WO1994018237A1 - Novel peptide having receptor activity and dna coding for said peptide - Google Patents

Novel peptide having receptor activity and dna coding for said peptide Download PDF

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WO1994018237A1
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Yoh Takuwa
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Tsumura & Co.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants

Definitions

  • Novel peptides having receptor activity and DNA encoding the peptides
  • the present invention relates to a novel peptide having a receptor activity coupled to a GTP-binding protein, which is used for, for example, treatment of a disease and development of a medicament, and a DNA encoding the peptide.
  • animal cells respond to a primary messenger that acts on cells from outside the cell, such as neurotransmitters, hormones, or watercoils, and responds to that information. It has the function of performing physiological responses to Most of this primary messenger binds to receptors, which are specific glycoproteins located on the surface of cell membranes and directed outward.
  • receptors which are specific glycoproteins located on the surface of cell membranes and directed outward.
  • an intracellular enzyme hereinafter referred to as an effector
  • a secondary information transmitter that is sent out into the cell from the intracellular enzyme is generated, and a physiological response corresponding to the secondary information transmitter is performed.
  • an effector an intracellular enzyme
  • a guanine nucleotide-binding control protein (hereinafter, referred to as a GTP-binding protein) that transmits a stimulus received by the receptor to the effector due to the binding of the primary messenger to the receptor. It has been shown to intervene.
  • the GTP-binding protein usually exists as a guanine nucleosidonilate (hereinafter referred to as GDP) -bound form that is inactive against the effector.
  • GDP guanine nucleosidonilate
  • the receptor to which the primary messenger is bound promotes the dissociation of GDP bound to this inactive GTP binding protein.
  • the GTP-binding protein from which GDP has been dissociated binds to GTP and ⁇ Mg + ion present in excess in the cell, and is converted to an active form. This active form of the GTP-binding protein activates the effector.
  • the GTP-binding protein acting in this manner consists of three subunits, ⁇ , ⁇ , and 7.
  • G D ⁇ binding inactive form It exists as a ⁇ 7-associated form, and in the GTP-binding form, it is present. And ⁇ ⁇ .
  • ⁇ subunits include (1) those that control the enzymatic action involved in the production of secondary signaling substances, (2) those that control the opening and closing of the channel, Etc. have been confirmed.
  • Examples of the former are those that activate adenylate cyclase ( ⁇ s ) or those that inactivate it.
  • Subunit activating (C.q) isostatic 5 'is known. Examples of the latter include a subunit that has the effect of opening the K + channel, and an effect that closes the Ca 2 + channel when present in a large amount in nerve cells. Subunits ( 0. ) etc. are known.
  • the effects of the /? 7 subunit on effectors include (1) activation of adenylate cyclase, (2) opening of K + channel, and And (3) activation of phospholipase C has been reported.
  • Polypeptide 'sex holmon' receptor Neurokinin: Ne-char — ( Nature ) 329, 836-838 (1987), Endoselin: Nehi char 348, 730 ⁇ 732 (1990)]
  • GTP-binding proteins and receptors that couple to these GTP-binding proteins play a very important role in signal transduction. Therefore, a peptide having a receptor activity conjugated to a GTP-binding protein present in various organs was found, and its structure and correlation with the GTP-binding protein and the receptor were clarified. Is extremely important in elucidating the causes of physiological phenomena and diseases and in developing pharmaceuticals. For this purpose, it is important to find a DNA encoding a peptide having a receptor activity coupled to a GTP-binding protein, and to enable the cloning of this peptide.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a novel peptide having a receptor activity useful for drug design, and a DNA encoding the peptide.
  • conjugated receptor In order to newly identify a peptide having a receptor activity that is conjugated to a GTP-binding protein (hereinafter, referred to as a conjugated receptor), the present inventors have proposed an conjugated receptor that has already been identified. Focusing on the fact that the amino acid sequence has regions of high homology between different conjugated receptors, a polymerase chain using degenerate nucleotide mix primers corresponding to these regions was used. We have found that a new conjugated receptor can be identified using nonreaction (PCR) amplification. Book Based on such a viewpoint, the inventors have identified a novel conjugated receptor and a DNA encoding this conjugated receptor from the cDNA of rat aortic smooth muscle (RASM) cells. That is, the present invention provides a novel peptide having a receptor activity encoded by a DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a novel peptide containing, as a main component, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a DNA encoding a novel peptide having a receptor activity, which comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a conjugated receptor has a structure as shown in FIG. 1 and has the following features.
  • poly (A) + RNA was isolated from RASM cells and synthesized from this poly (A) + R ⁇ 'A.
  • a partial cDNA corresponding to the amino acid sequence between the above-mentioned transmembrane domains III and VI is selectively increased by a PCR reaction. This selective PCR amplification is performed using a pair of upstream primer and downstream primer that are presumed to correspond to this partial cDNA.
  • the primer used was a digital-enhanced nucleotide mix primer.
  • a cDNA library derived from RASM is screened, and cDNA encoding the full length of the conjugated receptor is screened. Obtainable.
  • the conjugated receptor of the present invention can be synthesized. That is, an appropriate DNA fragment is synthesized based on the nucleotide sequence of the DNA of the present invention, and the obtained fragment is recloned to an appropriate vector such as a plasmid. Next, the vector is introduced into a microorganism such as E. coli to obtain a transformant. By expressing DNA using this transformant, the conjugated receptor of the present invention can be obtained.
  • the distribution of the conjugated receptor of the present invention was determined by isolating mRKA corresponding to the DNA of the present invention from the RNA extracted from various tissues or cells of the rat in accordance with the Northern blotting.
