WO1993016789A1 - Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en ×uvre - Google Patents

Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en ×uvre Download PDF

Info

Publication number
WO1993016789A1
WO1993016789A1 PCT/FR1993/000182 FR9300182W WO9316789A1 WO 1993016789 A1 WO1993016789 A1 WO 1993016789A1 FR 9300182 W FR9300182 W FR 9300182W WO 9316789 A1 WO9316789 A1 WO 9316789A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
component
electrophoresis
electrodes
transverse
volume
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/000182
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Louis Viovy
Jacques Prost
Philippe Sergot
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique
Priority to EP93905421A priority Critical patent/EP0627955A1/fr
Priority to JP5514596A priority patent/JPH07507134A/ja
Publication of WO1993016789A1 publication Critical patent/WO1993016789A1/fr

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44769—Continuous electrophoresis, i.e. the sample being continuously introduced, e.g. free flow electrophoresis [FFE]

Definitions

  • the present invention relates to a method of electrophoresis in a liquid vein, a method of optimizing the resolution of the separation in such a method, as well as an apparatus of electrophoresis in a liquid vein.
  • electrophoresis methods are used, both for the analysis and for the preparation of different substances.
  • the preparation of substances by electrophoresis in significant quantities is essentially carried out by electrophoresis in liquid vein.
  • This method is implemented in an apparatus which comprises a separation chamber of parallelepiped shape, along the length of which the treated liquid circulates while an electric field is applied in the direction of the width of the chamber. Electrodes are arranged at the ends of the volume delimited by the directions of length and thickness. As the thickness is much less than the width, the electric field created in the liquid which flows along the length is relatively uniform. The flow of liquid in the chamber is laminar.
  • the material to be separated is introduced at one longitudinal end of the chamber, through an injection orifice, and a separate product of interest at least is generally recovered by a collecting orifice placed at the other end of the chamber.
  • auxiliary devices intended to homogenize the temperature, to regulate it, to detect and / or visualize the products, etc. are also used in general.
  • the material to be separated is introduced through the injection orifice and forms a net which is entrained by the current.
  • the initial product separates in several nets each containing particles of a determined electrophoretic mobility.
  • this separation is subject to a certain number of disturbing phenomena which cause distortion of these nets.
  • disturbing phenomena mention may be made of that which is due to the profile of the velocities of theizide in the chamber (Poiseuille rofil), in the case of continuous electrophoresis.
  • Another disturbing phenomenon is electroendosmosis which depends on the zeta potential of the wall of the chamber faces.
  • This electrohydrodynamic phenomenon is currently the one which most reduces the resolution which can be obtained during a separation by electrophoresis in a liquid vein, when sufficient precautions have been taken.
  • the subject of the invention is the compensation of the electrohydrodynamic disturbing phenomenon observed in an electrophoresis in a liquid vein. It has been found according to the invention that, when a uniform electric field having a transverse alternating component, that is to say oriented in the direction of the thickness, was applied with a suitable amplitude and frequency, the average of this transverse alternative component being practically zero, the electrohydrodynamic disturbing phenomenon described by Rhodes et al. could be almost completely removed.
  • the methods according to the invention in no way modify the mobilities of the particles to be separated whose average displacement remains unchanged in the presence or absence of a transverse component of the electric field.
  • the hydrodynamic deformation, during a period of the field, of the medium containing the particles to be separated is so reduced that it would have practically no effect on a gel. Consequently, the frequencies used according to the invention are much higher than those of the electrophoresis methods taken from gel, and therefore would not cause the differentiation according to the size which is the object of the known methods. Conversely, the frequencies used in these known methods are not suitable for the methods according to the invention.
  • the invention relates to a method of electrophoresis in a liquid vein, of the type which comprises the circulation of a liquid medium in a volume, preferably substantially parallelepipedal, having dimensions of thickness, width and length, the direction of circulation corresponding to the direction of the length of said volume, the application of an electric separation field having a component, in the direction of the width, the mean of which is not zero, the introduction into this volume, upstream in the direction of circulation, of a sample intended to undergo separation by electrophoresis by migration of constituents in the width direction, and the extraction of a fraction of the liquid medium having undergone separation ;
  • the application of the electric separation field is carried out with a field which also has a transverse alternative component, that is to say oriented in the direction of the thickness, the mean of which is practically zero .
  • the method further comprises a preliminary step of determining at least one parameter of the transverse alternative component.
  • the determination step comprises determining the amplitude of the alternative component so that it is of the order of the square root of the amplitude of the component in the width direction.
  • the step of determining the parameter comprises reading at least one value of the parameter of the transverse alternative component on an abacus or a table.
  • the determination step comprises the prior experimental measurement of the variation of a property at least of the fraction obtained by extraction as a function of the variation of at least one parameter of the transverse alternative component .
  • the parameter of the transverse alter ⁇ native component is the amplitude of this component.
  • this step can advantageously include the determination of an additional parameter which is the frequency of the transverse AC component.
  • the invention also relates to a method for optimizing a liquid vein electrophoresis method of the type described in the preceding paragraphs, which comprises the execution of a series of preliminary electrophoresis operations such as, each operation, the applied electric field comprises, in addition to a component in the direction of the width, a transverse alternative component, that is to say oriented in the direction of the thickness, the average of which is practically zero, of determined amplitude and having a determined frequency, and a desired property of at least a fraction obtained with each operation is determined, the preliminary electrophoresis operations of the series differing from each other by 1 ' amplitude of the transverse alternative component of the applied field; the optimization method further comprises determining, from the results of the preliminary operations, the amplitude of the transverse alternative component of the electric field for which the desired property of at least the fraction obtained is optimal.
  • the invention also relates to an apparatus for electro ⁇ phoresis in a liquid vein, of the type which comprises a body delimiting a volume, preferably substantially parallelepipedic, having, in the direction of the thickness, a dimension much smaller than its dimensions in the directions of length and width, said volume being open at its longitudinal ends so that a fluid can circulate in the direction of the length of the volume, and a first set of electrodes placed on the short sides delimited by directions of thickness and length or near these short sides; according to the invention, the apparatus comprises a second set of electrodes placed on the sides parallel to the plane containing the width and the length, this second set of electrodes being intended to ensure a capacitive coupling in alternating current between an external generator alternating current and the liquid placed in said volume.
  • the capacitive coupling is obtained by using a set of electrodes comprising two large electrodes, placed on either side of said volume and each separated from this volume by a thin dielectric film l ' insulator of the liquid medium.
  • the dielectric is a polymer chosen from polyimides, polysulfones, parylenes, polyethylene terephthalate, and mineral oxides such as silicon oxide (silica).
  • the capacitive coupling is obtained by using, as a second set of electrodes, two sets of electrodes each formed of several electrode elements which are substantially parallel and elongated in the direction of the length of the body. , the electrode elements being intended to be directly in contact with the liquid medium placed in said body volume and being individually coupled by capacitors to an alternating current generator.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view and partly in the form of a block diagram of a electrophoresis apparatus in one embodiment of the invention
  • Figure 2 is a cross section of the apparatus of Figure 1
  • FIG. 3 is a diagram of another embodiment of the electrophoresis apparatus according to the invention
  • FIG. 4 is a graph showing the variation of the section of the net obtained for various electrophoresis conditions according to the invention.
  • Figures 1 and 2 show an example of an apparatus which can be used for the implementation of the electrophoresis method according to the invention.
  • the apparatus 10 has front faces 12, 14, for example formed from glass, polycarbonate, etc., advantageously in transparent or semi-transparent form so that the separation of the different constituents of the material to be observed separate when colored or otherwise visible.
  • These large walls are arranged vertically in Figure 1, the length being oriented in vertical direction, the width in horizontal direction in the plane of the figure while. the direction of the thickness is substantially perpendicular to the plane of the figure.
  • the thickness has been exaggerated in Figures 1 and 2 and that it is generally much smaller than the length and the width. In one example, the length is equal to 15 cm, the width to 5 cm, and the thickness to 6 mm. It should however be noted that the width can be greater than the length, the latter term being thus used because it corresponds to the longitudinal direction of fluid flow.
  • the electrophoresis chamber is delimited by small vertical sides 16, 18, delimited in the directions of length and thickness, and which retain the liquid.
  • Membranes 20, 22, parallel to the short sides 16, 18, are intended to delimit chambers in which electrodes 24, 26 are placed, for example metallic wires.
  • the volume delimited between the sides and the membranes contains a liquid substantially identical to that which is placed inside the chamber, but which is separated from the chamber by membranes 20, 22 which are permeable to ions, so that a electrical and ionic contact is established between the electrodes and the chamber, but that the electrolysis products which could form at the electrodes cannot penetrate into the chamber.
  • the electrodes 24 and 26 are connected by wires 28 and 30 to a generator 29 which, in the embodiment shown in FIG. 2, is a simple DC power supply, which is intended to create, with the electrodes 24 and 26, a component of the electrophoresis electric field oriented in the direction of the width of the chamber and whose mean is not zero.
