WO2004046710A1 - Dispositif et procede d'electrophorese - Google Patents

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WO2004046710A1
WO2004046710A1 PCT/FR2003/003396 FR0303396W WO2004046710A1 WO 2004046710 A1 WO2004046710 A1 WO 2004046710A1 FR 0303396 W FR0303396 W FR 0303396W WO 2004046710 A1 WO2004046710 A1 WO 2004046710A1
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WO
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populations
corridor
migration
analytes
paj
Prior art date
Application number
PCT/FR2003/003396
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English (en)
Inventor
Bernard TINLAND
Jérôme MATHE
Jean-Marc Di Meglio
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs
Universite Louis Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs, Universite Louis Pasteur filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs
Priority to AU2003290207A priority Critical patent/AU2003290207A1/en
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44713—Particularly adapted electric power supply

Definitions

  • the present invention relates, in general, to a device and a method of electrophoresis. More particularly, the means of the electrophoresis device and method in accordance with the invention make it possible to separate populations of charged analytes comprised in a mixture in a solution, and are in particular suitable for separation. nucleic acids such as double-stranded chromosomal DNA.
  • Electrophoresis is one of the most used techniques in molecular biology. It has notably been used for the study of the human genome (decryption of the human genome). It is indeed necessary to be able to differentiate the DNA molecules by their size, to then study them one by one.
  • Electrophoresis is etymologically a setting in motion of charged particles by an electric field. If in a mixture of various particles, each of them advances in the electric field with a different speed, electrophoresis becomes an effective separation tool. It was Tiselius who first used this technique in the 1930s to separate mixed proteins from a solution. But DNA electrophoresis in the very simple medium that is the solution is not possible because under these conditions, the electrophoretic speed is independent of the mass, unlike the diffusion coefficient.
  • the gel separations (polyacrylamide gels, agarose gels) use the sieving power of gels whose crosslinking gives a distribution of pore sizes around an average value a which is adjusted case by case according to the populations to separate so that this average size a is less than the radius of gyration in solution of the molecules to be separated.
  • These pores constitute very fine virtual corridors which communicate with each other so that the molecules are confined there in crawling and that their migration is hindered by topological obstacles.
  • the efficiency is all the greater as the solution is concentrated, but the speed is then affected.
  • the diluted solution is essential.
  • the . corridor has a length of 1.5 cm long and a width of 30 micrometers, and the time required for separation is about 30min. It is further indicated that if one tried to extrapolate the functioning of the system described to the situation of DNA of chromosomal size, the system should have a size of the order of 5 cm, would require a migration time of about 3.5 hours, and would likely result in DNA purification rather than actual separation.
  • a periodically curved capillary with a diameter of 0.6 microns is used for molecules whose indicated diameter is approximately 4.5 microns.
  • This system was also not tested in the presence of a mixture of analytes, but only in the presence of a single population (166 kb). Its power of separation is therefore not established.
  • - a mode without electro-osmotic flow that is to say with walls with electrically neutral internal faces: in this case, the migration of negatively charged analytes takes place in the direction of the positive pole, and that of positively charged analytes is done in the direction of the negative pole, and - a mode with electro-osmotic flux (with EOF), that is to say with walls with electrically charged internal faces, negatively or positively: if the faces internal walls are negatively charged, the EOF goes from the positive pole to the negative pole, and when they are subjected to both the electric field and EOF, the negatively charged analytes will be entrained, towards the negative pole, if the internal faces of the walls are positively charged, the EOF goes from the negative pole towards the positive pole, and when they are subjected to both the electric field and at EOF, the positively charged analytes will be drawn to the positive pole.
  • the electrophoresis means according to the invention do not require the presence of topological obstacles. They can also be provided
  • the means according to the invention make it possible to separate any type of populations of charged analytes, and advantageously, make it possible to separate populations of nucleic acids of high molecular weights included as a mixture in a solution (such as nucleic acids in gammé from 50 to 250 kb, in particular).
  • the electrophoresis means in accordance with the present invention also have the advantage of not necessarily requiring the application of a pulsed field (populations of nucleic acids in the range of 50-250 kb can be separated in continuous field ), to be reusable, and to be able to be kept at a size less than a centimeter or even a millimeter (the effective migration length for separating populations of nucleic acids in the range of 50-250kb is approximately 1 , 58 micrometer).
  • the device according to the invention can therefore be manufactured in the form of a chip, such as a micro- or nano-chip.
  • FIGS. 1A, IB, 2 A, 2B, 3 A, 3B, 4, 5 show different schematic representations of a corridor of volume V according to the invention.
  • Figures 6 and 7 show a schematic representation of a longitudinal sectional view of an embodiment of a device according to the invention.
  • Figure 8 shows an electro-osmotic flow velocity profile in a system with two negatively charged glass walls, according to the invention.
  • Figures 9 and 10 show a schematic representation of a sectional view of a device according to the invention, the corridor of which is defined by two glass walls
  • Figures 11, 12, 13 and 14 show photographs of a prototype device according to the invention.
  • Figures 15 and 16 are graphs showing the apparent mobility as a function of the inter-wall height (h, also called thickness e), for a population of T2 DNA and for a population of lambda DNA (unmixed populations).
  • Figures 17 and 18 are graphs presenting the speed distributions observed for a solution comprising two populations of mixed analytes (T2 DNA and lambda DNA) at different inter-wall heights h (height h, also called thickness e):
  • Figure 17 left column height (or thickness) of 1.2 micrometer;
  • Figure 17 right column height of 2.3 micrometers;
  • Figure 18 left column height of 5 micrometers;
  • Figure 18 right column height of 8 micrometers.
  • the upper graphs show the velocity distribution of the populations of T2 DNA and of lambda DNA in a mixture;
  • the middle and bottom graphs show the velocity distribution of the T2 DNA population and that of the lambda DNA population, respectively, as extracted from the corresponding "mixture" graph (top graph).
  • Figures 19A, 19B and 19C are a schematic representation of the speed reversal due to electro-osmosis (the algebraic sum of the speed due to the applied electric field and the speed due to the electro-osmotic flow EOF is such that negatively charged molecules, such as nucleic acids, migrate to the negative pole).
  • Figure 20 gives a schematic representation of the mobility ⁇ of T2 and lambda DNA as a function of the inter-wall height h between the glass plates.
  • Figure 21 gives a schematic representation of electrophoretic mobility (without EOF) ⁇ ei in absolute value of T2 and lambda DNA as a function of the inter-wall height h between the glass plates.
  • Figures 23 and 24 show a schematic representation of a device according to the invention presented in longitudinal section (Figure 23: volume corridor N of bevel type; Figure 24 volume corridor N in half-bevel).
  • the present invention thus relates to a device and a method which are specially adapted to, and allow the electrophoretic separation of n population (s) PAj of electrically charged analytes, from a solution comprising them in mixture, with i going from 1 to n, and with n greater than or equal to 1, and advantageously with n greater than or equal to 2.
  • Each population of analytes PAj is characterized by an average molecular radius R; which, in said solution, is different from that of the other population (s) PAj of loaded analytes.
  • the device according to the invention comprises a migration unit which comprises at least one compact solid wall defining a migration corridor in which there is a space of volume V, in which is likely to prevail an electric field.
  • This corridor is intended to receive said solution of PA populations; of analytes to be separated, and to allow the migration of these PAi populations in a migration direction D m contained in said volume N of said corridor over an available migration length Lmdailability
  • This corridor has a volume N which, throughout said available length of migration Lm is o n ibie, or over an effective part thereof, is adapted to maintain each of the populations of PA analytes; intended to be received in this corridor at a confinement rate ⁇ q which is greater than or equal to 0.2 and less than or equal to 2, preferably greater than or equal to 0.2 and less than or equal to 1.7.
  • the degree of confinement required in accordance with the present invention represents an “intermediate” confinement between the situation of absence of confinement which is for example observed when the molecules are left free in solution, and the situation of strong confinement which is for example observed when the molecules are placed in a migration corridor whose dimension is less than the smallest of the average molecular rays of the populations in mixture.
  • This intermediate confinement situation can be configured in the form: Rmin ⁇ h ⁇ 6Rmax, that is to say 0.2 ⁇ c ⁇ 2, with: h the smallest dimension of the migration corridor,
  • Rmin the smallest of the average molecular radii of the populations of mixed analytes (radius of the Gaussian ball in solution)
  • R m has the largest of the average molecular radii of the populations
  • the PAj populations of analytes must be kept in “intermediate” confinement in accordance with the invention over a distance long enough for the desired separation to actually occur (significantly different average migration speeds, taking into account the standard deviation at within each population); this necessary length is the effective migration length Lirief ⁇ icace-
  • the cell corridor can therefore offer the desired containment over the entire migration length it offers (available migration length
  • the corridor has the “intermediate” confinement required in accordance with the invention over a portion of available migration length Lmd; ava jbie.
  • This part must however correspond to an effective part, that is to say a part at the entrance of which the PA populations; are not separated (migration rates not significantly different), but at the exit from which the populations are separated (significantly different migration speeds).
  • This effective part of the corridor will therefore generally represent a majority part of this corridor.
  • the corridor of the device according to the invention comprises at least one compact solid wall.
  • compact solid wall it is understood here a wall which is considered by the skilled person as substantially non-porous in operation, for example non-porous in contact with a solution such as a solution of analytes contained in an electrophoretic buffer. , for example a glass slide. This wall cannot therefore be constituted by a crosslinked or liquid material.
  • the average molecular radius of a population PAi of analytes is the average radius of the molecular ball in the solution in which the molecule is found before migration.
  • This radius Rg varies as N "0 ' 5 when the conformation of the macromolecular ball is Gaussian, N representing the number of segments of the molecular chain. It corresponds to the radius that this molecule presents under unfavorable solvation conditions, such as conditions of high salinity (for example, a buffered solution whose salt concentration is equal to 1M) or of low temperature (below ambient temperature) or theta condition. It is then rigorously designated by the symbol Rge- Under better solvation conditions (for example a molecule placed in a solvent which does not include too many salts, such as a TBE solution at 10 " M), the radius of the molecule increases. M.
  • the radius of the macromolecule (classically symbolized Ri) varied as N "0 ' 6.
  • the Rge of a molecule is therefore slightly less than its Rf.
  • the radius The molecular to be considered is that which the molecule concerned actually presents in the solution in which it is found; it can therefore, depending on the circumstances, be an Rf or a Rge.
  • To measure the average molecular radius of a population of analytes one can proceed by any means known to those skilled in the art.
  • a conventional means includes the implementation of a microscope provided with a millimeter reticle previously calibrated by the observation of a micrometric graduated slide through the objective of the microscope used.
  • the observation of the molecular balls through the reticle makes it possible to measure the average molecular radius.
  • detection markers such as fluorescent markers for DNA molecules (markers: fluorescein, YOYO TM, TOTO TM or BOBO TM from Molecular Probes, Oregon, USA).
  • the human eye can be replaced by an image acquisition and processing chain composed of a camera (for example, a Hamamatsu C2400-08 camera) and an acquisition card (for example, Matrox Pulsar®) and image processing software (Matrox Mil® 6.0, for example).
  • a camera for example, a Hamamatsu C2400-08 camera
  • an acquisition card for example, Matrox Pulsar®
  • image processing software for example, Mil Mil® 6.0, for example.
  • the volume space N of said migration corridor can be devoid of a topological obstacle. It then has internal faces which, macroscopically, are rectilinear.
  • a device In an embodiment specially adapted for the electrophoretic separation of n population (s) of PAi nucleic acids whose (s) average molecular radius (s) (respective) Rj is (are) between 0 , 5 and 1 micrometer, limits included, from a solution comprising them as a mixture, a device according to the invention comprises a space of volume N, the smallest dimension of which is conventionally between 1.2 and 5 micrometers, terminals included, preferably between 2 and 4 micrometers, for example 2.3 micrometers.
  • This device has the advantage of allowing the separation of DNA PAi populations whose size is greater than 50 kb, for example between 50 and 250 kb.
  • the electrophoresis device further comprises means for adjusting said volume V to allow this volume V to be varied as a function of the average molecular rays Ri of the PAj populations of charged analytes intended for be received in said migration corridor. Thanks to these means, the same device can be used for a variety of successive electrophoretic separations; the device according to the invention thus has very great adaptability.
  • the prototype presented in illustration in the following examples thus includes threaded rods (cf. Figures 9, and 11-14).
  • a person skilled in the art can nevertheless of course provide any type of adjustment device which is adapted to the selected particular lane volume, to the desired adjustment precision, and to the desired ease of handling. Examples of adjustment means include a translation stage or a tilt stage with micrometric adjustment.
  • Said migration corridor may have a volume V chosen from the group consisting of a volume with constant section (cf. Figures 1 A, IB, 4) and a volume with divergent sections (cf. Figures 2A, 2B, 3A, 3B, 5 ).
  • said migration corridor may have a volume N chosen from the group consisting of a parallelepiped volume (Figures 1A, IB), a bevel type volume ( Figures 2A, 2B), a half bevel type volume ( Figures 3A , 3B), and a cylindrical volume such as a cylindrical volume ( Figure 4), a conical trunk volume ( Figure 5).
  • a parallelepiped volume Figures 1A, IB
  • a bevel type volume Figures 2A, 2B
  • a half bevel type volume Figures 3A , 3B
  • a cylindrical volume such as a cylindrical volume ( Figure 4), a conical trunk volume (Figure 5).
  • the electrophoresis device has a space of volume N which is defined by at least one compact solid wall is delimited by at least two compact solid faces Fi and F 2 opposite one on the other, such as a space of volume N which is defined by at at least two compact solid walls Pri and Pr 2 facing each other (cf.
  • the “smallest dimension of the space of said corridor which is perpendicular to said direction D m of migration” is here the height h, or the height gradient h, of the inter-face space.
  • Said at least two faces Fi and F facing one another can both be placed parallel to said direction D m of migration (cf. FIGS. 1A, 1B, 4, 6).
  • the non-zero angle ⁇ that one of said at least two faces forms with respect to said direction D m of migration can be equal to that formed by the other of said at least two faces, or it can be different. Regarding this aspect, there is therefore no constraint in terms of machining and adjustment.
  • the device according to the invention can also comprise means for easily supplying it with solution. It is recommended to ensure that the solution is brought into said volume space without creating gas bubbles within the layer of liquid in the corridor.
  • the device according to the invention can therefore comprise a supply duct intended to supply said volume corridor N with a solution of populations PA; of analytes to be separated.
