WO1993002704A1 - Melange de constituants peptidiques ayant des proprietes vaccinantes contre le paludisme, notamment du a plasmodium falciparum - Google Patents

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WO1993002704A1
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Denise Mattei
Artur Scherf
Odile Mercereau-Puijalon
Serge Bonnefoy
Jurg Gy Sin
Luiz Pereira Da Silva
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Institut Pasteur
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a mixture of 3 peptide constituents having vaccine properties against malaria, in particular A Plasmodium Falciparum. more particularly the ability to induce a protective immune response in vivo, including the production of immunoprotective antibodies capable of destroying the blood stage parasites responsible for disease in humans, in a primate model represented by the squirrel monkey SAIMIRI SCIUREUS.
  • the "first constituent” is constituted by a polypeptide derived from a major antigen of P falciparum, having a molecular weight of the order of 72 kDA, hence the name "Antigen 72 DA” used in this mistletoe follows for the denote, in particular of a polypeptide derived from this 72 kDA antigen having the capacity, like this:
  • This first constituent is itself often recognized by sera from human patients living in regions where malaria is rampant.
  • the nucleotide sequence coding for the peptide sequence sequence 72 kDA antigen was identified by LS MATTEI et al European Journal of Immunology (1989) 19: 1823 - 1828.
  • the first component is advantageously constituted by a polypeptide hereinafter designated "i72" comprising the 153 amino acids from the C-terminal region of the 72 kDA antigen, including the amino acid sequence, as well as a nucleic acid sequence coding for the polypeptide i72 are presented below:
  • the second constituent consists of a coded peptide or oligopeptide as defined below.
  • the second constituent, as well as a nucleic acid fragment which codes for this second constituent, are characterized in that they contain the following respective sequence elements:
  • This oligopeptide being recognized by antibodies against P.falciparum or capable of inducing production
  • a "second preferred constituent is the recombinant peptide containing the sequence of the peptide" R 23 "- of formula
  • a strain of E. Coli containing the corresponding DNA sequence was deposited on July 27, 1990 under number I-986 at the CNCM.
  • the peptide R23 (component 2) used in the example which follows, was likewise produced in the form of a recombinant fusion protein with the glutatione transferase of Schistosoma japonicum, according to the technique already mentioned by DB Smith and KS Johnson , or in the form of a fusion protein with ⁇ galactosidase from E. Coli by cloning into the vector pMSgtll (Scherf, A., Mattei, D. and Schreiber, M. (1990). "Parasite antigens expressed in Escherichia coli. A refined approach for epidemiological analysis". Journal of Immunological methods, 128: 81 -87).
  • the third constituent consists of an EB 200 polypeptide containing the polypeptide sequence below defined by its amino acid sequence: SVTGNILVEG
  • polypeptide is also capable of inducing protective antibodies in vivo, as defined above.
  • a preferred polypeptide is the "EB200" polypeptide, the amino acid sequence of which as well as a nucleotide sequence coding for this polypeptide, appear below: 31/11 GAA GTT GTA GGA GAA GAA AAA TTA GTT AGT 'GAA GAA ATA GTA A glu val val gly glu glu lys leu val ser glu glu ile val t
  • a recombinant fusion peptide containing this sequence (“component 3" in the following example) has, like “component 1" and “component 2”, been produced using the technique described by D. B. Smith and K.S. Johnson.
  • a culture of E. Coli (Escherichia coli DH 5) containing the corresponding expression plasmid was deposited on July 24, 1991 at the CNCM under the number I-1128.
  • the vaccine mixture of the invention contains proportions of these three constituents which can be adjusted by the specialist, according to their individual activities, measurable for example in a test of the type of which the description will be given in l 'example.
  • these proportions may, for each of the three constituents, correspond to a value of between 5% and 80%, in particular between 20% and 80% in moles of the mixture, it being understood of course that the total of the three proportions chosen cannot exceed 100 -t in moles.
  • polypeptides responsible for the relative activities of the three constituents can be used either alone, in particular when they themselves have sufficient immunogenic activity, where appropriate in the presence of an appropriate immunological adjuvant, for example of the muramylpeptide type or the like, or in oligomerized forms, in the case where such an oligo erisation would reinforce the induction of an immune response, either still within fusion proteins (as in the example which follows), or finally in the state conjugated to proteins carriers.
  • Techniques for producing such conjugates are described, for example, in French patent application 89 04847/2 645 877 filed October 12, 1989.
  • the invention also relates to fusion proteins in which peptide sequences respectively from the "first ",” second “and” third "constituents would be included in a single protein, these peptide sequences being linked to each other, either end to end, or via peptide bridging elements.
  • Each of these peptide sequences is reduced to the necessary size allowing it to contribute to the induction of antibodies recognizing the constituent to which it corresponds, when this fusion protein is administered to an appropriate host.
  • the fusion protein would comprise end-to-end linked sequences respectively from the "i72" polypeptide, the EB 200 polypeptide and the R23 polypeptide.
  • sequences of the last two peptides mentioned are optionally limited to fragments each containing 3 to 4 motifs of the degenerate repetitive sequences which EB200 and R 23 respectively have.
  • Such proteins fusing the 3 constituents can be produced by genetic engineering techniques, in particular by transformation of a competent cellular host by a vector modified by a nucleic acid itself containing successive nucleotide sequences coding for the corresponding polypeptide sequences in a common reading phase, under the control of a promoter recognized by the cell host polymerases.
  • the invention naturally relates to all vaccine compositions in which the above mixture of polypeptides is found associated with pharmaceutically acceptable vehicles facilitating their administration to humans.
  • Plasmodium falciparum strain the parasite strain used was the Palo Alto strain (FUP-1) adapted to the Saimiri monkey in 1979 (Gysin et al J. Parasitol. 66: 1003-1009, 1980).
  • Identification of groups of experimental animals the animals used in the experiment come from the Saimiri sciureus farm of the Institut Pasteur in French Guyana, belonging to the Guyana phenotype of karyotype K14-7. All were born in captivity (generation IF) and were between 1 and 2 years of age in March 1991.
  • the distribution of the animals in the groups was made by drawing lots from an initial pool group of 15 monkeys .
  • the identification numbers of each monkey were those assigned at birth and correspond to the individual files in the file established in the computerized program of the primatology unit of the Institut Pasteur in French Guyana.
  • FIG. 1 illustrates the results obtained concerning the evolution of parasitaemias (P on the ordinate axis) as a function of the number of days (D) following the test inoculations in the vaccinated monkeys and in the control monkeys.
  • the curves (a) relating to the animals of group II show a rapid development of the parasitaemia within 4 to 6 days following the inoculation of the animals with the parasitized red blood cells forcing the experimenter to introduce a chiotherapeutic treatment on the 7th day after infection.
  • the monkey 89021 exhibited a maximum parasitaemia rate of 0.48% on day 16 after the challenge.
  • the invention naturally also relates to mixtures of specific antibodies which can be obtained from respective constituents of the above-mentioned mixtures of polypeptides.
  • These mixtures of antibodies can be administered in vivo, in particular for the purpose of interfering with paratisemia due to infection by a human parasite, in particular of the P. falciparum type.
  • the invention likewise extends its effects to mixtures of the nucleic sequences in which the different corresponding nucleic sequences have been recombined with one another, under conditions permitting their expression in the form of a fusion protein comprising peptide sequences corresponding to the sequences of the three constituents (whole or partial) previously taken into consideration.

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Abstract

L'invention concerne une composition ayant des propriétés vaccinantes contre le paludisme. Elle comprend trois constituants, notamment l'antigène "i72", le polypeptide R23 et le polypeptide EB200.

Description

MELANGE DE CONSTITUANTS PEPTIDIQUES AYANT DES PROPRIETES VACCINANTES CONTRE LE PALUDISME, NOTAMMENT DU A PLASMODIUM FALCIPARUM
L'invention concerne un mélange de 3 constituants peptidigues ayant des propriétés vaccinantes contre le paludisme, notamment du A Plasmodium Falciparum. plus particulièrement la capacité d'induire in vivo une réponse immunitaire protectrice, y compris la production d'anticorps immunoprotecteurs aptes à détruire les parasites du stade sanguin, responsables de la maladie chez l'homme, dans un modèle de primate représenté par le singe écureuil SAIMIRI SCIUREUS.
Ces trois constituants sont définis dans ce qui suit comme "premier constituant", "deuxième constituant" et "troisième constituant".
Le "premier constituant" est constitué par un polypeptide dérivé d'un antigène majeur de P falciparum, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 72 kDA, d'où l'appellation "Antigène 72 DA" utilisée dans ce gui suit pour le désigner, particulièrement d'un polypeptide issu de cet antigène 72 kDA ayant la capacité, comme celui-ci :
- d'être reconnu par des anticorps protecteurs contenus dans des sérums ou des fractions immunoglobulinigues provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SCIUREUS, devenus résistants aux parasites après les infections répétées contrôlées par chimiothérapie, les dits sérums ou fractions étant susceptibles de rendre résistants des singes initialement sensibles ; - d'être lui-même inducteur, notamment chez le singe, et plus particulièrement chez le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de P falciparu ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles.
Ce premier constituant est lui-même souvent reconnu par des sérums de patients humains habitant des régions où le paludisme sévit de façon endémigue.
La séguence nucléotidigué codant pour la séguence peptidigue antigène 72 kDA a été identifiée par L.S. MATTEI et al Européen Journal of Immunology (1989) 19 : 1823 - 1828. Le premier constituant est avantageusement constitué par un polypeptide ci-après désigné "i72" comprenant les 153 acides aminés de la région C - terminale de l'antigène 72 kDA, dont la séguence en acides aminés, de même qu'une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide i72 sont présentées ci-après :
1/1 31/11
GAT CGT ATG GTT AAT GAT GCT GAA AAA TAC AAA GCA GAA GAT GAA GAA AAC AGA AAA A asp arg mec val asn asp ala glu lys tyr lys ala glu asp glu glu asn arg lys a
61/21 91 31
ATC GAA GCA AGA AAC AGC CTT GAA AAT TAC TGC TAT GGA GTT AAA AGC TCA TTA GAA G ile glu ala arg asn ser leu glu asn tyr cys tyr gly val lys ser ser leu glu a
121/41 151/51
CAA AAA ATT AAA GAA AAA TTA CAA CCA GCT GAA ATT GAA ACA TGT ATG AAA ACT ATT A gin lys ile lys glu lys leu gin pro ala glu ile glu thr cys met lys thr ile t
181/61 211/71
ACC ATA CTT GAA TGG TTA GAA AAA AAC CAA CTT GCT GGA AAA GAT GAA TAT GAA GCC A thr ile leu glu trp leu glu lys asn gin leu ala gly lys asp glu tyr glu ala l
241/81 271/91
CAA AAA GAA GCA GAA TCG GTT TGT GCT CCA ATT ATG TCT AAA ATC TAT CAA GAT GCT G qln lys αlu ala glu ser val cys ala pro ile met ser lys ile tyr gin asp ala a
301/101 " 33.1/111
GGT GCA GCC GGT GGT ATG CCA GGA GGT ATG CCC GGT GGA ATG CCA GGT GGA ATG CCA G gly ala ala gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro g
361/121 391/131
GGT ATG CCA GGT GGT ATG AAT TTC CCA GGA GGT ATG CCC GGA GCA GGA ATG CCA GGA A gly met pro gly gly met asn phe pro gly gly met pro gly ala gly met pro gly a
421/141 451/151
GCC CCA GCT GGA AGT GGA CCA ACA GTT GAA GAA GTT GAT TAA ACT AAT AAA AAA AAA A ala pro ala gly ser gly pro thr val glu glu val asp OCH thr asn lys lys lys l
481/161 511/171
CA TAA ACA GGA CAA ATA TAA AAA TAT ATA TAT TAT AAA AAT ATA TAT ATA TAT ATT T his OCH thr gly gin ile OCH lys tyr ile tyr tyr lys asn ile tyr ile tyr ile p
541/181 571/191
TTT TTT TTT TTA CAT TTT TGT AAA TTA ATA TGA ATT phe phe phe leu his phe cys lys leu ile OPA ile
PREMIER CONSTITUANT
ou par un polypeptide recombinant contenant la séguenc du précédent, par exemple celui obtenu sous forme d molécule de fusion avec la glutatione transférase d Schistosoma japonicum, selon la technique décrite pa D.B. Smith and K.S. Johnson (1988) Gène 67, 41-48, pa transformation de E. Coli avec le plasmide pGE préalablement modifié par la séquence nucléotidigué d'insertion appropriée. Une culture de E. Coli (Escherichia coli DH5α) transformé par le susdit plasmide modifié par une séguence nucléotidigué codant pour le peptide i72 qui a été déposée le 24 Juillet 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de
FEUILLE DE REMPLACEMENT Microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris (CNCM) sous le numéro I - 1129. C'est le produit d'expression de ce plasmide qui consiste en le "constituant 1" de l'exemple fourni plus loin.
Le deuxième constituant est constitué par un peptide ou oligopeptide codé tel qu'il est défini ci- après. Le deuxième constituant, ainsi qu'un fragment d'acide nucléique qui code pour ce deuxième constituant, sont caractérisés en ce qu'ils contiennent les éléments de séquence respectifs suivants :
CT
GAG GAA TGT CAA GGG GAA GTT TAT TTA TTT GTT AAA AAG ATA CCT ATA Glu Glu Cys Gin Gly Glu Val Tyr Leu Phe Val Lys Lys Ile Pro Ile
GAG GTA TGG ATA AGA CAG TAC AAC TTG ATG AAT GAT AAT GAT GGA GAA Glu Val Trp Ile Arg G n Tyr Asn Leu Met Asn Asp Asn Asp Gly Glu
TAT TTA TTA GAT GGG GAA AAT TTT ATT ATG GAA GCA GTA GCC TGC GCT Tyr Leu Leu Asp Gly Glu Asn Phe Ile Met Glu Ala Val Ala Cys Ala
TAT TTA AGC GAG CAT TAT CCT GGA CTC ACA CCT AAA TTG TAC AAG GTA Tyr Leu Ser Glu His Tyr Pro Gly Leu Thr Pro Lys Leu Tyr Lys Val
TTA TAT GAG CCT GAA TGT GCT AAC TGT AAT GAA GAG GAT AAG AAT ATG Leu Tyr Glu Pro Glu Cys Ala Asn Cys Asn Glu Glu Asp Lys Asn Met
Figure imgf000007_0001
Asp His Asn His Lys Ser Asp
CAT AAC CAC AAG AGC GAT AAT AAC CAC AAG AGT GAT CAT AAT CAC AAA His Asn His Lys Ser Asp Asn Asn His Lys Ser Asp His Asn His Lys
AGT GAT CAT AAA AAA AAT AAT AAC AAT AAT AAG GAT AAT AAA AAT GAC Ser Asp His Lys Lys Asn Asn Asn Asn Asn Lys Asp Asn Lys Asn Asp
GAT AAT GAT GAC AGT GAT GCA AGC GAT GCA GTT GAT GAA GAT ATT GAG Asp Asn Asp Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ala Val Asp Glu Asp Ile Glu
ATA CTT GAG TCT TAT AGT GAT TTG AAT AAA TTT AAT GAG ATG TTA ACA Ile Leu Glu Ser Tyr Ser Asp Leu Asn Lys Phe Asn Glu Met Leu Thr
GAA CAA TTA AAT AAA AAT AAG GAT GGA TAT GTT GTT TTG GTT ACT GAA Glu Gin Leu Asn Lys Asn Lys Asp Gly Tyr Val Val Leu Val Thr Glu
TTA TTT GGT GAA GAT CTT TTT CAA TAT ATT AAT AAA AGG AAT GAA AAT Leu Phe Gly Glu Asp Leu Phe Gin Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Glu Asn
DEUXIEME CONSTITUANT
FEUILLE DE REMPLACEMENT GAA GAT ACG CGT GTA AGA GAT GAA GAT AAA AAA ATA ATT ATG TTT GAA Glu Asp Thr Arg Val Arg Asp Glu Asp Lys Lys Ile Ile Met Phe Glu
TTT TTA AAG TTA TTA ATA AAA TTA CAT AAT GCA GGA TTG GTA CAT CTT Phe Leu Lys Leu Leu Ile Lyε Leu His Asn Ala Gly Leu Val His Leu
GAT ATA TCT CCT GAA AAT ATA TTG ATA GAA AAT AAT GGT GAG TTA CGC Asp Ile Ser Pro Glu Asn Ile Leu Ile Glu Asn Asn Gly Glu Leu Arg
TTA TGT GAT CTA GCT AAA TGT GCT CCA ATG TAT ACA CAC AAT TTA AGA Leu Cys Asp Leu Ala Lys Cyε Ala Pro Met Tyr Thr His Asn Leu Arg
CAT ATT AAA GGA AAT GGA AAC GAT TTG TAT TCA TTT CAA TCT TGT CAA His Ile Lys Gly Asn Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Phe Gin Ser Cys Gin
CCT TGT GTT GGA AAA ATC CCA TGT ATT CCA AAA GAG TGT TGG GAT ATT Pro Cyε Val Gly Lyε Ile Pro Cyε Ile Pro Lys Glu Cys Trp Asp Ile
ATT AGA GAA CAT ATA AAA TTA AAA ATA GAT AAT CCT TTT GAA CAT TTA
Ile Arg Glu Hiε Ile Lyε Leu Lyε Ile Asp Asn Pro Phe Glu His Leu
TCA ACT ATT ACT GAT CAA GAA GAA AGA AAA AAA TAT TAT TTT GAT GTA Ser Thr Ile Thr Asp Gin Glu Glu Arg Lyε Lyε Tyr Tyr Phe Asp Val
CAT TGT GTA GAT AAA TAT ATG CTT GGT ATA TTT TAT ATA TGG ATA TGG Hiε Cyε Val Asp Lys Tyr Met Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Trp Ile Trp
AAT TTA AAT TAT ATA TGG AAA CGA GCT GAC CCA CCA AAT GAT AGA ACA Asn Leu Asn Tyr Ile Trp Lyε Arg Ala Asp Pro Pro Asn Asp Arg Thr
TTT AAT AAT TTC TTA AAA TAT AAT TTA AAT ATA AAT GTA TTT CAG TTA Phe Asn Asn Phe Leu Lyε Tyr Asn Leu Asn Ile Asn Val Phe Gin Leu