  • the lower part of the chamber is delimited by an end wall 32.
  • This has one or more nozzles 34, 36, which allow the introduction of a fluid through the wall 32.
  • These nozzles may be identical, but they have been designated by different references in order to distinguish the nozzles 34 , used for the introduction of the liquid which constitutes the carrier fluid, from the nozzle 36, preferably of circular shape, used for the introduction of the material to be separated.
  • the upper part of the chamber is closed by an upper wall 38 which also includes nozzles 40, 42.
  • the nozzles 40 allow the outlet of the carrier liquid practically devoid of the constituents of the material to be separated, and the nozzles 42 collect threads of constituents of the material introduced through the nozzle 36.
  • nozzle assignments are only one example of implementation, since those skilled in the art know many devices for introducing and recovering the liquid and the material to be separated.
  • the apparatus described so far is entirely conventional. Its use allows separation, but the resolution of the separation of the constituents is disturbed by the aforementioned electrodynamic phenomenon. More precisely, when the applied electric field is oriented in the direction of the width, whether in continuous or pulsed form, the net formed by a constituent of the material to be separated, instead of keeping the same section over all its length deforms into an ellipse (or with a more complex '-configuration) and its extent increases in the direction of the width. This phenomenon is described in more detail below, with reference to the methods according to the invention.
  • the apparatus is improved according to the invention by adding additional electrodes 44, 46.
  • these electrodes 44, 46 are placed on the internal faces of the large walls 12, 14 of the cell .
  • the electrodes 44, 46 are formed of a thin layer of gold, tin and indium oxide, platinum, aluminum, etc., formed by a process known to those skilled in the art.
  • these electrodes are preferably transparent or semi-transparent. So that they do not short-circuit the electrodes 24, 26 which create a component of the electric field along the width, they are covered with a thin dielectric passivation layer, formed by a process known to those skilled in the art, by example with a spinner, by vacuum evaporation or by application of a film.
  • the passivation dielectric layer may in particular be formed from a film of polyethylene terephthalate, polyimide, polysulfone, parylene, titanium oxide or silicon oxide.
  • the optimal thickness of this layer depends on the electrical parameters of the device and of the liquid and it can be between 0.1 and 20 ⁇ m and preferably between 0.5 and 5 ⁇ m.
  • the assembly consisting of the electrode and its passivation film is prepared beforehand in the form of a polymer film, for example of polyethylene terephthalate, having a uniform thickness and metallized on one side, for example by gold or aluminum. The film is applied to the inner face of the large walls so that the polymer is turned towards the liquid.
  • the electrodes 44 and 46 are connected by wires 48 and 50 to an alternating current generator 56.
  • the direct current supply and the alternating current generator must be decoupled in order to be floating one compared to each other.
  • the alternating current generator provides approximately a phase agreement between the current and the voltage so that the overvoltage of the dielectric layer is reduced.
  • the thread formed by a constituent for example between the nozzles 36 and 42, exhibits a certain number of distortions.
  • distortions include first distortion “crescent” that is due to the velocity profile or Poiseuille profile in the thickness of the cell, as well as 1 r electroendosmosis possible along the walls.
  • Other distortions are due to thermal and density gradients. It has been reported that known methods allow compensation for these effects, and therefore are not described in more detail in this specification.
  • the invention allows the suppression or a significant reduction of this disturbing phenomenon.
  • electro ⁇ phoresis in a liquid vein is carried out with the application of a transverse component whose amplitude is equal to the square root of the amplitude of the constant field used for separation in the absence of a transverse component , with a sufficiently high frequency.
  • This process is suitable for electrophoresis, the conditions of which correspond well to the simplifying hypotheses set out above.
  • At least one parameter (amplitude, frequency) of the transverse component is determined by reading on an abacus which indicates the value of the parameter as a function of the conditions of the separation.
  • This process is especially suitable for cases which do not correspond perfectly to the assumptions set out above. In these particular cases, the ratio of the amplitudes of the transverse and continuous components may not have to be exactly equal to / 2.
  • the results obtained previously or by implementing the third process considered hereinafter are plotted on an abacus which is used each time that new separation conditions must be used.
  • the abacus can be replaced by a table or by the use of the result of a mathematical formula, possibly calculated on a computer.
  • the value of the amplitude of the transverse component is determined during a series of electrophoreses in which the distortion (observed optically, under a microscope, or obtained by analysis, by any suitable physical or chemical process, at least a separate fraction) is measured as a function of the amplitude of this transverse component. At each frequency used, a curve is obtained, an extremum of which indicates the optimal value of the amplitude.
  • the apparatus shown in Figures 1 and 2 can be used in the context of the invention because the frequencies used are relatively high, so that the thin dielectric passivation layer placed on the electrodes of the large faces, for example formed of polyethylene, polysulfone, polyimide, parylene or silicon oxide terephthalate provides direct current isolation but alternating current coupling.
  • the invention can also be implemented with an apparatus in which the DC insulation and the AC coupling are obtained not by using a passivation layer placed on the electrodes of the large faces, but by dividing these electrodes, each electrode member being elongated in the direction of the length of the chamber.
  • Such an apparatus is schematically represented in FIG. 3. In this case, it is noted that the walls of the large faces, which bear the references 12 and 14 in FIG.
  • each electrode element is replaced by walls 60, 62 which each carry elements d electrode in the form of elongated strips 64 which are directly in contact with the liquid phase.
  • the dimensions of the electrode elements in the directions of the width and the thickness are sufficiently reduced so as not to disturb the uniformity of the electric field.
  • Each electrode element is connected to the power supply 56 via a separate coupling capacitor 66.
  • the apparatus of FIGS. 1 and 2 is preferably used at high frequencies above 10 kHz, and the apparatus of FIG. 3 is used at frequencies too low for the apparatus of FIGS. 1 and 2 to be used in such a way satisfactory.
  • a cell of the type represented in FIG. 2 is constructed, having a length equal to 15 cm, a width to 5 cm, and a thickness to 0.6 cm.
  • the membranes 20, 22 are made up of dialysis membranes.
  • the lateral electrodes 24, 26 are made of platinum.
  • the transverse electrodes 44, 46 are formed by an aluminum film deposited on a polyethylene terephthalate film 3 ⁇ m thick, forming a passivation layer 52, 54 ("Steinerfilm" T).
  • the power supply 29 is a conventional electrophoresis power supply
  • the power supply 56 is constituted by a medium voltage power amplifier ("Krohn-Hite” 7500), connected in series with a variable resistance which allows the measurement of the current on the oscilloscope. It is controlled by a programmable function generator (“Hameg” 8130).
  • the electrolyte is introduced using a "Ismatec” gear pump without pulsation, by a single nozzle 34 provided with a divergent. Its flow speed in the cell is 0.5 cm / s. Circulation of an electrolyte identical to that of the chamber is ensured in the compartments of the side electrodes.
  • the sample is introduced through a nozzle 36 of circular section with an initial diameter of 1 mm. The shape of the sample can be observed from above, through a transparent window placed at the end of the separation chamber, and, along the axis of the net, through the outlet face.
  • the electrolyte is a phosphate buffer of pH 7, with a conductivity equal to 12 ⁇ S, and the sample consists of a bromophemol blue solution in phosphate buffer, with a conductivity equal to 37 ⁇ S.
  • Figure 4 shows the evolution of the net elm during the implementation of the invention.
  • the abscissas represent the effective transverse alternating field and the ordinates the dimension of the thread.
  • the crosses indicate the lateral dimension, and the diamonds the vertical dimension.
  • the field has a continuous horizontal component of 14.9 V / cm and a vertical component of variable amplitude and frequency equal to 50 kHz.
  • a progressive reduction in the width of the sample is observed when the vertical component of the field increases, then a stretching of the net in the vertical direction when the optimal value is exceeded.
  • the net takes on a quasi-circular shape when the effective values of the vertical and horizontal components of the field are close. In some cases, a slightly higher value may be useful to improve the separation.
  • the methods according to the invention are carried out in an ungelled liquid.
  • the liquid may however contain one or more dissolved polymers which have the advantage of reducing convection movements and thus facilitate the formation of a laminar flow.
  • the invention has important advantages. Indeed, for the same continuous component of separation by electrophoresis, the resolution is increased. However, it is also possible to increase the amplitude of the continuous electrophoresis component in order to obtain a higher yield for the same resolution. Of course, the increase in the amplitude of the DC component and the superposition of the AC component must not create a high amount of heat to the point of disturbing thermal homogeneity, because other disturbing phenomena would appear. so. POSSIBILITIES OF INDUSTRIAL APPLICATION
  • the invention used alone or in combination with other processes, there are may include the separation and purification of various products of natural origin, such as proteins, enzymes, peptides, polypeptides, nucleic acids, in particular DNA and RNA, cells of living organisms or parts of cells, in particular chromosomes, drugs or products used in their manufacture, and various products of mineral or synthetic origin such as macromolecules, molecules or particles in colloidal suspension.
  • products of natural origin such as proteins, enzymes, peptides, polypeptides, nucleic acids, in particular DNA and RNA, cells of living organisms or parts of cells, in particular chromosomes, drugs or products used in their manufacture, and various products of mineral or synthetic origin such as macromolecules, molecules or particles in colloidal suspension.
  • products of natural origin such as proteins, enzymes, peptides, polypeptides, nucleic acids, in particular DNA and RNA, cells of living organisms or parts of cells, in particular chromosomes, drugs or products used in their manufacture, and various products of mineral or