  • the conjugated receptor of the present invention was confirmed by performing hybridization using a DNA fragment as a probe. Tar was found to be highly distributed in the heart, lungs, stomach and small intestine.
  • the conjugated receptor of the present invention was involved in intimal neovascularization in a murine carotid artery ballooning model created as an arteriosclerosis model of the aortic artery.
  • a murine carotid artery ballooning model created as an arteriosclerosis model of the aortic artery.
  • increased neovascularization of the injured vascular intima thickens the vascular intima and causes vasoconstriction.
  • the expression level of mRNA corresponding to the novel conjugated receptor of the present invention is significantly reduced as compared with healthy endovascular cells. all right.
  • the conjugated receptor of the present invention and the DNA encoding the same can be used to investigate the causes of various diseases caused by enhanced angiogenesis in the intima of the blood vessel and to treat these diseases It is extremely useful for designing effective and preventive medicines.
  • the DNA of the present invention is a DNA partial region corresponding to a structurally characteristic site of an amino acid sequence common to conjugated receptor pigs such as the transmembrane domain described above. Contains. Using these partial DNAs as primers, new subfamilies of conjugated receptors can be found.
  • the DNA encoding the novel peptide having the conjugated receptor activity of the present invention includes all recombinant DNAs, chromosomes, cDNAs, etc., including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. You.
  • the novel receptor having one activity of the present invention.
  • expression of the DNA synthesizes a large amount of a peptide having a receptor activity which co-acts with a GTP-binding protein. be able to.
  • This peptide greatly contributes to elucidating the interrelationship between GTP-binding proteins and receptors that couple to GTP-binding proteins.
  • physiological phenomena involving this receptor can be achieved.
  • it is extremely useful for the design of pharmaceuticals used for treatment and prevention of such diseases.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing the structure of a receptor coupled to a general GTP-binding protein.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the amino acid sequence of the novel peptide having the receptor activity of the present invention and the nucleotide sequence of DNA encoding the novel peptide.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing the amino acid sequence of the novel peptide having the receptor activity of the present invention and the nucleotide sequence of DNA encoding the novel peptide.
  • FIG. 4 is a photograph showing an autoradiograph showing the results of a Northern plot performed to determine the distribution of the novel peptide of the present invention in the examples.
  • RNA and preparation of cDNA library were cultured from aortic smooth muscle tissue slices [Expplant method; Chamley-Campbell, J., Champbell, GR, Ross, R. (1972), Physiol. Rev. 59, 1-61], and used from 5 to 10 generations.
  • Total RNA was extracted from RASM cells according to the guanidine isocyanate phenol / chloroform extraction method described by Chomczynski, Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987). This total RNA was passed twice through a column filled with Oligo dt Cellulose (manufactured by Collaborative Reseach) to purify poly (A) + RNA.
  • a cDNA library was synthesized as follows. First, a 5-fold concentrated solution of cDNA synthesis first buffer [250 mM Tris buffer (pH 8.3), 25 mM magnesium chloride, 375 mM potassium chloride] was placed in an eppendorf tube (1.5 ml). , 50mM Jichiosu Rei (manufactured by Boeringer Co., Ltd.) toe Le] ⁇ t, o re-Gore (d T) i 5
  • cDNAs larger than O kb were selected. These c DNA collected Ri by the ethanol precipitation, was dissolved in ⁇ 2 0 9 ⁇ i, to this solution, scan subjected to E c 0 RI cut and alkaline phosphate off ⁇ data Ichize process gt10 Phage DNA (Stratagene) 2 ⁇ , ⁇ 4 10-fold concentrated solution of ligase buffer 1 ⁇ I And T4 ligase was added and incubated at 15 ° C. for 16 hours, and the cDNA was ligated to the EcoRI site of; Igt10. A sphage extraction protein solution (manufactured by Stratagene) was added to the fruit, an in vitro package reaction was performed, and library synthesis was completed.
  • SM buffer [50 mM Tris buffer (pH 7.5), lOOm sodium chloride, 8 mM magnesium sulfate, 0.01% gelatin] 500 and It was added finely click b chloroform (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2 0 lambda £, and stored until use at 4 ° C.
  • cDNA synthesis primary buffer 8 ⁇ 20.19.5 ⁇ , RNase inhibitor 1-2, deoxynucleotide 4; /, 70 ° C 2 ⁇ g of RASM poly (A) + RNA heat-denatured for 3 min, 0.5 ⁇ t of downstream PCR primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and AMV reverse transcriptase 4 /
  • the mixture was incubated at 42 ° C for 60 minutes to synthesize the first strand of cDNA.
  • the nucleotide sequence of the PCR product subcloned to PUC118 in step (2) was determined by the dideoxy method, and it should be a PCR clone having significant homology to a known conjugated receptor. It was confirmed.
  • This PCR clone was subjected to EcoRI treatment to cut out a cDNA insert.
  • the probe was obtained by labeling g radioactivity.
  • FIGS. 2 and 3 The amino acid sequence of the peptide coded by the cDNA, which is deduced from the base sequence of the cDNA, is also shown in FIGS. 2 and 3.
  • the asterisk (*) indicates a laser near the ⁇ ′ end. Glycosylation sites linking with lagins are indicated, and + symbols indicate intracellular loops and phosphorylation sites near the C-terminus. I to VII each represent a transmembrane domain.
  • step A (1) the rat cerebrum, cerebellum, heart, lung, liver, spleen, stomach, and small intestine 5 g of poly (A) + RNA obtained from smooth muscle cells (A10) derived from kidney, adrenal gland, testis, skeletal muscle, aorta, RASM and rat fetal aorta, ⁇ g was electrophoresed on a 1% agarose gel supplemented with formaldehyde at 80 V for 3 hours. After this, the RNA was transferred from the gel to a nylon membrane.