  • This duct can for example take the form of a capillary or a chimney (symbolically illustrated by a small plastic tube in Figures 12, 13, 14), or even the shape of an inlet neck at the start of the corridor migration.
  • the device according to the invention can operate according to two main types of modes: a mode without electro-osmotic flow (without EOF), and a mode with electro-osmotic flow (with EOF).
  • the or each of the compact solid walls of said volume corridor N has an electrically neutral internal face, or electrically isolated, for example an internal non-ionizable face, that is to say an internal face which, in operation, does not charge significantly during its wetting by the ionic solution.
  • the or each of the compact solid walls of said volume corridor N may be a wall of compact solid material, covered on its internal face with an electrically insulating coating layer.
  • said or each of the electrically neutral internal faces has an attraction ⁇ s less than or equal to 2.0, that is to say a zero or weak attraction, so as to avoid the phenomena of adhesion and adsorption of molecules, which are likely to disturb the quality of the separation.
  • a coating which has an attraction ⁇ s less than or equal to 2.0 such as a coating of neutral polymer, for example a coating chosen from the group consisting of a coating of PNP (polyvinylpirrolidone), a coating in PDMA (polydimethylacrylamide). It is recommended to ensure that the insulating coating covers the entire internal face of the wall, without leaving any uninsulated zone or microzone.
  • the or each of the compact solid walls of said volume corridor N has an internal face capable of being electrically charged, or more precisely an electrically ionizable internal face (internal face which is made of a material which comprises chemical groups ionizable).
  • This or each of these internal faces is thus capable of being electrically charged according to the pH of the solution with which it is brought into contact. More particularly, an internal face capable of being negatively charged on contact with a basic solution such as a solution at pH 8.3 will be chosen. In an operating mode with EOF, this or internal face is therefore not covered with electrically insulating material.
  • this loaded internal face is of the hydrophilic type, that is to say a surface "easily wettable. with an aqueous solution. " A surface is considered by those skilled in the art to be of the hydrophilic type when a drop of water deposited on this surface makes a contact angle of less than 5 degrees with this surface.
  • a surface is considered to be “hydrophilic type” or “wettable”, when its “spreading parameter” S is strictly greater than zero, with S ⁇ ⁇ sv - 7S L - 7LV where ⁇ sv represents the energy per unit area between the solid element (here, the surface of the wall) and the vapor (here, the ambient air), ⁇ s L represents the energy per unit area between the solid element (here, the surface of the wall) and the liquid (here, the aqueous solution), and Y L V represents the energy per unit area between the liquid and the vapor.
  • the or each of the internal faces of said compact solid walls of said corridor of volume N may have a roughness which is low to zero, and in particular a roughness of between 0 and 100 Angstroms, preferably between 2 and 60 Angstroms, for example of 5 to 50 Angstroms, all terminals included.
  • the or each of the compact solid walls of said corridor of volume N can therefore be a glass wall (which, conventionally, has a roughness of 5 to 50
  • the device according to the invention can also comprise means, such as a capillary, for collecting the PAj populations of separate analytes.
  • the device according to the invention may also comprise means suitable for applying an electric field within said migration space, so as to allow the induction of a migration of said populations of PAi analytes in said direction D m of migration.
  • the device may include platinum electrodes and / or reservoirs intended to contain an electrophoretic buffer and / or an electric current generator (direct current and / or alternating current generator).
  • the device according to the invention can be miniaturized. It can in particular be reduced to a size less than a centimeter, preferably a size less than a millimeter.
  • the present invention therefore also relates to any nano- or microchip which comprises a device according to the invention.
  • the inventors have indeed been able to demonstrate that, in order to separate two populations of DNA which are contained in equimolar mixture in a solution, and whose average molecular rays RI and R2 are 0.5 micrometer and 1 micrometer respectively (lambda DNA about 50 kb, and T2 DNA from
  • the effective migration distance required to reach a difference of 20s between the respective migration elution peaks of the two DNA populations does not exceed 10 mm (device with two parallel walls separated by a height of 1.2 micrometer).
  • This effective migration distance can, in this example of an equimolar mixture of lambda and T2 DNA, be reduced to 0.5 mm, by choosing an inter-wall height of 2.3 micrometers.
  • the device according to the invention therefore has, in its arrangement leading to a size less than a centimeter, just as in its arrangement leading to a size less than a millimeter, the ability to separate DNA from low PM (size less than 50kb), as well as DNA from high PM (size equal to or greater than 50kb).
  • the device according to the invention has such separation performance, that it can be produced in the form of a microchip, or even of a nano-chip.
  • Such micro- or nano-chips are particularly suitable for the separation of populations of nucleic acids such as DNA and RNA, and in particular double-stranded nucleic acids.
  • the performance in terms of speed and separation power are in fact such that the invention allows access to the electrophoretic separation of double-stranded DNA such as chromosomal DNA.
  • the present invention also relates to a process for the electrophoretic separation of n population (s) of electrically charged PAj analytes, from a solution comprising them in admixture, with i ranging from 1 to n and with n greater than or equal to 1 , each PAj population of analytes being characterized by an average molecular radius Rj different from that of the other PAj populations of analytes contained in said solution.
  • the electrophoresis method according to the invention is characterized in, that said solution is placed so that all the populations PA; of analytes to be separated are maintained at a containment rate which is greater than or equal to 0.2, and less than or equal to 2, and an electric field is applied, so that said populations of PA analytes ; migrate from one pole to another in said migration direction D m , each population of PAj analytes contained in said solution acquiring an average speed significantly different from that of the other PAj populations to be separated contained in said solution.
  • ⁇ min [2 x Rmin] / [the smallest dimension of the volume space N of said corridor which is perpendicular to the straight line D m of migration]
  • Each PA analyte population; contained in said solution thus acquires an average speed significantly different from that of other PA populations; to be separated contained in said solution.
  • This process has the advantage of making it possible to resolve high PM (separation of DNA larger than 50kb), while remaining in a continuous field.
  • This solution can for example be provided within said migration corridor via a supply conduit (chimney or neck), or else directly in the volume corridor N, for example by spreading it over the first third of the migration plane and then spreading electrophoretic buffer over the other two thirds.
  • the length of said volume corridor N must be sufficient to allow said separation.
  • this length depends on the populations to be separated, but also on other operating conditions such as nature of the electric field, intensity of the electric field, nature of the buffer used. Depending on these operating conditions, a person skilled in the art will be able to determine the minimum effective length on a case-by-case basis, if necessary by means of preliminary tests. As illustrated in the examples above, it is indeed possible to separate DNAs between 50 and 250 kb in continuous field with a voltage of 1 to 30 N over a distance less than.
  • the separation obtained after subjecting the PAj populations to an “intermediate” confinement in accordance with the present invention is in fact kept for several cm, so that one can build an oversized length device as a prototype. In the case of the above example, two 7.5 cm microscope slides were used in prototype; such slides therefore offer a migration length which is sufficiently excess to allow any type of electrophoretic separation of nucleic acids.
  • PAj populations to be separated consist of negatively charged analytes, such as nucleic acids (DNA, in particular)
  • PAj populations to be separated consist of positively charged analytes, we can therefore deposit the solution in the corridor on the side of the positive pole, and the smallest molecules will leave first at the negative pole.
  • a solution of PA populations; negatively charged analytes can therefore be deposited in the corridor of said device on the side of the positive pole, while a solution of PAj populations of positively charged analytes can be deposited in said corridor on the side of the negative pole.
  • this duct (capillary or chimney, for example) should preferably be placed on the side of the most appropriate pole (positive pole for negative analytes, pole negative for positive analytes).
  • the device and method according to the invention are suitable for the separation of any type from any population of charged or chargeable molecules.
  • molecules include double-stranded nucleic acids (chromosomal nucleic acids in particular), single-stranded nucleic acids, such as double-stranded and single-stranded DNA and RNA; the proteins ; ionic polymers such as ionic polysaccharides and in particular anionic polysaccharides of bacterial or vegetable origin such as xanthans, succinnoglycans and carrageenans.
  • Xanthans and succinnoglycans can indeed be separated from a bacterial culture medium, such as for example a culture medium from Pseudomonas campestris.
  • Carrageenans can be separated from ground materials or plant extracts.
  • polysaccharides are particularly useful for the food industry.
  • the method according to the invention can be implemented under a DC electric field, for example, a DC applied voltage between 1 and 1000 N, terminals included and chosen according to the system to correspond to an electric field between 1 and 200 N / cm so that it allows the desired separation, while retaining good elimination of the Joule effect.
  • a DC electric field for example, a DC applied voltage between 1 and 1000 N
  • the present application also relates to any use of a device or method in accordance with the invention for the separation of chromosomal DNA, or for the production of xanthans, succinoglycans or monodispersed carrageenans, by separation from a solution in containing as a mixture with other compounds, or for the separation of polyelectrolytes.
  • FIG. 1A A prototype comprising a migration unit whose volume space V is defined in the smallest dimension by two glass walls was built. (system according to the diagrams in Figures 1A and 6) using two standard microscope slides (walls Prl and Pr2).
  • Figure 9 gives a schematic representation of this prototype device in longitudinal section
  • Figure 10 a schematic representation of a top view of this prototype device.
  • Figure 11 shows a photograph. The glass walls are bare (i.e. not covered with an insulating coating).
  • the solution is basic buffered (in this case, Tris borate EDTA 10 "2 M at pH 8.4), which makes it possible to induce a negative electrical charge of the glass walls (mother DNA solution lambda at 500 ⁇ g / ml provided by Biolabs (ref 301-1 S), and T2 DNA solution at 129. ⁇ g / ml provided by Sigma Aldrich (refD-4806)).
  • the microscope slides (standard glass slides 7.5 cm long; Entreprise Roth-Sochiel SARL, 3, rue de la Chapelle, 67630 Lauterlaub, France) are immersed in a £ 10% surfactant solution, Entreprise Roth- Sochiel SARL, 3, rue de la Chapelle, 67630 Lauterlaub, France) and sonicated for 15 minutes. They are then rinsed with distilled water, and dried in an oven at 60 ° C. Good wettability of the blades is required to avoid the appearance of bubbles; care should therefore be taken not to exceed a dry storage period which exceeds 2 hours. On the other hand, the slides can be kept for 24 hours in distilled water without any noticeable deterioration in their wettability.
  • the lower blade is connected to two polyoxymethylene tanks by means of a silicone seal line (CAF 4, Rhône-Poulenc) to ensure watertightness and mechanical strength.
  • the solution containing the analytes is brought into the inter-slide space by depositing a drop directly in the middle of the bottom slide, before covering this slide with the second.
  • the solution can be provided via a supply duct (or chimney) provided for this purpose. Whatever the mode of supply chosen, it is important to ensure that the liquid is supplied without gas bubbles forming in the liquid layer.
  • Figures 12, 13 and 14 show photographs of a prototype device on which a small plastic tube placed on the top blade symbolizes the presence of a possible supply duct:
  • Figure 12 shows a photograph in disassembled form
  • Figure 13 in assembled form
  • Figure 14 shows the prototype device schematically connected to a generator.
  • the black terminal is the positive terminal
  • the red terminal the positive terminal.
  • a hollowed-out metal plate (to allow observation under the microscope) is put on and held in place with screws to ensure tightening and to maintain the desired height of intermesh h (also called thickness e) (part appearing at the top of Figure 12, and appearing in the foreground in Figure 13).
  • the two tanks are filled with buffer solution (Tris borate EDTA 10 "2 M at pH 8.4).
  • the electrophoretic speed or mobility is measured ( ⁇ ⁇ V DNA / E, where E denotes the electric field defined as the quotient of U by the distance between electrodes) using a camera mounted on a microscope which records the displacement of molecules.
  • the speed of the molecules is determined by analysis of the images of the film. The measurements are made for different applied voltages (20N, 30N, 40N, 50N and 60N). It was verified that the electrophoretic mobility (speed / electric field) was independent of the field.
  • Figure 15 gives an illustration of the results obtained (apparent mobility of each population as a function of the inter-blade height).
  • the device of the invention therefore makes it possible to migrate the DNA population 48.5 kb at a speed different from that of the DNA population 164 kb.
  • Figure 16 shows a representation of the mobilities measured as a function of the inter-blade height h (the square symbols represent the DNA population T2, the cross symbols the lambda DNA population). It is observed that there is indeed a difference in speed between the two molecular weights for equivalent thicknesses. T2 DNA has a higher speed than that of lambda DNA.
  • EEF electro-osmotic flow
  • - regime II for a thickness of the order of 2 times the size of the chains, the mobility suddenly decreases
  • - regime III at great thickness (well beyond the size of the chains), the mobility is constant, and the different sizes of chain are no longer differentiable; we are in a regime where the walls no longer have an effect on mobility, the chains are then as in solution.
  • Example 2 The experiment described in Example 1 above is continued with a solution which comprises two populations of mixed analytes (DNA 48.5 kb and DNA 164 kb mixed).
  • the prototype device described in Example 1 above is thus implemented for the separation of a solution comprising two populations of DNA in admixture, namely a solution comprising in admixture a population of lambda DNA (48.5 kb- 1.25 ⁇ g / ml) and a population of T2 DNA (164 kb- 1.29 ⁇ g / ml) in a basic buffered aqueous solution (in this case, Tris borate EDTA 10 * 2 M at pH 8.4) .
  • the final concentration of lambda DNA comes from the dilution of a stock solution to 500 ⁇ g / ml supplied by Biolabs, and that of T2 from a solution 129 ⁇ g / ml supplied by Sigma Aldrich.
  • the DNAs are labeled with YOYO-1 (Molecular probes, Eu relie, Oregon, USA) at the rate of 1 dye for 50 base pairs according to the supplier's instructions.
  • a mixing volume of 60 ⁇ l is spread over the lower slide (the thickness of the liquid layer is then of the order of 5 ⁇ m), then covered by the upper slide. We also proceed as indicated in Example 1 above.
  • the upper cover is put in place and held in place by screws so that the filling of the side tanks with 800 ⁇ l of TBE 10 "2 M buffer does not raise the upper slide.
  • Table 1 presents a summary of the measured experimental values, compared with the measured mobilities for the same unmixed populations:
  • Figures 17 and 18 give a graphic representation of the experimental results.