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Electrostatic Separation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

L'invention concerne l'électrophorèse en veine liquide. Elle se rapporte à un appareil qui comprend un corps (12, 14, 16, 18, 32, 38) délimitant un volume sensiblement parallélépipédique, et un premier jeu d'électrodes (24, 26) placées sur les petits côtés délimités par les directions d'épaisseur et de longueur. Selon l'invention, l'appareil comporte un second jeu d'électrodes (44, 46) placées sur les côtés parallèles au plan contenant la largeur et la longueur, et assurant un couplage capacitif. Par exemple, ces électrodes (44, 46) portent une couche de passivation de téléphtalate de polyéthylène. Application à la préparation de substances d'origine biologique.

Description

Procédés d'électrophorèse et d'optimisation d'électro- phorèse et appareil pour leur mise en oeuyre. DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé d'électro- phorèse en veine liquide, un procédé d'optimisation de la résolution de la séparation dans un tel procédé, ainsi qu'un appareil d'électrophorèse en veine liquide. TECHNIQUE ANTERIEURE
On utilise de très nombreux procédés d'électropho- rèse, aussi bien pour l'analyse que pour la préparation de différentes substances. La préparation de substances par électrophorèse en quantités notables est essentiellement réalisée par électrophorèse en veine liquide. Ce procédé est mis en oeuvre dans un appareil qui comporte une chambre de séparation de forme parallélépipédique, suivant la longueur de laquelle circule le liquide traité alors qu'un champ électrique est appliqué dans la direction de la largeur de la chambre. Des électrodes sont disposées aux extrémités du volume délimitées par les directions de lon- gueur et d'épaisseur. Comme l'épaisseur est très inférieure à la largeur, le champ électrique créé dans le liquide qui s'écoule suivant la longueur est relativement uniforme. L'écoulement du liquide dans la chambre est laminaire. La matière à séparer est introduite à une extrémité longitu- dinale de la chambre, par un orifice d'injection, et un produit séparé intéressant au moins est en général récupéré par un orifice collecteur placé à l'autre extrémité de la chambre. Des dispositifs auxiliaires destinés à homogé¬ néiser la température, à la réguler, à détecter et/ou visualiser les produits, etc. sont aussi utilisés en général.
Lors du fonctionnement d'un tel appareil, la matière à séparer est introduite par l'orifice d'injection et forme un filet qui est entraîné par le courant. En l'absence de tout phénomène perturbateur et pour un écoulement parfai¬ tement laminaire et homogène, le produit initial se sépare en plusieurs filets contenant chacun des particules d'une mobilité électrophorétique déterminée.
En pratique, cette séparation est soumise à un certain nombre de phénomènes perturbateurs qui provoquent une distorsion de ces filets. Parmi ces phénomènes pertur¬ bateurs, on peut citer celui qui est dû au profil des vitesses du luide dans la chambre ( rofil de Poiseuille), dans le cas de 1'électrophorèse en continu. Un autre phénomène perturbateur est l'électroendosmose qui dépend du potentiel zêta de la paroi des faces de la chambre.
On sait déjà compenser convenablement les effets de ces phénomènes perturbateurs. Par exemple, on peut intro¬ duire le produit à séparer de manière intermittente. On peut aussi utiliser des parois mobiles ou des distorsions volontaires des lignes d'écoulement. Plus simplement, on peut réduire au minimum les distorsions dues au profil de Poiseuille et à l'électroendosmose par introduction de la matière par un orifice dont la dimension, mesurée dans la direction de l'épaisseur, est faible par rapport à l'êpais- seur de la chambre. On peut en outre utiliser un traitement particulier des surfaces de la chambre afin qu'elles possèdent un potentiel particulier. Les documents DE-A- 2 508 844 et EP-A-0 256 552 décrivent des solutions connues apportées à ces problèmes. Lorsque ces distorsions ont été compensées et permettent donc l'obtention d'une meilleure résolution, on se rend compte qu'il subsiste une distorsion dite "en ellipse" de la matière introduite (on la désigne, dans la présent mémoire, par cette expression "en ellipse", bien que sa orme puisse parfois être plus complexe). Cette distorsion a été décrite par exemple par Rhodes et al., "Electrohydrodynamic Distorsion of Sample Streams in Continuous Flow Electrophoresis", Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 129, n° 1, Avril 1989, pages 78 à 90. Cette perturbation, appelée "électrohydrodynamique", est attribuée à la différence de conductivité existant entre le produit à séparer et le milieu, mais elle ne dépend pas des propriétés électrocinétiques individuelles des particules contenues dans la matière à séparer.
Ce phénomène électrohydrodynamique est actuellement celui qui réduit le plus la résolution qui peut être obtenue au cours d'une séparation par électrophorèse en veine liquide, lorsque des précautions suffisantes ont été prises.
L'invention a pour objet la compensation du phéno¬ mène perturbateur électrohydrodynamique observé dans une électrophorèse en veine liquide. On a constaté selon l'invention que, lorsqu'un champ électrique uniforme ayant une composante alternative transversale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, était appliqué avec une amplitude et une fréquence convenables, la moyenne de cette composante alternative transversale étant prati¬ quement nulle, le phénomène perturbateur électrohydrody¬ namique décrit par Rhodes et al. pouvait être presque totalement supprimé.
On a déjà appliqué un champ électrique ayant une composante alternative transversale à un échantillon à séparer dans des procédés dits d'"électrophorèse puisée sur gel". Ainsi, la demande internationale de brevet WO 84/02001 décrit un procédé d'électrophorèse mettant en oeuvre des champs électriques transversaux alternatifs. Ces procédés ont pour effet de changer les mobilités de cer¬ taines des particules au moins que 1'on veut séparer par rapport à leur mobilité en champ constant, dans une propor¬ tion qui dépend de la taille de ces particules. Cet effet n'existe qu'au sein d'un milieu gélifié, car il met en jeu une orientation des particules sous l'action conjointe du champ électrique et des forces de réaction du gel. Il ne se manifeste que lorsque la variation du champ électrique est suffisamment lente pour permettre un changement signifi¬ catif d'orientation et/ou de position au cours d'une période.
Au contraire, les procédés selon l'invention ne modifient aucunement les mobilités des particules à séparer dont le déplacement moyen reste inchangé en présence ou en 1'absence d'une composante transversale du champ élec¬ trique. La déformation hydrodynamique, pendant une période du champ, du milieu contenant les particules à séparer est si réduite qu'elle n'aurait pratiquement aucun effet sur un gel. En conséquence, les fréquences utilisées selon l'in¬ vention sont très supérieures à celles des procédés d'élec¬ trophorèse puisée sur gel, et ne provoqueraient donc pas la différentiation selon la taille qui est l'objet des procé- dés connus. A l'inverse, les fréquences utilisées dans ces procédés connus ne conviennent pas aux procédés selon 1'invention. DESCRIPTION DE L'INVENTION
Ainsi, l'invention concerne un procédé d'électro- phorèse en veine liquide, du type qui comprend la circula¬ tion d'un milieu liquide dans un volume, de préférence sensiblement parallélépipédique, ayant des dimensions d'épaisseur, de largeur et de longueur, la direction de circulation correspondant à la direction de la longueur dudit volume, l'application d'un champ électrique de séparation ayant une composante, dans la direction de la largeur, dont la moyenne n'est pas nulle, l'introduction dans ce volume, en amont dans le sens de circulation, d'un échantillon destiné à subir une séparation par électropho- rèse par migration de constituants dans la direction de la largeur, et l'extraction d'une fraction du milieu liquide ayant subi la séparation ; selon l'invention, l'application du champ électrique de séparation est réalisée avec un champ qui possède aussi une composante alternative trans- versale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle.