  • the BamHI to Ec0RV1.3 kb fragment of the AGR16 cDNA obtained in step A (3) was converted into a fragment according to the same procedure as the method shown in step A (3). [.
  • the probe was obtained by labeling with — 32 P] d CTP.

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Description

明 細 書
レセプタ ー活性を有する新規べプチ ドお よび該ぺプチ ドを コ ー ドする D N A
技術分野
本発明は、 例えば、 疾病の治療およ び医薬品の開発に利用 さ れる G T P結合蛋白質と共役する レセプタ ー活性を有する 新規べプチ ドぉよ ぴ該ぺプチ ドをコ一 ドする D N Aに関する。 背景技術
迷走神経が刺激される と、 心臓の拍動が遅く なる ことが知 られている。 この よ う な現象は、 迷走神経末端の神経細胞か ら ァセチルコ リ ンが分泌さ れ、 洞房結節においてァセチルコ リ ンが特異的な K +チャ ンネルを活性化するために起こ る こ とがわかっている。 このよ う な作用を示すァセチルコリ ンは、 通常、 神経伝達物質と呼ばれている。
このよ う に、 動物細胞は、 例えば、 神経伝達物質、 ホルモ ン、 ォー タ コ イ ドのよ う な細胞外から細胞に対して作用する 第一次情報伝達物質に応答して、 その情報に対する生理反応 を営む機能を有している。 この第一次情報伝達物質のほ と ん どは、 細胞膜の表面上に膜外に向いて存在する特異的糖蛋白 質である レセプタ ー （受容体） に結合する。 この レセプタ 一 に第一次情報伝達物質が結合する と、 同 じ細胞膜の膜内に向 いて存在する細胞内酵素 （以下、 効果器という ） が活性化さ れる。 この効果器の活性化によ って細胞内酵素から細胞内に 送り 出さ れる第二次情報伝達物質が生成され、 この第二次情 報伝達物質に応じた生理反応が営まれる。 このよ う な情報伝達系において、 レセプターから効果器に 至る経路には、 も う 一つの蛋白質が存在する こ とがわかって いる。 すなわち、 第一次情報伝達物質がレセプタ ーに結合し たこ とに よ り レセプタ 一が受け取つた刺激を、 効果器に伝達 する グァニンヌク レオチ ド結合性制御蛋白質 （以下.、 G T P 結合蛋白質と いう ） が介在する ことが明らかにされている。
G T P結合蛋白質は、 通常、 効果器に対して不活性なグァ ニンヌク レオシ ドニリ ン酸 （以下、 G D P と い う ） 結合型と して存在する。 第一次情報伝達物質が結合したレセプターは、 この不活性な状態の G T P結合蛋白質に結合した G D P の解 離を促進する 。 この結果、 G D Pが解離された G T P結合蛋 白質は、 細胞内に過剰に存在する G T Pおよ ぴ M g +イ オン と結合し、 活性型に変換される。 この活性型の G T P結合蛋 白質が効果器を活性化する。
このよ う な働き をする G T P結合蛋白質は、 《 、 β、 7 の 3 つのサブュニッ トからなる。 G D Ρ結合不活性型では 。 β 7 会合型と して存在し、 G T P結合活性型では、 。 と β γ と に解離している。
このう ち、 α サブユニ ッ ト と しては、 （ 1 ) 第二次情報伝 達物質の産生に関与する酵素作用を制御している もの、 （ 2 ) カ チオンチャ ンネルの開閉を制御する もの、 等が確認されて いる。 前者の例と しては、 アデ二ル酸シクラ一ゼを活性化す るサブュニ ッ ト （ α s ) 若 しく は不活性化するサブュニッ ト
( α ■ ) 、 網膜に存在し、 c G M Pホスホジエステラ ーゼを 活性化するサブユニ ッ ト （ a t ) 、 およ び、 I P S を産生す るホスホ リ ノ、。ーゼ C を活性化するサブュニッ ト （ 。 q ) 等力5' 知られている。 また、 後者の例と しては、 K +チ ャ ンネ ルを 開 く 作用を有するサブユニ ッ ト 、 およ び、 神経細胞 に大量に存在し、 C a 2 +チ ャ ンネ ルを閉じる作用を有する サブュニ ッ ト （ 0 。） 等が知られている。
また、 /? 7 サブユニ ッ トのエフ ェク タ ーに対する作用と し ては、 （ 1 ) アデ二ル酸シク ラ ーゼの活性化、 （ 2 ) K +チ ヤ ンネルを開 く作用、 およ び、 （ 3 ) ホスホリ パーゼ Cの活 性化等が報告されている。
第一次情報伝達物質と結合し、 かつ、 G T P結合蛋白質に 結合した G D Pの解離を促進する レセプター、 すなわち、 G T P結合蛋白質と共役する レセプタ ーは、 数百種類存在して いる ことが明 らかにされている。 G T P結合蛋白質と共役す る レセプタ ー と しては、 以下の よ う な も のが知られている。 ア ド レナ リ ン ' レセ プタ ー [サ イエ ンス （Sience) 238, 650 〜 656 (1987)] 、
ム ス カ リ ン '性アセチル コ リ ン ' レセ プタ ー [ジ ャ ーナル - ォ ブ ' ノ ィ ォ ロジ カ ル ' ケ ミ ス ト リ （Journal of Bioligical Chemistry) 260， 7927〜 7935 (1985) ] 、
ポ リ ペプチ ド'性ホルモ ン ' レセ プタ 一 [ニュ ー ロ キニ ン ： ネ —チヤ — （Nature) 329，836〜 838(1987)、 エ ン ドセ リ ン ： ネ ー チ ヤ 一 348， 730〜 732 (1990)]
ト ロ ン ビン · レセプタ ー [セル （Cell) 64， 1057〜 1068(1991)] 、 脂質性ホルモ ン · レセ プタ ー （ ト ロ ン ポキサ ン A 2等） しかし、 これらの レセプタ ー と G T P結合蛋白質との関係 に関 しては、 これらの レセプタ ーと しての活性を有するぺプ チ ドを用いた研究に も 関わ らず、 その選択性を規定する 因子 はいまだ解明 されていない。
しかし、 G T P結合蛋白質およ びこの G T P結合蛋白質と 共役する レセプタ ーは、 情報伝達に極めて重要な役割を果た している こ と は明 らかである。 従って、 各種臓器に存在する G T P結合蛋白質と共役する レセプタ ー活性を有するぺプチ ドを見出だし、 その構造お よ び G T P結合蛋白質とのレセプ タ ー との相互関係を明 らかにするこ と は、 生理現象、 疾患の 原因の解明お よび医薬品の開発を進める上で極めて重要であ る 。 このためには、 G T P結合蛋白質と共役する レセプタ ー 活性を有するぺプチ ドをコ一ドする D N Aを見出だし、 この ペプチ ドのク ロー ン化を可能にする こ とが重要である。
本発明は、 かかる点に鑑みてなされた も のであ り 、 医薬品 のデザィ ンに有用な レセプタ ー活性を有する新規べプチ ドぉ よ ぴ該ぺプチ ドを コ一 ドする D N Aを提供する。
発明の開示
本発明者ら は、 G T P結合蛋白質と共役する レセプタ 一活 性を有するペプチ ド （以下、 共役型レセプタ ー と記す） を新 たに確認するために、 すでに確認されている共役型レセプタ 一 のア ミ ノ酸配列が、 異なる共役型レセプターの間で相同性が 高い領域を有する こ と に着目 し、 これらの領域に対応するデ ジエネレー ト ヌク レオチ ドミ ッ クスプライマー を用いたポリ メ ラ一ゼチェ イ ン リ アクシ ョ ン （ P C R ) 増幅法を用いて、 新たな共役型 レセプタ 一を確認でき る こ と を見出だした。 本 発明者ら は、 この よ う な見地に基づいて、 ラ ッ ト の大動脈平 滑筋 （ R A S M ) 細胞の c D N Aから新規な共役型レセプタ ー およびこの共役型レセプター をコー ドする D N Aを確認した。 すなわち、 本発明は、 配列番号 1 の塩基配列を含有する D N Aによ り コ ー ドされる レセプター活性を有する新規べプチ ドを提供する 。
また、 配列番号 2 のア ミ ノ酸配列を有するポ リ ペプチ ドを 主要構成成分と して含有する新規ペプチ ドを提供する。
また、 配列番号 1 の塩基配列を含有する 、 レセプタ一活性 を有する新規べプチ ドをコ一 ドする D N Aを提供する。
以下、 本発明をさ ら に詳細に説明する。
本発明者ら は、 既知の共役型レセプタ ーのァ ミ ノ酸配列の 構造について検討した。 一般に、 共役型レセプタ ーは、 図 1 に示すよ う な構造を有し、 以下のよ う な特徴を有する。
( 1 ) 細胞膜 1 1 を貫通する、 2 0〜 2 6残基の疎水性ァ ミ ノ酸から なる 7 つのス ト レ ッ チ （夫々 を N末端側から ト ラ ンス メ ン ブラ ン ドメ イ ン I 〜VIIと レ う） の存在。
( 2 ) N末端付近のァスパラギンと リ ンクする グリ コ レー シ ョ ン部位の存在。
( 3 ) 細胞内ループおよび C末端付近の リ ン酸化部位の存 在。
このよ う な共役型レセプタ ーのアミ ノ酸配列の構造上の特 徴を、 今だ見出だされていない新規な共役型レセプタ ー も有 している 'こ とが推定できる 。 そこで、 R A S M細胞からポリ ( A ) + R N Aを分離し、 このポリ （ A ) + R λ' Aから合成 した c D N Aのう ち、 上述の ト ランスメ ンブラ ン ドメ イ ン IIIお よ び VIの間のア ミ ノ酸配列に対応する部分 c D N Aを P C R反応に よ り 選択的に増加させる。 この選択的な P C R 増幅法は、 この部分 c DN Aに対応する こ とが推定される一 対の上流側プライ マーおよ ぴ下流側プラ イマー を用いて行わ れる。 このプライ マーには、 デジエネ レー トヌ ク レオチ ドミ ッ クスプラ イ マー を用いた。
次に、 この よ う に して得られた P C R産物を プローブと し て、 RA S M由来の c DN Aラ イブラ リ ーをスク リ ーニング し、 共役型レセプタ ーの全長を コー ドする c D N Aを得る こ とができ る。
このよ う に して確認された配列番号 1の塩基配列を有する D NAを発現させる こ とに よ り 、 本発明の共役型レセプタ ー を合成する こ とができ る。 すなわち、 本発明の D N Aの塩基 配列に基いて、 適当な D N A断片を合成し、 これを例えばプ ラス ミ ドの よ う な適当なベク タ ーにリ ク ローニ ングする 。 次 いで、 このべクタ 一を、 例えば大腸菌のよ う な微生物に揷入 して形質転換体を得る。 この形質転換体を用いて D N Aを発 現させる こ と によ り 、 本発明の共役型レセプタ ーを得る こ と ができる。
本発明の共役型レセプターの分布を、 ラ ッ ト の各種組織ま たは細胞から抽出 した R N Aの う ち、 本発明の D N Aに対応 する m R K Aをノ ーザンブロ ッ トに従って分離した後に、 本 発明の D N Aの断片を プロ ーブと してハイブリ ダイゼーシ ョ ン を行う こ と によ り確認した と ころ、 本発明の共役型レセプ タ ーは、 心臓、 肺、 胃およ び小腸に多 く 分布している こ とが ゎカゝつた。
さ ら に、 心；！状動脈の動脈硬化モデルと して作成されたネ ズ ミ 頸動脈のバルー ン障害モデルにおいて、 本発明の共役型 レセプタ ーが血管内膜新生に関与する こ とが確認された。 す なわち、 ネズミ頸動脈のバルーン障害モデルでは、 傷ついた 血管内膜の新生の亢進によ って血管内膜が厚 く な り、 血管狭 搾が引き起こ される こ とが知られている。 この よ う な状態に ある血管内膜細胞では、 本発明の新規な共役型レセプタ ーに 対応する m R N Aの発現量が健常な血管内膜細胞に比べて有 意に減少している こ とがわかった。 この よ う な見地力 ら、 本 発明の共役型レセプタ ーお よ びこれを コー ドする D N Aは、 血管内膜における血管新生の亢進に起因する各種疾患の原因 の究明や、 これらの疾患の治療およ び予防に有効な医薬品の デザイ ンに極めて有用である。
さ ら に、 本発明の D N Aは、 上述の ト ラ ンスメ ンブラ ン ド メ イ ンの よ う な共役型レセブタ ーに共通する ア ミ ノ酸配列の 構造上特徴的な部位に対応する D N A部分領域を含んでいる。 これらの部分 D N Aをプラ イ マーと して用いて、 新たな共役 型レセプタ ーのサブフ ァ ミ リ ー を見出だすこ とができ る 。
なお、 本発明の共役型レセ プタ ー活性を有する新規べプチ ドを コ一 ドする D N Aは、 配列番号 1 の塩基配列を包含する 全ての組み換え D N A、 染色体およ び c D N A等を含んでい る。
以上説明 した よ う に、 本発明の レセプタ 一活性を有する新 規ぺプチ ドぉ よび該ぺプチ ドを コ一ドする D N Aによれば、 この D N Aを発現させるこ と に よ り 、 G T P結合蛋白質と共 役する レセプター活性を有するぺプチ ドを大量に合成する こ とができ る。 このペプチ ドは、 G T P結合蛋白質と G T P結 合蛋白質と共役する レセプタ ー との相互関係の解明に大き く 寄与する も のである。 さ ら に、 G T P結合蛋白質と共役する レセプタ 一のアミ ノ酸配列およ びこのぺプチ ドを コ一 ドする DNAの塩基配列を明らかにする こと によ り、 このレセプタ ー が関与する生理現象および疾患のメ カ ニズムの解明に有用で ある と共に、 この よ う な疾患の治療お よ び予防に利用さ れる 医薬品のデザイ ンに極めて有用である。
図面の簡単な説明
図 1 は、 一般的な G T P結合蛋白質と共役する レセプタ ー の構造を示す説明図である。
図 2は、 本発明のレセプタ ー活性を有する新規べプチ ドの ァ ミ ノ酸配列およ び該新規ペプチ ドを コ一 ドする DN Aの塩 基配列を示す説明図である。
図 3は、 本発明の レセプタ ー活性を有する新規べプチ ドの ア ミ ノ酸配列およ ぴ該新規ペプチ ドを コー ドする DN Aの塩 基配列を示す説明図である。
図 4は、 実施例において本発明の新規べプチ ドの分布を調 ベるために行ったノ ーザンプロ ッ ト の結果を示すォー ト ラジ ォグラフ を示す写真である。
発明を実施する ための最良の形態
A . 共役型 レセプタ ーをコー ドする D N Aの塩基配列の決 ( 1 ) R N Aの調製および c D NA ラ イ ブラ リ ーの作成 本実施例において、 R A S M細胞は、 大動脈平滑筋組織片 培養 〔ェクス プラ ン ト 法 ； Chamley-Campbell, J.，Champbell，G. R. , Ross, R. (1972), Physiol. Rev.59, 1-61 〕 に従って得、 5 〜 1 0世 代継代した も のを用レ た。 Chomczynski, Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)に記載に よ ってされたグァニジンイ ソチア ネ一 ト フエ ノール/クロ ロ フ オ ルム抽出法に従って、 R A S M細胞から総 R N Aを抽出 した。 こ の総 R N Aを、 オ リ ゴ d t セル ロ ース （Collaborative Reseach社製） を充填 したカ ラ ム に 2 回通して、 ポリ （A ) + R N Aを精製した。
次に、 c D N Aラ イブラリ 一を以下の よ う にして合成した。 まず、 エツペン ドル フチューブ （1.5ml)に、 c D N A合成 第一緩衝液の 5倍濃厚溶液 〔250mMト リ ス緩衝液 （pH8.3) , 25mM塩 化マグネ シ ウ ム， 375mM塩化カ リ ゥム， 50mMジチオス レィ トー ル〕 （Boeringer 社製） μ t 、 オ リ ゴ （ d T ) i 5
(Boeringer社製） μ t , H 2 0 6 ^ , R N a s e イ ン ヒ ビタ ー （ Boeringer 社製） 1 ， デォ キ シヌ ク レ オチ ド
( d A T P , d C T P 1 // ί , d G Τ Ρ , d T T P )
( Boeringer 社製） μ ί , 〔 " 一 3 2 P〕 d C T P， 上述の よ う に精製した後に， 7 0 °C， 3分間熱変性した R A S Mの ポリ （A ) + R N A 2 ;z ( 2 ^ g ) , A M V逆転写酵素
( Boeringer 社製） 2 〃 を入れて、 4 2 °Cで 1 2 0分間保 温し、 c D N A第一鎖を合成した。 この結果物を、 7 0 °Cで 3 分間保温した後、 水中で急冷 した。 次に、 c D N A合成第 二緩衝液の二倍濃厚溶液 4 0 μ t , Η 2 0 3 4 μ ί , 大腸菌