  • Figures 17 and 18 show the velocity distributions of the lambda + T2 mixture (top graphs), the largest molecules (T2 DNA in the middle), and the smallest molecules (bottom graphs), for different confinement thicknesses : in Figure 17, the three graphs placed in the column on the left show the speed distributions obtained with a device whose inter-blade height h is 1.2 micrometer, and the three graphs placed in the column on the right the speed distributions obtained with a device whose inter-blade height h is 2.3 micrometers; in Figure 18, the three graphs placed in the column on the left show the speed distributions obtained with a device whose inter-blade height h is 5 micrometers, and the three graphs placed in the column on the right show the speed distributions obtained with a device whose inter-blade height h is 8 micrometers.
  • the curves are characterized by the area of the peaks, which make it possible to distinguish the two types of DNA populations, and the position of the peaks, which provide information on the average speed of the chains, as well as the error associated with this average (width at mid-height divided by the root of the number of speeds measured).
  • AON T2 always has greater mobility than that of lambda DNA, but lambda DNA has greater mobility than that measured when it is alone.
  • T2 DNA keeps the mobility it had when it was alone, we can conclude that T2 carries the lambda with it.
  • the increase in mobility of the lambda decreases with increasing the inter-blade height h (also called thickness e).
  • the horizontal axis (direction of migration D ra ) is the axis Oj (of unit vector u x ). v is written:
  • Mobility is usually a scalar value (positive if the strings are positively charged). According to the previous equation, the apparent mobility ⁇ is therefore written:
  • the measurements carried out on the DNA T2 and the DNA ⁇ have qualitatively the shape represented in FIG. 20.
  • ⁇ is the zeta potential of DNA and 2 ⁇ ri_ 2 + 2 ⁇ R n e ⁇ ⁇ '1 & Debye length. It is assumed that this force per unit area acts on the surface of the cylinder, i.e.
  • the electric force is therefore:
  • This electrical force has a positive modulus ( ⁇ and EU X are negative). It drives the molecules well towards the positive electrode.
  • This friction force is oriented in the positive direction since - (v - VEOF ) -U X ⁇ 0.
  • FIG. 22 represents this theoretical variation of the measured mobility ⁇ as a function of the thickness e. We have chosen ⁇ o + ⁇ so ⁇ - 1 in arbitrary unit on this representation.
  • FC / L ⁇ (N ⁇ N ⁇ ) a (v - VEOF)
  • Mass dependence is indirect. Chains only experience these forces if they are confined. The containment rate of ⁇ DNA and DNA 72 is not the even for a given thickness. They therefore do not follow this mobility at the same thicknesses.
  • the radius of gyration is smaller than the thickness, but R g is only an average of their radius.
  • the chains fluctuate and therefore have the possibility of exploring the space beyond the sphere of radius R g and of approaching one of the walls.
  • the molecules have the possibility of moving on either side of the median plane of the two walls. They can then rub on the walls which are still quite close. This remains quite difficult to quantify.
  • IH diet The plateau observed when the confinement thickness is greater than the size of the chains, is easily interpretable. The walls no longer influence electrophoretic mobility and the chains are found as in solution. True mobility
  • the analyte molecules are not compressed by the walls of the migration corridor (their average molecular radius is not crushed): they are not constrained to constant friction on these walls, they are not subjected to forces involving their elasticity, and where
  • the analyte molecules are not left free as would be in a solution: their respective mobilities are in fact affected by the presence of walls in their immediate vicinity. It was then determined that the limits of the useful heights (or effective heights) of this “intermediate” confinement situation can be expressed as a function of the average molecular rays of the populations present.
  • Ri and six times R 2 Ri ⁇ h ⁇ 6R 2 .

Abstract

La présente demande est relative à un dispositif et un procédé d'électrophorèse selon lesquels les analytes à séparer sont placés à un niveau intermédiaire de confinement. Les moyens d'électrophorèse selon l'invention peuvent fonctionner avec ou sans flux électro-osmotique, et peuvent fonctionner en champ continu ou en champ pulsé. Ils présentent l'avantage d'être ré-utilisables (dispositif réglable et ajustable), et d'offrir des performances de rapidité et de pouvoir de séparation telles, que le dispositif peut être réduit à une taille inférieure au centimètre, voire au millimètre, tout en permettant la séparation d'analytes de forts poids moléculaire, tels que notamment des acides nucléiques de 50 à 250kb.

Description

TITRE : DISPOSITIF ET PROCEDE D'ELECTROPHORESE
La présente invention est, de manière générale, relative à un dispositif et à un procédé d'électrophorèse. Plus particulièrement, les moyens de dispositif et de procédé d'électrophorèse conformes à l'invention permettent de séparer des populations d'analytes chargés compris en mélange dans une solution, et sont notamment adaptés à la séparation . d'acides nucléiques tels que des ADN chromosomiques double-brin.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE :
L'électrophorèse est une des techniques les plus utilisées en biologie moléculaire. Elle a notamment été utilisée pour l'étude du génome humain (décryptage du génome humain). Il faut en effet pouvoir différencier les molécules d'ADN par leur taille, pour ensuite les étudier une à une.
Les études consacrées à l'électrophorèse ont pour objectif d'augmenter ses performances : la rapidité et le pouvoir séparateur. L'intérêt de la rapidité est évident. Celui du pouvoir séparateur est une question d'efficacité et de fiabilité de la séparation. Un développement de systèmes de plus en plus simples et de plus en plus performants est en cours depuis maintenant plusieurs années. Le décryptage de génomes en est un des buts actuels. Les techniques proposés dans l'art antérieur souffrent toutefois de divers désavantages, et notamment d'une limitation en terme de pouvoir séparateur : elles ne permettent pas ou peu facilement de séparer des molécules d'ADN dont la taille est de l'ordre de quelques millions de paires de bases (10Mb), ce qui reste insuffisant et insatisfaisant pour la séparation d'ADN chromosomiques de très grande taille.
L'électrophorèse est étymologiquement une mise en mouvement de particules chargées par un champ électrique. Si dans un mélange de diverses particules, chacune d'elles avance dans le champ électrique avec une vitesse différente, l'électrophorèse devient un outil de séparation efficace. C'est Tiselius qui, dans les années 1930, utilisa le premier cette technique pour séparer des protéines en mélange dans une solution. Mais l'électrophorèse d'ADN dans le milieu très simple qu'est la solution n'est pas possible car dans ces conditions, la vitesse électrophorétique est indépendante de la masse, contrairement au coefficient de diffusion.
La plupart des techniques d'électrophorèse actuelles utilisent donc un gel, ou un équivalent tel qu'une solution de polymère neutre non réticulé, un gel mimé par une matrice de billes ou plus généralement des obstacles topologiques,, pour séparer les molécules et notamment les molécules d'acides nucléiques.
Les séparations sur gel (gels de polyacrylamide, gels d'agarose) utilisent le pouvoir de tamisage de gels dont la réticulation confère une distribution de tailles de pores autour d'une valeur moyenne a qui est ajustée au cas par cas en fonction des populations à séparer de manière à ce que cette taille moyenne a soit inférieure au rayon de giration en solution des molécules à séparer. Ces pores constituent de très fins couloirs virtuels qui communiquent entre eux de sorte que les molécules y sont confinées en reptation et que leur migration est entravée par les obstacles topologiques. Les techniques sur gel actuellement disponibles sont très longues, et, en champ continu, ne permettent pas de séparer des acides nucléiques dont la taille serait supérieure à 50kb : soit les champs utilisables sont trop faibles et les temps de migration sont prohibitifs, soit on augmente le champ et la mobilité électrophorétique redevient (comme en solution) indépendante de la masse ; en outre, des effets secondaires d'échauffement du gel sont induits par effet Joule, ce qui conduit à une perte de résolution due à l'augmentation de la diffusion voire à la fusion du gel. Pour séparer de tels acides nucléiques sur gel, il est donc nécessaire de passer en champ puisé, mais les temps nécessaires d'analyse restent très longs, et la mise en œuvre délicate. En outre, les gels présentent le désavantage d'être non ré-utilisables.
D'autres recherches ont alors abouti à proposer des techniques de séparation d'ADN sur solution de polymère non réticulé en électrophorese capillaire. L'utilisation de capillaires permet de bien évacuer la chaleur créée par effet Joule, et donc de ne pas affecter la résolution par augmentation de la diffusion. On peut ainsi utiliser des champs plus élevés que sur gel, et gagner en rapidité d'analyse. La matrice d'obstacles est constituée par une solutione de polymère neutre (les molécules sont enchevêtrées mais non réticulées). Un exemple de telles techniques est décrit dans l'article Barron, Sunada et Blanch (Electrophoresis
1996, 17 :744-757, « The effects ofpolymer properties on DNA séparations by capillary electrophoresis in uncross-linked polymer solutions »). Une solution diluée de e polymère neutre est placée dans un capillaire non confinant (un capillaire de diamètre 51 microns est utilisé dans l'article Barron et al. précité).
Pour des petites chaînes, l'efficacité est alors d'autant plus grande que la solution est concentrée, mais la rapidité est alors affectée. Pour les longues chaînes, la solution diluée s'impose.
Au final, ces techniques d'électrophorèse capillaire en solution de polymère non réticulé ne permettent pas de séparer des populations d'ADN dont la taille est supérieure à 50 kb (dans l'article Barron et al. précité, la taille maximale d'analyte séparable est de 23 kb).
On peut également mentionner d'autres techniques d'électrophorèse sans confinement, telles que celles qui consistent à greffer une molécule neutre aux chaînes d'ADN de manière à créer un parachute électrophorétique destiné à ralentir les petites molécules par rapport aux grosses, ainsi que les techniques qui utilisent l'adsorption des molécules à une interface (N. Pernodet, N. Samuilov, K. Shin, J. Sokolov, M. H. Rafailovich, D. Gersappe et B. Chu, Physical Revîew Letters 2000, 85(26) : 5651-5654, « DNA Electrophoresis on a Fiat Surface »), Ces techniques demandent néanmoins de sélectionner très soigneusement les molécules neutres ou le revêtement d'interface nécessaires (un revêtement d'attraction intermédiaire εs 2,25), et sont donc délicates et complexes à maîtriser et à mettre en œuvre pour une grande variété de solutions d' analytes à séparer.
Ces dernières années, d'autres techniques d'électrophorèse ont donc été développées. Ces techniques plus récentes mettent en œuvre la micro- lithographie. Au lieu d'une matrice tamisante de type gel ou polymère non réticulé, elles mettent en œuvre des obstacles topologiques constitués de matériau solide compact, pour jouer sur les changements entropiques des molécules qu'ils induisent. Un exemple de telles techniques est décrit dans l'article Jongyoon Han et Harold G. Craighead (Anal. Chem 2002, 74 : 394-401, « Characterization and optimization of an entropie trop for DNA séparation »). Dans cet article, une cellule de migration comportant un couloir présentant une alternance de régions fines et larges est utilisée. Cette cellule fait ainsi passer de manière répétée les molécules directement d'une situation d'absence de confinement à une situation de fort confinement. Il est rapporté que cette cellule à obstacles topologiques permet la séparation de molécules d'ADN dans la gamme des 1-200 kb. Le . couloir a une longueur de 1,5 cm de long et une largeur de 30 micromètres, et la durée nécessaire à la séparation est d'environ 30min. II est en outre indiqué que s'il l'on tentait d'extrapoler le fonctionnement du système décrit à la situation d'ADN de taille chromosomique, le système devrait présenter une taille de l'ordre de 5cm, nécessiterait une durée de migration de l'ordre de 3,5 heures, et parviendrait vraisemblablement à une purification de l'ADN plutôt qu'à une réelle séparation.
Un autre exemple d'une telle technique est proposé dans l'article Masanori Ueda, Tetsuya Hayama, Yuzuru Takamura, Yasuhiro Horiike et Yoshinobu Baba (Electrophoresis 2002, 23 : 2635-2641, « Investigation of the possibility of geometrical electrophoresis »). Le système décrit est un système complexe, qui combine un fort confinement des molécules (diamètre de capillaire très inférieur au rayon de Flory des molécules), la présence d'obstacles topologiques (mise en jeu de l'élasticité des molécules d'analytes), et un effet de tamisage sur polymère non réticulé (flux de polyvinylpirrolidone). Ainsi, dans l'article Ueda et al. précité, un capillaire périodiquement incurvé de diamètre 0,6 micromètre est utilisé pour des molécules dont le diamètre indiqué est d'environ 4,5 micromètres. Ce système n'a en outre pas été testé en présence d'un mélange d'analytes, mais seulement en présence d'une seule population (de 166 kb). Son pouvoir de séparation n'est donc pas établi.
II subsiste donc un besoin pour des outils de séparation électrophorétique qui permettraient d'atteindre des performances de rapidité et de pouvoir de séparation satisfaisantes, pour des molécules de grande taille telles que des ADN de taille supérieure à 50kb, et des ADN double-brin en particulier, tout en étant simples à fabriquer, aisés à mettre en œuvre, faciles à ré-utiliser pour différentes séparations.
DESCRIPTION SYNTHETIQUE DE L'INVENTION :
Face à ce problème, les Demanderesses ont mis au point des moyens de dispositif et de procédé d'électrophorèse qui ne présentent pas les désavantages des techniques de l'art antérieur, et qui, pour ce faire, mettent en jeu une relation de confinement particulière qui, schématiquement, correspond à un confinement « intermédiaire » entre la situation d'absence de confinement qui est par exemple observée lorsque les molécules sont laissées libres en solution, et la situation de fort confinement qui est par exemple observée lorsque les molécules sont placées dans un couloir de migration dont une dimension est inférieure au plus petit des rayons moléculaires moyens des populations en mélange. Cette situation de confinement intermédiaire peut être paramétrée sous la forme :
Rmin < h < δRmax, c'est-à-dire 0,2 < τc < 2, avec : h la plus petite dimension du couloir de migration,
Rmin le plus petit des rayons moléculaires moyens des populations d'analytes en mélange (rayon de la pelote gaussienne en solution),
Rma le plus grand des rayons moléculaires moyens des populations d'analytes en mélange (rayon de la pelote gaussienne en solution), et τc le taux de confinement appliqué (τc = 2R/h).
Deux grands modes de fonctionnement peuvent leur être appliqués :
- un mode sans flux électro-osmotique (sans EOF), c'est-à-dire avec des parois à faces internes électriquement neutres : dans ce cas, la migration d'analytes chargés négativement se fait en direction du pôle positif, et celle d'analytes chargés positivement se fait en direction du pôle négatif, et - un mode avec flux électro-osmotique (avec EOF), c'est-à-dire avec des parois à faces internes électriquement chargées, négativement ou positivement : si les faces internes des parois sont chargées négativement, l'EOF va du pôle positif vers le pôle négatif, et lorsqu'ils seront soumis à la fois au champ électrique et à l'EOF, les analytes chargés négativement seront entraînés, vers le pôle négatif, si les faces internes des parois sont chargées positivement, l'EOF va du pôle négatif vers le pôle positif, et lorsqu'ils seront soumis à la fois au champ électrique et à l'EOF, les analytes chargés positivement seront entraînés vers lé pôle positif. Les moyens d'électrophorèse conformes à l'invention ne nécessitent pas la présence d'obstacles topologiques. Ils peuvent en outre être munis de moyens de réglage de sorte qu'ils sont ré-utilisables pour différentes séparations.
Les moyens conformes à l'invention permettent de séparer tout type de populations d'analytes chargés, et de manière avantageuse, permettent de séparer des populations d'acides nucléiques de forts poids moléculaires compris en mélange dans une solution (tels que des acides nucléiques dans la gammé dès 50 à 250 kb, notamment).
Les moyens d'électrophorèse conformes à la présente invention présentent en outre l'avantage de ne pas nécessairement requérir l'application d'un champ puisé (des populations d'acides nucléiques dans la gamme des 50-250 kb peuvent être séparées en champ continu), d'être ré-utilisables, et de pouvoir être maintenus à une taille inférieure au centimètre, voire au millimètre (la longueur de migration efficace pour séparer des populations d'acides nucléiques dans la gamme des 50- 250kb est d'environ 1,58 micromètre). Le dispositif selon l'invention peut donc être fabriqué sous la forme d'une puce, telle que micro- ou nano-puce.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES :
Dans la présente demande, il est fait référence aux figures suivantes : Les Figures 1A, IB, 2 A, 2B, 3 A, 3B, 4, 5 présentent différentes représentations schématiques d'un couloir de volume V selon l'invention.
Les Figures 6 et 7 présentent une représentation schématique d'une vue en coupe longitudinale d'un mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention.
La Figure 8 présente un profil de vitesse de flux électro-osmotique dans un système à deux parois de verre chargées négativement, conformément à l'invention. Les Figures 9 et 10 présentent une représentation schématique d'une vue en coupe d'un dispositif selon l'invention dont le couloir est défini par deux parois en verre
Pri et Pr2 (Figure 9 : vue en coupe longitudinale ; Figure 10 : vue de dessus).
Les Figures 11, 12, 13 et 14 présentent des photographies d'un dispositif prototype conforme à l'invention.
Les Figures 15 et 16 sont des graphes présentant la mobilité apparente en fonction de la hauteur inter-paroi (h, également appelée épaisseur e), pour une population d'ADN T2 et pour une population d'ADN lambda (populations non mélangées).
Les Figures 17 et 18 sont des graphes présentant les distributions de vitesse observées pour une solution comprenant deux populations d'analytes en mélange (ADN T2 et ADN lambda) à différentes hauteurs inter-parois h (hauteur h, également appelée épaisseur e) : Figure 17 colonne de gauche : hauteur (ou épaisseur) de 1,2 micromètre ; Figure 17 colonne de droite : hauteur de 2,3 micromètres ; Figure 18 colonne de gauche : hauteur de 5 micromètres ; Figure 18 colonne de droite : hauteur de 8 micromètres. Les graphes du haut présentent la distribution des vitesses des populations d'ADN T2 et d'ADN lambda en mélange ; les graphes du milieu et du bas présentent la distribution de la vitesse de la population d'ADN T2 et celle de la population d'ADN lambda, respectivement, telles qu'extraites du graphe « mélange » correspondant (graphe du haut). Les Figures 19A, 19B et 19C sont une représentation schématique de l'inversion des vitesses due à l' électro-osmose (la somme algébrique de la vitesse due au champ électrique appliqué et de la vitesse due au flux électro-osmotique EOF est telle que les molécules chargées négativement, telles que les acides nucléiques, migrent vers le pôle négatif). La Figure 20 donne une représentation schématique de la mobilité μ des ADN T2 et lambda en fonction de la hauteur inter-parois h entre les plaques de verre. La Figure 21 donne une représentation schématique de la mobilité électrophorétique (sans EOF) μei en valeur absolue des ADN T2 et lambda en fonction de la hauteur inter-parois h entre les plaques de verre. La Figure 22 présente l'évolution théorique de la mobilité vraie μ (en unité arbitraire) en fonction de la hauteur inter-parois h (trait continu = mobilité de la population d'ADN lambda ; trait pointillé = mobilité de la population d'ADN T2). Les Figures 23 et 24 montrent une représentation schématique d'un dispositif conforme à l'invention présenté en coupe longitudinale (Figure 23 : couloir de volume N de type biseau ; Figure 24 couloir de volume N en demi-biseau).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION :
La présente invention est ainsi relative à un dispositif et un procédé qui sont spécialement adaptés à, et permettent la séparation électrophorétique de n population(s) PAj d'analytes chargés électriquement, à partir d'une solution les comprenant en mélange, avec i allant de 1 à n, et avec n supérieur ou égal à 1, et avantageusement avec n supérieur ou égal à 2. Chaque population d'analytes PAj est caractérisée par un rayon moléculaire moyen R; qui, dans ladite solution, est différent de celui de la ou des autres populations PAj d'analytes chargés.
Le dispositif selon l'invention comprend une unité de migration qui comprend au moins une paroi solide compacte définissant un couloir de migration dans lequel il y a un espace de volume V, dans lequel est susceptible de régner un champ électrique. Ce couloir est destiné à recevoir ladite solution de populations PA; d'analytes à séparer, et à y permettre la migration de ces populations PAi suivant une direction de migration Dm contenue dans ledit volume N dudit couloir sur une longueur de migration disponible Lmdisponibie-
Ce couloir présente un volume N qui, tout au long de ladite longueur de migration disponible Lm is onibie, ou sur une partie efficace de celle-ci, est adapté pour maintenir chacune des populations d'analytes PA; destinées à être reçues dans ce couloir à un taux de confinement τq qui est supérieur ou égal à 0,2 et inférieur ou égal à 2, préférentiellement supérieur ou égal à 0,2 et inférieur ou égal à 1,7.
Le taux de confinement τq d'une population PAj à un point p de ladite longueur de migration disponible Lmdisponibie étant défini par le rapport suivant : τcj = [2 x (le rayon moléculaire moyen Rj de la population PAi)] / [la plus petite dimension de l'espace de volume N dudit couloir qui est perpendiculaire à la direction Dm de migration audit point p]. Le taux de confinement requis conformément à la présente invention représente un confinement « intermédiaire » entre la situation d'absence de confinement qui est par exemple observée lorsque les molécules sont laissées libres en solution, et la situation de fort confinement qui est par exemple observée lorsque les molécules sont placées dans un couloir de migration dont une dimension est inférieure au plus petit des rayons moléculaires moyens des populations en mélange. Cette situation de confinement intermédiaire peut être paramétrée sous la forme : Rmin ≤ h < 6Rmax, c ' est-à-dire 0,2 < τc < 2, avec : h la plus petite dimension du couloir de migration,
Rmin le plus petit des rayons moléculaires moyens des populations d'analytes en mélange (rayon de la pelote gaussienne en solution), Rma le plus grand des rayons moléculaires moyens des populations
• d'analytes en mélange (rayon de la pelote gaussienne en solution), et τc le taux de confinement appliqué (τc = 2R/h).
Les populations PAj d'analytes doivent être maintenues en confinement « intermédiaire » conforme à l'invention sur une distance suffisamment longue pour que la séparation recherchée se produise effectivement (vitesses moyennes de migration significativement différentes, en tenant compte de l'écart-type au sein de chaque population) ; cette longueur nécessaire est la longueur efficace de migration Liriefïicace- Le couloir de la cellule peut donc offrir le confinement voulu sur toute la longueur de migration qu'il offre (longueur de migration disponible
Lmdisponibie)- On peut néanmoins choisir une cellule qui offre une longueur de migration disponible Lmdisponibie légèrement excédentaire par rapport à la longueur de migration qui aurait été théoriquement suffisante (longueur efficace de migration L etπcace). Dans ce cas, le couloir présente le confinement « intermédiaire » requis conformément à l'invention sur une partie de longueur de migration disponible Lmd;sponjbie. Cette partie doit toutefois correspondre à une partie efficace, c'est-à-dire une partie à l'entrée de laquelle les populations PA; ne sont pas séparées (vitesses de migration non significativement différentes), mais à la sortie de laquelle les populations sont séparées (vitesses de migration significativement différentes). Cette partie efficace du couloir représentera donc généralement une partie majoritaire de ce couloir.
Le couloir du dispositif selon l'invention comprend au moins une paroi solide compacte. Par paroi solide compacte, il est ici entendu une paroi qui est considérée par l'homme du métier comme substantiellement non poreuse en fonctionnement, par exemple non poreuse au contact d'une solution telle qu'une solution d'analytes contenus dans un tampon électrophorétique, par exemple une lame de verre. Cette paroi ne peut donc être constituée par un matériau réticulé ou liquide.
Le rayon moléculaire moyen d'une population PAi d'analytes, c'est-à-dire R;, est le rayon moyen de la pelote moléculaire dans la solution dans laquelle se trouve la molécule avant migration.
Le nom générique de ce rayon est le rayon de giration, symbolisé Rg. Ce rayon Rg varie comme N"0'5 quand la conformation de la pelote macromoléculaire est gaussienne, N représentant le nombre de segments de la chaîne moléculaire. Il correspond au rayon que présente cette molécule dans des conditions de solvatation peu favorables, telles que des conditions de forte salinité (par exemple, une solution tamponnée dont la concentration en sel est égale à 1M) ou de basse température (inférieure à la température ambiante) ou condition thêta. Il est alors désigné, en toute rigueur, par le symbole Rge- Dans de meilleures conditions de solvatation (par exemple molécule placée dans un solvant qui ne comprend pas trop de sels, tel qu'une solution de TBE à 10" M) , le rayon de la molécule augmente. M. Flory a montré que, dans ce cas, le rayon de la macromolécule (classiquement symbolisé Ri) variait comme N"0'6. Le Rge d'une molécule est donc légèrement inférieur à son Rf. Dans la présente invention, le rayon moléculaire à considérer est celui que présente effectivement la molécule concernée dans la solution dans laquelle elle se trouve ; il peut donc, selon les circonstances, s'agir d'un Rf ou d'un Rge. Pour mesurer la rayon moléculaire moyen d'une population d'analytes, on peut procéder par tout moyen connu de l'homme du métier.
Un moyen classique comprend la mise en œuvre d'un microscope muni d'un réticule millimétrique préalablement étalonné par l'observation d'une réglette graduée micrométrique ent à travers l'objectif du microscope utilisé. L'observation des pelotes moléculaires à travers le réticule permet de mesurer le rayon moléculaire moyen. Si souhaité, pour faciliter l'observation des molécules, on peut en outre marquer les molécules objets de la mesure à l'aide de marqueurs de détection, tels que les marqueurs fluorescents pour les molécules d'ADN (marqueurs : fluorescéine, YOYO™, TOTO™ ou BOBO™ de chez Molecular Probes, Oregon, USA).
Alternativement, on peut remplacer l'œil humain par une chaîne d'acquisition et de traitement de l'image composée d'une caméra (par exemple, une caméra Hamamatsu C2400-08) et d'une carte d'acquisition (par exemple, Matrox Pulsar®) et d'un logiciel de traitement d'images (Matrox Mil® 6.0, par exemple).
De manière remarquable, l'espace de volume N dudit couloir de migration peut être dépourvu d'obstacle topologique. Il présente alors des faces internes qui, macroscopiquement, sont rectilignes.
Dans un mode de réalisation spécialement adapté à la séparation électrophorétique de n population(s) d'acides nucléiques PAi dont le(s) rayon(s) moléculaire(s) moyen(s) (respectifs) Rj est(sont) compris entre 0,5 et 1 micromètre, bornes incluses, à partir d'une solution les comprenant en mélange, un dispositif conforme à l'invention comprend un espace de volume N dont la plus petite dimension est classiquement comprise entre 1,2 et 5 micromètres, bornes incluses, préférentiellement entre 2 et 4 micromètres, par exemple 2,3 micromètres. Ce dispositif présente l'avantage de permettre la séparation de populations PAi d'ADN dont la taille est supérieure à 50kb, par exemple entre 50 et 250 kb. Par exemple, pour un mélange d'une population de rayon moléculaire moyen 1 micromètre (telle qu'une population d'ADN T2) et d'une population de rayon moléculaire moyen 0,5 micromètre (telle qu'une population d'ADN lambda), on peut choisir une hauteur constante de 1,2 micromètre (τ ambda = 0,83 ; τcχ2 = 1,67), de 2,3 micromètres (τ am da = 0,43 ; τc-n = 0,9), ou de 5 micromètres
(τciambda = 052 ; τcχ2 = 0,4), cf. exemple 2 ci-dessous. Par contre, une hauteur constante de 8 micromètres ne conviendrait pas (τcιambda = 0,25 ; mais τcτ2 = 0.13).
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le dispositif d'électrophorèse comprend en outre des moyens de réglage dudit volume V pour permettre de faire varier ce volume V en fonction des rayons moléculaires moyens Ri des populations PAj d'analytes chargés destinées à être reçues dans ledit couloir de migration. Grâce à ces moyens, un même dispositif peut être utilisé pour toute une variété de séparations électrophorétiques successives ; le dispositif selon l'invention présente ainsi une très grande adaptabilité. Le prototype présenté en illustration dans les exemples qui suivent comporte ainsi des tiges filetées (cf. Figures 9, et 11-14). L'homme du métier peut néanmoins bien entendu prévoir tout type de dispositif de réglage qui est adapté au volume de couloir particulier sélectionné, à la précision dé réglage souhaitée, et à la facilité de manipulation recherchée. Des exemples de moyens de réglage comprennent une platine de translation ou une platine de tilt à réglage micrométrique.
Ledit couloir de migration peut présenter un volume V choisi parmi le groupe constitué par un volume à section constante (cf. Figures 1 A, IB, 4) et un volume à sections divergentes (cf. Figures 2A, 2B, 3A, 3B, 5).
Par exemple, ledit couloir de migration peut présenter un volume N choisi parmi le groupe constitué par un volume parallélépipédique (Figures 1A, IB), un volume de type biseau (Figures 2A, 2B), un volume de type demi-biseau (Figures 3A, 3B), et un volume cylindroïde tel qu'un volume cylindrique (Figure 4), un volume de tronc conique (Figure 5).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dispositif d'électrophorèse présente un espace de volume N qui est défini par au moins une paroi solide compacte est délimité par au moins deux faces solides compactes Fi et F2 en regard l'une de l'autre, tel qu'un espace de volume N qui est défini par au moins deux parois solides compactes Pri et Pr2 en regard l'une de l'autre (cf.
Figures illustratives 6 et 7).
Ces au moins deux faces solides compactes Fi et F2 en regard l'une de l'autre, sont alors séparées par : - une hauteur h constante non nulle (cf. Figure illustrative 6), ou par
- un gradient de hauteurs non nulles Vh, qui s'étend de la hauteur la plus faible hmin à la hauteur la plus élevée hmax, avec hmin < hmax (cf. Figure illustrative 7), de manière à définir entre elles ledit couloir de migration de volume N, et - ladite hauteur h constante est supérieure ou égale au plus petit des rayons moléculaires moyens (R in) des populations PA; destinées à être reçues dans ledit couloir, mais inférieure ou égale à six fois le plus grand des rayons moléculaires moyens des populations d'analytes PAj destinées à être reçues dans ledit couloir (6 x Rma ), ou le cas échéant, - ledit gradient Vh est tel que sa borne inférieure hmin est supérieure ou égale audit Rmi„, et sa borne supérieure hma est supérieure ou égale à 6
X -K-max-
La « plus petite dimension de l'espace dudit couloir qui est perpendiculaire à ladite direction Dm de migration » est ici la hauteur h, ou le gradient de hauteurs h, de l'espace inter-faces.
Lesdites au moins deux faces Fi et F en regard l'une de l'autre peuvent être toutes deux placées parallèlement à ladite direction Dm de migration (cf. Figures 1A, 1B, 4, 6).
On peut également placer l'une desdites au moins deux faces en regard l'une de l'autre Fi ou F2, ou les deux faces Fi et F2, de manière à ce qu'elle(s) forme(nt) un angle θ non nul par rapport à ladite direction Dm de migration (cf. Figures 2A, 2B, 3A, 3B, 5, 7).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'une desdites au moins deux faces Fi et F2 en regard l'une de l'autre forme un angle θ non nul par rapport à ladite direction Dm de migration, tel que cet angle θ non nul est inférieur ou égal à θma = Arcsin [6Rmax / L], avec L longueur de la face correspondante, et l'autre desdites au moins deux faces Fi et F2 en regard l'une de l'autre est parallèle à ladite direction Dm de migration (volume de type demi-biseau, cf. Figures 3A,
3B).
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, lesdites au moins deux faces Fi et F2 en regard l'une de l'autre forment chacune un angle θ non nul par rapport à ladite direction Dm de migration, respectivement θl et Θ2, avec θl égal à ou différent de Θ2, et ces angles θl et Θ2 sont tous deux inférieurs ou égaux à Θmaχ = Arcsin [3Rmax / L], avec L longueur de la face correspondante (volume de type biseau, cf. Figures 2A, 2B).
L'angle θ non nul qu'une desdites au moins deux faces forme par rapport à ladite direction Dm de migration peut être égal à celui formé par l'autre desdites au moins deux faces, ou il peut en être différent. Concernant cet aspect, il n'y a donc pas de contrainte en terme d'usinage et d'ajustement.
Le dispositif selon l'invention peut en outre comprendre des moyens pour l'alimenter facilement en solution. Il est recommandé de veiller à ce que la solution soit apportée dans ledit espace de volume sans créer de bulles gazeuses au sein de la couche de liquide dans le couloir. De manière avantageuse, le dispositif selon l'invention peut donc comprendre un conduit d'alimentation destiné à alimenter ledit couloir de volume N en solution de populations PA; d'analytes à séparer. Ce conduit peut par exemple prendre la forme d'un capillaire ou d'une cheminée (symboliquement illustrée par un petit tube plastique en Figures 12, 13, 14), ou bien encore la forme d'un goulot d'arrivée au départ du couloir de migration.
Le dispositif selon l'invention peut fonctionner selon deux grands types de modes : un mode sans flux électro-osmotique (sans EOF), et un mode avec flux électro-osmotique (avec EOF).
Dans un mode de fonctionnement sans EOF, la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N a une face interne électriquement neutre, ou électriquement isolée, par exemple une face interne non ionisable, c'est-à-dire une face interne qui, en fonctionnement, ne se charge pas significativement lors de son mouillage par la solution ionique. Par exemple, la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N peut être une paroi en matériau solide compact, couverte sur sa face interne d'une couche de revêtement électriquement isolant.
Conformément à la présente invention, on préférera que ladite ou chacune des faces internes électriquement neutres présente une attraction εs inférieure ou égale à 2,0, c'est-à-dire une attraction nulle ou faible, de manière à éviter les phénomènes d'adhésion et d'adsorption des molécules, qui sont susceptibles de perturber la qualité de la séparation. On peut par exemple utiliser un revêtement qui présente une attraction εs inférieure ou égale à 2,0, tel qu'un revêtement de polymère neutre, par exemple un revêtement choisi parmi le groupe constitué par un revêtement en PNP (polyvinylpirrolidone), un revêtement en PDMA (polydiméthylacrylamide). Il est recommandé de veiller à ce que le revêtement isolant recouvre toute la face interne de la paroi, sans laisser de zone ou microzone non isolée.
Dans un mode fonctionnement avec EOF, la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N a une face interne capable de se charger électriquement, ou plus précisément une face interne électriquement ionisable (face interne qui est dans un matériau qui comporte des groupements chimiques ionisables). Cette ou chacune de ces faces internes est ainsi capable de se charger électriquement selon le pH de la solution avec laquelle on la met en contact. On choisira plus particulièrement une face interne capable de se charger négativement au contact d'une solution basique telle qu'une solution à pH 8,3. Dans un mode de fonctionnement avec EOF, cette ou face interne n'est donc pas recouverte de matériau électriquement isolant.
En fonctionnement, du fait des charges électriques de cette ou ces face(s), il se crée contre cette ou ces faces internes négatives, une couche de liquide d'épaisseur K"1, qui comprend un excès de charges positives (couche de Debye- Hϋckel). En Figure 8, est représenté de manière schématique le profil de vitesse du flux électro-osmotique entre deux plaques de verre chargées négativement (la longueur K" a été exagérée pour la clarté de la représentation, mais elle est de l'ordre du nanomètre pour une solution dont la force ionique est de 10"2M). Lorsque l'on applique le champ électrique, cette (ou ces) couche(s) de contre-ions se déplacent vers l'électrode négative, et entraîne(nt) avec elle(s) le liquide. Il se crée ainsi un flux électro-osmotique ou EOF.
Il est recommandé de veiller à ce que cette face interne chargée soit de type hydrophile, c'est-à-dire une surface « facilement mouillable. par une solution , aqueuse ». Une surface est considérée par l'homme du métier comme étant de type hydrophile lorsqu'une goutte d'eau déposée sur cette surface fait un angle de contact inférieur à 5 degrés avec cette surface. Plus précisément une surface est considérée comme « de type hydrophile » ou « mouillable », lorsque son « spreading parameter » S est strictement supérieur à zéro, avec S≈ γsv - 7SL - 7LV où γsv représente l'énergie par unité de surface entre l'élément solide (ici, la surface de la paroi) et la vapeur (ici, l'air ambiant), γsL représente l'énergie par unité de surface entre l'élément solide (ici, la surface de la paroi) et le liquide (ici, la solution aqueuse), et YLV représente l'énergie par unité de surface entre le liquide et la vapeur.
Dans le cas de la séparation de polyanions avec EOF, on pourra donc choisir une paroi en matériau négatif ou neutre tel que le verre ou le mica ; dans le cas de la séparation de polycations avec EOF, on pourra donc choisir une paroi en matériau positif ou neutre telle qu'une paroi à surface en oxydes de métaux (oxyde de titane, oxyde de cerium, oxyde d'aluminium, par exemple).
Conformément à la présente invention, la ou chacune des faces internes desdites parois solides compactes dudit couloir de volume N peut présenter une rugosité faible à nulle, et notamment une rugosité comprise entre 0 et 100 Angstrôm, préférentiellement entre 2 et 60 Angstrôm, par exemple de 5 à 50 Angstrôm, toutes bornes incluses.
La ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N peut donc être une paroi en verre (qui, classiquement, présente une rugosité de 5 à 50
Angstrôm environ). Le dispositif selon l'invention peut en outre comprendre des moyens, tel qu'un capillaire, pour collecter les populations PAj d'analytes séparées.
Le dispositif selon l'invention peut par ailleurs comprendre des moyens adaptés pour appliquer un champ électrique au sein dudit espace de migration, de sorte à permettre l'induction d'une migration desdites populations d'analytes PAi suivant ladite direction Dm de migration. Par exemple, le dispositif peut comprendre des électrodes en platine et/ou réservoirs destinés à contenir un tampon électrophorétique et/ou un générateur de courant électrique (générateur de courant continu et/ou de courant alternatif).
De manière particulière remarquable, le dispositif selon l'invention peut être miniaturisé. Il peut notamment être réduit à une taille inférieure au centimètre, préférentiellement une taille inférieure au millimètre. La présente invention vise donc également toute nano- ou micro-puce qui comprend un dispositif selon l'invention.
Les inventeurs ont en effet pu mettre en évidence que, pour séparer deux populations d'ADN qui sont contenues en mélange équimolaire dans une solution, et dont les rayons moléculaires moyens RI et R2 sont de 0,5 micromètre et 1 micromètre respectivement (ADN lambda de 50 kb environ, et ADN T2 de
164kb), la distance efficace de migration nécessaire pour atteindre une différence de 20s entre les pics d'élution respectifs de migration des deux populations d'ADN ne dépasse pas 10 mm (dispositif à deux parois parallèles séparées d'une hauteur de 1,2 micromètre). Cette distance efficace de migration peut, dans cet exemple de mélange équimolaire d'ADN lambda et T2, être réduit à 0,5 mm, en choisissant une hauteur inter-parois de 2,3 micromètres. Pour cet exemple de séparation de deux populations ADN d'environ 50 et 164kb, le dispositif selon l'invention a donc, dans sa disposition conduisant à une taille inférieure au centimètre, tout comme dans sa disposition conduisant à une taille inférieure au millimètre, la capacité de séparer des ADN de bas PM (taille inférieure à 50kb), tout comme des ADN de hauts PM (taille égale ou supérieure à 50 kb).
On voit donc que le dispositif selon l'invention présente des performances de séparation telles, qu'il peut être réalisé sous la forme d'une micro-puce, voire d'une nano-puce. De telles micro- ou nano-puces sont particulièrement appropriées à la séparation de populations d'acides nucléiques tels que des ADN et des ARN, et notamment d'acides nucléiques double-brin. Les performances en terme de rapidité et de pouvoir de séparation sont en effet telles que l'invention permet d'accéder à la séparation électrophorétique d'ADN double-brin tels que des ADN chromosomiques.
La présente invention vise également un procédé pour là séparation électrophorétique de n population(s) d'analytes PAj chargés électriquement, à partir d'une solution les comprenant en mélange, avec i allant de 1 à n et avec n supérieur ou égal à 1, chaque population PAj d'analytes étant caractérisée par un rayon moléculaire moyen Rj différent de celui des autres populations PAj d'analytes contenues dans ladite solution. Le procédé d'électrophorèse conforme à l'invention est caractérisé en ,ce que l'on place ladite solution de telle sorte que toutes les populations PA; d'analytes à séparer se trouvent maintenues à un taux de confinement qui est supérieur ou égal à 0,2, et inférieur ou égal à 2, et l'on applique un champ électrique, de manière à ce que lesdites populations d'analytes PA; migrent d'un pôle à l'autre suivant ladite direction Dm de migration, chaque population d'analytes PAj contenue dans ladite solution acquérant une vitesse moyenne significativement différente de celle des autres populations PAj à séparer contenues dans ladite solution. Pour ce faire, on peut avantageusement utiliser un dispositif selon l'invention.
Notamment lorsque la solution est de composition inconnue, c'est-à-dire lorsque les populations PA; en mélange ne sont pas préalablement connues, on peut alors déterminer la hauteur h (la plus petite dimension dudit couloir à un point p suivant la direction de migration Dm) en fonction du plus petit des rayons moléculaires moyens des populations PAj destinées à être reçues dans ledit couloir (R in)» et du plus grand des rayons moléculaires moyens des populations PAj destinées à être reçues dans ledit couloir (Rmaχ)- Le procédé selon l'invention peut alors comprendre alors les étapes suivantes :
- on fournit un dispositif ou une puce selon l'invention, sélectionné de telle sorte que : τ min = [2 x Rmin] / [la plus petite dimension de l'espace de volume N dudit couloir qui est perpendiculaire à la droite Dm de migration], et τcj max = [2 x Rmax)] / [la plus petite dimension de l'espace de volume N dudit couloir qui est perpendiculaire à la direction Dm de migration] soient tous deux, indépendamment l'un de l'autre, supérieurs ou égaux à 0,2 et inférieurs ou égaux à 2, avec Rmin représentant le plus petit des rayons moléculaires moyens des populations PA; destinées à être reçues dans ledit couloir, et avec Rmax le plus grand des rayons moléculaires moyens des populations PAj destinées à être reçues dans ledit couloir, on dépose ladite solution dans ledit dispositif ou ladite puce en la plaçant dans le couloir de ce dispositif ou cette puce, et on applique un champ électrique, de manière à ce que lesdites populations d'analytes PAj migrent d'un pôle à l'autre suivant ladite direction Dm de migration. Chaque population d'analytes PA; contenue dans ladite solution acquiert ainsi une vitesse moyenne significativement différente de celle des autres populations PA; à séparer contenues dans ladite solution. On peut alors laisser les populations migrer pendant la durée nécessaire (ou les distances respectives) pour qu'elles atteignent les temps d'élution souhaités (ou les différences de distance souhaitées).
Ce procédé présente l'avantage de permettre de résoudre de hauts PM (séparation des ADN de taille supérieure à 50kb), tout en restant en champ continu.
Il est recommandé de veiller à déposer la solution en s'assurant que l'on ne crée pas de bulles. Cette solution peut être par exemple apportée au sein dudit couloir de migration via un conduit d'alimentation (cheminée ou goulot), ou bien directement dans le couloir de volume N, par exemple en l'étalant sur le premier tiers du plan de migration puis en étalant du tampon électrophorétique sur les deux autres tiers.
Bien entendu, la longueur dudit couloir de volume N doit être suffisante pour permettre ladite séparation. Pour un choix de hauteur ou d'un gradient de hauteurs donné, cette longueur dépend des populations à séparer, mais aussi d'autres conditions opératoires telles que nature du champ électrique, intensité du champ électrique, nature du tampon utilisé. En fonction de ces conditions opératoires, l'homme du métier saura déterminer au cas par cas la longueur minimale efficace, si nécessaire au moyen d'essais préliminaires. Comme illustré dans les exemples ci-dessus, on parvient en effet à séparer des ADN compris entre 50 et 250 kb en champ continu avec une tension de 1 à 30 N sur une distance inférieure au . centimètre, voire au millimètre (acquisition d'une différence de 20s entre les pics d'élution de la population à Rmin -ADN lambda- et de la population à Rm x -ADN T2-). Il peut donc, dans un premier temps, être choisi de mettre en œuvre un dispositif qui offre une distance de migration disponible de plusieurs centimètres afin de se placer en très large excédent de longueur de migration disponible, pour ensuite ajuster et optimiser les dimensions efficaces du dispositif.. La séparation obtenue après avoir soumis les populations PAj à une confinement « intermédiaire » conforme à la présente invention est en effet conservée pendant plusieurs cm, de sorte que l'on peut construire un dispositif de longueur surdimensionnée à titre de prototype. Dans le cas de l'exemple précité, deux lames de microscope de 7,5 cm ont été utilisées en prototype ; de telles lames offrent donc une longueur de migration suffisamment excédentaire pour permettre tout type de séparation électrophorétique d'acides nucléiques.
Il est également recommandé de veiller à ce que la concentration en populations d'analytes dans la solution ne soit pas trop forte. Il a en effet été constaté qu'une trop forte concentration nuisait à la qualité de la séparation. Les interactions entre analytes gênent une differentiation maximum des vitesses des populations. Aussi, une concentration globale de l'ordre du dixième du C* du plus gros analyte (C* = concentration à partir de laquelle les molécules du plus gros analyte commenceraient à se toucher) apparaît préférable.
Lorsque l'on souhaite travailler en mode sans EOF, on peut utiliser un dispositif selon l'invention dont le couloir est à faces internes électriquement isolées et/ou non ionisables (cf. ci-dessus). L'on déposera alors ladite solution de populations PA; d'analytes en mélange dans le couloir dudit dispositif du côté du pôle positif ou négatif selon le signe de la charge des populations à séparer. Dans le mode sans EOF, les populations d'analytes chargés négativement migrent en effet en direction du pôle positif, et les populations d'analytes chargés positivement en direction du pôle négatif. Si les populations PAj à séparer sont constituées d'analytes chargés négativement, tels que acides nucléiques (ADN, notamment), on peut donc déposer la solution dans le couloir du côté du pôle négatif, les molécules les plus petites sortiront en premier au pôle positif. Si les populations PAj à séparer sont constituées d'analytes chargés positivement, on peut donc déposer la solution dans le couloir du côté du pôle positif, et les molécules les plus petites sortiront en premier au pôle négatif.
Lorsque l'on souhaite travailler en mode avec EOF, on peut utiliser un dispositif selon l'invention dont le couloir est à faces internes électriquement chargées ou ionisées tel que décrit ci-dessus. Les inventeurs ont en effet mis en évidence que, en présence d'EOF, du fait de la somme algébrique du champ électrique et de cet EOF, les populations d'analytes migrent en sens inverse de ce qu'il est observé en l'absence d'EOF : les populations d'analytes chargés négativement, tels que les acides nucléiques, migrent en direction du pôle négatif, et les populations d'analytes chargés positivement migrent en direction du pôle positif. Une solution de populations PA; d'analytes chargés négativement peut donc être déposée dans le couloir dudit dispositif du côté du pôle positif, alors qu'une solution de populations PAj d'analytes chargés positivement peut être déposée dans ledit couloir du côté du pôle négatif. Si un conduit d'alimentation en solution est inclus dans le dispositif destiné à travailler avec EOF, on placera donc de préférence ce conduit (capillaire ou cheminée, par exemple) du côté du pôle le plus approprié (pôle positif pour des analytes négatifs, pôle négatif pour des analytes positifs).
Le dispositif et le procédé selon l'invention sont adaptés à la séparation de tout type de toute population de molécules chargées ou chargeables. Des exemples de molécules comprennent les acides nucléiques double-brin (acides nucléiques chromosomiques notamment), les acides nucléiques simple-brin, tels que ADN et ARN double-brin et simple-brin ; les protéines ; les polymères ioniques tels que les polysaccharides ioniques et notamment les polysaccharides anioniques d'origine bactérienne ou végétale tels que les xanthanes, les succinnoglycanes et les carraghénanes.
Des xanthanes et des succinnoglycanes peuvent en effet être séparés d'un milieu de culture bactérien, tel que par exemple un milieu de culture de Pseudomonas campestris.
Les carraghénanes peuvent être séparés à partir de broyats ou d'extraits végétaux.
Ces polysaccharides sont notamment utiles pour l'industrie alimentaire.
Ils sont notamment utiles comme épaississant dans des produits alimentaires tels que les yaourts, dans des produits pharmaceutiques ou para-pharmaceutiques (médicaments, cosmétiques, produits pour l'hygiène) tels que les dentifrices, dans des produits tels que la peinture.
La préparation de fractions monodispersées permet d'optimiser leur utilisation quand la propriété recherchée (rhéofluidifiant, épaississant,..) dépend fortement de la masse.
De manière remarquable, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre sous champ électrique continu, par exemple, une tension appliquée continue comprise entre 1 et 1000 N, bornes incluses et choisie en fonction du système pour correspondre à un champ électrique compris entre 1 et 200 N/cm de manière à ce qu'il permette la séparation souhaitée, tout en conservant une bonne élimination de l'effet Joule.
Ceci étant, on pourra toutefois choisir d'appliquer un champ puisé.
La présente demande est également relative à toute utilisation d'un dispositif ou procédé conforme à l'invention pour la séparation d'ADN chromosomique, ou pour la production de xanthanes, succinoglycanes ou de carraghénanes monodispersés, par séparation à partir d'une solution en contenant en .mélange avec d'autres composés, ou pour la séparation de polyélectrolytes.
La présente invention est illustrée par les exemples qui suivent, donnés à titre purement illustratif. Ils ne la limitent en aucune façon. EXEMPLE 1 : VITESSES DE MIGRATION
Un prototype comprenant une unité de migration dont l'espace de volume V est défini dans la plus petite dimension par deux parois en verre a été construit . (système conforme aux schémas des Figures 1A et 6) à l'aide de deux lames de microscope standard (parois Prl et Pr2). La Figure 9 donne une représentation schématique de ce dispositif prototype en coupe longitudinale, et la Figure 10 une représentation schématique d'une vue de dessus de ce dispositif prototype. La Figure 11 en présente une photographie. Les parois en verre sont nues (c'est-à-dire non recouvertes d'un revêtement isolant).
Les capacités migratoires de ce dispositif sont testées en présence d'une solution contenant une population d'ADN lambda (48,5 kb ; Rf = 0,5 micromètre), puis en présence d'une solution contenant une population d'ADN T2 (164 kb ; Rf = 1 micromètre). La solution est tamponnée basique (en l'occurrence, Tris borate EDTA 10"2 M à pH 8,4), ce qui permet d'induire un chargement électrique négatif des parois de verre (solution mère d'ADN lambda à 500 μg/ml fournie par Biolabs (ref 301-1 S), et solution d'ADN T2 à 129 . μg/ml fournie par Sigma Aldrich(refD-4806)).
Les lames de microscope (lames standard en verre de longueur 7,5 cm ; Entreprise Roth-Sochiel SARL, 3, rue de la Chapelle, 67630 Lauterbourg, France) sont plongées dans une solution de tensio-actif £10%, Entreprise Roth-Sochiel SARL, 3, rue de la Chapelle, 67630 Lauterbourg, France) et soniquées durant 15 minutes. Elles sont ensuite rincées à l'eau distillée, et séchées à l'étuve à 60°C. Une bonne mouillabilité des lames est requise pour éviter l'apparition de bulles ; on veillera donc à ne pas dépasser une durée de stockage à sec qui excéderait 2 heures. Les lames pourront par contre être conservée 24 heures dans l'eau distillée sans altération notable de leur mouillabilité. La lame inférieure est connectée à deux réservoirs en polyoxyméthylène au moyen d'une ligne de joint silicone (CAF 4, Rhône-Poulenc) pour assurer l'étanchéité et la tenue mécanique.
Deux électrodes de platine (diamètre 0,1mm- Société Goodfellow SARL, 229, rue Solférino, 59000 Lille, France) sont insérées dans les réservoirs pour être reliées à un générateur (distance entre électrodes = 8 cm). Un générateur standard basse tension a été utilisé.
On apporte la solution contenant les analytes dans l'espace inter-lames en en déposant une goutte directement au milieu de la lame du bas, avant de recouvrir cette lame avec la seconde. On peut également apporter la solution directement entre les lames en l'étalant sur un tiers de la longueur de la lame, et en recouvrant les deux tiers restant de solution tampon. Alternativement, on peut apporter la solution via un conduit d'alimentation (ou cheminée) prévu à cet effet. Quelque soit le mode d'alimentation choisi, il importe de veiller à ce que le liquide soit apporté sans que des bulles de gaz ne se forment dans la couche de liquide.
Les Figures 12, 13 et 14 présentent des photographies d'un dispositif prototype sur lequel un petit tube en plastique placé sur la lame du haut symbolise la présence d'un éventuel conduit d'alimentation : la Figure 12 en présente une photographie sous forme démontée, la Figure 13 sous forme montée, et la Figure 14 présente le dispositif prototype schématiquement connecté à un générateur. En Figure 13, la borne noire est la borne positive, et la borne rouge la borne positive.
Une plaque de métal évidée (pour permettre l'observation au microscope) est mise et maintenue avec des vis pour assurer le serrage et maintenir la hauteur interlames h souhaitée (également appelée épaisseur e) (pièce figurant en haut de la Figure 12, et apparaissant en' premier plan en Figure 13).
Les deux réservoirs sont remplis de solution tampon (Tris borate EDTA 10"2 M à pH 8,4). L'épaisseur de liquide entre les lames est calculée précisément à partir d'une mesure de l'intensité du courant à l'aide d'un microampèremètre placé en série (U = Ri, lere loi d'Ohm ; on connaît U, on mesure i, on calcule R qui est fonction de l'épaisseur).
On mesure la vitesse ou mobilité électrophorétique (μ ≈ VADN/E, OÙ E désigne le champ électrique défini comme le quotient de U par la distance entre électrodes) à l'aide d'une caméra montée sur un microscope qui enregistre le déplacement des molécules. On détermine la vitesse des molécules par analyse des images du film. Les mesures sont effectuées pour différentes tensions appliquées (20N, 30N, 40N, 50N et 60N). Il a été vérifié que la mobilité électrophorétique (vitesse/champ électrique) était indépendante du champ.
De cette façon, la vitesse de la population d'ADN T2 et celle de la population d'ADN lambda ont été mesurées à différentes hauteurs inter-lames h.
La Figure 15 donne une illustration des résultats obtenus (mobilité apparente de chaque population en fonction de la hauteur inter-lames).
On constate que les vitesses (ou mobilités) sont différentes, et que le dispositif de l'invention permet donc de faire migrer la population d'ADN 48,5 kb à une vitesse différente de celle de la population d'ADN 164 kb.
La Figure 16 présente une représentation des mobilités mesurées en fonction de la hauteur inter-lames h (les symboles carrées représentent la population d'ADN T2, les symboles en croix la population d'ADN lambda). On observe qu'il y a bien une différence de vitesse entre les deux masses moléculaires pour des épaisseurs équivalentes. L'ADN T2 a une vitesse plus importante que celle de l'ADN lambda. Le phénomène de flux électro-osmotique (EOF) inverse l'ordre des mobilités (les plus fortes masses de déplacent plus vite). On peut distinguer trois régimes :
- régime I : à petite épaisseur (plus petite que la taille des chaînes), la mobilité mesurée augmente avec l'épaisseur et atteint un maximum,
- régime II : pour une épaisseur de l'ordre de 2 fois la taille des chaînes, la mobilité diminue brusquement, - régime III : à grande épaisseur (bien au-delà de la taille des chaînes), la mobilité est constante, et les différentes tailles de chaîne ne sont plus différentiables ; on est dans un régime où les parois n'ont plus d'effet sur les mobilités, les chaînes sont alors comme en solution.
EXEMPLE 2 : SEPARATION D'UN MELANGE
On poursuit l'expérimentation décrite à l'exemple 1 ci-dessus avec une solution qui comprend deux populations d'analytes en mélange (ADN de 48,5 kb et ADN de 164 kb en mélange).
On met ainsi en œuvre le dispositif prototype décrit à l'exemple 1 ci-dessus pour la séparation d'une solution comprenant deux populations d'ADN en mélange, à savoir une solution comprenant en mélange une population d'ADN lambda (48,5 kb- 1,25 μg/ml) et une population d'ADN T2 (164 kb- 1,29 μg/ml) dans une solution aqueuse tamponnée basique (en l'occurrence, Tris borate EDTA 10*2 M à pH 8.4).
La concentration finale d'ADN lambda provient de la dilution d'une solution mère à 500 μg/ml fournie par Biolabs, et celle du T2 d'une solution 129 μg/ml fournie par Sigma Aldrich. Aux fins de visualisation et d'analyse d'images, les ADN sont marqués avec du YOYO-1 (Molecular probes, Eugène, Oregon, USA) au taux de 1 colorant pour 50 paires de bases conformément aux indications du fournisseur.
Un volume de mélange de 60 μl est étalé sur la lame inférieure (l'épaisseur de la couche liquide est alors de l'ordre de 5 μm), puis recouvert par la lame supérieure. On procède par ailleurs comme indiqué dans l'exemple 1 ci-dessus.
Le cache supérieur est mis en place et maintenu par des vis afin que le remplissage des cuves latérales par 800 μl de tampon TBE 10"2M ne re-soulève pas la lame supérieure. Une estimation de l'épaisseur de liquide est faite à partir de la course du bouton de réglage fin du microscope (1 graduation = 2 μm) existante entre les mises au point de la face inférieure de la lame supérieure et la face supérieure de la lame inférieure . En faisant varier le volume initial de mélange, nous prédéterminons la hauteur h inter-lames finale, et avons ainsi effectué des mesures de mobilité à différentes épaisseurs.
Résultats ;
Le tableau 1 ci-dessous présente un résumé des valeurs expérimentales mesurées, placées en comparaison avec les mobilités mesurées pour les mêmes populations non mélangées :
Figure imgf000029_0001
Les Figures 17 et 18 donnent une représentation graphique des résultats expérimentaux. Les Figures 17 et 18 présentent les distributions des vitesses du mélange lambda + T2 (graphes du haut), des molécules les plus grosses (ADN T2 au milieu), et des molécules les plus petites (graphes du bas), pour différentes épaisseurs de confinement : en Figure 17, les trois graphes placés en colonne à gauche présentent les distributions de vitesse obtenues avec un dispositif dont la hauteur inter-lames h est de 1,2 micromètre, et les trois graphes placés en colonne à droite les distributions de vitesse obtenues avec un dispositif dont la hauteur inter-lames h est de 2,3 micromètres ; en Figure 18, les trois graphes placés en colonne à gauche présentent les distributions de vitesse obtenues avec un dispositif dont la hauteur inter-lames h est de 5 micromètres, et les trois graphes placés en colonne à droite les distributions de vitesse obtenues avec un dispositif dont la hauteur inter-lames h est de 8 micromètres. Les distributions de vitesses des molécules les plus grosses (ADN T2 au milieu) et des molécules les plus petites (graphes du bas) ont été obtenues a partir de la distribution du mélange une fois que le programme de traitement d'image a trié les molécules par tailles en affectant à chaque population sa vitesse. On note que dans le cas où les vitesses des populations sont les plus différentes (hauteur inter-lames h est de 2,3 micromètres), la distribution globale est clairement bimodale (puisque le mélange contient deux populations de masses différentes).
Les courbes sont caractérisées par la surface des pics, qui permettent de distinguer les deux types de populations d'ADN, et la position des pics, qui renseignent sur la vitesse moyenne des chaînes, ainsi que l'erreur associée à cette moyenne (largeur à mi-hauteur divisée par la racine du nombre de vitesses mesurées).
On remarque qu'à une hauteur inter-lames h de 1,2 micromètre, de 2,3 micromètres et de 5 micromètres, la population d'ADN lambda et celle d'ADN T2 ont, en mélange, des mobilités moyennes respectives qui restent significativement différentes, et que le dispositif permet donc leur séparation. A une hauteur inter-lames de 8 micromètres, il n'y a plus de différence significative en terme de mobilité. Nous avons vérifié que dans un capillaire avec h= 50 micromètres, les vitesses des deux populations sont identiques.
Concentration en analytes de la solution et effet d'entraînement :
On constate par ailleurs que l'AON T2 a toujours une mobilité supérieure à celle de l'ADN lambda, mais l'ADN lambda a une mobilité plus importante que celle mesurée lorsqu'il est seul.
Comme l'ADN T2 garde la mobilité qu'il avait lorsqu'il était seul, on peut en conclure que le T2 entraîne le lambda avec lui. La concentration des molécules utilisée doit avoir un effet important sur cet entraînement. Elle est inférieure à la concentration de recouvrement c (c* (lambda) = 10 μg/ml et c (T2) = 2 μg/ml) en solution et nous avons mesuré que les chaînes occupaient environ 1% de la surface de l'image lors du confinement. Les molécules les plus lentes n'ont pas de place pour éviter les plus rapides et sont donc vraisemblablement emportées. De plus, l'augmentation de la mobilité du lambda diminue lorsqu'on augmente la hauteur inter-lames h (également appelée épaisseur e). Elle est de 2,2 pour h = 1,2 μm , de 1,5 pour h = 2,3 μm et de 1,4 pour h = 5 μm. Ceci confirme que les plus courtes chaînes sont entraînées par les plus longues. Une concentration plus faible • doit empêcher cet effet puisque dans la limite d'une solution très diluée, les chaînes doivent se comporter comme si elles étaient isolées. On remarque d'ailleurs sur la figure 17 la présence d'un deuxième pic à gauche de l'histogramme de la vitesse de l'ADN T2 (colonne de droite de la Figure 17).
Il est donc dans ce cas recommandé de diluer la solution avant migration, afin de limiter, cet effet.
Interprétations des différents régimes de migration :
Les molécules observées sont mises en mouvement par le champ électrique E qui leur applique une vitesse électrophorétique ve/ qui est opposée au champ. Mais comme ces chaînes sont dans un milieu confiné par deux parois chargées, un flux électro-osmotique (EOF : Electro-Osmotic Flow) de vitesses VEOF les emportent dans l'autre sens. Elles ont finalement un mouvement avec une vitesse apparente v (cf. Figures 19A, 19B et 19C).
L'axe horizontal (direction de migration Dra) est l'axe Oj (de vecteur unitaire ux). v s'écrit :
v = veι + VEOF
La mobilité est habituellement une valeur scalaire (positive si les chaînes sont chargées positivement). D'après l'équation précédente, la mobilité apparente μ s'écrit donc:
μ = μeι + μεOF Nous appelons μsoι la mobilité en solution. Cette mobilité n'est pas dépendante de la masse des molécules. On trouve dans la littérature plusieurs mesures de cette mobilité et toutes s'accordent à dire que sa valeur est environ 4.10"4 cmWs .
Les mesures effectuées sur l'ADN T2 et l'ADN λ ont qualitativement la forme représentée sur la figure 20.
Pour voir l'influence du confinement sur la mobilité vraie il faut donc enlever la mobilité électro-osmotique à la mobilité mesurée. Nous avons pu montrer que la vitesse de l'EOF n'est pas dépendante de l'épaisseur tant que celle-ci est plus grande que 2K'1. C'est bien le cas dans nos mesures. Dans l'équation précédente μeι est négatif et les deux autres mobilités sont positives. La variation de la mobilité vraie (électrophorétique) en valeur absolue est représentée schématiquement sur la figure 21.
En premier lieu, on observe que l'ADN λ a une mobilité supérieure à celle du T2 et atteint la valeur limite μsoι plus rapidement que le T2. C'est donc bien ce que l'intuition nous laisse penser. Ayant une taille plus petite que l'ADN 72, le λ ressent les effets du confinement à plus petite épaisseur.
Ensuite, à grande hauteur inter-lame h, c'est-à-dire à grande épaisseur e (e » Rg), les molécules réagissent de la même manière au champ électrique appliqué (c'est le régime III de la Figure 16); leur mobilité est μsoι. Si on diminue l'épaisseur, les molécules commencent à ressentir les parois et leur mobilité diminue (régime II de la Figure 16). Enfin, à petite hauteur inter lames h, c'est-à- dire à petite épaisseur (e < Rg), les mobilités augmentent (régime I de la Figure 16). Nous présentons dans la suite une interprétation de cette augmentation de la mobilité vraie (c'est-à-dire une diminution de la mobilité mesurée) avec des arguments utilisant des lois d'échelle.
Explications en loi d'échelle du régime I Nous avons distingué deux interprétations possibles de ce régime. La première prend en compte la chaîne comme un objet imperméable au solvant. La deuxième interprétation considère la chaîne comme perméable au solvant. La différence des résultats obtenus se trouve dans la dépendance en masse de la mobilité calculée.
Première interprétation
Les molécules en confinement fort sont écrasées entre les parois. Chaque chaîne forme un cylindre de rayon Rp et d 'épaisseur e (épaisseur e = hauteur h). Elles sont donc en contact avec les parois.
Chaque chaîne sera donc soumise à trois forces. La force électrique du champ E, la force de friction de la chaîne sur le liquide et la force de friction de la chaîne sur les parois de confinement.
La force électrique Feι du champ E qui tire les molécules vers l'électrode positive s'écrit :
Ee;(par unité de surface) = — yE
où ε est la constante diélectrique du milieu (ε = εo εr), ζ est le potentiel zêta de l'ADN et 2τri_2 + 2πRne κ~' 1& longueur de Debye . On suppose que cette force par unité de surface agit sur la surface du cylindre, c'est-à-dire
La force électrique est donc :
Pt = ïÊRl ( R
Cette force électrique a un module positif (ζ et E.UX sont négatifs). Elle entraîne bien les molécules vers l'électrode positive.
La force FC/L de friction de la chaîne sur le liquide s'écrit : Ec/i(par unité de surface) _ = - „ V - VEOF
--1 où ηι est la viscosité du liquide. En électrophorese, on considère la chaîne comme étant en drainage libre, donc le liquide frotte sur toute la chaîne (et pas seulement sur la sphère équivalente). Les forces hydrodynamiques sont alors écrantées sur une distance K'. Cette force agit sur la tranche du cylindre, c'est-à-dire sur une surface 2Rp e.
Figure imgf000034_0001
Cette force de friction est orientée dans le sens positif puisque -(v -VEOF)-UX < 0.
Enfin la chaîne frotte sur les parois. Le nombre de monomères Ni au contact des parois peut être exprimé par N; = N a/e (N est le nombre de monomères par chaîne et a la taille d'un monomère). Donc la force de friction sur les parois s'écrit:
α2 Fc/s - -fv = -ηιN—v e où 771 est un coefficient de viscosité caractérisant la friction d'un monomère sur les parois. Cette deuxième force de friction est orientée quant à elle dans le sens négatif.( -v.f > 0).
Le bilan des forces s'écrit
Fc/L
Figure imgf000034_0002
Nous avons mesuré la mobilité μ des chaînes v = μ E. La mobilité électro- osmotique s'écrit
Figure imgf000034_0003
où ζs est le potentiel zêta des parois. La mobilité en solution s'écrit sol - = €^ < 0
1/2 ou ζ est le potentiel zêta des molécules d'ADN. En prenant ^ = ^" ^"pour une chaîne gaussienne, on obtient:
Figure imgf000035_0001
On exprime maintenant ce bilan de force en fonction de rc - N1'2 a/e, et μ s'écrit :
Figure imgf000035_0002
En supposant que ηj ~ ηι et que K'1 ~ a, la relation précédente s'écrit
Figure imgf000035_0003
Lorsque rc tend vers 0 (c'est a dire e tendant vers l'infini), les chaînes sont en solution, et μ = μεoF +μSoi- De plus, l'équation précédente rend compte de la diminution de la mobilité mesurée μ lorsque l'on diminue l'épaisseur entre les parois. Enfin, cette diminution est dépendante de la masse (par N et par τc) ce qui confirme l'observation des mobilités différentes pour deux chaînes de taille différente.
Pour rc » 1 (c'est-à-dire à petite épaisseur), la mobilité calculée devient très grande (Figure 22) : à petite épaisseur μ diverge. Cette théorie ne sera plus valable pour des taux de confinement supérieure à 10, puisque lorsque τc tend vers N1/2 (l'épaisseur est égale à la taille des monomères), la mobilité de la chaîne devrait être nulle même avec l'EOF. La chaîne serait bloquée par les parois. Nous n'avons pas fait d'expériences avec des taux de confinement aussi importants. La figure 22 représente cette variation théorique de la mobilité mesurée μ en fonction de l'épaisseur e. Nous avons choisit μεo +μsoι - 1 en unité arbitraire sur cette représentation.
Deuxième interprétation
On considère toujours les trois forces précédentes. Mais dans cette interprétation, la force électrique agit sur chaque monomère : elle n'agit plus sur la surface du cylindre. Cette force s'écrit :
F = NqÊ où q est la charge d'un monomère.
La force de friction de la chaîne sur les parois reste inchangée :
2
FC/s — —ηiNiav ≈ —η- N — v
La force de friction de la chaîne sur le solvant n'agit plus sur la surface de cylindre mais sur chaque monomère (chaîne perméable au solvant) et s'écrit :
FC/L = ~ (N ~ Nι)a(v - VEOF)
Par la même procédure que pour la première interprétation, on obtient la mobilité mesurée :
sol + EOF (l - f) μ = - te - 1) *
μ>sol ηa avec
La dépendance en masse est indirecte. Les chaînes ne subissent ces forces que si elle sont confinées. Le taux de confinement de l'ADN λ et l'ADN 72 n'est pas le même pour une épaisseur donnée. Ils ne suivent donc pas cette mobilité aux même épaisseurs.
A petite épaisseur nous avons le même problème que dans l'interprétation précédente. Ces interprétation ne sont valides que pour des taux de confinement inférieur à 10. La variation de la mobilité en fonction de l'épaisseur a la même allure dans les deux cas.
Finalement, la pertinence de l'une ou l'autre de ses interprétations est difficile à définir. Il faut choisir entre : (i) une perméabilité des chaînes au solvant et une dépendance en masse faible, et (ii) une imperméabilité des chaînes au solvant et une forte dépendance en masse. Les mesures montrent une importante dépendance en masse. Cependant, pour l'électrophorèse, on considère toujours les chaînes en drainage libre.
Régime II
Le régime II est difficile à expliquer. On pourrait d'abord penser que les parois jouent le même rôle que pour la diffusion et diminuent la mobilité électrophorétique (donc augmentent la mobilité mesurée). Mais cet argument ne convient pas car il faudrait considérer la chaîne comme étant en non drainage libre, ce qui n'est pas le cas en électrophorese.
Aux épaisseurs correspondant à ce régime II, le rayon de giration est plus petit que l'épaisseur, mais Rg n'est qu'une moyenne de leur rayon. Les chaînes fluctuent et ont donc la possibilité d'explorer l'espace au delà de la sphère de rayon Rg et de s'approcher d'une des parois. De plus, pour les épaisseurs correspondant à ce régime, les molécules ont la possibilité de se déplacer de part et d'autre du plan médian des deux parois. Elles peuvent alors frotter sur les parois qui sont tout de même assez proches. Ceci reste assez difficile à quantifier.
Régime IH : Le plateau observé lorsque l'épaisseur de confinement est supérieure à la taille des chaînes, est facilement interprétable. Les parois n'influencent plus la mobilité électrophorétique est les chaîne se trouvent comme en solution. Là mobilité vraie
(en valeur absolue) est donc de l'ordre de 4 10"4 cmWs, ce qui nous permet d'évaluer la mobilité électro-osmotique à environ 5 10"4 cmVNs.