De préférence, le procédé comporte en outre une étape préalable de détermination d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale. Dans un mode de réalisation, l'étape de détermination comprend la détermi¬ nation de 1'amplitude de la composante alternative afin qu'elle soit de l'ordre de la racine carrée de 1'amplitude de la composante dans la direction de la largeur. Dans un autre mode de réalisation, l'étape de détermination du paramètre comprend la lecture d'au moins une valeur du paramètre de la composante alternative transversale sur un abaque ou un tableau. Dans un autre mode de réalisation plus élaboré, l'étape de détermination comprend la mesure expérimentale préalable de la variation d'une propriété au moins de la fraction obtenue par extraction en fonction de la variation d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale.
De préférence, le paramètre de la composante alter¬ native transversale est l'amplitude de cette composante. En outre, cette étape peut avantageusement comprendre la détermination d'un paramètre supplémentaire qui est la fréquence de la composante alternative transversale.
L'invention concerne aussi un procédé d'optimisation d'un procédé d'électrophorèse en veine liquide du type décrit dans les précédents paragraphes, qui comprend 1'exécution d'une série d'opérations préliminaires d'élec- trophorèse telles que, à chaque opération, le champ élec¬ trique appliqué comporte, en plus d'une composante dans la direction de la largeur, une composante alternative trans¬ versale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle, d'amplitude déterminée et ayant une fréquence déterminée, et une propriété voulue au moins d'une fraction obtenue à chaque opération est déterminée, les opérations d'électro¬ phorèse préliminaires de la série différant les unes des autres par 1'amplitude de la composante alternative trans- versale du champ appliqué ; le procédé d'optimisation comprend en outre la détermination, à partir des résultats des opérations préliminaires, de l'amplitude de la compo¬ sante alternative transversale du champ électrique pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale.
Il est aussi avantageux que ce procédé comprenne en outre l'exécution répétée des différentes étapes du procédé pour diverses valeurs de la fréquence de la composante alternative transversale, afin que la valeur de la fré¬ quence pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale soit déterminée. L'invention concerne aussi un appareil d'électro¬ phorèse en veine liquide, du type qui comprend un corps délimitant un volume, de préférence sensiblement parallélé- pipédique, ayant, dans la direction.de l'épaisseur, une dimension très inférieure à ses dimensions dans les direc- tions de longueur et de largeur, ledit volume étant ouvert à ses extrémités longitudinales afin qu'un fluide puisse circuler dans la direction de la longueur du volume, et un premier jeu d'électrodes placées sur les petits côtés délimités par les directions d'épaisseur et de longueur ou à proximité de ces petits côtés ; selon l'invention, l'appareil comporte un second jeu d'électrodes placées sur les côtés parallèles au plan contenant la largeur et la longueur, ce deuxième jeu d'électrodes étant destiné à assurer un couplage capacitif en courant alternatif entre un générateur externe de courant alternatif et le liquide placé dans ledit volume.
Dans un premier mode de réalisation, le couplage capacitif est obtenu par utilisation d'un jeu d'électrodes comprenant deux électrodes de grande étendue, placées de part et d'autre dudit volume et séparées chacune de ce volume par un mince film diélectrique l'isolant du milieu liquide. De préférence, le diélectrique est un polymère choisi parmi les polyimides, les polysulfones, les parylènes, le téréphtalate de polyethylene, et des oxydes minéraux comme l'oxyde de silicium (silice).
Dans un second mode de réalisation, le couplage capacitif est obtenu par utilisation, comme second jeu d'électrodes, de deux ensembles d'électrodes formés chacun de plusieurs éléments d'électrode qui sont sensiblement parallèles et allongés dans la direction de la longueur du corps, les éléments d'électrode étant destinés à être directement au contact du milieu liquide placé dans ledit volume du corps et étant couplés individuellement par des condensateurs à un générateur de courant alternatif. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
D'autres caractéristiques et avantages de 1'inven- tion ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 est une vue schématique en perspective et en partie sous forme de diagramme synoptique d'un appareil d'électrophorèse dans un mode de réalisation de 1'invention ; la figure 2 est une coupe transversale de 1'appareil de la figure 1 ; la figure 3 est un schéma d'un autre mode de réali¬ sation d'appareil d'électrophorèse selon l'invention ; et la figure 4 est un graphique représentant la varia¬ tion de la section du filet obtenu pour diverses conditions d'électrophorèse selon l'invention. MEILLEURS MODES DE REALISATION DE L'INVENTION
Les figures 1 et 2 représentent un exemple d'appareil qui peut être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé d'électrophorèse selon l'invention. L'appareil 10 comporte des faces avant 12, 14, par exemple formées de verre, de polycarbonate, etc., avantageusement sous forme transpa¬ rente ou semi-transparente de manière qu'on puisse observer la séparation des différents constituants de la matière à séparer lorsqu'ils sont colorés ou visibles d'une autre manière. Ces parois de grande étendue sont disposées verticalement sur la figure 1, la longueur étant orientée en direction verticale, la largeur en direction horizontale dans le plan de la figure alors que . la direction de 1'épaisseur est sensiblement perpendiculaire au plan de la figure. Il faut noter que l'épaisseur a été exagérée sur les figures 1 et 2 et qu'elle est en général bien plus petite que la longueur et la largeur. Dans un exemple, la longueur est égale à 15 cm, la largeur à 5 cm, et l'épais¬ seur à 6 mm. Il faut cependant noter que la largeur peut être supérieure à la longueur, ce dernier terme étant ainsi utilisé parce qu'il correspond à la direction longitudinale de courant de fluide.
La chambre d'électrophorèse est délimitée par des petits côtés verticaux 16, 18, délimités dans les direc- tions de longueur et d'épaisseur, et qui retiennent le liquide. Des membranes 20, 22, parallèles aux petits côtés 16, 18, sont destinées à délimiter des chambres dans lesquelles sont placées des électrodes 24, 26, par exemple des fils métalliques. Le volume délimité entre les côtés et les membranes contient un liquide sensiblement identique à celui qui est placé à l'intérieur de la chambre, mais qui est séparé de la chambre par des membranes 20, 22 qui sont perméables aux ions, afin qu'un contact électrique et ionique soit établi entre les électrodes et la chambre, mais que les produits d'électrolyse qui pourraient se former aux électrodes ne puissent pas pénétrer dans la chambre. Les électrodes 24 et 26 sont reliées par des fils 28 et 30 à un générateur 29 qui, dans le mode de réalisa¬ tion représenté sur la figure 2, est une simple alimenta- tion en courant continu, qui est destinée à créer, avec les électrodes 24 et 26, une composante du champ électrique d'électrophorèse orientée dans la direction de la largeur de la chambre et dont la moyenne est non nulle.
La partie inférieure de la chambre est délimitée par une paroi 32 d'extrémité. Celle-ci a une ou plusieurs buses 34, 36, qui permettent l'introduction d'un fluide à travers la paroi 32. Ces buses peuvent être identiques, mais on les a désignées par des références différentes afin de distin¬ guer les buses 34, utilisées pour l'introduction du liquide qui constitue le fluide porteur, de la buse 36, de préfé¬ rence de forme circulaire, utilisée pour 1'introduction de la matière à séparer. La partie supérieure de la chambre est fermée par une paroi supérieure 38 qui comporte aussi des buses 40, 42. Les buses 40 permettent la sortie du liquide porteur pratiquement dépourvu des constituants de la matière à séparer, et les buses 42 collectent des filets de constituants de la matière introduite par la buse 36. Ces affectations des buses ne constituent qu'un exemple de mise en oeuvre, car les hommes du métier connaissent de nombreux dispositifs d'introduction et de récupération du liquide et de la matière à séparer. L'appareil décrit jusqu'à présent est tout à fait classique. Son utilisation permet une séparation, mais la résolution de la séparation des constituants est perturbée par le phénomène électrodynamique précité. Plus précisé¬ ment, lorsque le champ électrique appliqué est orienté dans la direction de la largeur, qu'il soit sous forme continue ou puisée, le filet formé par un constituant de la matière à séparer, au lieu de garder la même section sur toute sa longueur, se déforme en ellipse (ou avec une '-configuration plus complexe) et son étendue augmente dans le sens de la largeur. Ce phénomène est décrit plus en détail dans la suite, en référence aux procédés selon l'invention.
L'appareil est perfectionné selon 1'invention par addition d'électrodes supplémentaires 44, 46. Comme l'in¬ diquent les figures 1 et 2, ces électrodes 44, 46 sont placées aux faces internes des grandes parois 12, 14 de la cellule. Par exemple, les électrodes 44, 46 sont formées d'une mince couche d'or, d'oxyde d'étain et d'indium, de platine, d'aluminium, etc., formée par un procédé connu des hommes du métier. Pour les raisons indiquées précédemment, ces électrodes sont de préférence transparentes ou semi- transparentes. Afin qu'elles ne mettent pas en court- circuit les électrodes 24, 26 qui créent une composante du champ électrique suivant la largeur, elles sont recouvertes d'une mince couche diélectrique de passivation, formée par un procédé connu des hommes du métier, par exemple à la tournette, par évaporation sous vide ou par application d'un film. La couche diélectrique de passivation peut être notamment formée d'un film de téréphtalate de polyethylene, de polyimide, de polysulfone, de parylène, d'oxyde de titane ou d'oxyde de silicium. L'épaisseur optimale de cette couche dépend des paramètres électriques de 1'appa¬ reil et du liquide et elle peut être comprise entre 0,1 et 20 μm et de préférence entre 0,5 et 5 μm. Dans une variante très avantageuse, l'ensemble constitué par l'électrode et son film de passivation est préparé au préalable sous forme d'un film polymère, par exemple de téréphtalate de poly- éthylène, ayant une épaisseur uniforme et métallisé sur une face, par exemple par de l'or ou de l'aluminium. Le film est appliqué à la face interne des grandes parois de sorte que le polymère est tourné vers le liquide.
Les électrodes 44 et 46 sont reliées par des fils 48 et 50 à un générateur de courant alternatif 56. Il faut noter que l'alimentation en courant continu et le généra¬ teur de courant alternatif doivent être découplés afin d'être flottants l'un par rapport à l'autre. En outre, il est préférable que le générateur de courant alternatif assure approximativement un accord de phase entre le courant et la tension afin que la surtension de la couche diélectrique soit réduite. Ces caractéristiques sont bien connues de l'homme du métier et on ne les décrit donc pas plus en détail. On n'a pas représenté de circuit de refroidissement, de régulation de température, etc. Bien entendu, de tels dispositifs sont utilisés le cas échéant, mais comme leur utilisation est bien connue et comme ils compliqueraient la représentation des figures, on ne les a pas représentés. L'homme du métier sait lorsqu'il doit utiliser de tels perfectionnements de la technique antérieure.
On considère maintenant l'utilisation de 1'appareil qu'on vient de décrire. Comme indiqué précédemment, lors d'une séparation, le filet formé par un constituant, par exemple entre les buses 36 et 42, présente un certain nombre de distorsions. On peut citer d'abord une distorsion "en croissant" qui est due au profil de vitesses ou profil de Poiseuille dans l'épaisseur de la cellule, ainsi qu'à 1rélectroendosmose éventuelle le long des parois. D'autres distorsions sont dues aux gradients thermiques et de densité. On a indiqué que les procédés connus permettaient la compensation de ces effets, et on ne les décrit donc pas plus en détail dans le présent mémoire.
Enfin, il existe un autre phénomène perturbateur qui n'a pas été corrigé jusqu'à présent. Cet effet perturbateur est l'effet éleσtrohydrodynamique décrit par Rhodes et al. dans le document précité. En effet, quand la conductivité et/ou la polarisabilité du filet formé diffèrent de celles du milieu environnant, une distorsion en ellipse du filet (ou plus complexe) apparaît et est d'autant plus importante que le champ est intense.
On peut envisager de réduire 1'acuité de ce phéno¬ mène perturbateur électrohydrodynamique par réduction du champ électrique ou de la concentration de la matière à séparer ; cependant, ces mesures réduisent le pouvoir séparateur ou le rendement. Il faut noter que ce phénomène perturbateur est celui qui limite actuellement le plus le rendement de 1'électrophorèse en veine liquide utilisée comme procédé préparatif.
L'invention permet la suppression ou une diminution importante de ce phénomène perturbateur.
Rhodes et al. ont représenté ce phénomène perturba¬ teur par une équation donnant la vitesse radiale u(θ) par rapport au centre du filet, dans un plan perpendiculaire à la longueur de la cellule, sous la forme u(θ) = [(4/3)aEo 2KEDcos2θ]/[16τt(μe+μi)(R+l)2] a étant le rayon du filet, E l'amplitude d'un champ constant appliqué, K et KX_ les constantes diélectriques du milieu et du filet, μe et μ' i. les viscosités du milieu et du filet, R le rapport σ./σ des conductivités du filet et du milieu, D la valeur R2+R+1-3S et S le rapport K Δ--../K, E-,L.
Ces auteurs ont obtenu ce résultat moyennant quelques hypothèses, qui sont les suivantes : la tension superficielle entre le filet et le milieu est négligeable, la diffusion est négligeable, et la vitesse est uniforme suivant la longueur de la cellule. On note que cette relation est indépendante de la fréquence. Bien que 1'invention ne soit nullement limitée par l'interprétation théorique qui suit, celle-ci peut être utile pour l'évaluation de l'action de certains paramètres. Selon l'invention, on superpose au champ E d'élec- trophorèse, utilisé en l'absence de composante transver¬ sale, une composante transversale oscillante dont la moyenne est nulle. Une composante particulièrement simple peut être représentée par la relation E (t) = βE Retexp(iωt)} dans laquelle β est un coefficient de proportionnalité.
On utilise alors deux hypothèses supplémentaires : d'une part la variation de la constante électrique et de la polarisation de la surface en fonction de la fréquence est négligeable, et d'autre part la pulsation ω est suffisam- ment élevée pour que le filet n'ait pas le temps de se déformer de façon significative pendant une seule période, c'est-à-dire que la fréquence doit être suffisamment élevée. On peut alors montrer que la répartition des vitesses u' (θ,β) est donnée par une relation de la forme u'(θ,β) = u(θ)(l-β2/2)
Cette relation suggère que la composante transver¬ sale n'introduit pas de nouvelle distorsion du filet et modifie simplement l'amplitude de la distorsion due au champ constant. D'après la dernière relation, lorsque le paramètre β est égal à 2, l'effet électrohydrodynamique est supprimé. Ce résultat ne dépend pas de la valeur de la conductivité, et il est donc le même pour tous les consti¬ tuants du produit à séparer.
L'exemple précédent d'une forme sinusoïdale donnant une valeur égale à la racine carrée de deux est particuliè¬ rement démonstratif, mais d'autres types d'évolution tempo¬ relle de la composante transversale du champ électrique peuvent aussi être utilisés, dès lors qu'ils sont alterna¬ tifs, de moyenne nulle et de fréquence suffisamment élevée. Ces déductions théoriques, obtenues dans le cadre de certaines hypothèses, suggèrent qu'il existe une composante transversale ayant des valeurs de ses paramètres (amplitude, et accessoirement fréquence) qui permettent pratiquement la correction de la perturbation électrohydrodynamique.
L'invention met en oeuvre cette propriété de trois manières différentes. Dans un premier procédé, l'électro¬ phorèse en veine liquide est exécutée avec application d'une composante transversale dont l'amplitude est égale à la racine carrée de 1'amplitude du champ constant utilisé pour la séparation en l'absence de composante transversale, avec une fréquence suffisamment élevée. Ce procédé convient à une électrophorèse dont les conditions correspondent bien aux hypothèses simplificatrices énoncées précédemment.
Dans un second procédé plus élaboré, un paramètre au moins (amplitude, fréquence) de la composante transversale est déterminé par lecture sur un abaque qui indique la valeur du paramètre en fonction des conditions de la séparation. Ce procédé convient surtout aux cas qui ne correspondent pas parfaitement aux hypothèses énoncées précédemment. Dans ces cas particuliers, il est possible que le rapport des amplitudes des composantes transversale et continue ne doive pas être exactement égal à /2. Les résultats obtenus antérieurement ou par mise en oeuvre du troisième procédé considéré dans la suite sont portés sur un abaque qui est utilisé chaque fois que de nouvelles conditions de séparation doivent être utilisées. Bien entendu, l'abaque peut être remplacé par un tableau ou par l'utilisation du résultat d'une formule mathématique, éventuellement calculé sur un ordinateur.
Dans un troisième procédé très élaboré, la valeur de l'amplitude de la composante transversale, éventuellement à plusieurs fréquences, est déterminée au cours d'une série d'électrophorèses dans lesquelles la distorsion (observée optiquement, au microscope, ou obtenue par analyse, par tout procédé physique ou chimique approprié, d'une fraction séparée au moins) est mesurée en fonction de l'amplitude de cette composante transversale. A chaque fréquence utilisée, on obtient une courbe dont un extremum indique la valeur optimale de l'amplitude.
Dans le cas d'une électrophorèse occasionnelle, on peut se limiter à la détermination de l'amplitude de la composante transversale à une valeur égale à la racine carrée de celle de la composante continue d'électrophorèse. Au contraire, dans le cas d'électrophorèses industrielles, il conviendra d'utiliser le dernier procédé dans lequel la courbe de résolution est déterminée en fonction des diffé- rentes amplitudes de la composante transversale, à une fréquence suffisamment élevée ou même à plusieurs fré¬ quences, afin que la compensation optimale puisse être obtenue.
L'appareil représenté sur les figures 1 et 2 peut être utilisé dans le cadre de l'invention parce que les fréquences utilisées sont relativement élevées, si bien que la mince couche diélectrique de passivation placée sur les électrodes des grandes faces, par exemple formée de téré- phtalate de polyethylene, de polysulfone, de polyimide, de parylène ou d'oxyde de silicium assure l'isolement en courant continu mais le couplage en courant alternatif. L'invention peut aussi être mise en oeuvre avec un appareil dans lequel l'isolement en courant continu et le couplage en courant alternatif sont obtenus non par utilisation d'une couche de passivation placée sur les électrodes des grandes faces, mais par division de ces électrodes, chaque élément d'électrode étant allongé dans la direction de la longueur de la chambre. Un tel appareil est schématiquement représenté sur la figure 3. Dans ce cas, on note que les parois des grandes faces, qui portent les références 12 et 14 sur la figure 1, sont remplacées par des parois 60, 62 qui portent chacune des éléments d'électrode sous forme de bandes allongées 64 qui sont directement au contact de la phase liquide. Les dimensions des éléments d'électrode dans les directions de la largeur et de l'épaisseur sont suffi¬ samment réduites pour ne pas perturber l'uniformité du champ électrique. Chaque élément d'électrode est relié à l'alimentation 56 par l'intermédiaire d'un condensateur séparé 66 de couplage.
On connaît déjà, pour l'exécution d'électrophorèses sur gel, des cuves ayant des électrodes constituées d'élé- ments séparés. Cependant, comme ces cuves travaillent à très basse fréquence ou en courant continu, l'élément d'isolement n'est pas constitué par un condensateur, mais par une ou plusieurs diodes. Dans ces conditions, l'appa¬ reil représenté sur la figure 3 est lui-même original par rapport à la technique antérieure. On peut aussi effectuer, dans certains cas, des électrophorèses selon 1'invention avec des éléments d'électrodes découplés par des diodes.
L'appareil des figures 1 et 2 est de préférence utilisé aux fréquences élevées, supérieures à 10 kHz, et l'appareil de la figure 3 est utilisé aux fréquences trop basses pour que 1'appareil des figures 1 et 2 puisse être utilisé de manière satisfaisante.
On ne décrit pas plus en détail les générateurs de courant et autres éléments électriques car ils sont bien connus des hommes du métier.
On décrit maintenant un exemple de séparation réalisée avec une cellule selon 1'invention et dont la résolution est limitée par l'effet électrohydrodynamique. On construit une cellule du type représenté sur la figure 2, ayant une longueur égale à 15 cm, une largeur à 5 cm, et une épaisseur à 0,6 cm. Les membranes 20, 22 sont consti¬ tuées par des membranes de dialyse. Les électrodes laté¬ rales 24, 26 sont en platine. Les électrodes transversales 44, 46 sont constituées par un film d'aluminium déposé sur un film de téréphtalate de polyethylene de 3 μm d'épais¬ seur, formant une couche de passivation 52, 54 ("Steinerfilm" T). L'alimentation 29 est une alimentation classique d'électrophorèse, l'alimentation 56 est consti¬ tuée par un amplificateur de puissance à moyenne tension ( "Krohn-Hite" 7500), monté en série avec une résistance variable qui permet la mesure du courant à l'oscilloscope. Il est piloté par un générateur de fonctions programmable ("Hameg" 8130). L'électrolyte est introduit à l'aide d'une pompe à engrenage "Ismatec" sans pulsation, par une seule buse 34 munie d'un divergent. Sa vitesse d'écoulement dans la cellule est 0,5 cm/s. Une circulation d'un électrolyte identique à celui de la chambre est assurée dans les compartiments des électrodes latérales. L'échantillon est introduit par une buse 36 de section circulaire avec un diamètre initial de 1 mm. La forme de l'échantillon peut être observée par dessus, par une fenêtre transparente placée à l'extrémité de la chambre de séparation, et, suivant l'axe du filet, par la face de sortie.
L'électrolyte est un tampon de phosphate de pH 7, de conductivité égale à 12 μS, et l'échantillon est constitué par une solution de bleu de bromophémol en tampon phosphate, de conductivité égale à 37 μS.
Après avoir déterminé expérimentalement la bande passante de la cellule et vérifié que les électrodes capacitives transmettent bien la tension alternative dans une gamme de fréquences dans laquelle le filet d'échan- tillon est sensible, on se place à une fréquence de 50 kHz.
La figure 4 montre 1'évolution de la orme du filet pendant la mise en oeuvre de l'invention. Sur la figure 4, les abscisses représentent le champ alternatif transversal efficace et les ordonnées la dimension du filet. Les croix indiquent la dimension latérale, et les losanges la dimen¬ sion verticale.
Dans l'exemple considéré, le champ a une composante horizontale continue de 14,9 V/cm et une composante verti¬ cale d'amplitude variable et de fréquence égale à 50 kHz. On observe une réduction progressive de la largeur de 1'échantillon quand la composante verticale du champ augmente, puis un étirement du filet dans la direction verticale quand la valeur optimale est dépassée. Le filet adopte une forme quasi-circulaire quand les valeurs effi- caces des composantes verticale et horizontale du champ sont voisines. Dans certains cas, une valeur légèrement supérieure peut être intéressante pour améliorer la séparation.
Dans l'exemple qu'on vient de décrire, on suppose que la résolution peut être appréciée directement d'une manière optique, soit à l'oeil soit au microscope. Cepen¬ dant, dans certains cas, il n'est pas possible de réaliser une telle observation. Il est donc nécessaire d'utiliser une analyse d'un autre type, par exemple une analyse de concentration d'une ou plusieurs fractions séparées, ou une analyse physique ou chimique de tout autre type, bien connue des hommes du métier.
Bien qu'on ait utilisé l'expression "générateur de courant", il faut noter que le procédé et l'appareil selon 1'invention peuvent être utilisés avec une régulation en courant ou en tension. La seconde possibilité est la plus fréquente, mais la première permet une meilleure maîtrise de la chaleur dégagée.
On a indiqué que les procédés selon 1'invention étaient mis en oeuvre dans un liquide non gélifié. Le liquide peut cependant contenir un ou plusieurs polymères dissous qui présentent 1'avantage de réduire les mouvements de convection et facilitent ainsi la formation d'un écoule¬ ment laminaire.
L'invention présente des avantages importants. En effet, pour une même composante continue de séparation par électrophorèse, la résolution est accrue. Cependant, il est aussi possible d'accroître 1'amplitude de la composante continue d'électrophorèse pour obtenir un rendement plus élevé pour une même résolution. Bien entendu, il faut que 1'augmentation de 1'amplitude de la composante continue et la superposition de la composante alternative ne créent pas une quantité de chaleur élevée au point de perturber l'homogénéité thermique, car d'autres phénomènes perturba¬ teurs apparaîtraient alors. POSSIBILITES D'APPLICATION INDUSTRIELLE
Parmi les applications industrielles de l'invention, utilisée seule ou en combinaison avec d'autres procédés, on peut citer la séparation et la purification de divers produits d'origine naturelle, tels que des protéines, des enzymes, des peptides, des polypeptides, des acides nucléiques, notamment l'ADN et l'ARN, des cellules d'orga- nismes vivants ou des parties de cellules, en particulier des chromosomes, des médicaments ou des produits utilisés dans leur fabrication, et différents produits d'origine minérale ou synthétique tels que des macromolécules, des molécules ou des particules en suspension colloïdale. Bien entendu, l'invention a bien d'autres applica¬ tions, et les indications qui précèdent ne sont que des exemples. En effet, l'invention s'applique d'une part à tout procédé existant d'électrophorèse en veine liquide, dont elle permet une optimisation de la résolution.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'électrophorèse en veine liquide, du type qui comprend la circulation d'un milieu liquide dans un volume ayant des dimensions d'épaisseur, de largeur et de longueur, la direction de circulation correspondant à la direction de la longueur dudit volume, l'application d'un champ électrique de séparation ayant une composante, dans la direction de la largeur, dont la moyenne n'est pas nulle, l'introduction dans ce volume, en amont dans le sens de circulation, d'une matière destinée à subir une sépara¬ tion par électrophorèse par migration de constituants au sein du liquide dans la direction de la largeur, et l'ex¬ traction d'une fraction de la matière ayant subi la sépara¬ tion, caractérisé en ce que l'application du champ élec- trique de séparation est réalisée avec un champ qui possède aussi une composante alternative transversale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape préalable de détermi¬ nation d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale du champ électrique.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape de détermination comprend la mesure expéri- mentale préalable de la variation d'une propriété au moins de la fraction obtenue par extraction en fonction de la variation d'au moins un paramètre de la composante alter¬ native transversale du champ électrique.
4. Procédé selon 1'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le paramètre de la composante alter¬ native transversale du champ électrique est 1'amplitude de cette composante.
5. Procédé selon 1'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'étape de détermination d'au moins un paramètre comprend la détermination d'un paramètre supplémentaire qui est la fréquence de la composante alternative transversale du champ électrique.
6. Procédé d'optimisation d'un procédé d'électro¬ phorèse en veine liquide selon l'une quelconque des reven¬ dications précédentes, du type qui comprend l'exécution d'un série d'opérations préliminaires d'électrophorèse telles que, à chaque opération, le champ électrique appli¬ qué comporte, en plus d'une composante dans la direction de la largeur, une composante alternative transversale, c'est- à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle, d'amplitude déterminée et ayant une fréquence déterminée, et la détermination d'une propriété voulue au moins d'une fraction obtenue à chaque opération, les opérations d'électrophorèse préliminaires de la série di érant les unes des autres par 1'amplitude de la composante alternative transversale du champ appliqué, le procédé d'optimisation étant caractérisé en ce qu'il comprend en outre la détermination, à partir des résultats des opérations préliminaires, de l'amplitude de la compo¬ sante alternative transversale du champ électrique pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'exécution répétée des diffé¬ rentes étapes du procédé pour diverses valeurs de la fréquence de la composante transversale pour la détermi- nation de la valeur de la fréquence pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale.
8. Appareil d'électrophorèse en veine liquide, du type qui comprend - un corps (12, 14, 16, 18, 32, 38) délimitant un volume ayant, dans la direction de l'épaisseur, une dimen¬ sion très inférieure à ses dimensions dans les directions de longueur et de largeur, ledit volume étant ouvert à ses extrémités longitudinales afin qu'un fluide puisse circuler dans la direction de la longueur du volume, et
- un premier jeu d'électrodes (24, 26) placées sur les petits côtés délimités par les directions d'épaisseur et de longueur ou à proximité de ces petits côtés, caractérisé en ce que 1'appareil comporte un second jeu d'électrodes (44, 46) placées sur les côtés parallèles au plan contenant la largeur et la longueur, ce deuxième jeu d'électrodes étant destiné à assurer un couplage capacitif en courant alternatif entre un générateur externe de courant électrique alternatif et le liquide placé dans ledit volume.
9. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage capacitif est obtenu par utilisation d'un jeu d'électrodes comprenant deux électrodes (44, 46) de grande étendue, placées de part et d'autre dudit volume et séparées chacune de ce volume par un mince film diélec¬ trique (52, 54).
10. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage capacitif est obtenu par utilisation, comme second jeu d'électrodes, de deux ensembles d'élec¬ trodes formés chacun de plusieurs éléments (64) d'électrode qui sont sensiblement parallèles et allongés dans la direction de la longueur du corps, les éléments d'électrode étant destinés à être directement au contact d'un liquide placé dans ledit volume du corps et étant couplés indivi¬ duellement par des condensateurs (66).
PCT/FR1993/000182 1992-02-28 1993-02-24 Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en ×uvre WO1993016789A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93905421A EP0627955A1 (fr) 1992-02-28 1993-02-24 Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en oeuvre
JP5514596A JPH07507134A (ja) 1992-02-28 1993-02-24 電気泳動方法および電気泳動最適化方法およびそれらの適用のための装置

