WO1994021659A1 - Novel 2'-methylidenenucleotide compound, process for producing the same, and pharmaceutical use thereof - Google Patents

Novel 2'-methylidenenucleotide compound, process for producing the same, and pharmaceutical use thereof Download PDF

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WO1994021659A1
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salt
compound
cancer
hydrogen
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Akira Matsuda
Takuma Sasaki
Satoshi Shutou
Akihiro Fujii
Takashi Ono
Shinji Sakata
Takanori Miyashita
Original Assignee
Yamasa Corporation
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Definitions

  • the present invention provides a novel 2′-methylidene nucleotide compound and a salt thereof, which has an excellent pile tumor action and is useful as a medicament, a method for producing the compound, a pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient, and treatment of tumor About the method.
  • nucleoside antitumor agents have been widely applied to various tumors in clinical practice, but the following problems have been pointed out.
  • the activity of the antitumor agent is expressed by phosphorylation of the 5'-hydroxyl group, but it is decomposed to an inactive substance by inactivation such as phosphorolysis and deamination.
  • Various problems have been pointed out, such as the susceptibility of the tumor cells to the antitumor agent and the toxicity of the tumor cells to normal cells.
  • An object of the present invention is to solve the above problems and to provide a novel 2′-methylidene nucleotide compound having properties superior to those of known nucleoside antitumor agents, a method for producing the compound, and a pharmaceutical use thereof. .
  • R is hydrogen or halogen
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent an aliphatic acid residue or hydrocarbon residue
  • R 3 and R 4 are the same or different and represent hydrogen, halogen or alkyl .
  • a salt thereof is hydrogen or halogen
  • R, R 3 and R 4 are hydrogen 2 '- main dust Den nucleotide compound;
  • R is fluorine,
  • R 3 and R 4 are hydrogen 2' - methylidene nucleotide compound A 2'-methylidene nucleotide compound wherein R, R 3 and R 4 are hydrogen, R 1 and R 2 are the same fatty acid residue;
  • R is fluorine,
  • R 3 and R 4 are hydrogen, R 1 and R 2 are the same fatty acid residues 2 '- methylidene nucleotide compound;
  • R, R and R 4 are hydrogen, R 1 and R 2 are the same fatty acid residues 1 2-20 carbon atoms 2' - methylidene nucleotide compound A 2′-methylidene nucleotide compound wherein R is fluorine, R 3 and R 4 are hydrogen, R 1 and R 2 are the same fatty acid residue having 12 to 20 carbon atoms, and salts thereof.
  • the present invention provides a method for
  • R 1 and R 2 are as defined above, and R 5 represents a choline residue.
  • R 5 represents a choline residue.
  • R, R 3 and R 4 are as defined above. And a method for producing a 2′-methylidene nucleotide compound represented by the above general formula (I) and a salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a 2′-methylidenenucleotide compound represented by the general formula (I) or a salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier;
  • the present invention relates to a method for treating a tumor, comprising administering an effective amount of the 2′-methylidene nucleotide compound represented by the formula (I) or a salt thereof to a mammal including a human in need of the treatment of the tumor.
  • halogen represented by R, R 3 and R 4 means fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • the fatty acid residues represented by R 1 and R 2 are those having 2 to 30, preferably 10 to 24, and more preferably 12 to 20 carbon atoms, and these are saturated fatty acid residues and unsaturated fatty acids. It may be any of the residues. Specific examples of such fatty acid residues include saturated fatty acid residues such as lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, and icosanoyl; With two unsaturated bonds Fatty acid residues.
  • the hydrocarbon residue represented by R 1 and R 2 has 2 to 30 carbon atoms, preferably 10 to 24 carbon atoms, and more preferably 12 to 20 carbon atoms, and these are saturated hydrocarbons. Residue or unsaturated hydrocarbon residue. Specific examples of such hydrocarbon residues include saturated hydrocarbon residues such as lauryl, myristyl, palmityl, stearyl, and icosanyl; and 1 to 4 such as palmitooleyl, oleyl, linoleyl, linolenyl, and arachidonyl. And an unsaturated hydrocarbon residue having an unsaturated bond.
  • the alkyl represented by R 3 and R 4 means alkyl having 1 to 5 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopyl pill, butyl, and pentyl.
  • the 2′-methylidene nucleotide compounds of the present invention may exist as salts or hydrates having excellent properties.
  • Such salts include, for example, an acid addition salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid or an organic acid such as fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, citric acid, methanesulfonic acid, sodium And metal salts with metals such as potassium, potassium, and calcium, and ammonium salts.
  • the salt is used in a pharmaceutical composition, it is preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • the hydrate include those in which 0.1 to 3 molecules of water are hydrated per 1 molecule of the 2′-methylidene nucleotide compound of the present invention or a salt thereof. Further, isomers are also included in the present invention.
  • R 3 and R 4 are the same and are hydrogen or fluorine
  • R 3 is hydrogen and R 4 is fluorine
  • R 3 is fluorine and R 4 is hydrogen
  • R 1 and R 2 are fatty acid residues
  • R 1 and R 2 are the same saturated fatty acid residue; 8 R 1 and R 2 are the same unsaturated fatty acid residue;
  • R 1 and R 2 are hydrocarbon residues
  • R 1 and R 2 are the same saturated hydrocarbon residue
  • R 1 and R 2 are the same unsaturated hydrocarbon residue
  • the 2′-methylidene nucleotide compound of the present invention can be produced, for example, by the method shown in the following reaction scheme.
  • R, R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are as defined above, and R 5 represents a choline residue.
  • the 2, -methylidene nucleotide compound of the present invention is represented by the general formula (III) and the phospholipid represented by the general formula (II) in the presence of phospholipase D, where necessary, in the presence of a metal ion.
  • Examples of the phospholipid used in the present method include phosphatidylcholine having R 1 and R 2 (for example, 1,2-diacyl-sn-glycerol 3-phosphocholine, 1,2-dialkyl-1-sn-glycerol 3-). phosphocholine, 1, 2-di Arukeniru s n Gurisero 3- phosphocholine, etc.) and the like.
  • Such phosphatidylcholines are commercially available from reagent manufacturers and are used in this method. Can be used.
  • R 1 and R 2 are fatty acid residues
  • natural phosphatidylcholine represented by a radil (R ady 1) group which is a mixture of long-chain fatty acids having 12 to 20 carbon atoms may be used. .
  • the nucleoside used in the present method is represented by the above general formula (ill), and is preferably 2'-dexoxy-2'-methylidene cytidine ( ⁇ — ⁇ —031067, EP—).
  • Examples of the phospholipase D used in the present method include phospholipase D—P derived from Streptomyces sp. AA586 (Streptomyces sp. AA586; FER P-6100) belonging to the genus Streptomyces. No. 8-1524881, which is commercially available from Asahi Kasei Corporation).
  • the amount of phospholipase D used per mg of phosphatidylcholine is at least 0.01 unit (unit: U), preferably 0.1 to 100 units.
  • Examples of the solvent used in the present method include organic solvents such as ether, benzene, and chloroform, and an organic solvent layer—aqueous layer of a buffer having a pH of 3 to 9 (preferably a buffer having a pH of 4 to 6). And the like.
  • metal ions may be allowed to coexist in the reaction solution for the purpose of accelerating the enzymatic reaction.
  • water-soluble salts for forming metal ions calcium chloride or the like is usually used.
  • the reaction temperature is usually from 20 to 60 ° C, and the reaction time is from 30 minutes to 50 hours.
  • the 2′-methylidene nucleotide compound of the present invention thus obtained can be purified by a liquid separation method, silica gel chromatography, or the like.
  • salt and hydrate of the 2′-methylidene nucleotide compound of the present invention can be produced and purified by a means known per se.
  • the 2′-methylidene nucleotide compound and the salt thereof of the present invention have an excellent antitumor effect on mammals (for example, human, mouse, rat, rabbit, dog, cat, etc.). In addition, it is extremely useful as an antitumor agent because of its increased bioavailability and low toxicity.
  • the 2′-methylidene nucleotide compound of the present invention and a salt thereof are used for mouse tumors such as L1210 leukemia cell, P388 leukemia cell, M5076 sarcoma, B16 mouse melanoma, Louis lung cancer, Colon 26 colon cancer; CEM acute T-cell leukemia , U937 human tissue acute leukemia, M0LT4 acute T-cell leukemia, K562 chronic myeloid leukemia, SK-Mel-28 melanoma, T24 bladder cancer, ⁇ 2 esophageal adenocarcinoma, SW colon adenocarcinoma, KB epidermoid carcinoma, Lu-65 lung Large cell carcinoma, PC13 lung large cell carcinoma, PC14 lung adenocarcinoma, ⁇ 0 ⁇ [cultured human tumor cells such as gastric cancer; or SK-Mel-28 melanoma transplanted into nude mice, LX-1 lung cancer, Lull6 lung cancer,
  • gynecological cancer uterine cancer, ovarian cancer, etc.
  • urological cancer kidney cancer, bladder cancer, etc.
  • leukemia melanoma
  • lymphophilic metastatic tumor etc.
  • the 2′-methylidene nucleotide compounds and salts thereof of the present invention have high lipophilicity, so they stay in the living body for a long time to maintain their activity, and furthermore, have inactive activities such as deamination, phosphorolysis, and reduction. It is less susceptible to metabolism, has a high affinity for biological membranes, and has the advantage of producing intracellular 5'-monophosphates of antitumor nucleosides without the involvement of kinases. That is, the 2′-methylidene nucleotide compound and the salt thereof of the present invention have effects such as sustained and enhanced activity.
  • the amount of the active ingredient is usually mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent, etc. to obtain a powder or granule. Tablets, dragees, capsules, capsules, syrups, suppositories, external preparations, injections, infusions, etc., but oral preparations are preferred.
  • the dosage may vary depending on the disease to be administered, the administration route, the dosage form, and the like.
  • the 2′-methylidene nucleotide compound of the present invention or a salt thereof is administered daily.
  • the weight per day is 10 to 40 OmgZkg, preferably 50 to 20 Omg / kg, and the weight of an injection is 1 to 10 OmgZkg, preferably 1 to 5 mgZkg per day.
  • the frequency of administration can be appropriately selected within the range of 1 to 4 times a day.
  • 2'-Deoxy-1'-methylidene cytidine dihydrate 12 Omg (0.05 mmo 1) was dissolved in 2.OM sodium acetate buffer (pH 4.5), and phospholipase D-P (PLDP ) 3 mg (522 U) and 1,4-dipalmitoyl-sn-glycose-1-3-phosphocholine (DPPC), dissolved in 20 ml of clonal form, 404 mg (0.55 mmol) were added. Stir vigorously at 45 ° C. After 2 hours and 4 hours, 2 mg (348 U) of PLDP was added, and the mixture was stirred for a total of 6 hours.
  • PLDP phospholipase D-P
  • DPPC 1,4-dipalmitoyl-sn-glycose-1-3-phosphocholine
  • This compound was synthesized using 2.0 g (2.5 mmol) of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) as phosphatidylcholine to obtain 1.7 g of the powdery target compound. Rate: 72%).
  • DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • the above compound was synthesized using 2.0 g (2.9 mmo 1) of 1,2-dimyristoyl-s ⁇ -glycerol 3-phosphocholine (DMPC) as phosphatidylcholine, and 1.5 g of the desired product was obtained (yield: 59). %).
  • DMPC 1,2-dimyristoyl-s ⁇ -glycerol 3-phosphocholine
  • 1.8 g (yield) of the powdered target compound was synthesized using 1.8 g (2.3 mmo 1) of 1,2-dilinoleoyl-sn-glycose-l-phosphocholine (DLPC) as phosphatidylcholine. : 84%).
  • DLPC 1,2-dilinoleoyl-sn-glycose-l-phosphocholine
  • the above compound was synthesized using 0.50 g (0.7 mmo 1) of 1,2-di-palpalmityl-sn-glycerol 3-phosphocholine as phosphatidylcholine, and the powdery target product 0.4 1 g (65% ).
  • 2'-Deoquinone 2'-methylidene-5-fluorocytidine 0.6 5 to 73 g (2.5 to 2.8 mmo 1) and 0.2 g of sodium acetate are dissolved in 10 ml of purified water and 1N hydrochloric acid Adjust the pH to 4.3 to 4.5, add PLDP l to 3 mg (180 to 540 U), and phosphatidylcholine (1.0 to 1.5 mmol) dissolved in 20 ml of clonal form. The mixture was stirred vigorously at 35-40 ° C for 3-20 hours. The reaction solution was separated by adding 13 ml of chloroform and 16 ml of methanol.
  • the lower layer was washed with 16 ml of methanol and 1 Om1 of water, and the solvent was distilled off.
  • This was dissolved in 18 mL of a formaldehyde: methanol (2: 1) solution, and separated into 27 ml of 0.75 N hydrochloric acid.
  • 27 m 1 of water and 3 Om 1 of methanol were added to the lower layer to carry out liquid separation (three times), and then 3 Om 1 of methanol was added.
  • This was applied to a Diaion WK-20 resin column (Na type), and eluted with chloroform-methanol-water (10: 5: 1), and the solvent was distilled off.
  • Acetone was added to the residue to obtain a powdery target compound
  • test solution After dissolving the compound in cimethylsulfoxide, serially dilute it to 20 times the final concentration with distilled water for injection to obtain a concentration of 1.0, 0.5, 0.125, and 0.0625 g gZnil. Test solution.
  • the test solution 1 0 1 placed in 9 6-well tissue culture plates (Falcon No.3072), 1 X 1 0 to 5 L1210 leukemia cell suspension 1 9 0 n 1 of ⁇ addition, in a carbon dioxide incubator of all, 37 The culture was performed at 48 ° C. for 48 hours.
  • As a control group use only distilled water for injection 101 and culture in the same manner.
  • the number of viable cells is counted by trypan-blue staining using an erythrocytometer, and the 50 % tumor growth inhibition rate (IC 50 , ⁇ g / ral) is determined.
  • mice 1 0 6 P388 leukemia (8 weeks old) were transplanted intraperitoneally, once 5 consecutive days abdominal cavity 1 day from the next day transplanted compound Intravenous administration.
  • Survival time Median (me dian survival time, MST) sought, this and based seeking survival rate by the following equation (TZC,%).
  • V n ZV tumor volume ratio
  • Sugar-coated tablets or film-coated tablets can be prepared by subjecting them to sugar-coating treatment or film coating treatment as desired.

Description

明細書
新規 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物、 その製造方法およびその医薬用途 技術分野
本発明は、 優れた杭腫瘍作用を有し、 医薬として有用な、 新規な 2 ' —メチリ デンヌクレオチド化合物およびその塩、 その製造方法、 それを有効成分として含 有する医薬組成物、 および腫瘍の治療方法に関する。
背景技術
ヌクレオシド系抗腫瘍剤は、 従来から種々の腫瘍に対して広く臨床に応用され てきたが、 次のような問題点が指摘されている。 すなわち、 当該抗腫瘍剤の活性 は 5 ' 位水酸基がリン酸化されて発現されるものであるが、 加リン酸分解ゃ脱ァ ミノ化等の不活性化を受けて不活性な物質に分解されやすいこと、 腫瘍細胞が当 該抗腫瘍剤に抵抗性を有するようになること、 また正常細胞に対しても毒性を示 すこと等の種々の問題点が指摘されている。
従って、 これら問題点の解決されたヌクレオシド系抗腫瘍剤が待望されている のが実情である。
本発明の目的は、 上記問題点を解決し、 公知のヌクレオシド系抗腫瘍剤よりも 優れた特性を有する新規な 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物、 その製造方法 およびその医薬用途を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、 前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、 後記一般式 ( I ) で表される新規な 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物およびその塩が極 めて優れた特性を有することを見出した。
本発明は、 上記の知見に基づいて完成されたものであり、 一般式 （ I )
Figure imgf000004_0001
〔式中、 Rは水素またはハロゲンを、 R1 および R2 は同一または異なって脂肪 酸残基または炭化水素残基を、 R3 および R4 は同一または異なって水素、 ハロ ゲンまたはアルキルを示す。 〕 で表される 2' —メチリデンヌクレオチド化合物 およびその塩に関する。
また、 特に一般式 （ I) において、 R、 R3 および R4 が水素である 2' —メ チリデンヌクレオチド化合物； Rがフッ素、 R3 および R4 が水素である 2' — メチリデンヌクレオチド化合物； R、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が 同一の脂肪酸残基である 2' —メチリデンヌクレオチド化合物； Rがフッ素、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が同一の脂肪酸残基である 2' —メチリデン ヌクレオチド化合物； R、 R および R4 が水素、 R1 および R2 が炭素数 1 2 〜20の同一の脂肪酸残基である 2' —メチリデンヌクレオチド化合物； Rがフ ッ素、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が炭素数 1 2〜20の同一の脂肪 酸残基である 2' —メチリデンヌクレオチド化合物、 およびその塩に関する。 また、 本発明は、 ホスホリパーゼ Dの存在下、 一般式 （II)
Figure imgf000004_0002
〔式中、 R1 および R2 は前記と同意義であり、 R5 はコリン残基を示す。 〕 で 表されるリン脂質と、 一般式（III)
Figure imgf000005_0001
〔式中、 R、 R3 および R4 は前記と同意義である。 〕 で表されるヌクレオシド とを反応させることからなる、 上記一般式 （I) で表される 2' —メチリデンヌ クレオチド化合物およびその塩の製造方法に関する。
さらに、 本発明は、 前記一般式 （I) で表される 2' —メチリデンヌクレオチ ド化合物またはその塩と薬学的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物、 および前記一般式 （I) で表される 2' —メチリデンヌクレオチド化合物または その塩の有効量を腫瘍の治療を必要とするヒトを含む哺乳動物に投与することか らなる腫瘍の治療方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
( 1 ) 化合物
本明細書中、 R、 R3 および R4 で表されるハロゲンとは、 フッ素、 塩素、 臭 素、 ヨウ素を意味する。
R1 および R2 で表される脂肪酸残基としては、 炭素数 2〜30、 好ましくは 1 0〜24、 さらに好ましくは 1 2〜20のものであり、 これらは飽和脂肪酸残 基、 不飽和脂肪酸残基のいずれのものであってもよい。 このような脂肪酸残基を 具体的に例示すれば、 ラウロイル、 ミ リストイル、 パルミ トイル、 ステアロイル、 ィコサノィル等の飽和脂肪酸残基、 パルミ トォレオイル、 ォレオイル、 リノレオ ィル、 リノレノィル、 ァラキドノィル等の 1〜4個の不飽和結合を有する不飽和 脂肪酸残基が挙げられる。
R 1 および R 2 で表される炭化水素残基としては、 炭素数 2 ~ 3 0、 好ましく は 1 0〜2 4、 さらに好ましくは 1 2〜2 0のものであり、 これらは飽和炭化水 素残基、 不飽和炭化水素残基のいずれのものであってもよい。 このような炭化水 素残基を具体的に例示すれば、 ラウリル、 ミ リスチル、 パルミチル、 ステアリル、 ィコサニル等の飽和炭化水素残基、 パルミ トォレイル、 ォレイル、 リノレイル、 リノレニル、 ァラキドニル等の 1〜4個の不飽和結合を有する不飽和炭化水素残 基が挙げられる。
R 3 および R 4 で表されるアルキルとは、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプ 口ピル、 プチル、 ペンチル等の炭素数 1〜5のアルキルを意味する。
本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物は、 塩または水和物の形態でも 優れた特性を有するものとして存在し得る。 そのような塩としては、 たとえば塩 酸、 硫酸、 臭化水素酸、 リン酸等の無機酸もしくはフマル酸、 酒石酸、 コハク酸、 クェン酸、 メタンスルホン酸等の有機酸との酸付加塩、 ナトリウム、 カリウム、 カルシウム等の金属との金属塩、 またはアンモニゥム塩等を例示することができ る。 当該塩を医薬組成物に使用する場合には、 医薬上許容されうる塩であること が好ましい。 また、 水和物としては、 本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化 合物またはその塩 1分子に対し、 0 . 1〜3分子の水が水和したものを例示する ことができる。 また、 異性体も本発明に包含されるものである。
このような本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物のうち、 下記の①〜 ⑬の条件を一つ以上満足する化合物が好ましい化合物として例示される。
① Rは水素である ；
② Rはフッ素である ；
③ R 3 と R 4 は同一で、 水素またはフッ素である ；
④ R 3 は水素で R 4 はフッ素である ；
⑤ R 3 はフッ素で R 4 は水素である ；
⑥ R 1 と R 2 は脂肪酸残基である ；
⑦ R 1 と R 2 は同一の飽和脂肪酸残基である ； ⑧ R1 と R2 は同一の不飽和脂肪酸残基である ；
⑨ R1 と R2 は炭化水素残基である ；
⑩ R1 と R2 は同一の飽和炭化水素残基である ；
⑪ R1 と R2 は同一の不飽和炭化水素残基である ；
⑫塩の形態である ；
⑬水和物の形態である ；
( 2 ) 製造方法
本発明の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物は、 たとえば下記の反応スキムに示した方法によって製造されうる。
Figure imgf000007_0001
〔式中、 R、 R1 、 R2 、 R3 および R4 は前記と同意義であり、 R5 はコリン 残基を示す。 〕
即ち、 本発明の 2， ーメチリデンヌクレオチド化合物は、 ホスホリパーゼ Dの 存在下、 必要に応じて金属イオンを共存させ、 一般式 （II) で表されるリン脂質 と一般式（III) で表されるヌクレオシドとを溶媒中で反応させることにより製造 することができる。
本方法において使用されるリン脂質としては、 前記 R1 および R2 を有するホ スファチジルコリン （たとえば 1 , 2—ジァシルー s n—グリセロー 3—ホスホ コリン、 1, 2—ジアルキル一 s n—グリセロー 3—ホスホコリン、 1, 2—ジ アルケニルー s nーグリセロー 3—ホスホコリン等） 等が挙げられる。 このよう なホスファチジルコリンは試薬メーカーから市販されており、 これを本方法に使 用することができる。 また、 R1 と R2 が脂肪酸残基である場合には、 炭素数 1 2~2 0の長鎖脂肪酸の混合体であるラジール （R a d y 1 ) 基で示される天然 のホスファチジルコリ ンでもよい。
本方法において使用されるヌクレオシドは上記一般式（ill) で表されるもので あり、 好ましくは 2' —デォキシ— 2' —メチリデンシチジン （ΕΡ— Α— 0 3 1 0 6 7 3、 EP— A— 0 4 4 3 4 7 1 )、 2' —デォキシー 2' —メチリデン- 5—フルォロシチジン （EP— A— 0 3 6 0 0 1 8 )、 2' ーデォキシー 2' - ジフルォロメチリデンシチジン、 （E) — 2' —デォキン一 2' —フルォロメチ リデンシチジン、 （Z) — 2' —デォキシー 2' —フルォロメチリデンシチジン (以上、 EP— A— 0 3 7 2 2 6 8 ) 等が挙げられる。
本方法において使用されるホスホリパーゼ Dとしては、 たとえばストレプトミ セス属に属するストレプト ミセス 'エス · ピー · AA 5 8 6 (Streptomyces sp · AA586 ； FER P-6100) 由来のホスホリパーゼ D— P (特開昭 5 8 - 1 5 2 4 8 1号公報：旭化成 （株） から市販されている） 等が好ましいものとして例示され る。 その使用量は、 ホスファチジルコリン 1 mg当たりホスホリパーゼ Dは 0. 0 1単位 （ュニッ ト ： U) 以上、 好ましくは 0. 1〜1 0 0単位である。
本方法において使用される溶媒としては、 たとえばエーテル、 ベンゼン、 クロ 口ホルム等の有機溶媒および p H 3〜 9の緩衝液 （好ましくは p H 4〜 6の緩衝 液） の有機溶媒層—水層の二層系溶媒等が挙げられる。
また、 酵素反応を促進させる目的で反応液中に金属イオンを共存させてもよく、 そのような金属イオン形成のための水溶性塩類としては、 通常、 塩化カルシウム 等が用いられる。 反応温度は通常 2 0〜6 0°Cであり、 反応時間は 3 0分〜 5 0 時間で充分である。
このようにして得られる本発明の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物は、 分 液法およびシリカゲルクロマトグラフィー等により精製することができる。
また、 本発明の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物の塩および水和物は、 自 体既知の手段によって製造、 精製することができる。
(3) 用途 本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物およびその塩は、 哺乳動物 （た とえばヒ ト、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ等） に対して優れた抗腫瘍作 用を有する。 また、 生体内利用率が高められ、 かつ低毒性であることから抗腫瘍 剤として極めて有用である。
すなわち、 本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物およびその塩は、 L1210 白血病細胞、 P388白血病細胞、 M5076 肉腫、 B16 マウスメラノーマ、 ルイ ス肺癌、 Colon 26結腸癌等のマウス腫瘍； CEM 急性 T細胞白血病、 U937ヒト組織 急性白血病、 M0LT4 急性 T細胞白血病、 K562慢性骨髄性白血病、 SK-Mel-28 メラ ノーマ、 T24 膀胱癌、 ΤΈ2 食道腺癌、 SW結腸腺癌、 KB類表皮癌、 Lu- 65 肺大細胞 癌、 PC13肺大細胞癌、 PC14肺腺癌、 ΚΑΤ0Π [胃癌等の培養ヒト腫瘍細胞； またはヌ —ドマウスに移植した SK-Mel-28 メラノーマ、 LX-1肺癌、 Lull6 肺癌、 PC10肺癌、 PC14肺癌、 MX-1乳癌もしくは SC6 胃癌等のヒト腫瘍等に対して、 顕著な増殖抑制 作用を示し、 ヒト等の哺乳動物の肺癌、 消化器系癌 （食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直 腸癌、 結腸癌等） 、 乳癌、 頭頸部癌、 婦人科癌 （子宮癌、 卵巣癌等） 、 泌尿器科 癌 （腎癌、 膀胱癌等） 、 白血病、 メラノ一マ、 リンパ好性転移腫瘍等の治療また は再発防止に有効である。
また、 本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物およびその塩は、 脂溶性 が高いので生体内に長時間滞留して活性を持続し、 さらに脱ァミノ化、 加リン酸 分解、 還元等の不活性化を受けにく く、 生体膜への親和性が高く、 キナーゼの関 与なしに抗腫瘍性ヌクレオシドの 5 ' —モノリン酸体が細胞内で生成する等の利 点がある。 すなわち、 本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物およびその 塩は、 活性が持続、 増強される等の効果を有する。
本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物およびその塩を医薬として用い る場合、 通常、 その有効成分量を薬学的に許容されうる担体、 賦形剤、 希釈剤等 と混合して、 散剤、 顆粒、 錠剤、 糖衣剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 坐剤、 外用 剤、 注射剤、 点滴用剤等の形態とすることができるが、 経口剤が好ましい。
投与量は、 対象疾患、 投与経路、 剤型等により変動し得るが、 一般に経口剤の 場合、 本発明の 2 ' —メチリデンヌクレオチド化合物またはその塩として、 1 日 当たり 1 0〜4 0 OmgZk g体重、 好ましくは 5 0— 20 Omg/k g体重で あり、 注射剤では 1日 1〜 1 OmgZk g体重、 好ましくは 1〜5mgZk g体 重である。 投与回数は 1日 1〜4回の範囲で適宜選択し得る。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらによって 何ら限定されるものではない。
実施例 1
2' —デォキシ一 2' —メチリデンシチジン 2水和物 1 2 Omg (0. 05m m o 1 ) を 2. OM酢酸ナトリゥム緩衝液 （pH4. 5) に溶解し、 ホスホリパ —ゼ D— P (PLDP) 3mg ( 522 U) と、 20 m 1のクロ口ホルムに溶解 した 1 , 2—ジパルミ トイル— s n—グリセ口一 3—ホスホコリン （DP PC) 4 04 mg (0. 5 5mmo l ) を加え、 4 5 °Cで激しく撹拌した。 2時間後お よび 4時間後に PLDP 2mg ( 34 8 U) を加え、 合計 6時間撹拌した。 反応 液を放冷後、 クロ口ホルム 20m l、 メタノール 2 Om 1、 水 5m 1を加えて分 液し、 下層をメタノール一水 （ 1 ： 1 ) 1 Om 1で 3回洗浄した後、 溶媒を留去 した。 残渣をクロ口ホルム一メタノール （2 : 1 ) 少量に溶解してシリカゲルに 吸着させ、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （ø 2. 8 cmx 7. 5 cm + 2. O cm, 25 %メタノールノクロ口ホルムで溶出） により精製し、 白色の固 体を得た。 これをクロ口ホルム一メタノール一水 （ 1 0 : 5 : 1 ) に溶解し、 ダ ィァイオン WK— 20樹脂カラム （Na型， 02. 2 cmx 6. O cm) にかけ、 同溶媒で溶出し、 5' — ( 1， 2—ジパルミ トイル— s n—グリセ口— 3—ホス ホ） — 2' —デォキシ— 2' —メチリデンシチジンナトリウム塩 3/2水和物 2 1 6mg (0. 24mmo 1 ) を得た。 収率 4 8 %。
元素分析 （C45H73N3 OuPNa · 3/2H2 0) ；
理論値 C : 5 8. 80, H： 8. 9 9， N： 4. 57
測定値 C : 5 8. 82, H： 8. 94, N： 4. 5 9
F AB-MS (m/z) ； 8 92 (M+ )
UV； Amax (Me OH, OH" ) 27 1 nm， Amax (H+ ) 28 0 nm NMR (CDC 13 -CD3 OD, 3 : 1 ) 5 ; 7. 82 (d, 1 H， 6— H, J6, 5 = 7. 7Hz)
6. 67 (s, 1 H, 1 ' -H)
6. 00 (d, 1 H, 5— H, J 5, 6 = 7. 3 H z)
5. 52 (b r . s, 1 H, 2' -C = CHa )
5. 47 (b r . s， 1 H， 2' - C = CHb )
5. 38-5. 21 (m， 1 H， g l yc e r o l 2 - H)
4. 79 - 4. 76 (m, 1 H, 3' — H)
4. 4 1— 3. 82 (m, 7 H, 4 ' , 5 ' , 5 ' - H, glycerol 1 , 3 -H) 2. 32 ( t, 2 H, C〇CH2 , J = 7. 7Hz)
2. 3 1 ( t, 2H, COCH2 , J= 7. 7Hz)
1. 60 (m, 4 H, COCCH2 )
1. 26 (m, 48 H， p a 1 m i t o y 1 CH2 )
0. 88 ( t , 6H, pa lmi t oy l CH3 , J= 6. 6 Hz)
実施例 2
2， —デォキシー 2' —メチリデン一 5—フルォロシチジン 1 29mg (0.
50mmo l) を 2. 0 M酢酸ナトリウム緩衝液 （ p H 4. 5) に溶解し、 PL DP 3mg ( 522 U) と、 20 m 1のクロ口ホルムに溶解した D P P C 404 mg (0. 55mmo l) を加え、 45 °Cで激しく撹拌した。 2時間後および 4 時間後に PLDP 2mg ( 348 U) を加え、 合計 6時間撹拌した。 反応液を放 冷後、 クロ口ホルム 20ml、 メタノール 20m 1、 水 5m 1を加えて分液し、 下層をメタノール—水 （1 : 1) 1 0mlで 3回洗浄した後、 溶媒を留去した。 残渣をクロ口ホルム一メタノール （2 ： 1)少量に溶解してシリカゲルに吸着さ せ、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （ø 2. 8 cmx 8. O cm+2. 0 cm, 25%メタノール Zクロ口ホルムで溶出） により精製し、 白色の固体を得 た。 これをクロ口ホルム一メタノール一水 （1 0 : 5 : 1) に溶解し、 ダイアイ オン WK— 20樹脂カラム （Na型， 02. 2 cmx 5. 5 cm) にかけ、 同溶 媒で溶出し、 5' — （1， 2—ジパルミ トイルー s n-グリセ口— 3—ホスホ） 一 2' —デォキシ— 2' —メチリデン一 5—フルォロシチジンナトリウム塩 1 Z2 水和物 2 2 3mg ( 0. 2 5 mm o 1 ) を得た。 収率 4 9 %。
元素分析 （C45H78N3 OiiF PNa · 1 /2 H2 O) ；
理論値 C : 5 8. 8 1 , H : 8. 6 6， N : 4. 5 7
測定値 C ： 5 8. 72 H： 8. 64， N： 4. 4 0
FAB-MS (m/z) ； 9 1 0 (M+ )
UV； Araax (Me OH, 〇H— ) 27 1 nm, Amax (H+ ) 28 0 nm
NMR (CDC 13 -CD3 OD, 3 : 1 ) 5 ;
7. 73 (d, 1 H, 6 - H, J6，5F= 6. 2 Hz)
6. 6 5 (s, 1 H, 1 ' — H)
5. 5 3 (s, 1 H, 2， -C = CHa )
5. 4 7 (s， 1 H， 2' -C = CHb )
5. 24 (m, 1 H, g l y c e r o l 2 -H)
4. 73 (m, 1 H， 3' - H)
4. 2 1 - 3. 8 5 (m, 8 H, 3 ' , 4 ' ， 5 ' - H, glycerol 1, 3 -H)
2. 3 6 - 2. 28 (m, 4 H, COCH2 )
1. 6 0 (b r . s， 4 H， COCCH2 )
1. 4 3 - 1. 27 (m, 4 8 H， p a 1 m i t o y 1 CH2 )
0. 8 9 (t, 6 H, p a 1 m i t o y 1 CH3 )
実施例 3〜8においては、 以下の方法に従って行った。
2， ーデォキシー 2' —メチリデンシチジン 2水和物 1. 9〜3. 5 g (7〜 1 2. 5mmo 1 ) と塩化カルシウム 2水和物 1. 4 gを精製水 4 0 m 1に溶解 し、 l N塩酸でpHを4. 3〜4. 5に調製し、 PLDP l〜4mg ( 1 8 0〜 720 U) と、 クロ口ホルム 8 0m lに溶解したホスファチジルコリン （ 0. 7 〜2. 9mmo l ) を加え、 35〜 4 0 °Cで 3〜 8時間激しく撹拌した。 反応液 をクロ口ホルム 5 3m 1、 メタノール 67m lを加えて分液し、 下層にメタノ一 ル 6 7m 1、 水 4 0m 1を加えて洗浄した後、 溶媒を留去した。 残渣をクロロホ ルムーメタノール （2 : 1 ) 少量に溶解してシリカゲルに吸着させ、 シリカゲル カラムクロマトグラフィー （クロ口ホルム： メタノール = 3 ： 1で溶出） により 精製し、 白色の固体を得た。 これをクロ口ホルム ： メタノール （ 2 ： 1 ) 溶液 1 8 Om lに溶解し、 0. 75 N塩酸 27m 1 と分液した。 下層に水 27m 1 とメ 夕ノール 3 0 m 1を加えて分液 （ 3回） した後、 メタノール 3 0 m 1を加えた。 これをダイアイオン WK— 20樹脂カラム （Na型） にかけ、 クロ口ホルムーメ 夕ノール—水 （ 1 0 : 5 : 1 ) で溶出し、 溶媒を留去した。 残渣にアセトンを加 え、 粉末状の目的化合物を得た。
実施例 3
5 ' - ( 1 , 2—ジステアロイルー s n—グリセロー 3—ホスホ） 一 2' —デ ォキシ一 2' —メチリデンシチジンナトリウム塩
ホスファチジルコリンとして 1 , 2—ジステアロイルー s n—グリセロー 3— ホスホコリン （DS PC) 2. 0 g (2. 5mmo 1 ) を用いて上記方法により 合成し、 粉末状の目的物 1. 7 gを得た （収率： 72%) 。
元素分析 （C49H87N3 OnPNa)
理論値 C : 62. 07、 H : 9. 25、 N : 4. 4 3
測定値 C : 6 1. 8 1、 H : 9. 4 7、 N : 4. 53
NMR (CDC 13 -CDs OD. 3 : 1 ) 5 ;
7. 7 9 (d, 1 H， 6— H， J6, s = 7. 3 Hz)
6. 6 9 (s， 1 H, 1 ' — H)
5. 9 8 (d, 1 H， 5— H， J 5, 6 = 7. 3 Hz)
5. 5 1 (s， 1 H, -C = CHa )
5. 4 7 (s, 1 H， — C = CHb )
5. 24 - 5. 22 (m, 1 H, g l y c e r o l 2 - H)
4. 7 9 - 4. 77 (m， 1 H, 3' — H)
4. 4 2 - 3. 8 3 (m, 7 H, 4' , 5' , 5' — H， glycerol 1， 3 -H) 2. 35 - 2. 29 (m， 4 H, COCH2 )
1. 6 1 - 1. 5 9 (m, 4 H, COCCH2 )
1. 27 (m, 5 6 H， s t e a r o y 1 CH2 )
0. 8 9 ( t , 6 H, CH3 ) 実施例 4
5 ' 一 （ 1 , 2—ジミ リストイルー s η—グリセ口— 3—ホスホ） 一 2 ' —デ ォキシ一 2' —メチリデンシチジンナトリゥム塩 3/4水和物
ホスファチジルコリンとして 1 , 2—ジミ リストイルー s η—グリセロー 3— ホスホコリン （DMPC) 2. 0 g (2. 9mmo 1 ) を用いて上記方法により 合成し、 目的物 1. 5 g (収率： 5 9%) を得た。
元素分析 （C41H71N3 OnPNa · 3/4 H2 0)
理論値 C : 5 7. 9 7 , H： 8. 6 0、 N : 4. 9 5
測定値 C : 5 7. 9 9、 H : 8. 8 3、 N : 4. 9 1
NMR (CDC 13 -CDs OD, 3 : 1 ) d ;
7. 54 (d, 1 H, 6 -H, J6,5 = 7. 6 Hz)
6. 6 3 (s, 1 H, 1 ' -H)
5. 8 6 (d, 1 H, 5— H, J 5, 6 = 7. 6 Hz)
5. 52 (s， 1 H, — C = CHa )
5. 3 9 (s， 1 H, -C = CHb )
5. 23 - 5. 22 (m, 1 H, l y c e r o l 2— H)
4. 7 1 - 4. 6 8 (m, 1 H, 3' 一 H)
4. 4 1一 3. 82 (m, 7 H， 4 ' ， 5 ' ， 5 ' — H, glycerol 1 , 3— H)
2. 34 - 2. 28 (m, 4 H, COCH2 )
1. 6 0— 1. 5 9 (m, 4 H, COC CH2 )
1. 26 (m, 4 0 H, my r i s t o y l CH2 )
0. 8 8 (t, 6H， CH3 )
実施例 5
5' 一 （ 1 , 2—ジォレオイル— s n—グリセ口— 3—ホスホ） — 2' —デォ キシー 2' —メチリデンシチジンナトリウム塩 1ノ2水和物
ホスファチジルコリンとして 1 , 2—ジォレオイル一 s n—グリセロー 3—ホ スホコリン （DOPC) 1. 8 g (2. 3mmo 1 ) を用いて上記方法により合 成し、 粉末状の目的物 1. 6 g (収率： 77%) を得た。 元素分析 （C4SH83N3 OuPNa 1 /2H2 〇）
理論値 C ： 6 1. 74、 H： 8 8 8、 N： 4. 4 1
測定値 C ： 6 1. 77、 H： 8 9 3、 N： 4. 1 1
NMR (CDC 13 - CD3 OD、 3 : 1 ) 5 ;
7. 62 (d, 1 H， 6 - H， J6, 5 = 7. 8 Hz)
6 6 6 (s, 1 H， 1 ' -H)
5 9 9 (d, 1 H, 5— H, J 5, e = 7. 8 Hz)
5 5 1 (s， 1 H, — C = CHa )
5 42 (s, 1 H， -C = CHb )
5 3 9 - 5. 30 (m, 4 H, 一 CH = CH -）
5 24 - 5 22 (m, 1 H, g l y c e r o l 2 -H)
4 74 - 4 72 (m, 1 H, 3' — H)
4 42- 3 8 1 (m， 7 H, 4' , 5' ， 5 ' 一 H, glycerol 1， 3 -H) 2 3 5 - 2 2 9 (m, 4 H, COCH2 )
2 02 - 1 9 9 (m， 8H, -CH2 C = CCH2 -)
1 6 1 - 1 6 0 (m, 4H， C〇CCH2 )
1 30 - 1 27 (m， 4 0 H, o 1 e o y 1 CH2 )
0 8 9 ( t 6 H， CH3 )
実施例 6
5' - ( 1 2—ジリノレオイル一 s n—グリセ口一 3—ホスホ） 一 2' —デ ォキシ一 2' —メチリデンシチジンナトリウム塩
ホスファチジルコリンとして 1 , 2—ジリノレオイル一 s n—グリセ口一 3 - ホスホコリン （DLPC) 1. 8 g (2. 3mmo 1 ) を用いて上記方法により 合成し、 粉末状の目的物 1. 8 g (収率： 84%) を得た。
NMR (CDC 13 -CD3 OD、 3 : 1 ) 5 ;
7. 5 5 (d, 1 H, 6— H， J6.5 = 7. 6 Hz)
6. 64 (s， 1 H, 1 ' -H)
5. 8 5 (d, 1 H， 5 -H, J5, 6 = 7. 6 Hz) 5. 52 ( s 1 H, -C = CHa )
5. 4 2 - 5 28 (m, 9H, -C = CHb , 一 CH=CH— )
5. 26 - 5 20 (m, 1 H, g l y c e r o l 2 - H)
4. 7 1 - 4 6 8 (m, 1 H, 3' 一 H)
4. 4 2 - 3 8 1 (m, 7 H, 4' , 5' , 5' — H, glycerol 1， 3 -H) 2. 77 ( t 4 H, C = C-CH2 - C = C)
2. 35 - 2 28 (m, 4 H， C〇CH2 )
2. 0 8 - 2 02 (m, 8 H, — CCH2 C = C— )
1. 6 1 - 1 5 9 (m, 4 H, COCCH2 )
1. 3 9 - 1 22 (m, 28H, 1 i n o 1 e o y 1 CH2 )
0. 8 9 ( t 6H， CH3 )
実施例 7
5, - ( 1 2 -0-ジパルミチル— s n—グリセ口— 3—ホスホ） 2' 一 デォキシー 2 ーメチリデンシチジンナトリゥム塩 1水和物
ホスファチジルコリンとして 1， 2—〇一ジパルミチル— s n—グリセ口 3 ホスホコリン 0. 50 g (0. 7mmo 1 ) を用いて上記方法により合成し、 粉 末状の目的物 0. 4 1 g (6 5%) を得た。
元素分析 （C45H83N3 09 PNa - H2 0)
理論値 C : 6 1. 27、 H : 9. 7 1、 N 4 76
測定値 C : 6 1. 23、 H : 9. 52、 N 4 4 6
FAB-MS (mZz) ; 8 64 (M+ )
実施例 8
5' 一 （し 2— 0—ジステアリル— s n—グリセロー 3—ホスホ） — 2' — デォキシ一 2 ' —メチリデンシチジンナトリウム塩 1 Z 2水和物
ホスファチジルコリンとしてし 2—〇—ジステアリルー s n—グリセロー 3 ホスホコリン 0. 5 0 g (0. 7mmo 1 ) を用いて上記方法により合成し、 粉 末状の目的物 0. 3 8 g (6 2%) を得た。
元素分析 （C43HS1N3 Os PNa · 1/2H2 0) 理論値 C : 6 3. 34、 H : 9. 9 8、 N : 4. 52
測定値 C : 6 3. 5 3、 H : 9. 72、 N : 4. 35
FAB-MS (mZz) ; 920 (M+ )
実施例 9〜1 3においては、 以下の方法に従って行った。
2' ーデォキン一 2' —メチリデンー 5—フルォロシチジン 0. 6 5〜 7 3 g ( 2. 5〜2. 8mmo 1 ) と酢酸ナトリウム 0. 2 gを精製水 1 0m lに 溶解し、 1 N塩酸で pHを 4. 3〜4. 5に調製して、 PLDP l〜3mg ( 1 8 0〜54 0 U) と、 クロ口ホルム 20m 1に溶解したホスファチジルコリン （ 1. 0〜1. 5mmo l ) を加え、 35〜 4 0 °Cで 3〜 20時間激しく撹拌した。 反応液をクロ口ホルム 1 3m 1、 メタノール 1 6m lを加えて分液し、 下層にメ 夕ノール 1 6m 1、 水 1 Om 1を加えて洗浄した後、 溶媒を留去した。 残渣をク ロロホルム—メタノール （2 : 1 ) 少量に溶解してシリカゲルに吸着させ、 シリ 力ゲルカラムクロマトグラフィー （クロ口ホルム： メタノール = 3 ： 1で溶出） により精製し、 白色の固体を得た。 これをクロ口ホルム： メタノール （2 ： 1 ) 溶液 1 8 Om lに溶解し、 0. 75 N塩酸 27m 1 と分液した。 下層に水 27m 1 とメタノール 3 Om 1を加えて分液 （3回） した後、 メタノール 3 Om 1を加え た。 これをダイアイオン WK— 20樹脂カラム （Na型） にかけ、 クロ口ホルム— メタノール—水 （ 1 0 : 5 : 1 ) で溶出し、 溶媒を留去した。 残渣にアセトンを 加え、 粉末状の目的化合物を得た。
実施例 9
