production de composés dérivés du géranyl diphosphate

Also Published As

Publication number Publication date
FR2704237B1 (fr) 1995-07-13
FR2704237A1 (fr) 1994-10-28
AU6681094A (en) 1994-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dmochowska et al. Yeast KEX1 gene encodes a putative protease with a carboxypeptidase B-like function involved in killer toxin and α-factor precursor processing
US8518668B2 (en) Method for making maturated insulin polypeptides in a fungal cell
FR2646437A1 (fr) Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
IE81016B1 (en) Process for preparing a protein by a fungus transformed by a multicopy integration of an expression vector
JP5850848B2 (ja) ポリペプチドの製造方法
US20160115216A1 (en) Method for Making Mature Insulin Polypeptides
EP1917363A1 (fr) Procede permettant de realiser des polypeptides d'insuline matures
EP0390676B1 (fr) Souche de saccharomyces cerevisiae productrice d'une protéine hétérologue et procédé de préparation de ladite protéine hétérologue par fermentation de ladite souche
WO1991000909A1 (fr) Proteine a activite urate oxydase, gene recombinant codant pour celle-ci, vecteur d'expression, micro-organismes et cellules transformees
WO1994024289A1 (fr) Procede d'adressage de proteines dans les peroxysomes de levures
EP0396436B1 (fr) Souches de levure pour la production de protéines hétérologues matures, en particulier d'hirudine
EP0672150B1 (fr) Levures kluyveromyces modifiees, preparation et utilisation
CN113249241B (zh) 一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用
EP0435776B1 (fr) Promoteur artificiel pour l'expression de protéines dans la levure
FR2700338A1 (fr) Nouvelle séquence pro permettant la secrétion de protéines hétérologues à partir d'une cellule de levure.
WO1996031611A1 (fr) Nouveaux promoteurs pour l'expression de proteines d'interet dans la levure
EP3027752B1 (fr) Séquence signal pour l'expression de protéine dans pichia pastoris
KR970005584B1 (ko) 폴리 펩타이드의 개선된 제조방법
KR100246932B1 (ko) Yap3 유전자가 결손된 신규한 효모균주 및 그를 이용한 재조합 인체 부갑상선호르몬의 생산
JPH06253858A (ja) げっ歯類アポリポプロテインｅを有する融合遺伝子、それを挿入したプラスミドおよびその用途
KR20000059528A (ko) 한세눌라 폴리모르파 유전자 및 이들 유전자가 결핍된 균주

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BG CA FI HU JP KR NO RU UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA