WO1994019490A1 - Procede de destabilisation d'une structure secondaire intracatenaire d'un polynucleotide simple brin, et de capture dudit nucleotide - Google Patents

Procede de destabilisation d'une structure secondaire intracatenaire d'un polynucleotide simple brin, et de capture dudit nucleotide Download PDF

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WO1994019490A1
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polynucleotide
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nucleotides
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Claude Mabilat
Richard Christen
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Bio Merieux
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction

Definitions

  • the subject of the invention is a method for destabilizing an intracatenary secondary structure present in a single-stranded polynucleotide, this method being usable in a solid phase hybridization technique when a locus of interest of the nucleic acid is present. at the level of a secondary structure.
  • the invention also relates to a device intended for the implementation of this method.
  • One of the advantages of this process is that it is easily automated.
  • the hybridization of nucleic acids by formation of hydrogen bonds between two complementary sequences according to the laws of pairing A-T, G-C for DNA, and A-U, G-C for RNA, is a well known phenomenon.
  • nucleic probe On the basis of the hybridization properties of nucleic acids, tests have been developed which make it possible to identify and quantify, in a sample to be analyzed, a nucleic acid.
  • nucleic probe the presence of a nucleic acid in a sample is confirmed by using an oligonucleotide of known sequence (the probe) which is complementary to a nucleotide sequence of the desired nucleic acid (the target ).
  • a particularly interesting hybridization technique is the so-called sandwich hybridization technique which uses a first probe fixed in excess on a solid support, making it possible to capture the desired nucleic acid, and a second labeled probe called the detection probe, which reveals the presence of the nucleic acid thus captured.
  • This technique described in particular by Dunn and Hassel, Cell 12: 23-36 (1977), therefore involves the use of two probes, a capture probe, fixed on a solid support, capable of hybridizing with a part (or capture zone) of a nucleic acid to be detected in a sample, and a labeled detection probe, which is complementary to another zone of the target, and which allows detection using a marker which may be radioactive, enzymatic or chemical.
  • the formation or absence of formation of a hybrid between the detection probe and the target nucleic acid is an important source of information for diagnosis. For example, if the nucleic sequence of interest is specific for a genus or species of bacteria, the presence of the genus or species in a sample is confirmed when the formation of a hybrid is detected. Tests based on hybridization techniques can therefore be used in the diagnosis of diseases associated with the presence of microorganisms pathogens such as bacteria, fungi or viruses. They also find use in the food industry, in particular to control the absence of bacterial contamination.
  • the hybridization technique can be used in the diagnosis of genetic diseases.
  • the target nucleic acid (DNA or RNA) must of course comprise at least one nucleic sequence sufficiently specific for the species, of the genus or of the family of the organism to be detected and the probe, complementary to said nucleic sequence, must possibly be able to recognize its target even within a medium containing thousands of other nucleic acids which, in certain cases, will not differ from the target only through a base pair.
  • the desired nucleic sequence is present in the sample examined, it will form with the probe, a DNA / DNA, DNA / RNA or RNA / RNA hybrid, as the case may be.
  • the target can be a single-stranded DNA molecule (obtained for example by prior thermal denaturation of double-stranded DNA or by reverse transcription of an RNA) comprising a nucleic sequence specific for the organism to be detected.
  • the target can also be an RNA (ribosomal RNA, transfer RNA, or messenger RNA).
  • the target can also be a DNA or RNA molecule.
  • ribosomal RNA rRNA
  • Ribosomal RNA which is found in all cells, is a universal marker for living things that has discriminating variations in each species. It has been the subject of numerous researches, a recent compilation of which can be found in "The Ribosome: Structure, Function and Evolution",
  • the small ribosome subunit (16-18 S) and the large subunit (23-28 S) are molecules of choice for studying the phylogenetic relationships between different living organisms, and for identifying them.
  • Takahashi et al., Biochim. Biophys. Acta 134.124-133 (1967) have shown the taxonomic value of the ribosomal RNA subunits by performing reference rRNA hybridization experiments with DNAs from similar species. These experiments show a percentage of quantifiable, reproducible homology representative of the taxonomic distance from the reference species.
  • Fox et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 27: 44-57 (1977), have shown the interest of 16 S rRNAs for the taxonomy of prokaryotes.
  • the taxonomic value of the nucleotide sequences of the rRNA subunits has been underlined in particular by: Pace and Campbell, J. of Bacteriology 107: 543-547 (1971), who discuss ribosomal RNAs of various bacterial species and of a hybridization method for quantifying levels of homology between these species; and Woese et al., Microbiological Reviews 47: 621-669 (1983), as well as Grayet et al., Nucleic Acids Research 12: 5837-5852 (1984), which show by comparisons of 16S RNA sequences that regions highly conserved are interspersed with regions of medium and low homology, even in the case of close species.
  • ribosomal RNAs are present in all living organisms, from bacteria to humans. They present a particular nucleotide sequence made up of a succession of domains characterized by a variable rate of evolution. In the latter case, certain domains are conserved in all organisms, or in groups of organisms, and are therefore usable as complementary sites for hybridization to universal oligonucleotide primers for sequencing or amplification. When, on the contrary, the speed of evolution of a certain domain is high, it can be used to develop specific probes, depending on the case, of the species, genus, family or kingdom.
  • RRNA is a very abundant molecule in all cells, representing more than 90% of total RNA. Their organization as a multigenic family results in their sequence being representative of a species, or possibly a population, rather than an individual.
  • ribosomal RNA as a target, for hybridization reactions, can be carried out on culture, for example on bacterial culture, or on a clinical sample, after reverse transcription followed optionally by enzymatic amplification in vitro.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • TAS Transcription Amplification System
  • 3SR Self Sustained Sequence Replication
  • DNA can also be used directly as a target, the ribosomal RNA of which is the transcript.
  • the rRNA molecule although single-stranded, has so-called secondary structures. It indeed contains self-complementary sequences which, under determined physico-chemical conditions, are capable of pairing locally, by intramolecular hybridization, by folding back on themselves and thus forming structures known as "hairpin” "or” rod-loops "(the” loops "corresponding to parts of non-self-complementary sequences located between two sequences each involved in an intramolecular hybridization); see for example Figure 1.
  • the invention relates to a device allowing the destabilization of the intracatenary secondary structures of a single-stranded polynucleotide, and simultaneously allowing the capture of said polynucleotide, which further facilitates subsequent operations such as detection by hybridization, amplification or sequencing.
  • the device of the invention can be used without prior denaturation of the single-stranded target polynucleotide.
  • the device can therefore be used in an automatic device, operating at a fixed temperature, for example at 37 ° C.
  • the subject of the invention is therefore a device for the destabilization of an intracatenary secondary structure present in a single-stranded polynucleotide, characterized in that it contains an oligonucleotide fixed on a support, said oligonucleotide containing a so-called destabilizing sequence capable of s hybridize with a non-self-complementary sequence participating in said secondary structure of said polynucleotide, and by the fact that it is usable as a capture probe for said polynucleotide.
  • the oligonucleotide attached to a support plays both the role of destabilizer and the role of capture probe.
  • a capture probe an oligonucleotide fixed on a support and allowing the isolation of the target.
  • the oligonucleotide may be a fragment of natural DNA or RNA, or a natural or synthetic oligonucleotide, or a fragment of synthetic DNA or RNA either unmodified or comprising one or more modified bases such as l inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • modified bases such as l inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • modified bases such as l inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-de
  • the support can be a macromolecular support, and in particular a solid support.
  • the supports which can be used are known per se. It can be for example the wall of a test tube, a polystyrene or nylon plate, a cone (for example made of butadiene-styrene copolymer), latex beads or microspheres, etc.
  • the destabilizing oligonucleotide must be able to compete with the sequence complementary to the sequence which it recognizes in the secondary structure of the target. For this reason, the sequence recognized by the oligonucleotide must not consist solely of a part which is itself self-complementary to the target, since the oligonucleotide probe would then also include a self-complementary sequence and would fold in on itself, so that it could not play its role of destabilizing probe without prior denaturation. It should be noted that it was not obvious that a probe fixed on a support, and therefore subjected to steric constraints, could be used as a means of destabilization of an intracatenary secondary structure whose accessibility is of course strongly reduced, as a simple examination of FIG.