5 ' - ( 1 , 2—ジステアロイルー s n—グリセロー 3—ホスホ） — 2' —デ ォキシ— 2' —メチリデン— 5—フルォロシチジンナトリゥム塩 3 Z 2水和物 ホスファチジルコリンとして 1， 2—ジステアロイルー s n—グリセ口— 3— ホスホコリン （DS PC) 1. 0 g ( 1. 2mmo 1 ) を用いて上記方法により 合成し、 粉末状の目的物 0. 3 1 g (収率： 25%) を得た。
元素分析 （C49H86N3 OnFPNa · 3/2H2 0)
理論値 C : 5 9. 26、 H : 9. 03. N： 4. 23
測定値 C : 5 9. 28、 H : 9. 02、 N : 4. 0 6 l 5 NMR (CD C 13 -CDS OD, 3 : 1 ) 5 ;
7 6 7 (d, 1 H, 6一 H, J e, 5F= 5 9 Hz)
6 6 2 (s， 1 H， 1 ' -H)
5 5 4 (s 1 H, -C = CHa )
5 4 5 ( s 1 H, -C = CHb )
5 2 6 - 5 2 2 (m, 1 H, g l y c e r o l 2 -H)
4 7 2 - 4 6 9 (m, 1 H, 3' — H)
4 4 2 - 3 8 1 (m, 7 H, 4' , 5' , 5' H， glycerol 1 , 3 -H) 2 3 5 - 2 2 8 (m, 4 H, COCH2 )
1 6 1 - 1 5 9 (m, 4 H, COCCH2 )
1 2 6 (m, 5 6 H, s t e a r o y l CH2 )
0 8 8 ( t, 6 H, CH3 )
実施例 1 0
5' — ( 1， 2—ジミ リストイルー s n—グリセ口— 3—ホスホ） 一 2' —デ ォキシ一 2 ' —メチリデンー 5—フルォロシチジンナトリウム塩 1水和物
ホスファチジルコリンとして 1, 2—ジミ リストイルー s n—グリセロー 3一 ホスホコリン （DMPC) 1. 0 g ( 1. 5mmo 1 ) を用いて上記方法により 合成し、 粉末状の目的物 0. 3 3 g (収率： 2 6%) を得た。
元素分析 （C41H7。N3 OnFPNa · H2 0)
理論値 C : 5 6. 4 7、 H : 8. 3 2、 N : 4. 8 2
測定値 C : 5 6. 3 5、 H : 8. 1 8、 N : 4. 7 5
NMR (CDC 13 -CD3 OD, 3 : 1 ) 5 ;
7. 6 5 (d， 1 H， 6一 H， J6.5F= 6. 3Hz)
6 6 2 (s, 1 H, 1 ' -H)
5 5 5 (s, 1 H， -C = CHa )
5 4 4 (s, 1 H， -C = CHb )
5 2 6 - 5. 2 2 (m, 1 H， g l y c e r o l 2 - H)
4 7 1 - 4. 6 8 (m, 1 H， 3' — H) 4. 42 - 3. 82 (m, 7 H, 4' , 5' , 5 ' — H, glycerol 1， 3— H) 2. 35 - 2. 28 (m, 4 H， COCH2 )
1. 6 1 - 1. 59 (m, 4 H, COCCH2 )
1. 26 (m, 40 H, my r i s t o y 1 CH2 )
0. 88 ( t, 6 H, CH3 )
実施例 1 1
5 ' - (1, 2—ジォレオイル一 s n—グリセ口— 3—ホスホ） 一 2' —デォ キシー 2' —メチリデンー 5—フルォロシチジンナトリウム塩 1 Z2水和物 ホスファチジルコリンとして 1 , 2—ジォレオイル一 s n—グリセ口一 3—ホ スホコリン （DOPC) 0. 8 g ( 1. Ommo 1 ) を用いて上記方法により合 成し、 粉末状の目的物 0. 32 g (収率： 33%) を得た。
元素分析 （C49H82N3 OnFPNa · 1/2H2 0)
理論値 C : 60. 60、 H : 8. 6 K N： 4. 33
測定値 C : 60. 46、 H : 8. 65、 N : 4. 08
NMR (CDC 13 -CD3 〇D、 3 ： 1) δ ；
7. 63 (d, 1 H， 6 -H, J6. S F= 5. 9 Hz)
6. 6 1 (s, 1 H, 1 ' — H)
5. 55 (s， 1 H, -C = CHa )
5. 43 (s, 1 H, - C = CHb )
5. 39 - 5. 29 (m, 4 H， 一 CH = CH- )
5. 25-5. 21 (m, 1 H, l yc e r o l 2 -H)
4. 70 - 4. 67 (m， 1 H, 3' 一 H)
4. 42- 3. 8 1 (m, 7 H, 4' , 5* , 5' H, glycerol 1 , 3 -H) 2. 35 - 2. 28 (m， 4 H， COCH2 )
2. 03 - 2. 00 (m, 8 H, - CH2 C = CCH: -)
1. 6 1 - 1. 59 (m, 4 H， COCCH2 )
1. 31 - 1. 27 (m, 40 H， o l e oy l CH2 )
0. 88 ( t， 6 H, CH3 ) 実施例 1 2
5 ' 一 （ 1, 2—ジリノレオイル一 s n—グリセ口— 3—ホスホ） 一 2' —デ ォキシ一 2' —メチリデン— 5—フルォロシチジンナトリゥム塩 2水和物
ホスファチジルコリンとして 1， 2—ジリノレオイル一 s n—グリセロー 3— ホスホコリン （DLPC) 0. 8 g ( 1. Ommo 1 ) を用いて上記方法により 合成し、 粉末状の目的物 0. 3 1 g (収率： 3 1 を得た。
NMR (CDC 13 -CD3 OD. 3 : 1 ) 5 ;
7. 6 6 (d， 1 H， 6— H, J6,5F= 5. 9 Hz)
6 62 (s, 1 H, 1 ' - H)
5 54 (s， 1 H, 一 C = CHa )
5 4 5 (s, 1 H, — C = CHb )
5 42 - 5. 2 9 (m, 8 H, 一 CH = CH -）
5 27 - 5 22 (m, 1 H, g l y c e r o l 2一 H)
4 7 1 - 4 6 8 (m, 1 H, 3' - H)
4 42 - 3 8 0 (m, 7 H, 4' , 5' , 5' — H, glycerol 1, 3 - H) 2 77 ( t 4 H， C = C-CH2 一 C = C)
2 35 - 2 28 (m, 4 H, COCH2 )
2 0 8 - 2 02 (m， 8 H, -CCH2 C = C一）
1 6 1 - 1 6 0 (m， 4 H, COCCH2 )
1 3 9 - 1 24 (m， 28 H, 1 i n o 1 e o y 1 CH2 )
0 8 9 ( t 6 H, CH3 )
実施例 1 3
5' 一 ( 1 2— 0—ジパルミチル— s n—グリセロー 3—ホスホ） 一 2' — デォキシ— 2' —メチリデンー 5—フルォロシチジンナトリウム塩 1 / 2水和物 ホスファチジルコリンとして 1 , 2— 0—ジパルミチル一 s n—グリセロー 3— ホスホコリン 0. 25 g (0. 35mmo 1 ) を用いて上記方法により合成し、 粉末状の目的物 0. 0 9 g (29%) を得た。