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9202396A FR2687931A1 (fr) 1992-02-28 1992-02-28 Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en óoeuvre.
FR92/02396 1992-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1993016789A1 true WO1993016789A1 (fr) 1993-09-02

Family

ID=9427189

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1993/000182 WO1993016789A1 (fr) 1992-02-28 1993-02-24 Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en ×uvre

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0627955A1 (fr)
JP (1) JPH07507134A (fr)
FR (1) FR2687931A1 (fr)
WO (1) WO1993016789A1 (fr)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE213227T1 (de) 1996-07-12 2002-02-15 November Ag Molekulare Medizin Verfahren und vorrichtung zur aufreinigung und anreicherung von molekülen
JP2003028835A (ja) * 2001-07-11 2003-01-29 Olympus Optical Co Ltd フリーフロー電気泳動素子、及びフリーフロー電気泳動法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2508844A1 (de) * 1975-02-28 1976-09-09 Max Planck Gesellschaft Verfahren und einrichtung zur ablenkungselektrophorese
EP0256552A2 (fr) * 1986-08-18 1988-02-24 Milan Bier Procédé et appareil de focalisation isoélectrique par recyclage et isotachophorésis
US5059294A (en) * 1985-12-26 1991-10-22 The University Of Puerto Rico Method for separating nucleic acids and nucleic acid probes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2508844A1 (de) * 1975-02-28 1976-09-09 Max Planck Gesellschaft Verfahren und einrichtung zur ablenkungselektrophorese
US5059294A (en) * 1985-12-26 1991-10-22 The University Of Puerto Rico Method for separating nucleic acids and nucleic acid probes
EP0256552A2 (fr) * 1986-08-18 1988-02-24 Milan Bier Procédé et appareil de focalisation isoélectrique par recyclage et isotachophorésis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MECHANICAL ENGINEERING vol. 104, no. 12, Décembre 1982, NEW YORK, USA pages 46 - 49 S.WALTERS 'Bioprocessing in Space' *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0627955A1 (fr) 1994-12-14
JPH07507134A (ja) 1995-08-03
FR2687931B1 (fr) 1994-04-22
FR2687931A1 (fr) 1993-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2282827B1 (fr) Dispositif de séparation de biomolécules d'un fluide
EP0645169A1 (fr) Perfectionnements aux procédés et dispositifs de séparation des particules contenues dans un fluide
EP1796843B1 (fr) Dispositif pour realiser la separation dielectrophoretique de particules contenues dans un fluide
EP2880434A1 (fr) Procede de separation de molecules et cellules biologiques en solution
EP1543080B1 (fr) Procede de garniture d une surface par un film organique
EP2350634B1 (fr) Dispositif microfluidique de séparation ou de fractionnement ou de préconcentration d'analytes contenus dans un électrolyte
Gu et al. A new method for the determination of electrical properties of supported bilayer lipid membranes by cyclic voltammetry
EP2165753A2 (fr) Micro-dispositif d'analyse d'echantillons liquides
JP3410099B2 (ja) 担体両性電解質を使用しない等電点電気泳動方法及び装置
WO1993016789A1 (fr) Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en ×uvre
WO1998023379A1 (fr) Procede et dispositif de separation de particules ou molecules par migration a travers un ferrofluide
EP0974839A1 (fr) Méthode de mesure rapide de l'indice de résistivité d'échantillons solides tels que des roches
Haas et al. Design and construction of a new electrophoretic light-scattering chamber and applications to solutions of hemoglobin
FR2907228A1 (fr) Dispositif d'ecoulement fluidique,ensemble de determination d'au moins une caracteristique d'un systeme physico-chimique comprenant un tel dispositif,procede de determination et procede de criblage correspondants
EP0780684A1 (fr) Microcapteurs et microsystèmes électrochimiques intégrés fiables pour l'analyse chimique directe de composés en milieux aqueux complexes
EP3194952B1 (fr) Procédé et dispositif de concentration de molécules ou objets dissous en solution
Loeb The properties of nonbiological surfaces and their characterization
FR2907028A1 (fr) Electrophorese capillaire bi-ou multidimensionnelle au sein d'un unique capillaire.
Nishimoto et al. A simplified fabrication method of dielectrophoresis chip using Au thin-film and box cutter
WO2004046710A1 (fr) Dispositif et procede d'electrophorese
FR2776072A1 (fr) Perfectionnements aux dispositifs d'electrophorese multicapillaires du type a detection en sortie des capillaires
FR3013121A1 (fr) Dispositif de caracterisation du potentiel electroacoustique d'une solution
US9410925B2 (en) Capillary tubes for electrophoresis
FR2468120A1 (fr) Cellule de mesure et dispositif automatique de microelectrophorese analytique
WO2023227493A1 (fr) Dispositif de capture d'un objet biologique, procédé et système d'analyse d'un objet biologique utilisant ledit dispositif de capture

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1993905421

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref country code: US

Ref document number: 1994 290859

Date of ref document: 19941028

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1993905421

Country of ref document: EP

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 1993905421

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1993905421

Country of ref document: EP