  • the destabilizing sequence of the oligonucleotide used in the device of the invention must have a sufficient length (that is to say a sufficient number of nucleotide units) to cause destabilization of the secondary structure of the target at a predetermined temperature .
  • Tm dissociation temperature of 50% of the duplexes
  • the destabilizing oligonucleotide sequence must therefore have a sufficient length to be able to both break the duplex formed by the sequences capable of intracatenary hybridization, by displacement of one of the strands, and effectively inhibit the reformation of the secondary structure by intracatenary hybridization, to the temperature at which we operate. It has been surprisingly discovered that despite the foreseeable constraints arising from the use of a destabilizing oligonucleotide fixed on a support, it is possible to obtain satisfactory destabilization of the secondary structure at temperatures below 50 ° C., and this without prior denaturation of the target polynucleotide, while using relatively short oligonucleotides, for example having from 20 to 40 nucleotides.
  • the invention therefore also relates to a method of destabilizing an intracatenary secondary structure of a single-stranded polynucleotide and of capturing said polynucleotide, characterized in that a device as defined above is brought into contact with a liquid phase containing, or capable of containing, said polynucleotide, at a temperature below 50 "C.
  • the liquid phase is for example a biological sample or a culture isolate in which it is desired to search, to assay or characterize it, a polynucleotide sequence of interest, as recalled in the introductory part above.
  • this second oligonucleotide may be used, in sufficient quantity, either as a detection probe (the second oligonucleotide is then an ol labeled igonucleotide), i.e. as a primer for amplification or sequencing of the target by elongation of the second oligonucleotide.
  • the second oligonucleotide must have an appropriate length, and in particular sufficiently short to ensure specificity at the temperature at which it is operated.
  • the second oligonucleotide is generally less than 25 nucleotides in length, in particular 8 to 20 nucleotides in length.
  • the sequence recognized by the second oligonucleotide, when it is present, is generally located in the destabilized part of the secondary structure.
  • the elementary nucleotides and a polymerase such as a DNA polymerase or, when the target is an RNA or a reverse transcriptase (DNA polymerase dependent RNA ).
  • nucleotides further containing modified nucleotides for example chain terminator nucleotides or labeled nucleotides
  • One of the applications may be sequencing, carried out by the Sanger method or by any other suitable method.
  • the probe of capture will of course be fixed by its 5 ′ end.
  • the second oligonucleotide When the capture oligonucleotide is fixed to the support by its 3 ′ end, and the second oligonucleotide is capable of hybridizing with a sequence of the target situated downstream from the sequence recognized by the capture probe (c ' that is to say with a sequence located between the 3 ′ end of the target and the sequence recognized by the capture oligonucleotide), it is possible to extend the second oligonucleotide so as to synthesize a sequence complementary to the target region between the second oligonucleotide and the capture probe, and in the case where a polymerase capable of displacing the strands of a duplex is used, the elongation of the second oligonucleotide may continue beyond the sequence recognized by the capture probe, and the elongation product of the second oligonucleotide will be released in solution.
  • the addition of a polymerase under conditions allowing the elongation then leads to an elongation of the capture oligonucleotide.
  • a second oligonucleotide capable of hybridizing with a target sequence located downstream from the sequence recognized by the capture oligonucleotide
  • the addition of a polymerase under conditions allowing the elongation leads to elongation of the two oligonucleotides
  • the progression of the elongation of the second oligonucleotide will cause the target to be dehybridized from the capture probe (and its elongation product).
  • the elongation product of the capture probe will then be in single-stranded form and fixed to the solid support, while the elongation product of the second oligonucleot
  • the process of the present application makes it possible to easily carry out, while taking advantage of the advantages specific to processes in solid phase, the detection, possibly quantitative, the characterization and the amplification of nucleotide sequences present in secondary structures, all operations which, until now, have raised significant technical difficulties.
  • the invention also relates to the particular devices and methods described below in the experimental part, and in particular the use of the specific capture probes described, including when they are used with the second oligonucleotides called “detection probes" in the experimental part, that is to say:
  • - Fig.l represents the secondary structure of E. coli 16S ribosomal RNA from Gutell RR, B. Weiser, CR Woese, and HF Noller, 1985. Comparative anatomy of the 16S-like ribosomal RNA. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 32: 155-216, and - Fig.2 shows a detail of Fig.l, with details on the sequence of probes used in Example 1.
  • the target is the stem-loop region of the rRNA at position 435-500 in Figure 1.
  • the numbering is that of Gutell RR, B. Weiser, CR Woese, and HF Noller, 1985. Comparative anatomy of the 16S-like ribosomal
  • RNA Prog. Nucleic Acid. Res. Mol., Biol. 32: 155-216.
  • the detection probe Gl in Table 1 is complementary to part of this structure and is, according to current knowledge, specific for the taxonomic entity E. coli-Shigella.
  • the hybridization of the rRNAs of a target bacterium was carried out according to the non-radioactive and semi-automated detection method described in French patent No. 90
  • the target rRNA is extracted from each bacteria using the following technique. 1.5 ml of bacterial culture is centrifuged and the pellet taken up in 75 ⁇ l of Tris buffer
  • the whole is added to the well to 50 ⁇ l of a solution of the oligonucleotide-peroxidase conjugate, constituting the detection probe, at the concentration of 0.1 ng / ⁇ l in oligonucleotide in a PBS-horse buffer (PBS 3X + 10% serum horse (BioMérieux 55842)).
  • PBS-horse buffer PBS 3X + 10% serum horse (BioMérieux 55842)
  • OPD substrate orthophenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref / 456
  • a buffer 0.055 M citric acid, 0.1 M sodium monohydrogen phosphate, pH 4.93 0.055 M citric acid, 0.1 M sodium monohydrogen phosphate, pH 4.93
  • 30% hydrogen peroxide diluted 1/1000 is added immediately.
  • the enzymatic activity is blocked with 100 ⁇ l of IN sulfuric acid and the reading is carried out on Axia Microreader (BioMérieux) at 492 nm.
  • the target bacteria were in particular the following: - 50 isolates or E. coli strains (including ATCC 25290, 25922, 27165, 10536,
  • Shigella S. boydii, S. dysenteriae (including ATCC 29027), S. flexneri, S. sonnei;
  • Salmonella (27 isolates or strains): S. arizonae (including ATCC 13314, 13323, 12325), S. choleraesuis (ATCC 13312), S. gallinarum, S. give, S. paratyphi A, S. shomron, S. sophia, S. typhimurium (including ATCC 14028 and 13311), S. spp (ATCC 9712, 1202, 11997, 8388, 6962, 29628); - Various enterobacteria: Citrobacter amalonaticus including ATCC 25405,
  • Proteus morganii including ATCC 25830
  • Proteus penneri including ATCC 25830
  • Proteus rettgeri Proteus vulgaris (including ATCC 6380), Providencia rettgeri, Pseudomonas aeruginosa ATCC 35422, Serratia grimesii ATCC 14460, Serratia marcescens including ATCC 8195 and 8100, various other Serratia, Y ATCC 23715, Yersinia intermedia including ATCC 29909, Yersinia kristensenii including ATCC 35669, Yersinia pseudotuberculosis including ATCC 23207 and NCTC 8487; - Enterococcus faecalis. Results:
  • the adaptation of the same G3 capture system - Gl detection on the VIDAS automaton (registered trademark - marketed by the company BioMérieux SA - VITEK) was carried out.
  • the wall of the microplate well is here replaced by the SPR ("Solid Phase Receptacle") which is a conical support produced from a material sold under the name K resin (butadiene-styrene copolymer) and marketed by the company VITEK ( USA).
  • the various reagents are placed in a strip with several cuvettes and the different stages take place in the SPR which is capable of sucking and discharging the reagents and which therefore acts as a pipette.
  • the sandwich hybridization reaction described in the protocol below takes place on the internal wall of the cone.
  • the destabilizing capture oligonucleotide comprising at its 5 ′ end the ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-ref. 400808) at a concentration of 1 ng / ⁇ l in a volume of 315 ⁇ l of a 4x PBS solution (200 mM sodium phosphate pH 7.0, 600 mM NaCl).
  • the cones are washed 2 times with a PBS Tween solution, then dried under vacuum.
  • the strip contains in cuvettes the reagents necessary for detection, that is to say: 200 ⁇ l of a solution at 0.1 ng / ⁇ l of the oligonucleotide-alkaline phosphatase detection conjugate, twice 600 ⁇ l of PBS washing solution Tween and a substrate bowl.
  • 10 ⁇ l of the RNA extracted are deposited in the same buffer as for the microplate protocol above.
  • the cone After incubating the cone for 30 minutes with the target mixture plus detection probe, the cone is washed twice with a PBS Tween solution. 250 ⁇ l of MUP substrate (4-methyl umbelliferyl phosphate) in solution in a diethanolamine buffer are aspirated into the cone, then released into a reading bowl. The device measures the fluorescent signal expressed in URF (relative fluorescence units) of the cuvette.
  • MUP substrate 4-methyl umbelliferyl phosphate
  • the Aminolink 2 reagent makes it possible to add an arm comprising a 6-aminohexyl group to the 5 ′ end of the probe.
  • the probe thus coupled to a ligand having a polar group (primary amine), and passively attached to the support, provides an improved signal; see application FR 91 09057.
  • the target comprises the two secondary structures of the 16S rRNA, similar to those present at positions 770 to 880 in FIG. 1.
  • the sequence of the probes is given in Table 1.
  • the hybridization of the rRNAs of bacterial strains was carried out according to the protocol described in Example 1. It uses the destabilizing probe dSAL9-2 for the capture and the oligonucleotide SAL9 as detection probe (conjugated to peroxidase).
  • the SAL9 detection probe in Table 1 is complementary to part of the secondary structure and must, according to current knowledge, be specific for the taxonomic entity genus Salmonella.
  • the target bacteria were in particular the following: - 20 isolates or strains of Salmonella arizoriae including ATCC 13314, 13323 and
  • Salmonella various other Salmonella, and in particular: S. bakou, S. derby, S. enteritidis, S. gallinarum, S. paratyphii A, B and C, S. panama, S. pullorum, S. thomson;
  • enterobacteria 34) of the genera Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Serratia; of which ATCC 11102, 13047, 29544,
  • Vibrio anguillarum, harveyi
  • Aeromonas Aeromonas
  • Pleisiomonas various Vibrio (anguillarum, harveyi), Aeromonas and Pleisiomonas.
  • the combination of probes used is specific to the genera Salmonella and to at least one species of the genus Vibrio (It is Vibrio anguillarum). It does not display cross reactions with nucleic acids, in particular rRNA, from other bacterial species, including species close to these two genera. This is controlled by the fact that a hybridization with the eubacterial specificity capture probe S8L, and the eubacterial specificity detection probe E220 is positive with the non-Salmonella and non-Vibrio strains. It should be noted that the SAL9 probe differs from the corresponding sequence in Escherichia coli (Fig.l) only by a single nucleotide. The SAL9 probe is however sufficiently specific and gives a negative result for E. coli.
  • Hybridization of the rRNAs of bacterial strains was carried out according to the protocol described in Example 1, with the exception of the extraction of the target rRNA which is carried out as follows: 1.5 ml of bacterial culture is centrifuged and the pellet taken up in 75 ⁇ l of Tris buffer (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, 25% sucrose pH 8) and 25 ⁇ l of mutanolysin solution (Sigma ) (1 mg / ml in Tris buffer) and lysozyme (1 mg / ml in Tris buffer). After incubation for 30 min at 37 ° C, 50 ⁇ l of phenol are added and the tube is shaken vigorously for 30 seconds. 50 ⁇ l of chloroform are added and the mixture is stirred again for 2 seconds. After centrifugation for 5 min, the aqueous phase is recovered.
  • Tris buffer Tris 50 mM, EDTA 10 mM, 25% sucrose pH 8
  • mutanolysin solution Sigma
  • This protocol uses the destabilizing probe RL1 for capture and the oligonucleotide RL2 as detection probe (conjugated to peroxidase).
  • the RL2 detection probe in Table 1 is complementary to part of this structure and should, according to current knowledge, be specific for Listeria monocytogenes.
  • the target bacteria were: - eleven isolates of Listeria monocytogenes; - three Listeria grayi including ATCC 19120, four Listeria innocua, three
  • Listeria murrayi including CCM 5990 (CCUG 4984), three Listeria ivanovii, four Listeria seeligeri including CIP 100100 (CCUG 15530), three Listeria spp, three Listeria welschineri including CIP 8149 (CCUG 15529).
  • Hybridization of the rRNAs of bacterial strains was carried out according to the protocol described in Example 1.
  • the hybridization uses the destabilizing probe dCT4 for capture and the oligonucleotide CT3 as detection probe (conjugated to peroxidase).
  • the CT3 detection probe in Table 1 is complementary to part of this structure and should, according to current knowledge, be specific for Chlamydia trachomatis.
  • the target bacteria were as follows: - four isolates of Chlamydia trachomatis corresponding respectively to the classification Serovar Ba, D, K and L2; Wang S.P. et al., 1975, J. Clin. Microbiol. 1: 250-255.
  • Chlamydia including Chlamydia Pneumoniae and Chlamydia psittaci
  • various non-Chlamydiae strains of the genera Acinetobacter - various other Chlamydia including Chlamydia Pneumoniae and Chlamydia psittaci
  • various non-Chlamydiae strains of the genera Acinetobacter - various non-Chlamydiae strains of the genera Acinetobacter
  • the hybridization of the rRNAs of the bacterial strains tested was carried out according to the protocol described in Example 1, with the exception of the extraction of the target rRNA carried out according to the basic protocol for the extraction of the RNA from the Gram positive bacteria described in "Current Protocols in Molecular Biology” 1987, Ausubel FM et al, Wiley interscience, New York.
  • the hybridization test uses the destabilizing probe dTB1 for capture and the oligonucleotide bovis 310 as detection probe (conjugated to peroxidase).
  • the bovis 310 detection probe in Table 1 complements part of the secondary structure and should, according to current knowledge, be specific to the taxonomic tuberculosis group comprising M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti.
  • the target bacteria were: - 27 isolates or strains of Mycobacterium tuberculosis including ATCC 27294 and
  • Mycobacterium (chelonae, diernoferi, flavescens, fortuitum, gastri, gordonae, kansasii, lactis, marinum, non chromogenicum, phlei, scrofulaceum, simiae, smegmatis, szulgai, term, trivial, xenopi, vaccae) of which ATCC 14472, 14447 , 19981, 25275, 35799, 15755 and 23292; - Non-mycobacteria: Actinomadura madurae, Nocardia asteroides ATCC
  • probes specific for the complex taxonomic group Mycobacterium avium-M. intracellulare also called "MAY”.
  • the hybridization test uses the destabilizing probe dTB1 and the mixture of detection probes MAI 1, MAI 2, MAI 3 (table 1).

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Abstract

Procédé de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire d'un polynucléotide simple brin, et de capture dudit polynucléotide, caractérisé par le fait que l'on met en contact un dispositif comprenant un oligonucléotide fixé sur un support avec une phase liquide contenant ledit polynucléotide, à une température inférieure à 50 °C, ledit oligonucléotide jouant le rôle de sonde de capture et contenant une séquence dite déstabilisante capable de s'hybrider avec une séquence non auto-complémentaire participant à ladite structure secondaire dudit polynucléotide; et dispositif pour la mise en ÷uvre de ce procédé.

Description

Procédé de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire d'un polynucleotide simple brin, et de capture dudit nucléotide.
L'invention a pour objet un procédé de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire présente dans un polynucleotide simple brin, ce procédé étant utilisable dans une technique d'hybridation en phase solide lorsqu'un locus d'intérêt de l'acide nucléique est présent au niveau d'une structure secondaire.
L'invention concerne également un dispositif destiné à la mise en oeuvre de ce procédé. L'un des avantages de ce procédé est qu'il est facilement automatisable. L'hybridation des acides nucléiques par formation de liaisons hydrogène entre deux séquences complémentaires selon les lois d'appariement A-T, G-C pour l'ADN, et A-U, G-C pour l'ARN, est un phénomène bien connu.
Sur la base des propriétés d'hybridation des acides nucléiques, des tests ont été développés permettant de mettre en évidence et de quantifier, dans un échantillon à analyser, un acide nucléique. Dans cette technologie dite "par sondes nucléiques", la présence d'un acide nucléique dans un échantillon est confirmée en utilisant un oligonucléotide de séquence connue (la sonde) qui est complémentaire d'une séquence nucléotidique de l'acide nucléique recherché (la cible).
Une technique d'hybridation particulièrement intéressante est la technique dite d'hybridation sandwich qui utilise une première sonde fixée en excès sur un support solide, permettant de capturer l'acide nucléique recherché, et une seconde sonde, marquée, appelée sonde de détection, qui permet de révéler la présence de l'acide nucléique ainsi capturé. Cette technique, décrite notamment par Dunn et Hassel, Cell 12:23-36 (1977), comporte donc l'utilisation de deux sondes, une sonde de capture, fixée sur un support solide, capable de s'hybrider avec une partie (ou zone de capture) d'un acide nucléique à détecter dans un échantillon, et une sonde de détection marquée, qui est complémentaire d'une autre zone de la cible, et qui permet la détection grâce à un marqueur qui peut être radioactif, enzymatique ou chimique. La formation ou l'absence de formation d'un hybride entre la sonde de détection et l'acide nucléique cible est une source de renseignements importante pour le diagnostic. Par exemple, si la séquence nucléique d'intérêt est spécifique d'un genre ou d'une espèce de bactéries, la présence du genre ou de l'espèce dans un échantillon est confirmée quand la formation d'un hybride est détectée. Les essais fondés sur les techniques d'hybridation peuvent donc être utilisés dans le diagnostic de maladies associées à la présence de microorganismes pathogènes tels que bactéries, champignons ou virus. Ils trouvent également une utilisation dans l'industrie agro-alimentaire, notamment pour contrôler l'absence de contamination bactérienne.
Par ailleurs, la technique d'hybridation peut être utilisée dans le diagnostic des maladies génétiques.
Dans le cas de la détection d'organismes, en particulier d'organismes infectieux, dans un échantillon, l'acide nucléique-cible (ADN ou ARN) doit bien entendu comprendre au moins une séquence nucléique suffisamment spécifique de l'espèce, du genre ou de la famille de l'organisme à détecter et la sonde, complémentaire de ladite séquence nucléique, doit éventuellement pouvoir reconnaître sa cible même au sein d'un milieu contenant des milliers d'autres acides nucléiques qui, dans certains cas, ne différeront de la cible que par une paire de bases. Ainsi, si la séquence nucléique recherchée est présente dans l'échantillon examiné, elle formera avec la sonde, un hybride ADN/ADN, ADN/ARN ou ARN/ARN, selon le cas.
La cible peut être une molécule d'ADN simple brin (obtenue par exemple par dénaturation thermique préalable d'un ADN double brin ou par transcription inverse d'un ARN) comprenant une séquence nucléique spécifique de l'organisme à détecter. La cible peut être également un ARN (ARN ribosomique, ARN de transfert, ou ARN messager).
Dans le cas de la détection de virus, la cible peut également être une molécule d'ADN ou d'ARN. Dans le cas des organismes procaryotes ou eucaryotes, on préfère souvent utiliser comme cible l'ARN ribosomique (ARNr) qui, avec les protéines ribosomiques, constitue le ribosome. Celui-ci assure une fonction essentielle de la cellule, à savoir la traduction de l'ARN messager en protéines. L'ARN ribosomique, qui est retrouvé dans toutes les cellules, est un marqueur universel des êtres vivants qui possède des variations discriminantes au niveau de chaque espèce. Il a été l'objet de nombreuses recherches dont une compilation récente peut être trouvée dans "The Ribosome : Structure, Function and Evolution",
American Society for Microbiology, Washington D.C. (1990).
La petite sous-unité du ribosome (16-18 S) et la grande sous-unité (23-28 S) sont des molécules de choix pour étudier les relations phylogénétiques entre les différents organismes vivants, et pour procéder à leur identification. Notamment Takahashi et al., Biochim. Biophys. Acta 134.124-133 (1967) ont montré la valeur taxonomique des sous-unités de l'ARN ribosomique en procédant à des expériences d'hybridation d'ARNr de référence avec des ADN d'espèces proches. Ces expériences font ressortir un pourcentage d'homologie quantifiable, reproductible et représentatif de l'éloignement taxonomique par rapport à l'espèce de référence. De même, Fox et al., International Journal of Systematic Bacteriology, 27:44-57 (1977), ont montré l'intérêt des ARNr 16 S pour la taxonomie des procaryotes.
La valeur taxonomique des séquences nucléotidiques des sous-unités de l'ARNr a été soulignée notamment par : Pace et Campbell, J. of Bacteriology 107 : 543-547 (1971), qui discutent des ARN ribosomiques de diverses espèces bactériennes et d'une méthode d'hybridation pour quantifier des niveaux d'homologie entre ces espèces ; et Woese et coll., Microbiological Reviews 47 : 621-669 (1983), ainsi que Grayet et coll., Nucleic Acids Research 12 : 5837-5852 (1984), qui montrent par des comparaisons de séquences d'ARN 16S que des régions hautement conservées sont intercalées avec des régions de moyenne et basse homologie, même dans le cas d'espèces proches.
En fait, les ARN ribosomiques sont présents dans tous les organismes vivants, de la bactérie à l'homme. Ils présentent une séquence nucléotidique particulière faite d'une succession de domaines caractérisés par une vitesse d'évolution variable. Dans ce dernier cas, certains domaines sont conservés chez tous les organismes, ou dans des groupes d'organismes, et sont donc utilisables comme sites de complémentarité pour l'hybridation à des amorces oligonucléotidiques universelles de séquençage ou d'amplification. Lorsqu'au contraire, la vitesse d'évolution d'un certain domaine est élevée, celui-ci peut être utilisé pour élaborer des sondes spécifiques, selon les cas, de l'espèce, du genre, de la famille ou du règne. Les ARNr constituent une molécule très abondante dans toutes les cellules, représentant plus de 90 % des ARN totaux. Leur organisation en famille multigénique a pour résultat que leur séquence est représentative d'une espèce, ou éventuellement d'une population, plutôt que d'un individu.
L'utilisation d'ARN ribosomique, en tant que cible, pour des réactions d'hybridation, peut être effectuée sur culture, par exemple sur culture bactérienne, ou sur un échantillon clinique, après transcription inverse suivie éventuellement d'une amplification enzymatique in vitro , en utilisant les méthodes connues, la PCR (Polymerase Chain Reaction) : Saiki et al., Science, 230:1350-1355 (1985), la TAS (Transcription Amplification System) : Kwoh et al., P.N.A.S. USA, 86:1173-1177 (1989), la 3SR (Self Sustained Séquence Replication) : Guatelli et al., P.N.A.S. USA,
87:1874-1878 (1990) ou toute autre méthode d'amplification appropriée. On peut également utiliser directement comme cible l'ADN dont l'ARN ribosomique est le produit de transcription.
Le développement de tests visant à mettre en évidence la présence d'ARNr dans un échantillon se heurte toutefois à certaines difficultés, liées notamment à la conformation des molécules dans l'échantillon. En effet, la molécule d'ARNr, bien que monocaténaire, présente des structures dites secondaires. Elle contient en effet des séquences auto-complémentaires qui, dans des conditions physico-chimiques déterminées, sont capables de s'apparier localement, par hybridation intramoléculaire, en se repliant sur elles-mêmes et en formant ainsi des structures dites "en épingle à cheveux" ou en "tiges-boucles" (les "boucles" correspondant à des parties de séquences non auto-complémentaires situées entre deux séquences impliquées chacune dans une hybridation intramoléculaire) ; voir par exemple la Figure 1. L'existence de structures de type "tige-boucle" a été prouvée expérimentalement ; voir par exemple Noller et al., in the Ribosome : Structure, Function and Evolution, op. cit. Le résultat est une structure secondaire organisée comparable à celle de la figure 1 qui représente la structure secondaire de l'ARNr 16 S d'E. Coli (Gutell et al., Comparative Anatomy of the 16 S-like ribosomal RNA, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 32:155-216 (1985)). Des structures secondaires analogues sont bien entendu présentes dans la forme simple brin de l'ADN dont l'ARNr est le produit de transcription.
Les structures secondaires présentes dans les acides nucléiques sont à l'origine de difficultés d'hybridation des sondes oligonucléotidiques, car elles sont difficilement accessibles auxdites sondes ; voir notamment Shimomaye et Salvato, Gène Anal. Techn.. 6 : 25-28 (1989). Pour cette raison, la demande de brevet PCT WO 91/00926 décrit un procédé dans lequel on choisit une région-cible de l'ARNr qui contienne le moins possible de structures secondaires. Mais un tel choix soulève des difficultés car les régions d'intérêt diagnostic, ayant varié dans le processus d'évolution, sont le plus souvent situées à l'intérieur desdites structures secondaires. On peut envisager d'éliminer les structures secondaires par dénaturation thermique ou à l'aide d'agents alcalins comme l'hydroxyde de sodium. Toutefois, il a été montré qu'une partie des structures secondaires et/ou tertiaires n'était pas dénaturée dans les conditions de dénaturation utilisées habituellement ; voir notamment EP-0318245, dont les auteurs ont montré en outre que les structures secondaires résiduelles peuvent inhiber, voire bloquer la formation d'un hybride entre une sonde et une séquence nucléique cible intégrée dans une structure secondaire. En outre, la dénaturation thermique n'est pas propice à la réalisation de l'hybridation dans un
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26} appareil automatique, car elle nécessite d'opérer à des températures variées. Enfin, l'utilisation d'hydroxyde de sodium pose des problèmes de corrosion et de précision des doses introduites.
L'invention a pour objet un dispositif permettant la déstabilisation des structures secondaires intracaténaires d'un polynucleotide simple brin, et permettant simultanément la capture dudit polynucleotide, ce qui facilite en outre des opérations ultérieures telles que la détection par hybridation, l'amplification ou le séquençage.
En outre, le dispositif de l'invention peut être utilisé sans dénaturation préalable du polynucleotide cible simple brin. Le dispositif peut donc être utilisé dans un appareil automatique, fonctionnant à température fixe, par exemple à 37°C.
L'invention a donc pour objet un dispositif pour la déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire présente dans un polynucleotide simple brin, caractérisé par le fait qu'il contient un oligonucléotide fixé sur un support, ledit oligonucléotide contenant une séquence dite déstabilisante capable de s'hybrider avec une séquence non auto-complémentaire participant à ladite structure secondaire dudit polynucleotide, et par le fait qu'il est utilisable comme sonde de capture pour ledit polynucleotide.
Autrement dit, l'oligonucléotide fixé sur un support joue à la fois le rôle de déstabilisant et le rôle de sonde de capture. Comme cela a été indiqué ci- dessus, on appelle sonde de capture un oligonucléotide fixé sur un support, et permettant l'isolement de la cible.
L'oligonucléotide peut être un fragment d'ADN ou d'ARN naturel, ou un oligonucléotide naturel ou de synthèse, ou un fragment d'ADN ou d'ARN de synthèse soit non modifié, soit comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre autre base modifée permettant l'hybridation. Des modifications chimiques appropriées peuvent permettre par exemple d'améliorer la résistance vis-à-vis d'une dégration enzymatique, en particulier due aux nucléases, et d'accroître en outre le rendement d'hybridation, bien entendu sans affecter l'enchainement des bases. Des exemples en sont l'introduction entre au moins deux nucleotides d'un groupement choisi parmi les esters de diphosphate, d'alkyl- et aryl-phosphonate et de phosphorothioate, ou le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide ; voir à ce sujet P.E. Nielsen et al. Science, 254, 1497-1500 (1991). Le support peut être un support macromoléculaire, et en particulier un support solide. Les supports utilisables sont connus en soi. Il peut s'agir par exemple de la paroi d'un tube à essais, d'une plaque de polystyrène ou de nylon, d'un cône (par exemple en copolymère butadiène-styrène), de billes ou de microsphères de latex, etc. L'oligonucléotide déstabilisant doit être capable d'entrer en concurrence avec la séquence complémentaire de la séquence qu'il reconnaît dans la structure secondaire de la cible. Pour cette raison, la séquence reconnue par l'oligonucléotide ne doit pas consister uniquement en une partie elle-même auto-complémentaire de la cible, car la sonde oligonucléotidique comporterait alors elle aussi une séquence auto¬ complémentaire et se replierait sur elle-même, de sorte qu'elle ne pourrait pas jouer son rôle de sonde déstabilisante sans dénaturation préalable. II convient de noter qu'il n'était pas évident qu'une sonde fixée sur un support, et donc soumise à des contraintes stériques, puisse être utilisée comme moyen de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire dont l'accessibilité est bien entendu fortement réduite, comme un simple examen de la figure 1 permet de le comprendre, et cela d'autant plus qu'en réalité, les polynucléotides tels que les ARNr ont une structure tertiaire qui, en général, complique encore davantage les problèmes d'accessibilité des sondes oligonucléotidiques fixées. Ce résultat est d'autant plus remarquable qu'en fait, comme cela est montré dans la partie expérimentale, il n'est même pas nécessaire d'effectuer une dénaturation préalable du polynucléotide-cible pour que le dispositif de l'invention fonctionne de manière satisfaisante.
Dans la demande de brevet EP-0318245, on a décrit des essais d'hybridation en phase liquide dans lesquels on utilise un ou plusieurs oligonucléotide s auxiliaires dont la capacité d'hybridation avec une séquence impliquée dans une structure secondaire de la cible permet de favoriser l'hybridation d'une autre sonde spécifique reconnaissant une autre séquence également présente dans ladite structure secondaire. Il est indiqué dans cette demande de brevet européen que le fait de travailler en milieu hétérogène, c'est-à-dire avec fixation d'un réactif sur une phase solide, ne favorise pas l'hybridation, pour des raisons qui tiennent à l'encombrement et à l'orientation des molécules. C'est manifestement pour cette raison que les auteurs de la demande de brevet européen citée ont opté pour la réalisation d'essais en phase liquide. Il existait donc, chez les spécialistes, un préjugé contre la possibilité d'utiliser un oligonucléotide fixé sur un support solide et, malgré cela, capable de déstabiliser une structure secondaire, sans l'aide d'un oligonucléotide auxiliaire. Pour fixer l'oligonucléotide sur le support, on peut utiliser toutes les méthodes connues telles que par exemple la fixation par établissement d'une liaison covalente, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un ligand lui-même fixé au support par au moins une liaison covalente ou par adsorption. On peut citer à ce propos les documents WO 88/01302 ainsi que FR-9109057 (2.679.255).
La séquence déstabilisante de l'oligonucléotide utilisé dans le dispositif de l'invention doit avoir une longueur suffisante (c'est-à-dire un nombre de motifs nucléotidiques suffisant) pour provoquer la déstabilisation de la structure secondaire de la cible à une température prédéterminée.
Il est connu que la stabilité d'un duplex nucléique augmente avec le nombre de bases appariées, ce qui se traduit par le fait que la température Tm (température de dissociation de 50 % des duplex) augmente, pour un oligonucléotide donné, lorsqu'on le soumet à une élongation par augmentation du nombre de motifs nucléotidiques.
La séquence oligonucléotidique déstabilisante devra donc avoir une longueur suffisante pour pouvoir à la fois rompre le duplex formé par les séquences capables d'hybridation intracaténaire, par déplacement d'un des brins, et inhiber efficacement la reformation de la structure secondaire par hybridation intracaténaire, à la température à laquelle on opère. On a découvert de façon surprenante que malgré les contraintes prévisibles nées de l'utilisation d'un oligonucléotide déstabilisant fixé sur un support, il est possible d'obtenir une déstabilisation satisfaisante de la structure secondaire à des températures inférieures à 50°C, et cela sans dénaturation préalable du polynucléotide-cible, tout en utilisant des oligonucléotides relativement courts, ayant par exemple de 20 à 40 nucleotides. En pratique, on peut opérer généralement entre 0 et 45°C environ, et en particulier à 37°C, ce qui représente un avantage évident. L'invention a donc également pour objet un procédé de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire d'un polynucleotide simple-brin et de capture dudit polynucleotide, caractérisé par le fait que l'on met en contact un dispositif tel que défini ci-dessus avec une phase liquide contenant, ou susceptible de contenir, ledit polynucleotide, à une température inférieure à 50"C. La phase liquide est par exemple un échantillon biologique ou un isolât de culture dans lequel on souhaite rechercher, pour la doser ou la caractériser, une séquence polynucléotidique d'intérêt, comme cela a été rappelé dans la partie introductive ci-dessus. Par exemple, si l'on ajoute à la phase liquide un second oligonucléotide capable de s'hybrider avec une séquence autre que la séquence reconnue par la séquence déstabilisante, ce second oligonucléotide pourra être utilisé, en quantité suffisante, soit comme sonde de détection (le second oligonucléotide est alors un oligonucléotide marqué), soit comme amorce pour l'amplification ou le séquençage de la cible par élongation du second oligonucléotide.
Bien entendu, le second oligonucléotide devra avoir une longueur appropriée, et en particulier suffisamment courte pour assurer une spécificité à la température à laquelle on opère. Le second oligonucléotide a généralement une longueur inférieure à 25 nucleotides, en particulier de 8 à 20 nucleotides.
La séquence reconnue par le second oligonucléotide, lorsqu'il est présent, est généralement située dans la partie déstabilisée de la structure secondaire.
Pour effectuer l'élongation du second oligonucléotide, il convient d'ajouter à la phase liquide en quantité suffisante les nucleotides élémentaires et une polymérase telle qu'une ADN polymérase ou, lorsque la cible est un ARN ou une transcriptase inverse (ADN polymérase ARN dépendante).
Par utilisation de nucleotides contenant en outre des nucleotides modifiés, par exemple des nucleotides terminateurs de chaîne ou des nucleotides marqués, il est possible de synthétiser et caractériser des produits d'élongation du second oligonucléotide. L'une des applications peut être le séquençage, effectué par la méthode de Sanger ou selon toute autre méthode appropriée.
On peut mettre également à profit la déstabilisation de la structure secondaire pour synthétiser une séquence complémentaire de la cible par élongation de la sonde de capture, par addition à la phase liquide des nucleotides élémentaires et d'une polymérase et, dans ce cas, la sonde de capture sera bien entendu fixée par son extrémité 5'. Ici encore, il est possible de procéder à un séquençage par utilisation de nucleotides mélangés à des nucleotides modifiés.
On sait par ailleurs qu'il existe des polymérases capables de déplacer les brins d'un duplex pour copier l'un des deux brins : c'est le cas par exemple de la
E. Coli DNA polymérase I ; voir notamment J. Sambrook et al. Moleculàr Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), chap.5 page 34.
Lorsque l'oligonucléotide de capture est fixé au support par son extrémité 3', et que le second oligonucléotide est capable de s'hybrider avec une séquence de la cible située en aval par rapport à la séquence reconnue par la sonde de capture (c'est-à-dire avec une séquence située entre l'extrémité 3' de la cible et la séquence reconnue par l'oligonucléotide de capture), il est possible de procéder à une élongation du second oligonucléotide de façon à synthétiser une séquence complémentaire de la région de la cible située entre le second oligonucléotide et la sonde de capture, et dans le cas où l'on utilise une polymérase capable de déplacer les brins d'un duplex, l'élongation du second oligonucléotide peut se poursuivre jusqu'au-delà de la séquence reconnue par la sonde de capture, et le produit d'élongation du second oligonucléotide se trouvera relargué en solution.
Lorsque l'oligonucléotide de capture est fixé au support par son extrémité 5', l'addition d'une polymérase dans des conditions permettant l'élongation conduit alors à une élongation de l'oligonucléotide de capture. Lorsqu'un second oligonucléotide, capable de s'hybrider avec une séquence de la cible situé en aval par rapport à la séquence reconnue par l'oligonucléotide de capture, est également présent, l'addition d'une polymérase dans des conditions permettant l'élongation conduit à l'élongation des deux oligonucléotides, et dans le cas où l'on utilise une polymérase capable de déplacer les brins d'un duplex, la progression de l'élongation du second oligonucléotide provoquera la déshybridation de la cible d'avec la sonde de capture (et son produit d'élongation). Le produit d'élongation de la sonde de capture sera alors sous forme monobrin et fixé au support solide, tandis que le produit d'élongation du second oligonucléotide sera relargué en solution sous la forme d'un duplex formé avec la cible.
Ainsi, le procédé de la présente demande permet de réaliser facilement, tout en mettant à profit les avantages propres aux procédés en phase solide, la détection, éventuellement quantitative, la caractérisation et l'amplification de séquences nucléotidiques présentes dans des structures secondaires, toutes opérations qui, jusqu'à présent, soulevaient des difficultés techniques importantes.
L'invention concerne également les dispositifs particuliers et procédés décrits ci-après dans la partie expérimentale, et notamment l'utilisation des sondes de capture particulières décrites, y compris lorsqu'elles sont utilisées avec les seconds oligonucléotides dénommés "sondes de détection" dans la partie expérimentale, c'est- à-dire :
- utilisation des sondes de capture SEQ ID No. 2, 6, 8, 10, ou 12 ;
- utilisation, respectivement comme sonde de capture et comme second oligonucléotide, des couples de sondes suivants : 2 et 1 ; 6 et 5 ; 8 et 7 ; 10 et 9 ; 12 et 13 ; 12 et, en mélange, 14, 15 et 16. Les exemples suivants illustrent l'invention. Dans ces exemples, on fait référence aux dessins annexés dans lesquelles:
- la Fig.l représente la structure secondaire de l'ARN ribosomique 16S d'E.Coli d'après Gutell R.R., B.Weiser, C.R. Woese, and H.F. Noller, 1985. Comparative anatomy of the 16S-like ribosomal RNA. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 32:155-216, et - la Fig.2 représente un détail de la Fig.l, avec des précisions sur la séquence des sondes utilisées à l'exemple 1.
Exemple 1:
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37°C sans dénaturation préalable et permettant d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus présent dans une structure secondaire permettant de distinguer les espèces Escherichia coli et Shigella des autres espèces bactériennes. La séquence des sondes utilisées est donnée dans le Tableau 1 ci-après.
Dans un premier temps, on a constaté expérimentalement que la présence de la structure secondaire empêche l'hybridation d'une sonde de détection spécifique et donc l'obtention d'un signal. La cible est la région tige-boucle de l'ARNr en position 435-500 de la figure 1. La numérotation est celle de Gutell R.R., B. Weiser, C.R. Woese, and H.F. Noller, 1985. Comparative anatomy of the 16S-like ribosomal
RNA. Prog. Nucleic Acid. Res. Mol., Biol. 32:155-216. La sonde de détection Gl du tableau 1 est complémentaire d'une partie de cette structure et est, d'après les connaissances actuelles, spécifique de l'entité taxonomique E. coli-Shigella. L'hybridation des ARNr d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de détection non-radioactif et semi-automatisé décrit dans le brevet français n° 90
07249 en utilisant une sonde de capture S8L de spécificité eubactérienne et une sonde de détection Gl conjuguée à la peroxydase. La manipulation a été conduite dans une plaque de microtitration selon le protocole suivant.
Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de 1 ng/μl de l'oligonucléotide de capture dont l'extrémité 5' a réagi avec le réactif
Aminolink 2 (Applied Biosystems, Foster city , Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCl 0.15 M phosphate de sodium pH 7.0). La plaque est incubée 2 h à 37° C puis lavée 3 fois avec 300 μl de PBST (PBS lx, Tween 20:0,5 %° (Merck 822184)).
L'ARNr cible est extrait de chaque bactérie selon la technique suivante. 1,5 ml de culture bactérienne est centrifugé et le culot repris dans 75 μl de tampon Tris
(Tris 25 mM, EDTA 10 mM, saccharose 50 mM pH 8) et 25 μl de solution de lysozyme (1 mg/ml en tampon Tris). Après incubation 30 min à 37°C, 50 μl de phénol sont ajoutés et le tube est agité fortement pendant 30 secondes. On rajoute 50 μl de chloroforme et on agite à nouveau 2 secondes. Après centrifugation pendant 5 min, on récupère la phase aqueuse. La cible constituée par 10 μl d'extrait d'ARN totaux est mélangée avec 40 μl de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de sperme de saumon 10 μg/ml (Sigma D 9156)). L'ensemble est ajouté dans le puits à 50 μl d'une solution du conjugué oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de 0.1 ng/μl en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 % sérum de cheval (BioMérieux 55842)). La plaque est incubée 1 h à 37° C puis lavée par 3 fois 300 μl de PBST. Dans chaque puits, on rajoute 100 μl de substrat OPD (ortho- phénylènediamine Cambridge Médical Biotechnology ref/456) dans un tampon 0,055 M acide citrique, 0,1 M monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93) à la concentration de 4 mg/ml, auquel on ajoute extemporanément du peroxyde d'hydrogène à 30% dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique est bloquée par 100 μl d'acide sulfurique IN et la lecture est effectuée sur Axia Microreader (BioMérieux) à 492 nm.
Les bactéries-cibles étaient notamment les suivantes : - 50 isolats ou souches E. coli (dont ATCC 25290, 25922, 27165, 10536,
4157, 11775T);
- Divers autres Escherichia (18 isolats) : E. fergusonii, E. hermanii, E. vulneris :
- 30 Shigella : S. boydii, S. dysenteriae (dont ATCC 29027), S. flexneri, S. sonnei ;
- Divers Salmonella (27 isolats ou souches) : S. arizonae (dont ATCC 13314, 13323, 12325), S. choleraesuis (ATCC 13312), S. gallinarum, S. give, S. paratyphi A, S. shomron, S. sophia, S. typhimurium (dont ATCC 14028 et 13311), S. spp (ATCC 9712, 1202, 11997, 8388, 6962, 29628) ; - Diverses entérobactéries : Citrobacter amalonaticus dont ATCC 25405,
Citrobacter freundii dont ATCC 11102, Enterobacter cloacae dont ATCC 13047, Enterobacter sakazaki dont CUETM 79104 et ATCC 29544, Enterobacter taylorae (CUETM 452384), Hafnia alvei, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae dont ATCC 13886 et divers autres Klebsiella, Kluyvera ascorbata ATCC 33433, Moellerella wisconsensis (dont CDC 182679 et 306575), Morganella morganii, Proteus mirabilis,
Proteus morganii (dont ATCC 25830), Proteus penneri, Proteus rettgeri, Proteus vulgaris (dont ATCC 6380), Providencia rettgeri, Pseudomonas aeruginosa ATCC 35422, Serratia grimesii ATCC 14460, Serratia marcescens dont ATCC 8195 et 8100, divers autres Serratia, Yersinia enterolitica dont ATCC 23715, Yersinia intermedia dont ATCC 29909, Yersinia kristensenii dont ATCC 35669, Yersinia pseudotuberculosis dont ATCC 23207 et NCTC 8487 ; - Enterococcus faecalis. Résultats :
Les résultats de spécificité montrent que ce système de détection ne donne aucun signal dans les conditions indiquées. La sonde de capture S8L n'est pas en cause : en effet, si l'on remplace la sonde de détection spécifique Gl par la sonde de détection eubactérienne E220, (capture : S8L) toutes les souches d'E. coli-Shigella, ainsi que les autres espèces bactériennes sélectionnées donnent un résultat positif. Les résultats négatifs obtenus avec la sonde de détection Gl pour les souches E. coli- Shigella indiquent donc que celle-ci ne peut pas accéder à sa cible à cause de la présence, dans les conditions expérimentales utilisées, de la structure secondaire décrite dans la figure 1.
Lorsque la sonde de capture eubactérienne S8L est remplacée dans les mêmes conditions par l'oligonucléotide G3 (Tableau 1 et Figure 2) situé dans la tige- boucle de coordonnées 435-500, un signal est obtenu avec toutes les souches E. coli et Shigella. La spécificité est alors celle désirée: cette combinaison de sondes ne présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, de toute autre espèce bactérienne, y compris les espèces proches d'Escherichia, à l'exception toutefois d'Escherichia fergusonii qui donne un résultat positif. Ainsi, l'oligonucléotide G3 fixé sur un support solide remplit la fonction de capture et de déstabilisation. En outre, ces expériences montrent clairement que la dénaturation préalable de l'ARN n'est pas nécessaire.
L'adaptation du même système capture G3 - détection Gl sur l'automate VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société BioMérieux SA - VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR ("Solid Phase Réceptacle") qui est un support conique réalisé à partir d'un matériau vendu sous la dénomination K résine (copolymère butadiène-styrène) et commercialisé par la société VITEK (USA). Les divers réactifs sont disposés dans une barrette à plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs et qui fait donc office de pipette. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône.
Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement l'oligonucléotide de capture déstabilisant comportant à son extrémité 5' le ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-réf.400808) à une concentration de 1 ng/μl dans un volume de 315 μl d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM).
Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37°C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide. La barrette contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire: 200 μl d'une solution à 0, 1 ng/μl du conjugué de détection oligonucléotide-phosphatase alcaline, 2 fois 600 μl de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat. Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10 μl de l'ARN extrait dans le même tampon que pour le protocole microplaque ci-dessus.
Après incubation 30 minutes du cône par le mélange cible plus sonde de détection, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween. 250 μl de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diethanolamine sont aspirés dans le cône, puis relâchés dans une cuvette de lecture. L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette.
On a obtenu avec ce système les mêmes résultats qu'avec les microplaques. Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à l'extrémité 5' de la sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle. La sonde ainsi couplée à un ligand possédant un groupement polaire (aminé primaire), et fixée de façon passive sur le support, procure un signal amélioré ; voir la demande FR 91 09057.
Exemple 2
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37°C et permettant d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant les genres Salmonella et Vibrio, ce locus étant présent dans une structure secondaire différente de celle de l'exemple 1. La cible comprend les deux structures secondaires de l'ARNr 16S, analogues à celles présentes aux positions 770 à 880 de la figure 1. La séquence des sondes est donnée au Tableau 1.
L'hybridation des ARNr de souches bactériennes a été conduite selon le protocole décrit dans l'exemple 1. Il utilise la sonde déstabilisante dSAL9-2 pour la capture et l'oligonucléotide SAL9 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase). La sonde de détection SAL9 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de la structure secondaire et doit, selon les connaissances actuelles, être spécifique de l'entité taxonomique genre Salmonella.
Les bactéries-cibles étaient notamment les suivantes : - 20 isolats ou souches de Salmonella arizoriae dont ATCC 13314, 13323 et
12325 ; - les autres Salmonella déjà utilisés à l'exemple 1 ;
- divers autres Salmonella, et notamment : S. bakou, S. derby, S. enteritidis, S. gallinarum, S. paratyphii A, B et C, S. panama, S. pullorum, S. thomson ;
- diverses enterobactéries (34) des genres Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Serratia ; dont ATCC 11102, 13047, 29544,
13886, 6380, 35422, 8195, déjà cités et 25830 (Proteus morganii) ;
- divers E. coli dont ATCC 27165 et 4157
- divers Shigella dont ATCC 11060
- divers autres Escherichia (blattae ATCC 29907T, fergusonii, hermanii, vulgaris) ;
- divers Vibrio (anguillarum, harveyi), Aeromonas et Pleisiomonas.
Les résultats obtenus indiquent que la combinaison de sondes utilisée est spécifique des genres Salmonella et d'au moins une espèce du genre Vibrio (Il s'agit de Vibrio anguillarum). Elle ne présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, des autres espèces bactériennes, y compris les espèces proches de ces deux genres. Ceci est contrôlé par le fait qu'une hybridation avec la sonde de capture S8L de spécificité eubactérienne, et la sonde de détection E220 de spécificité eubactérienne est positive avec les souches non-Salmonella et non-Vibrio. II convient de remarquer que la sonde SAL9 ne diffère de la séquence correspondante chez Escherichia coli (Fig.l) que par un seul nucléotide. La sonde SAL9 est cependant suffisamment spécifique et donne un résultat négatif pour E. coli.
L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS (bioMérieux S.A., France) a permis l'obtention des mêmes résultats qu'en microplaques.
Exemple 3 :
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37 °C et permettant d'hybrider en phase solide l'ARN r 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant l'espèce Listeria monocytogenes, ce locus étant présent dans une structure secondaire de l'ARNr 16S, analogue à celle présente entre les positions 1235 et 1300 de la figure 1.
L'hybridation des ARNr de souches bactériennes a été conduite selon le protocole décrit dans l'exemple 1, à l'exception de l'extraction de l'ARN r cible qui est effectuée de la manière suivante : 1,5 ml de culture bactérienne est centrifugé et le culot repris dans 75 μl de tampon Tris (Tris 50 mM, EDTA 10 mM, saccharose 25 % pH 8) et 25 μl de solution de mutanolysine (Sigma) (1 mg/ml en tampon Tris) et de lysozyme (1 mg/ml en tampon Tris). Après incubation 30 min à 37°C, 50 μl de phénol sont ajoutés et le tube est agité fortement pendant 30 secondes. On rajoute 50 μl de chloroforme et on agite à nouveau pendant 2 secondes. Après centrifugation pendant 5 min, on récupère la phase aqueuse.