元素分析 （C45H82N3 09 FPNa · 1/2H2 〇） 理論値 C : 6 0. 6 5、 H : 9. 3 9、 N : 4. 72
測定値 C : 6 0. 73、 H : 9. 30、 N : 4. 4 8
FAB-MS (m/z) ; 8 82 (M+ )
実験例 1
化合物をシメチルスルホキシドで溶解後、 注射用蒸留水で最終濃度の 20倍に なるように段階希釈を行い、 1. 0、 0. 5、 0. 1 25および 0. 0 6 25〃 gZnilの濃度の試験液とする。 この試験液 1 0 1を 9 6穴組織培養プレート （ ファルコン No.3072) に入れ、 1 X 1 05 個 ηΐの L1210白血病細胞浮遊液 1 9 0 n 1を加え、 炭酸ガスインキュベータ一中、 37°Cで 4 8時間培養した。 対照 群として注射用蒸留水 1 0 1のみを入れ、 同様に培養したものを用いる。
培養後、 トリパン ·ブルー染色法により赤血球計算盤を用いて生細胞数を数え、 5 0%腫瘍増殖阻止率 （ I C50, ^g/ral) を求める。
実験例 2
1群 3匹の雌性 CDF, マウス （8週齢） に 1 06 個の P388白血病 （米国国立 ガン研究所由来） を腹腔内移植し、 化合物を移植翌日から 1日 1回 5日間連続腹 腔内投与する。 生存日数中央値 （median survival time, MST)を求め、 これに基 づいて次式により延命率 （TZC, %) を求める。
処置群の MS T
延命率 （T/C, %) = 1 00
対照群の MS T
実験例 3
ヒト LX-1肺癌腫瘍のフラグメント （2 X 2 X 2隱） を BALB/C-nu/nuマウスの背 に皮下投与し、 腫瘍の容積が 1 0 0〜5 00讓 3 となったとき、 これらマウスを 4〜 5匹ずつのいくつかの実験グループに分ける。 被験化合物を 1日 1回、 5日 間投与する。 腫瘍の直径を測定し、 腫瘍の容積 （V) を下式
LXW2
V =
2
(Lと Wはそれぞれ腫瘍の長径と短径 （隱） を表す。 ） により算出する。 それぞ れマウスの腫瘍の容積を計算し、 腫瘍容積比 Vn ZV。 として表す。 ここで Vn は被験化合物を n日間投与した後の腫瘍容積であり、 V。 は被験化合物の投与開 始前 （0日） の最初の腫瘍容積である。 Vn ZV。 （RV) の値は、 それぞれの グループごとに計算され、 薬剤効力は
処置群の RV
薬剤効力 (T/C, %) = X 1 0 0
対照群の RV
により算出する。 本実験においては、 初回投与から 7日目に腫瘍容積を測定し、 各化合物の抗腫瘍効果 （腫瘍増殖抑制効果） を検討する。
製剤例 1
本発明化合物 30 0 m g
微粉末セルロース 25 0 m g
乳糖 3 9 5 m g
スターチ 40 0 m g
タルク 5 0 m g
ステアリン酸マグネシゥム 0 5 m g
からなる錠剤。
所望により糖衣処理またはフイルムコート処理を施すことによって、 糖衣錠ま たはフィルムコート錠とすることができる。
製剤例 2
本発明化合物 30. Omg
乳糖 4 0. 0 m g
スターチ 1 5. Omg
タルク 5. 0 m g
の組成をカプセルに充塡してなるカプセル剤。
製剤例 3
本発明化合物 1 0%
乳糖 8 0 %
スターチ 1 0 %
からなる細粒剤。 製剤例 4
本発明化合物 1 0 %
乳糖 5 5 %
微粉末セルロース 2 0 %
スターチ 1 5 %
からなる顆粒剤。
製剤例 5
本発明化合物 3 0. Omg
グルコース 1 0 0. Omg
を精製水に溶かして、 全量 2m 1の注射溶液とする。
製剤例 6
本発明化合物 1 0 Omg
ウイテブソール ^11 5 9 5 Omg
ウイテブソール £ 7 5 9 5 Omg
からなる坐剤。 但し、 ウイテブソールはヴイッテン社 （西ドイツ） 所有の登録商 標である。
製剤例 7
本発明化合物 2 g
パラヒドロキシ安息香酸ェチル 0. 0 2 5 g
パラヒドロキシ安息香酸プ口ピル 0. 0 1 5 g
ラウリル硫酸ナトリウム 1. 5 g
プロピレングリコール 1 2. 0 g
ステアリルアルコール 22. 0 g
白色ヮセリン 2 5. 0 g
の組成を精製水に溶かして、 全量 1 0 0. O gの親水軟膏とする,

Claims

請求の範囲
1. 一般式 （ I )
Figure imgf000024_0001
〔式中、 Rは水素またはハロゲンを、 R1 および R2 は同一または異なって脂肪 酸残基または炭化水素残基を、 R3 および R4 は同一または異なって水素、 ハロ ゲンまたはアルキルを示す。 〕 で表される 2' —メチリデンヌクレオチド化合物 またはその塩。
2. R、 R3 および R4 が水素である、 請求の範囲 1記載の 2' —メチリデンヌ クレオチド化合物またはその塩。
3. Rがフッ素、 R3 および R4 が水素である、 請求の範囲 1記載の 2' -メチ リデンヌクレオチド化合物またはその塩。
4. R、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が同一の脂肪酸残基である、 請 求の範囲 1記載の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物またはその塩。
5. Rがフッ素、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が同一の脂肪酸残基で ある、 請求の範囲 1記載の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物またはその塩。
6. R、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が炭素数 1 2〜20の同一の脂 肪酸残基である、 請求の範囲 1記載の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物また はその塩。
7. Rがフッ素、 R3 および R4 が水素、 R1 および R2 が炭素数 1 2〜20の 同一の脂肪酸残基である、 請求の範囲 1記載の 2' —メチリデンヌクレオチド化 合物またはその塩。
8. ホスホリパーゼ Dの存在下、 一般式 （II)
Figure imgf000025_0001
〔式中、 R1 および R2 は前記と同意義であり、 R5 はコリン残基を示す。 〕 で 表されるリン脂質と、 一般式（III)
Figure imgf000025_0002
〔式中、 R、 R および R4 は前記と同意義である。 〕 で表されるヌクレオシド とを反応させることからなる、 請求の範囲 1記載の 2' —メチリデンヌクレオチ ド化合物またはその塩の製造方法。
9. 請求の範囲 1〜7のいずれかに記載の 2' —メチリデンヌクレオチド化合物 またはその塩と薬学的に許容されうる担体とを含有してなる医薬組成物。
1 0. 請求の範囲 1〜7のいずれかに記載の 2' —メチリデンヌクレオチド化合 物またはその塩の有効量を腫瘍の治療を必要とするヒトを含む哺乳動物に投与す ることからなる腫瘍の治療方法。
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