GCC CAA CAA TGG CCA AAA GGT CTC AAA GAT AXA ATT AAC GTA AGA TAT Ala Gin Gin Trp Pro Lys Gly Leu Lyε Asp Ile Ile Asn Val Arg Tyr
ATA AGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATA ATA ATA ATA ATA ATG ATG Ile Arg Lys Lyε Lyε Lys Lyε Lyε Lys Ile Ile Ile Ile Ile Met Met
TTT TAT ATA GTA TGT GCA TAG TGAATGTTTT TTTTTTATAT TTTAATACAT Phe Tyr Ile Val Cyε Ala ***
GAAATGATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATTTTCTC TTTATAGAAA TTATTAAGCC TAGAAAGTAG AATGAAGACA GACTTAAATG AATTAACTGA ACATCCATGG TGGATTAATG AAGATTAATT TTAATTTTTT AAGTATTATA TGAATATTTA TTATTAGTAG ACTTTATATA TAACAATAAA TATTGACACG TGCAATATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGA ATTAAAAAGG AATGTTTTAT TGTTTAGGAC TATATGGAAA AATAATAATA TATATATGTT TCCACATTAA AAA
DEUXIEME CONSTITUANT (Suite
ce "deuxième constituant" a été décrit dans la demande de brevet français n* 90 10039 déposée le 6 Août 1990.
Cet oligopeptide étant reconnu par des anticorps contre P.falciparum ou capable d'induire la production
.FEUILLE DE REMPLACEMENT d•anticorps cytophiles, de préférence d'isotype IgGl et IgG3, et présentant en outre un caractère protecteur comme cela a été indiqué plus haut à propos du premier constituant".
Une souche de E. Coli, transformée par un tel acide nucléique, a été déposée à la CNCM sous le n°I-987 le 27 juillet 1990.
Un "deuxième constituant préféré est le peptide recombinant contenant la séquence du peptide "R 23" - de formule
LysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn
HisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspHisAsnHisLys
SerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAsp
SerAsnHisLysSerAspHisAsn
Une souche d'E. Coli contenant la séquence d'ADN correspondante a été déposée le 27 juillet année 1990 sous le n" I- 986 à la CNCM.
Le peptide R23 (le "constituant 2") utilisé dans l'exemple qui suit, a pareillement été produit sous forme d'une protéine recombinante de fusion avec la glutatione transférase de Schistosoma japonicum, selon la technique déjà mentionnée de D.B. Smith et K.S. Johnson, ou sous la forme d'une protéine de fusion avec la β galactosidase d'E. Coli par clonage dans le vecteur pMSgtll (Scherf, A., Mattei, D. and Schreiber, M. (1990) . "Parasite antigens expressed in Escherichia coli. A refined approach for epidemiological analysis". Journal of Immunological methods, 128:81-87) .
Enfin le troisième constituant est constitué par un polypeptide EB 200 contenant la séquence polypeptidique ci-dessous définie par sa séquence en acides aminés : S V T G N I L V E G
S V T E E V V G E E K
L V S E E I V T E E G
S V A Q E I V E E D A
P A T E E I D E I E
S V T E E V V E E E G
P V D E E I V Q E E G
T V T E E I I Q G E
S KV E E V V E E Q G
S E N E E I F V E E V
S A S Q E I V Q N E
S G T E E I L E LV
S A S Q E I V Q D G
S V T E Q I I E E L F
P V T E E VV N E E E
ou une partie de cette séquence dès lors que celle-ci est apte, le cas échéant lorsqu'elle est incorporée à une protéine de fusion, oligomerisee ou conjuguée à une protéine porteuse, à induire in vivo une réponse immunitaire protectrice chez le singe écureuil Saimiri sciureus, notamment à induire in vivo des anticorps eux-mêmes capables d'inhiber l'invasion de globules rouges par des mérozoïtes.