D N Aポリ メ ラーゼ 5 μ およ び R N a s e H 1 μ i をエツ ペン ドルフチューブに加え、 1 2 °Cで 6 0分間、 次いで、 2 2 °Cで 6 0分間保温し、 c D N A第二鎖を合成した。 次に、
6 5 °C、 1 0 分間保温して酵素を不活性化した後に、 T 4 D N Aポリ メ ラ ーゼを添加し、 3 7 °C， 1 0分間保温して、 c D N A末端を平滑化した。 この結果物を フエノ ール Zク ロ 口 ホ ルム （片山化学社製） に よ る抽出およ びエタ ノ ール沈降に 付 した後、 得られた c D N Aを H 2 0 3 /z に溶解した。 こ の溶液に、 E c o R l ZN o t l Z B a m H I アダプタ ー
(宝酒造社製） μ t ( 1 2 0 p m o 1 ) , T 4 リ ガーゼ緩 衝液の 1 0倍濃厚溶液 1 および Τ 4 リ ガ―ゼ （New England BioLab.社製） 0 . 7 を添加し、 1 5 °C、 1 6時 間保温して、 c D N Aの両端にアダプタ ーを連結した。 さ ら に、 7 0 °C、 1 5 分間保温して T 4 リ ガーゼを不活性化した 後、 T 4 ポリ ヌク レオチドキナーゼを添加し、 3 7 °C、 3 0 分間保温し、 アダプタ 一の 5 ' 末端を リ ン酸化した。 さ ら に
7 0 °C, 1 5 分間保温して T 4 ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼを 不活性化した後、 セ フ ァ ロ ース C L — 2 B (Pharmacia
Biochemical Co. Ltd社製）を用いたク ロマ ト グラ フィ 一に よ り 、
2 . O k b以上の大き さの c D N Aを選別した。 これらの c D N Aをエタ ノール沈降に よ り 集め、 Η 2 0 9 μ i に溶解し た後、 この溶液に、 E c 0 R I 切断およ びアルカ リ ホス フ ァ タ 一ゼ処理を施した ス g t 1 0 フ ァ ージ D N A (Stratagene 社製） 2 μ ， Τ 4 リ ガーゼ緩衝液の 1 0倍濃厚溶液 1 μ I およ び T 4 リ ガ一ゼを添加し、 1 5 °C， 1 6 時間保温して、 c D N A を ； I g t 1 0 の E c o R I 部位に連結 した。 この結 果物にス フ ァ ージ抽出タ ンパク液 （ Stratagene社製） を添加 し、 イ ン ビ ト ロパッ ケージ反応を行い、 ライ ブラ リ ー合成を 終了 した。 得られた c D N Aラ イブラ リ 一を含む溶液に、 S Mバッ ファー 〔 50mMト リス緩衝液 （pH7.5)， lOOm塩化ナ ト リ ウム、 8mM硫酸マグネシ ウム， 0.01%ゼラチン〕 5 0 0 およ びク ロ ロホルム （和光純薬社製） 2 0 Λ £ を添加し、 用時まで 4 °Cで保存した。
( 2 ) P C R
エツペン ドルフチュ ーブに、 c D N A合成第一緩衝液の 5 倍濃厚溶液 8 ， Η 2 0 1 9 . 5 μ ί , R N a s e イ ンヒ ビタ 一 2 ， デォキシヌ ク レオチ ド 4 ；/ ， 7 0 °C， 3分 間熱変性した R A S Mのポリ （ A ) + R N A 2 μ g , 配列番 号 4 の塩基配列から なる下流側 P C R プライ マー 0 . 5 μ t およ び A M V逆転写酵素 4 / を加え、 4 2 °C， 6 0分間保 温し、 c D N A第一鎖を合成した。
この反応液に、 Η 2 0 5 3 /ζ 、 P C R緩衝液 （ lOOmMト リ ス緩衝液 （ pH8.3)， 500mM塩化カ リ ゥム， 15mM塩化マグネシ ゥ ム， 0.01%ゼラチン〕 の 1 0 倍濃厚溶液 2 I , 配列番号 3 の塩基配列からなる上流側プラ イマ一 0 . 5 μ およ び T a q D K Aポリ メ ラ ーゼ （Perkin-Elmer社製） 0 . 5 μ t ( 2 . 5 U ) を添加 し、 この溶液に対して、 9 3 °C , 1 5分間、 5 5 °C , 2 分間、 7 2 °C， 4 分間を 1 サイ クルと して、 2 5 サ ィ ク ルの P C Rを施した。 このよ う に して得られた P C R反応物を、 1 %ァガロース ゲルを用いた電気泳動法に よ り 分離し、 3 0 0 〜 6 0 0 b p に相当するノ ン ドを切 り出 し、 ジー ンク リ ー ンキ ッ ト
(BiolOl社製） を用いて P C R生成物を精製した。 この P C R生成物に制限酵素 E c 0 R I (Boeringer社製） に よ る処理 を施した後、 再び、 ジーンク リ ーンキ ッ トで精製し、 結果物 を H 20 8 μ i に溶解した。 この溶液に E c 0 R I 切断およ びアルカ リ ホスフ ァ タ ーゼ処理した P U C 1 1 8 2 0 n g , T 4 リ ガーゼ緩衝液の 1 0 倍濃厚溶液 1 μ t T 4 リ ガーゼ 0 . Ί μ i 添加 し、 1 5 °C， 1 6 時間保温して、 P C R生 産物を P U C 1 1 8 に連結 した。
( 3 ) c D N Aラ イ ブラリ 一のスク リ ーニング
工程 （ 2 ) で P U C 1 1 8 にサブク ローニングした P C R 生産物の塩基配列をジデォキシ法によ り 決定し、 既知の共役 型 レセプタ 一 と有意の相同性を有する P C Rク ロ ーンである こ と を確認した。 この P C Rク ロー ン に E c o R I 処理を施 して、 c D N Aイ ンサー トを切り 出した。 このイ ンサー ト に、 [ « - 32P ] d C T P， ラ ンダムへキサプラ イマー、 大腸菌 D N Aポリ メ ラ一ゼク レノ ー断片 （以上、 日本ジーン社製） を用いて 2 〜 3 x 1 0 8 c p mZ g の放射活性に標識して、 プローブを得た。
このプローブを用いて、 工程 （ 1 ) で作成した R A S Mの c D N A ラ イ ブラ リ ーの中から、 6 x l 0 5個のク ロー ンに ついて、 プラ ークノヽイ ブリ ダィ ゼーシ ヨ ン法に従って、 スク リ 一ニングを施した。 ここで、 ハイ ブリ ダィゼーシ ョ ンは、 0 . 8 2 M塩化ナ ト リ ウム Z 5 0 %ホ ルムア ミ ド 0 . 5 % ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) サケ精子 D N A ( 1 6 Ί μ g / μ ί ) 中で、 4 2 °Cで行った。 この後、 フィ ルタ ー を、 3 0 で、 S S C (塩化ナ ト リ ウム 1 5 0 m M， クェン 酸ナ ト リ ウ ム 1 5 m M ) の 2 倍濃厚溶液/ / 1 % S D S混合溶 液中で 2 回洗浄し、 このフ ィ ルタ一についてォー ト ラジオグ ラ フ ィ 一に付した。 この結果に基づいて、 P C R プローブと ハイ プリ ダイ ズする 2個の陽性プラーク を単離した。 陽性の フ ァ ージク ロ ーンから ファ ージ D N A を精製し、 このフ ァ ー ジ D N Aからイ ンサー ト c D N Aを E c o R I で切り 出した。 得られたイ ンサー ト c D N Aを、 工程 （ 2 ) における P C R 生産物のサブクロ ーニ ングと 同様の手順に従っ て、 P U C 1 1 8 の E c 0 R I 部位にサブク ローニ ングした。 ジデォキシ 法に従っ て、 得られた c D N Aの塩基配列を決定した。 こ の 結果、 2 個の陽性プラ ークから得られた陽性フ ァ ージク ロ ー ンのぺプチ ドのコ 一ディ ングゥ領域の塩基配列は完全に一致 し、 いずれも完全長の コーディ ング領域を含んでいた。 この う ち、 2 . 9 k b のク ロー ン （以下、 A G R 1 6 とレ う ） の c D N A構造は、 図 2 およ び図 3 に示す通り である。 また、 この c D N Aの塩基配列から演繹された、 この c D N Aに よ り コー ドされるぺプチ ドのア ミ ノ酸配列を、 図 2 およ び図 3 に併記する。
なお、 図 2 および図 3 において、 * 印は、 λ'末端付近のァ ス ノ、。ラギン と リ ンクするグリ コ レーシ ョ ン部位を示し、 +印 は、 細胞内ループおよ び C末端付近の リ ン酸化部位を示 し、 I 〜 VIIは、 夫々 ト ラ ンスメ ンブラ ン ドメイ ン を示す。
B . 共役型レセプタ 一の分布
工程 A ( 1 ) に示す R A S M細胞からの総 R N Aの抽出 と ポリ （A) +R N Aの精製と同様の方法で、 ラ ッ トの、 大脳、 小脳、 心臓、 肺、 肝臓、 脾臓、 胃、 小腸、 腎臓、 副腎、 精巣、 骨格筋、 大動脈、 R A SMおよ ぴラ ッ ト胎児大動脈由来平滑 筋細胞 （ A 1 0 ) から得たポリ （ A ) + R N A 5 gある レ、 は総 R N A 1 0 μ gをホルムアルデヒ ドを添加した 1 %ァガ ロ ースゲルで、 8 0 V， 3時間電気泳動に付した。 この後、 R N Aをゲルから ナイ ロンメ ンブレンに転写した。 工程 A ( 3 ) で得られた A G R 1 6の c D N Aの B a mH I 〜 E c 0 R V 1 . 3 k b フ ラ グメ ン ト を、 工程 A ( 3 ) に示す方法 と 同様の手順に従って、 [ 。 — 32P ] d C T Pで標識して、 プロ一ブを得た。
このプローブを用いて、 工程 A (3 ) に示す方法と同様の 手順に従って、 ノ ーザンハイ ブリ ダィゼーシ ョ ンを行った。 この後、 メ ンブラ ンを、 5 0 °Cで 0. 1 S S C Z 0. 1 % S D S混合溶液中で洗浄し、 このメ ンブラ ンについてォー ト ラ ジオグラ フ ィ ーに付した。 この結果を図 4に示す。
図 4から明 らかな よ う に、 A G R 1 6に対応する m R N A の発現が、 心臓、 肺、 胃、 小腸に強 く 認められる。 配列表
配列番号 ： 1
配列の長さ ： 1 1 3 9
配列の型 ：核酸
. 鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直線鎖
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
CAGTCCCATG GCCCCGGCCG GCCACTGAGC CCCACCATGG GCGGTTTATA 50 CTCAGAGTAC CTCAATCCTG AGAAGGTTCA GGAACACTAC AATTACACCA 100 AGGAGACGCT GGACATGCAG GAGACGCCCT CCCGCAAGGT GGCCTCCGCC 150 TTCATCATCA TTTTATGCTG TGCCATCGTG GTGGAGAACC TTCTGGTGCT 200 AATCGCAGTG GCCAGGAACA GCAAGTTCCA CTCAGCCATG TACCTGTTCC 250 TCGGCAACCT GGCAGCCTCC GACCTGCTGG CAGGCGTGGC CTTCGTGGCC 300 AACACCTTGC TCTCCGGACC TGTCACCCTG TCCTTAACTC