Ce protocole utilise la sonde déstabilisante RL1 pour la capture et l'oligonucléotide RL2 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase). La sonde de détection RL2 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de cette structure et devrait, selon les connaissances actuelles, être spécifiques de Listeria monocytogenes.
Les bactéries-cibles étaient les suivantes : - onze isolats de Listeria monocytogenes ; - trois Listeria grayi dont ATCC 19120, quatre Listeria innocua, trois
Listeria murrayi dont CCM 5990 (CCUG 4984), trois Listeria ivanovii, quatre Listeria seeligeri dont CIP 100100 (CCUG 15530), trois Listeria spp, trois Listeria welschineri dont CIP 8149 (CCUG 15529).
Les résultats obtenus montrent que cette combinaison de sondes est spécifique pour Listeria monocytogenes. Elle ne présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, de toute autre espèce bactérienne " testée, y compris les espèces proches, tel Listeria innocua.
L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS (bioMérieux S.A., France) a permis d'observer les mêmes résultats qu'en microplaques.
Exemple 4 :
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37° C et permettant d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant l'espèce Chlamydia trachomatis, ce locus étant dans une structure secondaire analogue à celle située entre les positions 585 et 655 de la figure 1.
L'hybridation des ARNr de souches bactériennes a été conduite selon le protocole décrit dans l'exemple 1. L'hybridation utilise la sonde déstabilisante dCT4 pour la capture et l'oligonucléotide CT3 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase). La sonde de détection CT3 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de cette structure et devrait, selon les connaissances actuelles, être spécifique de Chlamydia trachomatis.
Les bactéries-cibles étaient les suivantes : - quatre isolats de Chlamydia trachomatis répondant respectivement à la classification Serovar Ba, D, K et L2 ; Wang S.P. et al., 1975, J.Clin.Microbiol. 1:250-255.
- divers autres Chlamydia dont Chlamydia Pneumoniae et Chlamydia psittaci ; - diverses souches non-Chlamydiae des genres Acinetobacter,
Achromobacter, Aeromonas, Bacillus, Branhamella, Candida, Chromobacter, Enterobacter, Enterococcus, Haemophilus, Klebsiella, Escherichia, Lactobacillus, Listeria, Micrococcus, Neisseria, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus. Les résultats obtenus montrent que cette combinaison de sondes est spécifique de Chlamydia trachomatis. Elle ne présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, de toute autre espèce bactérienne testée, y compris les espèces proches, tel Chlamydia psittaci.
L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS (bioMérieux S.A., France) a permis d'observer les mêmes résultats qu'en microplaque.
Exemple 5 :
On décrit ici un procédé fonctionnant en particulier à 37°C et permettant d'hybrider en phase solide l'ARNr 16S au niveau d'un locus d'intérêt discriminant diverses espèces du genre Mycobacterium, ce locus étant présent dans une structure secondaire analogue à celle située entre les positions 140-230 de la figure 1.
L'hybridation des ARNr des souches bactériennes testées a été conduite selon le protocole décrit dans l'exemple 1, à l'exception de l'extraction de l'ARNr cible effectuée selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries à Gram positif décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al, Wiley interscience, New York.
Le test d'hybridation utilise la sonde déstabilisante dTBl pour la capture et l'oligonucléotide bovis 310 comme sonde de détection (conjuguée à la peroxydase).
La sonde de détection bovis 310 du tableau 1 est complémentaire d'une partie de la structure secondaire et devrait, d'après les connaissances actuelles, être spécifique du groupe taxonomique tuberculosis regroupant M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti.
Les bactéries-cibles étaient les suivantes : - 27 isolats ou souches de Mycobacterium tuberculosis dont ATCC 27294 et
NCTC 7417 ;
- 5 souches ou isolats de Mycobacterium bovis dont ATCC 19210 et M. bovis BCG (Copenhague 1077) ;
- diverses souches de Mycobacterium avium et intracellulare dont ATCC 35716, 29555, 35764, 35847, 35770 ;
- divers Mycobacterium (chelonae, diernoferi, flavescens, fortuitum, gastri, gordonae, kansasii, lactis, marinum, non chromogenicum, phlei, scrofulaceum, simiae, smegmatis, szulgai, terme, triviale, xenopi, vaccae) dont ATCC 14472, 14470, 12478, 19981, 25275, 35799, 15755 et 23292 ; - Non-mycobacteries : Actinomadura madurae, Nocardia asteroides ATCC
3308, Nocardia brasilensis ATCC 19296, Rhodococcus aichiensis et Rhodococcus sputi.
Les résultats obtenus montrent que cette combinaison de sondes est spécifique de Mycobacterium tuberculosis. Elle ne présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ARNr, des autres espèces bactériennes, y compris les autres espèces du genre Mycobacterium, alors même que l'ARNr de ces souches est bien disponible pour l'hybridation comme le confirme l'hybridation observée avec la sonde de capture S8M de spécificité eubactérienne, et la sonde de détection E220 de spécificité eubactérienne. L'adaptation de la même combinaison de sondes sur l'automate VIDAS
(bioMérieux S.A., France) permet d'obtenir les mêmes résultats qu'en microplaque.
De la même manière, il est possible de définir des sondes spécifiques du groupe taxonomique complexe Mycobacterium avium-M. intracellulare encore appelé "MAI". Le test d'hybridation utilise la sonde déstabilisante dTBl et le mélange des sondes de détection MAI 1, MAI 2, MAI 3 (tableau 1).
Figure imgf000020_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif pour la déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire présente dans un polynucleotide simple brin, caractérisé par le fait qu'il contient un oligonucléotide fixé sur un support solide, ledit oligonucléotide contenant une séquence dite déstabilisante capable de s'hybrider avec une séquence non auto-complémentaire participant à ladite structure secondaire dudit polynucleotide, et par le fait qu'il est utilisable comme sonde de capture pour ledit polynucleotide.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit support est un support macromoléculaire.
3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ledit polynucleotide est un ARN.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ladite séquence déstabilisante a une longueur suffisante pour provoquer la déstabilisation de ladite structure secondaire à une température prédéterminée, inférieure à 50°C, choisie en particulier de 0 à 45°C.
5. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite séquence déstabilisante contient de 20 à 40 nucleotides. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que ledit oligonucléotide est choisi parmi ceux ayant les séquences SEQ ID No 2,
6, 8, 10 et 12.
7. Procédé de déstabilisation d'une structure secondaire intracaténaire d'un polynucleotide simple brin, et de capture dudit polynucleotide, caractérisé par le fait que l'on met en contact un dispositif tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes avec une phase liquide contenant ledit polynucleotide, à une température inférieure à 50°C, ledit oligonucléotide jouant le rôle de sonde de capture.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé par le fait que ladite température est 37°C.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé par le fait que l'on opère sans dénaturation préalable dudit polynucleotide.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait que ladite phase liquide contient en outre un second oligonucléotide capable de s'hybrider avec une séquence dudit polynucleotide autre que la séquence reconnue par ladite séquence déstabilisante.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÈGLE 26)
11. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ledit second oligonucléotide est capable de s'hybrider avec une séquence participant à ladite structure secondaire dudit polynucleotide.
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé par le fait que ledit second oligonucléotide est marqué.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé par le fait que ladite phase liquide contient en outre une polymérase et des nucleotides, et que l'on effectue une élongation dudit second oligonucléotide.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé par le fait que ladite phase liquide contient en outre une polymérase et des nucleotides, et que l'on effectue une élongation de la sonde de capture, ou une élongation de la sonde de capture et du second oligonucléotide.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, caractérisé par le fait que la phase liquide contient en outre des nucleotides modifiés.
16. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que lesdits nucleotides modifiés sont des nucleotides terminateurs de chaîne ou des nucleotides marqués.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé par le fait que ladite sonde de capture est choisie parmi celles ayant les séquences SEQ ID No 2, 6, 8, 10 et 12.
18. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que l'on utilise comme sonde de capture et comme second oligonucléotide, respectivement, les oligonucléotides choisis parmi ceux ayant les séquences SEQ ID No. : - 2 et l
- 6 et 5 - 8 et 7
- 10 et 9
- 12 et 13 - 12 et, en mélange, 14, 15 et 16.
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