Ce polypeptide étant également apte à induire in vivo des anticorps protecteurs, tels que définis plus haut. Un polypeptide préféré est le polypeptide "EB200", dont la séquence en aminoacides ainsi qu'uen séquence de nucléotides codant pour ce polypeptide, apparaissent ci-après : 31 /11 GAA GTT GTA GGA GAA GAA AAA TTA GTT AGT 'GAA GAA ATA GTA A glu val val gly glu glu lys leu val ser glu glu ile val t
91 /31 GCT CAA GAA ATA GTA GAA GAA GAT GCA CCA GCT ACT GAA GAA A ala gin glu ile val glu glu asp ala pro ala thr glu glu i
151 / 51 GTT ACT GAA GAA GTT GTC GAA GAA GAA GGA CCT GTT GAT GAA G val thr glu glu val val glu glu glu gly pro val asp glu g
211 /71 GGT ACA GTT ACT GAA GAA ATA ATA CAA GGA GAA TCT AAA GTT G gly thr val thr glu glu ile ile gin gly glu ser lys val g
271/ 91 CAA GGA TCT GAA AAT GAA GAA ATA TTC gin gly ser glu asn glu glu ile phe
331 / 111 CAA AAT GAA TCA GGT ACC GAA GAA ATA gin asn glu ser gly thr glu glu ile
391 / 131 CAA GAT GGA TCA GTT ACT GAA CAA ATA
Figure imgf000011_0001
gin asp gly ser val thr glu gin ile
Figure imgf000011_0002
TROISIEME CONSTITUANT
constitue l 'un des "troisièmes constituants" qui peuvent être utilisés de façon avantageuse dans le mélange vaccinant selon l ' invention. Un peptide recombinant de fusion contenant cette séquence ("constituant 3" dans l ' exemple qui suit) a, comme les "constituant 1" et "constituant 2" , été produit en mettant en oeuvre la technique décrite par D. B. Smith et K.S. Johnson. Une culture de E. Coli (Escherichia coli DH 5 ) contenant le plasmide d ' expression correspondant a été déposée le 24 Juillet 1991 à la CNCM sous le n' I - 1128.
La capacité qu ' a le singe écureuil SAIMIRI SCIUREUS de produire des anticorps actifs contre des P falciparu conduit à la solide présumption que tous les antigènes dont il est question dans la présente de brevet sont également inducteurs d' anticorps immunoprotecteurs chez l 'homme, dès lors qu ' ils lui seraient administrés , par analogie avec des travaux
FEUILLE DE REMPLACEMENT antérieurs faisant état de la similitude entre les anticorps contre les antigènes du parasite P falciparum présents dans les sérums de populations vivant dans des régions où le paludisme sévit de façon endémique d'une part, et les anticorps induits par les sèmes antigènes chez le singe écureuil Saimini Sciureus.
D'une façon générale, le mélange vaccinant de l'invention contient des proportions de ces trois constituants qui peuvent être ajustées par le spécialiste, selon leurs activités individuelles, mesurables par exemple dans un test du type de celui dont la description sera donnée dans l'exemple. A titre purement indicatif ces proportions pourront, pour chacun des trois constituants correspondre à une valeur comprise entre 5% et 80%, notamment entre 20% et 80% en moles du mélange, étant naturellement entendu que le total des trois proportions choisies ne saurait excéder 100 -t en moles. Les polypeptides responsables des activités relatives des trois constituants peuvent être utilisés soit seuls, en particulier lorsqu'ils présentent eux- mêmes une activité immunogène suffisante, le cas échéant en présence d'un adjuvant immunologique approprié, par exemple du type muramylpeptide ou analogue, soit sous formes oligomérisées, dans le cas où une telle oligo érisation renforcerait l'induction d'une réponse immunitaire, soit encore au sein de protéines de fusion (comme dans l'exemple qui suit), soit enfin à l'état conjugué à des protéines porteuses. Des techniques pour produire de tels conjugés sont décrites, par exemple, dans la demande de brevet français 89 04847/2 645 877 déposée le 12 Octobre 1989. L'invention concerne également des protéines de fusion dans lesquelles des séquences peptidiques respectivement issues des "premier", "deuxième" et "troisième" constituants seraient incluses dans une seule et même protéine, ces séquences peptidigues étant liées les unes aux autres, soit bout à bout, soit par l'intermédiaire d'éléments peptidigues de pontage.
Chacune de ces séquences peptidiques est réduite à la taille nécessaire lui permettant de contribuer à l'induction d'anticorps reconnaissant le constituant auquel elle correspond, lorsque cette protéine de fusion est administrée à un hôte approprié.
Par exemple, la protéine de fusion comprendrait des séquences liées bout à bout respectivement issues du polypeptide "i72", du polypeptide EB 200 et du polypeptide R23.
Les séquences des deux derniers peptides mentionnés sont le cas échéant limitées à des fragments contenant chacun 3 à 4 motifs des séquences répétitives dégénérés que possèdent respectivement EB200 et R 23.
De telles protéines fusionnant les 3 constituants peuvent être produites par des techniques de génie génétique, notamment par transformation d'un hôte cellulaire compétent par un vecteur modifié par un acide nucléique contenant lui-même des séquences nucléotidiques successives codant pour les séquences polypeptidiques correspondantes dans une phase de lecture commune, sous le contrôle d'un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire.
L'invention concerne naturellement toutes compositions de vaccins dans lesquelles le susdit mélange de polypeptides se trouverait associé à des véhicules pharmaceutiquement acceptables facilitant leur administration à l'homme.
Les résultats qui suivent, obtenus chez le singe, n'en sont pas moins hautement significatifs du caractère vaccinant potentiel du mélange concerné chez l'homme. Lors d'une première expérience, ce mélange contenait les "constituant 1", "constituant 2" et "constituant 3" dans les proportions molaires suivantes ( ëlcrige I) :
"Constituant 1" : 51% "Constituant 2" : 7 * (fusion avec la
Figure imgf000014_0001
"Constituant 3" : 42 %
Les expériences d'immunisation de singes Saimiri avec ce mélange d'antigènes recombinants de Plasmodium falciparum ont été conduites comme suit : Animaux : 16 singes Saimiri sciureus d'élevage (FI nés en captivité), phénotype Guyana K14-7, de 1 À 2 années d'âge : 1 animal donneur de parasites et 15 animaux répartis en 5 groupes expérimentaux. Les méthodes expérimentales de manipulation et d'infection des singes Saimiri ont été ceux décrits par Gysin et al (J. Parasitoi., 66 : 1003-1009, 1980) et Gysin & Fandeur (Amer. J. Trop. Med. & Hyg. 32 : 461-467, 1983).
Souche de Plasmodium falciparum : la souche de parasites utilisés a été la souche Palo Alto (FUP-1) adaptée au singe Saimiri en 1979 (Gysin et al J. Parasitol. 66: 1003-1009, 1980). Identification des groupes d'animaux d'expérience : les animaux utilisés dans l'expérience proviennent de l'élevage de Saimiri sciureus de l'Institut Pasteur de la Guyane française, appartenant au phénotype Guyana de karyotype K14-7. Tous sont nés en captivité (génération FI) et avaient entre 1 et 2 ans d'âge en mars 1991. La distribution des animaux dans les groupes a été faite par tirage- au-sort à partir d'un groupe pool initial de 15 singes. Les numéros d'identification de chaque singe ont été ceux affectés à la naissance et correspondent aux fiches individuelles dans le fichier établi dans le programme informatisé de l'unité de primatologie de l'Institut Pasteur de la Guyane Française.
Groupe I - Immunisation avec le mélange de la série d'antigènes de Pasteur : i72pGEx, EB200, R23, dorénavant appelés molécules recombinantes Pasteur. Singes 89053, 89023, 89080.
Groupe II - Contrôles non immunisés. Singes n* 89126, 89043, 90001. Immunisations : les animaux ont été immunisés l'état intact (non splénectomisés). Tous les antigène ont été utilisés dans la dose de 100 μg de protéin fusion par injection émulsionnée dans 1 ml d'adjuvan PAO (polyalofine) de Behringwerke, injecté dans plusieurs points par voie sous-cutanée dans la régio dorsale de l'animal.
Nombre d'injections : chaque animal a reçu 4 doses vaccinantes aux jours : 0 (zéro) , 21, 42 et 75 de 1'expérience.
Evaluation de la protection immune. Tous les animaux ont été splénectomisés le jour 85 de l'expérience, soit 10 jours après la dernière dose immunisante. Au jour 90, les animaux ont été soumis à une inoculation d'épreuve avec une dose de 100,000 globules rouges parasités par Plasmodium falciparum, souche Palo-Alto, provenant d'un anima 1 donneur (Saimiri splénoctomisé 10 jours avant l'infection) infecté avec l'échantillon d'un stabilat congelé de parasites (P. faciparu , souche Palo-Alto, FUP-1) , une semaine auparavant.
La figure l illustre les résultats obtenus concernant l'évolution des parasitémies (P sur l'axe des ordonnées) en fonction du nombre de jours (J) suivant les inoculations d'épreuve chez les singes vaccinés et chez les singes contrôle.
Les courbes (a) relatives aux animaux du groupe II témoignent d'un développement rapide de la parasitémie dans les 4 à 6 jours suivant l'inoculation des animaux avec les globules rouges parasités obligeant l'expérimentateur à introduire un traitement chi iothérapique au 7ème jour après l'infection .
Au contraire les courbes (b) relatives aux animaux du groupe I font apparaître une guérison complète de 2 des animaux vaccinés, et pour le troisième un retard à la parasitémie qui ne se développe qu'à compter du lOème jour.
Il est intéressant de remarquer que les trois courbes (b) y compris celle relative à l'animal chez lequel la parasitémie a tout de même fini par se développer, témoignent toutes d'un accroissement puis même d'une réduction de la paratisémie entre les jours 4et 6.
Compte tenu de la nature virulente des parasites utilisés dans les innoculations d'épreuve et des résultats moins favorables obtenus à ce jour avec d'autres peptides immunogènes, la guérison totale chez deux singes vaccinés et le retard dans le développement de la parasitémie chez le troisième doivent être dans tous les cas interprétés comme le résultat d'un effet vaccinant réel de la composition selon l'invention.
Une deuxième expérience a été réalisée chez le singe Saimiri sciureus, suivant le même protocole d'immunisation que pour l'expérience précédente, sauf que les singes n'ont pas été splénectomisés. La composition molaire du mélange utilisé est la suivante :
"Constituant 1" : 46%
"Constituant 2" : 13% (fusion dans le pGEX) II "Constituant 3" : 41%
Trois singes ont été immunisés avec le mélange de protéines recombinantes (Constituant l≈PfEB-pGEX ; Constituant 2=R23-pGEX) contenant lOOμg de chaque antigène en présence d'adjuvant PAO (Singes 89084, mort entre les jours 14 et 21, 89077 et 89021) et deux singes contrôles ont reçu seulement l'adjuvant (Singes 89061 et 89095). Les singes ont reçu 4 injections aux jours 0, 21, 42 et 75,suivies d'une injection de 106 parasites, P. falciparum souche Palo Alto, au jour 89. Les parasité ies ont été suivies pendant 27 jours et tous les singes ont été traités au jour 26 après le challenge. Les résultats sont présentés dans la figure 1. Le singe 89021 a présenté un taux de parasitémie maximum de 0,48% au jour 16 après le challenge. Les trois autres singes, 89077, 89061 et 89095, ont présenté des parasitémies de 2.3, 2.5 et 2.6%, respectivement, aux jours 15-16. Ces résultats témoignent donc d'une baisse importante de la paratisémie aussi chez les animaux non splénectomisés.
L'invention concerne naturellement aussi les mélanges d'anticorps spécifiques qui peuvent être obtenus à partir de constituants respectifs des mélanges susdits de polypeptides. Ces mélanges d'anticorps peuvent être administrés in vivo, notamment dans le but d'interférer avec une paratisémie due à une infection par un parasite humain, notamment du type P. falciparum.