CCTTGCAGTG 350 GTTTGCCCGA GAGGGTTCAG CCTTCATCAC GCTCTCTGCC TCGGTCTTCA 400 GCCTCCTGGC CATCGCCATC GAGAGACAAG TGGCCATCGC CAAGGTCAAG 450 CTCTACGGCA GTGACAAAAG CTGTCGAATG TTGATGCTCA TTGGGGCCTC 500 TTGGCTGATA TCGCTGATTC TGGGTGGCTT GCCCATCCTG GGCTGGAATT 550 GTCTGGACCA TCTGGAGGCT TGCTCCACTG TGCTGCCCCT CTATGCTAAG 600 CACTATGTGC TCTGCGTGGT CACCATCTTC TCTGTCATCT TACTGGCTAT 650 CGTGGCCTTG TACGTCCGAA TCTACTTCGT AGTCCGCTCA AGCCATGCGG 700 ACGTTGCTGG TCCTCAGACG CTGGCCCTGC TCAAGACAGT CACCATCGTA 750 CTGGGTGTTT TCATCATCTG CTGGCTGCCG GCTTTTAGCA TCCTTCTCTT 800 AGACTCTACC TGTCCCGTCC GGGCCTGTCC TGTCCTCTAC AAAGCCCATT 850 ATTTCTTTGC CTTCGCCACC CTCAACTCTC TGCTCAACCC TGTCATCTAT 900 ACATGGCGTA GCCGGGACCT TCGGAGGGAG GTACTGAGGC CCCTGCTGTG 950 CTGGCGGCAG GGGAAGGGAG CAACAGGGCG CAGAGGTGGG AACCCTGGTC 1000 ACCGACTCCT GCCCCTCCGC AGCTCCAGCT CCCTGGAGAG AGGCTTGCAT 1050 ATGCCTACGT CGCCAACATT TCTGGAGGGC AACACAGTGG TCTGAGGGGA 1100 AATGTGAACT GATCTGTAAC CAAGCCACAG AGAGAGCTC 1139
配列番号 ： 2
配列の長さ ： 3 5 2
配列の型 ： アミ ノ酸
配列の種類 ： ポリべプチド
配列
Met Gly Gly Leu Tyr Ser Glu Tyr Leu Asn Pro Glu Lys Val Gin
5 10 15
Glu His Tyr Asn Tyr Thr Lys Glu Thr Leu Asp Met Gin Glu Thr
20 25 30
Pro Ser Arg Lys Val Ala Ser Ala Phe lie lie lie Leu Cys Cys
• 35 40 45
Ala lie Val Val Glu Asn Leu Leu Val Leu lie Ala Val Ala Arg
50 55 60
Asn Ser Lys Phe His Ser Ala Met Tyr Leu Phe Leu Gly Asn Leu
65 70 75
Ala Ala Ser Asp Leu Leu Ala Gly Val Ala Phe Val Ala Asn Thr
80 85 90
Leu Leu Ser Gly Pro Val Thr Leu Ser Leu Thr Pro Leu Gin Trp
95 100 105
Phe Ala Arg Glu Gly Ser Ala Phe lie Thr Leu Ser Ala Ser Val
110 115 120
Phe Ser Leu Leu Ala lie Ala lie Glu Arg Gin Val Ala lie Ala j.as Jes 6JV ΠΘΊ oj.d ηβι nai βαγ STH Αχο oJd usv Αχο Αχο βαν ςτε οτε ςοε
βαγ AID ュ m ρχν AXOSAT; AID UIO 6αν diェ SAQ ΠΘΊ ΠΘΊ o .d 6αν
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Z T
Z0Z00IP6d£/ Dd L£ZSl/t6 OM 320 325 330
Ser Ser Leu Glu Arg Gly Leu His Met Pro Thr Ser Pro Thr Phe
335 340 345
Leu Glu Gly Asn Thr Val Val
350
配列番号 ： 3
配列の長さ ： 3 3
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トポロジー ：直線鎖
配列の種類 ：他の核酸 合成 D N A
その他の特徴
ディジェネレート . ミ ックス ' プライマーである。
配列
GGAATTCTGT GYGYSATTGC IITKGAYMGS TAC
配列番号 ： 4
配列の長さ ： 3 6
配列の型 ：核酸
鎖の数： 一本鎖
トボロジ— ：直線鎖
配列の種類 ：他の核酸 合成 D N A
その他の特徴
ディジェネレート . ミ ッ クス ' プライマーである。
配列
GGAATTCA G WAGWAGGGCA GCCAGCAGAI SRYGAA

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1 の塩基配列を含有する D N A に よ り コ ー ド される レセプター活性を有する新規ペプチ ド。
2 . 配列番号 2 のア ミ ノ酸配列を有する ポリ ペプチ ドを主 要構成成分と して含有する請求項 1 記載の新規ペプチ ド。
3 . 配列番号 1 の塩基配列を含有する D N A。
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