Surfaces de verres :
Nous avons observé la rugosité des parois de verre à l'aide d'un AFM {AFM : microscope à force atomique ou « atomic force microscope ») . Les images obtenues montrent une rugosité très faible (pics de 5 à 50 Â). Comparée à la taille de la chaîne, la surface est plutôt lisse. La séparation obtenue ne peut donc être due à des obstacles topologiques.
Calcul des bornes de hauteurs efficaces h min_
Au vu des expériences réalisées, il apparaît donc que lorsque les populations d'analytes présentes dans une même solution sont placées dans un confinement d'un niveau « intermédiaire » entre la situation « libre en solution « et la situation « très confiné avec compression moléculaire », il est possible de séparer ces populations de façon tout à fait satisfaisante. On peut décrire de manière imagée cette situation de confinement « intermédiaire » comme correspondant à une situation où :
- les molécules d'analytes ne sont pas comprimées par les parois du couloir de migration (leur rayon moléculaire moyen n'est pas écrasé) : elles ne sont pas contraintes à un frottement constant sur ces parois, elles ne sont pas soumises à des forces mettant en jeu leur élasticité, et où
- les molécules d'analytes n'en sont pas pour autant laissées libres comme le seraient dans une solution : leurs mobilités respectives sont en effet affectées par la présence de parois à leur proximité immédiate. Il a alors été déterminé que les bornes des hauteurs utiles (ou hauteurs efficaces) de cette situation de confinement « intermédiaire » peuvent être exprimées en fonction des rayons moléculaires moyens des populations présentes.
Ainsi, si l'on considère une solution comprenant 2 populations PAi et PA2 d'analytes chargés dont le rayon moléculaire moyen dans cette solution est Ri et
R2, respectivement, avec Ri < R2, la hauteur inter-lames efficace pour un confinement « intermédiaire » conforme à la présente invention est comprise entre
Ri et six fois R2 : Ri < h < 6R2. Cette relation peut être généralisée à une solution comprenant n populations PAi avec i allant de 1 à n, et n supérieur ou égal à 2 ; dans ce cas, il suffit de déterminer le plus et le plus grand des rayons moléculaires moyens en présence, pour calculer les bornes de la gamme de hauteurs efficaces : hirin(efficace) = Rmin et hmax(efficace) ≈ 6Rmax- Bien entendu, le dispositif peut être, si souhaité, sur-dimensionné et présenter une hmin(disponibie) très légèrement inférieure à la hmincefficace), et une hma (disponibie) supérieure au hmax(efficace)5 étant donné que la séparation acquise au cours de la gamme hmm(effîcace)-hmax(efficace) est conservée en
SOrtie après hmax(efricace)-
De manière plus générale, la relation de confinement « intermédiaire » conforme à l'invention peut ainsi s'exprimer sous la forme 0,2 < τc < 2, τc étant le taux de confinement subi par les analytes (τc est le rapport entre le diamètre moléculaire moyen et la hauteur disponible proposée aux molécules: τc = 2R / h).
Calcul de la longueur efficace de migration Lm efficace :
En présence d'une solution comprenant en mélange n populations d'analytes PAi, on peut donc calculer la distance de migration nécessaire pour obtenir une différence de vitesse déterminée.
Par exemple, dans le cas du présent exemple, avec une hauteur inter-lames constante de 2,3 micromètres, on observe que la vitesse moyenne de la population d'ADN lambda est de 19 micromètres par seconde, et celle de la population d'ADN T2 est de 25 micromètres par seconde. Si l'on souhaite obtenir une différence de temps d'élution de 20s entre les populations, on doit alors disposer d'une longueur de migration efficace Lm(efficace) de 20/(1-19 - 1/25) = 1583 micromètres. Le dispositif prototype utilisé qui offre une longueur disponible de migration de 7,5 cm est donc très sur-dimensionné.
EXEMPLE 3 : SYSTEME EN BISEAU
Comme présenté en exemple 2 ci-dessus, il existé, conformément à la présente invention, un gradient de hauteurs efficaces pour assurer le confinement . « intermédiaire » requis. Lorsque la solution comporte plusieurs populations d'analytes à séparer, et notamment plus de deux populations d'analytes à séparer, il est donc avantageux de configurer le dispositif de manière à ce qu'il offre non pas une seule hauteur h constante, mais un gradient de hauteurs qui parcourt la gamme hmin - hmax. On place alors le dispositif en configuration de sections divergentes telle que celles présentées schématiquement en Figures 2A, 2B, 3A, 3B et 5.
En poursuivant les exemples 1 et 2 présentés ci-dessus, on peut donc par exemple placer la lame supérieure en position inclinée d'un angle θ par rapport à la direction de migration (l'horizontale), ce qui conduit à un dispositif en demi- biseau tel que représenté schématiquement en Figure 24. On a alors θ = Arcsin (6Rmax / Lm). Avec une lame de microscope de 7,5 cm, on obtient donc un angle θ de 7,6 mrad.
On peut aussi bien incliner les deux lames d'un angle Θ par rapport à la direction de migration, ce qui conduit alors à un dispositif en biseau tel que représenté schématiquement en Figure 23. On a alors θ = Arcsin (3Rmax / Lm).
Ces relations entre angle θ et longueur permettent réciproquement de calculer la longueur de migration efficace Lm (longueur minimale nécessaire) pour un angle θ déterminé.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif adapté à la séparation électrophorétique de n population(s) PA; d'analytes chargés électriquement, à partir d'une solution les comprenant en mélange, avec i allant de 1 à n et avec n supérieur ou égal à 1 , chaque population d'analytes étant caractérisée par un rayon moléculaire moyen Rj qui, dans ladite solution, est différent de celui de la ou des autres populations PAj d'analytes chargés, caractérisé
en ce qu'il comprend une unité de migration comprenant au moins une paroi solide compacte Pr définissant un couloir de migration dans lequel il y a un espace de volume V, dans lequel est susceptible de régner un champ électrique, ledit couloir étant destiné à recevoir ladite solution de populations d'analytes, et à y permettre la migration de ces populations d'analytes suivant une direction de migration Dm contenue dans ledit volume N dudit couloir sur une longueur de migration disponible mdisponibie, et
en ce qu'il comprend en outre des moyens de réglage (4) dudit volume N pour permettre de faire varier ce volume V en fonction des rayons moléculaires moyens
Ri des populations PAj d'analytes chargés destinées à être reçues dans ledit couloir de migration, de sorte à ce que ledit couloir puisse présenter un volume V qui, tout au long de ladite longueur de migration disponible Lmdisponibie, ou sur une partie efficace de celle-ci, soit adapté pour maintenir chacune des populations d'analytes PAj destinées à être reçues dans ce couloir à un taux de confinement τq qui est supérieur ou égal à 0,2 et inférieur ou égal à 2, le taux de confinement τq d'une population PAj à un point p de la direction Dm de migration étant défini par le rapport suivant : τcj = [2 x (le rayon moléculaire moyen Rj de la population PAj)] / [la plus petite dimension de l'espace de volume V dudit couloir qui est perpendiculaire à la direction Dm de migration audit point p].
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'espace de volume N dudit couloir de migration est dépourvu d'obstacle topologique.
3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, qui est spécialement adapté à la séparation électrophorétique de n population(s) PAj d'acides nucléiques dont le(s) rayon(s) moléculaire(s) moyen(s) (respectifs) Rj est(sont) compris entre 0,5 et 1 micromètre, bornes incluses, à partir d'une solution les comprenant en mélange, caractérisé en ce que la plus petite dimension dudit espace de volume V est comprise entre 1,2 et 5 micromètres bornes incluses, préférentiellement entre 2 et 4 micromètres, par exemple 2,3 micromètres.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit couloir de migration présente un volume V choisi parmi le groupe constitué par un volume à section constante et un volume à sections divergentes.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit espace de volume V est défini par au moins deux parois solides compactes Pri et Pr2 en regard l'une de l'autre.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit espace de volume défini par au moins une paroi solide compacte est délimité par au moins deux faces solides compactes Fi et F en regard l'une de l'autre, lesdites faces étant séparées par : une hauteur h constante non nulle, ou par - un gradient de hauteurs non nulles Vh, qui s'étend de la hauteur la plus faible hmjn à la hauteur la plus élevée hraaχ, avec hmjn < hmax, de manière à définir entre elles ledit couloir de migration de volume N, et en ce que :
- ladite hauteur h constante est supérieure ou égale au plus petit des rayons moléculaires moyens (Rmin) des populations PAj destinées à être reçues dans ledit couloir, mais inférieure ou égale à six fois le plus grand des rayons moléculaires moyens des populations d'analytes PAj destinées à être reçues dans ledit couloir (6 x Rmax), ou le cas échéant, ledit gradient Vh est tel que sa borne inférieure hmin est supérieure ou égale audit Rmin, et sa borne supérieure hraax est supérieure ou égale à 6 X K ax-
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites au moins deux faces Fi et F en regard l'une de l'autre sont toutes deux parallèles à ladite direction Dm de migration.
8. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'une desdites au moins deux faces en regard l'une de l'autre Fj ou F forme un angle θ non nul par rapport à ladite direction Dm de migration.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un conduit d'alimentation (3) destiné à alimenter ledit couloir de volume V en solution de populations PAj d'analytes à séparer.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N a une face interne non ionisable.
11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N est une paroi en matériau solide compact, couverte sur sa face interne d'une couche de revêtement électriquement isolant.
12. Dispositif selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que ladite ou chacune desdites faces internes non ionisables présente une attraction εs inférieure ou égale à 2,0.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N a une face interne ionisable.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que la ou chacune des faces internes desdites parois solides compactes dudit couloir de volume N présente une rugosité comprise entre 0 et 100 Angstrôm, préférentiellement entre 30 et 60 Angstrôm, par exemple de 5 à 50 Angstrôm, toutes bornes incluses.
15. Dispositif selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que la ou chacune des parois solides compactes dudit couloir de volume N est une paroi en verre.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un capillaire de sortie pour collecter les populations PAj d'analytes séparées.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure au centimètre, préférentiellement une taille inférieure au millimètre.
18. Νano- ou micro-puce caractérisée en ce qu'elle comprend un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
19. Procédé pour la séparation électrophorétique de n population(s) d'analytes PAj chargés électriquement, à partir d'une solution les comprenant en mélange, avec i allant de 1 à n et avec n supérieur ou égal à 1, chaque population PA; d'analytes étant caractérisée par un rayon moléculaire moyen Rj différent de celui des autres populations PAj d'analytes contenues dans ladite solution, caractérisé en ce que l'on place ladite solution de telle sorte que toutes les populations PAj d'analytes à séparer se trouvent maintenues à un taux de confinement τq qui est supérieur ou égal à 0,2, et inférieur ou égal à 2, et l'on applique un champ électrique, de manière à ce que lesdites populations d'analytes PAj migrent d'un pôle à l'autre suivant ladite direction Dm de migration, chaque population d'analytes PAj contenue dans ladite solution acquérant ainsi une vitesse moyenne significativement différente de celle des autres populations PAj à séparer contenues dans ladite solution.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que :
- on fournit un dispositif ou une puce qui comprend une unité de migration comprenant au moins une paroi solide compacte Pr définissant un couloir de migration dans lequel il y a un espace de volume V, dans lequel est susceptible de régner un champ électrique, ledit couloir étant destiné à recevoir ladite solution de populations d'analytes, et à y permettre la migration de ces populations d'analytes suivant une direction de migration Dm contenue dans ledit volume V dudit couloir sur une longueur de migration disponible Lmdisponibie, et qui est choisi et/ou ajusté de telle sorte que : τq min = [2 x Rmin] / [la plus petite dimension de l'espace de volume V dudit couloir qui est perpendiculaire à la droite Dm de migration], et τq max = [2 x Rmax)] / [la plus petite dimension de l'espace de volume V dudit couloir qui est perpendiculaire à la direction Dm de migration] soient tous deux, indépendamment l'un de l'autre, supérieurs ou égaux à 0,2 et inférieurs ou égaux à 2, avec Rmjn représentant le plus petit des rayons moléculaires moyens des populations PAj destinées à être reçues dans ledit couloir, et avec Rmaχ le plus grand des rayons moléculaires moyens des populations PAj destinées à être reçues dans ledit couloir, on dépose ladite solution dans ledit dispositif ou ladite puce en la plaçant dans le couloir de ce dispositif ou cette puce, et on applique un champ électrique, de manière à ce que lesdites populations d'analytes PAj migrent d'un pôle à l'autre suivant ladite direction Dm de migration, chaque population d'analytes PAj contenue dans ladite solution acquérant ainsi une vitesse moyenne significativement différente de celle des autres populations PA, à séparer contenues dans ladite solution.
21. Procédé selon la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que le dispositif ou puce mis en œuvre est un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à
17, ou le cas échéant une puce selon la revendication 18.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisé en ce que on place ladite solution dans un couloir de migration qui présente un volume V choisi parmi le groupe constitué par un volume à section constante et un volume à sections divergentes.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que l'on place ladite solution dans un dispositif dont le couloir est à faces internes non ionisables, et en ce que l'on dépose ladite solution de populations PAj d'analytes en mélange dans le couloir dudit dispositif du côté du pôle négatif, lorsque ces populations PAj sont des populations d'analytes chargés négativement, ou du côté du pôle positif, lorsque ces populations PAj sont des populations d'analytes chargés positivement
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'on met en œuvre un dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12.
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que l'on place ladite solution dans un dispositif dont le couloir est à faces internes ionisables, et en ce que l'on dépose ladite solution de populations PAj d'analytes en mélange dans le couloir dudit dispositif du côté du pôle positif, lorsque ces populations PA; sont des populations d'analytes chargés négativement, ou du côté du pôle négatif, lorsque ces populations PAi sont des populations d'analytes chargés positivement.
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que le dispositif mis en œuvre est un dispositif selon l'une quelconque des revendications 13 à 15.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 26, caractérisé en ce que lesdites populations PAj d'analytes sont choisies parmi le groupe constitué par les acides nucléiques double-brin, les acides nucléiques simple-brin, tels que ADN et ARN double-brin et simple-brin ; les protéines ; les polymères ioniques tels que les polysaccharides ioniques et notamment les polysaccharides anioniques tels que les xanthanes, le succinnoglycane et les carraghénanes.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 27, caractérisé en ce que ledit champ électrique est un champ continu.
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