Enfin, l'invention étend de même ses effets à des mélanges des séquences nucléiques dans lesquelles les différentes séquences nucléiques correspondantes auront été recombinées entre elles, dans des conditions autorisant leur expression sous la forme d'une protéine de fusion comprenant des séquences peptidiques correspondant aux séquences des trois constituants (entiers ou partiels) précédemment pris en considération.

Claims

REVENDICATIONS
1. Mélange vaccinant contre la paludisme comprenant trois constituants définis dans ce qui suit comme "premier constituant", "deuxième constituant" et "troisième constituant", respectivement caractérisés en ce que :
- le "premier constituant" est constitué par un polypeptide dérivé d'un antigène majeur de P falciparum, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 72 kDA, d'où l'appellation "Antigène 72 kDA" utilisée dans ce qui suit pour le désigner, particulièrement d'un polypeptide issu de cet antigène 72 kDA ayant la capacité, comme celui-ci :
* d'être reconnu par des anticorps protecteurs contenus dans des sérums ou des fraction.-. immunoglobuliniques provenant d'animaux, notamment de singes SAIMIRI SCIUREUS, devenus résistants aux parasites après les infections répétées contrôlées par chimiothérapie, les dits sérums ou fractions étant susceptibles de rendre résistants des singes initialement sensibles ;
* d'être lui-même inducteur, notamment chez le singe, et plus particulièrement chez le singe SAIMIRI SCIUREUS, d'anticorps actifs contre des parasites du paludisme, plus particulièrement de P falciparum ou des parasites qui présentent les mêmes caractéristiques biologiques essentielles. ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique.
- le "deuxième constituant" correspond à au moins une partie de la séquence peptidique qui suit : CT
GAG GAA TGT CAA GGG GAA GTT TAT TTA TTT GTT AAA AAG ATA CCT ATA Glu Glu Cys Gin Gly Glu Val Tyr Leu Phe Val Lys Lys Ile Pro Ile
GAG GTA TGG ATA AGA CAG TAC AAC TTG ATG AAT GAT AAT GAT GGA GAA Glu Val Trp Ile Arg Gin Tyr Asn Leu Met Asn Asp Asn Asp Gly Glu
TAT TTA TTA GAT GGG GAA AAT TTT ATT ATG GAA GCA GTA GCC TGC GCT Tyr Leu Leu Asp Gly Glu Asn Phe Ile Met Glu Ala Val Ala Cys Ala
TAT TTA AGC GAG CAT TAT CCT GGA CTC ACA CCT AAA TTG TAC AAG GTA Tyr Leu Ser Glu His Tyr Pro Gly Leu Thr Pro Lys Leu Tyr Lys Val
TTA TAT GAG CCT GAA TGT GCT AAC TGT AAT GAA GAG GAT AAG AAT ATG Leu Tyr Glu Pro Glu Cyε Ala Asn Cys Asn Glu Glu Asp Lys Asn Met
Figure imgf000019_0001
GAT AAT GAT GAC AGT GAT GCA AGC GAT GCA GTT GAT GAA GAT ATT GAG Asp Asn Asp Asp Ser Asp Ala Ser Asp Ala Val Asp Glu Asp Ile Glu
ATA CTT GAG TCT TAT AGT GAT TTG AAT AAA TTT AAT GAG ATG TTA ACA Ile Leu Glu Ser Tyr Ser Asp Leu Asn Lys Phe Asn Glu Met Leu Thr
GAA CAA TTA AAT AAA AAT AAG GAT GGA TAT GTT GTT TTG GTT ACT GAA Glu Gin Leu Asn Lys Asn Lyε Asp Gly Tyr Val Val Leu Val Thr Glu
TTA TTT GGT GAA GAT CTT TTT CAA TAT ATT AAT AAA AGG AAT GAA AAT Leu Phe Gly Glu Asp Leu Phe Gin Tyr Ile Asn Lys Arg Asn Glu Asn
^FEUILLE DE ^EMPLACEMENT GAA GAT ACG CGT GTA AGA GAT GAA GAT AAA AAA ATA ATT ATG TTT GAA Glu Asp Thr Arg Val Arg Asp Glu Asp Lys Lyε Ile Ile Met Phe Glu
TTT TTA AAG TTA TTA ATA AAA TTA CAT AAT GCA GGA TTG GTA CAT CTT Phe Leu Lys Leu Leu Ile Lyε Leu Hiε Asn Ala Gly Leu Val Hiε Leu
GAT ATA TCT CCT GAA AAT ATA TTG ATA GAA AAT AAT GGT GAG TTA CGC Asp Ile Ser Pro Glu Asn Ile Leu Ile Glu Asn Asn Gly Glu Leu Arg
TTA TGT GAT CTA GCT AAA TGT GCT CCA ATG TAT ACA CAC AAT TTA AGA Leu Cys Asp Leu Ala Lyε Cyε Ala Pro Met Tyr Thr His Asn Leu Arg
CAT ATT AAA GGA AAT GGA AAC GAT TTG TAT TCA TTT CAA TCT TGT CAA His Ile Lys Gly Asn Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Phe Gin Ser Cyε Gin
CCT TGT GTT GGA AAA ATC CCA TGT ATT CCA AAA GAG TGT TGG GAT ATT Pro Cyε Val Gly Lys Ile Pro Cys Ile Pro Lyε Glu Cyε Trp Asp Ile
ATT AGA GAA CAT ATA AAA TTA AAA ATA GAT AAT CCT TTT GAA CAT TTA Ile Arg Glu Hiε Ile Lyε Leu Lyε Ile Asp Asn Pro Phe Glu Hiε Leu
TCA ACT ATT ACT GAT CAA GAA GAA AGA AAA AAA TAT TAT TTT GAT GTA Ser Thr Ile Thr Asp Gin Glu Glu Arg Lyε Lyε Tyr Tyr Phe Asp Val
CAT TGT GTA GAT AAA TAT ATG CTT GGT ATA TTT TAT ATA TGG ATA TGG Hiε Cyε Val Asp Lyε Tyr Met Leu Gly Ile Phe Tyr Ile Trp Ile Trp
AAT TTA AAT TAT ATA TGG AAA CGA GCT GAC CCA CCA AAT GAT AGA ACA Asn Leu Asn Tyr Ile Trp Lyε Arg Ala Asp Pro Pro Asn Asp Arg Thr
TTT AAT AAT TTC TTA AAA TAT AAT TTA AAT ATA AAT GTA TTT CAG TTA Phe Asn Asn Phe Leu Lyε Tyr Asn Leu Asn Ile Asn Val Phe Gin Leu
GCC CAA CAA TGG CCA AAA GGT CTC AAA GAT ATA ATT AAC GTA AGA TAT Ala Gin Gin Trp Pro Lys Gly Leu Lyε Asp Ile Ile Asn Val Arg Tyr
ATA AGA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATA ATA ATA ATA ATA ATG ATG Ile Arg Lys Lyε Lyε Lyε Lyε Lys Lys Ile Ile Ile Ile Ile Met Met
TTT TAT ATA GTA TGT GCA TAG TGAATGTTTT TTTTTTATAT TTTAATACAT Phe Tyr Ile Val Cyε Ala ***
GAAATGATAT ATATATATAT ATATATATAT ATATTTTCTC TTTATAGAAA TTATTAAGCC TAGAAAGTAG AATGAAGACA GACTTAAATG AATTAACTGA ACATCCATGG TGGATTAATG AAGATTAATT TTAATTTTTT AAGTATTATA TGAATATTTA TTATTAGTAG ACTTTATATA TAACAATAAA TATTGACACG TGCAATATTA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGA ATTAAAAAGG AATGTTTTAT TGTTTAGGAC TATATGGAAA AATAATAATA TATATATGTT TCCACATTAA AAA
ou à une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique.
- le troisième constituant est constitué par un polypeptide EB 200 contenant la séquence polypeptidique ci-dessous définie par sa séquence en acides aminés :
FEUILLE DE REMPLACEMENT S V T G N I L V E G
S V T E E V V G E E K
L V S E E I V T E E G
S V A Q E I V E E D A
P A T E E I D E I E
S V T E E V V E E E G
P V D E E I V Q E E G
T V T E E I I Q G E
S K V E E V V E E Q G
S E N E E I F V E E V
S A S Q E I V Q N E
S G T E E I L E L V
S A S Q E I V Q D G
S V T E Q I I E E L F
P V T E E V V N E E E
ou une partie de cette séquence dès lors que celle-ci est apte, le cas échéant lorsqu'elle est incorporée à une protéine de fusion, oligomerisee ou conjuguée à une protéine porteuse, à induire in vivo une réponse immunitaire protectrice chez le singe écureuil Saimiri sciureus, notamment à induire in vivo des anticorps eux-mêmes capables d'inhiber l'invasion de globules rouges par des mérozoites. ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique.
2. Mélange vaccinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que :
- le premier constituant est un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée ci-dessous : 1/1 31/11
GAT CGT ATG GTT AAT GAT GCT GAA AAA TAC AAA GCA GAA GAT GAA GAA AAC AGA AAA asp arσ met val asn asp ala glu lys tyr lys ala glu asp glu glu asn arg lys
61/21 " 91/31
ATC GAA GCA AGA AAC AGC CTT GAA AAT TAC TGC TAT GGA GTT AAA AGC TCA TTA GAA ile glu ala arg asn ser leu glu asn tyr cys tyr gly val lys ser ser leu glu
121/41 151/51
CAA AAA ATT AAA GAA AAA TTA CAA CCA GCT GAA ATT GAA ACA TGT ATG AAA ACT ATT gin lys ile lys glu lys leu gin pro ala glu ile glu thr cys met lys thr ile
181/61 211/71
ACC ATA CTT GAA TGG TTA GAA AAA AAC CAA CTT GCT GGA AAA GAT GAA TAT GAA GCC thr ile leu glu trp leu glu lys asn gin leu ala gly lys asp glu tyr glu ala
241/81 271/91
CAA AAA GAA GCA GAA TCG GTT TGT GCT CCA ATT ATG TCT AAA ATC TAT CAA GAT GCT gin lys glu ala glu ser val cys ala pro ile met ser lys ile tyr gin asp ala
301/101 331/111
GGT GCA GCC GGT GGT ATG CCA GGA GGT ATG CCC GGT GGA ATG CCA GGT GGA ATG CCA gly ala ala gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro gly gly met pro
361/121 391/131
GGT ATG CCA GGT GGT ATG AAT TTC CCA GGA GGT ATG CCC GGA GCA GGA ATG CCA GGA gly met pro gly gly met asn phe pro gly gly met pro gly ala gly met pro gly
421/141 451/151
GCC CCA GCT GGA AGT GGA CCA ACA GTT GAA GAA GTT GAT TAA ACT AAT AAA AAA AAA ala pro ala gly ser gly pro thr val glu glu val asp OCH thr asn lys lys lys
481/161 511/171
CAT TAA ACA GGA CAA ATA TAA AAA TAT ATA TAT TAT AAA AAT ATA TAT ATA TAT ATT his OCH thr gly gin ile OCH lys tyr ile tyr tyr lys asn ile tyr ile tyr ile
541/181 571/191
TTT TTT TTT TTA CAT TTT TGT AAA TTA ATA TGA ATT phe phe phe leu his phe cys lys leu ile OPA ile
ou par une protéine de fusion contenant la précédente séquence peptidique.
- le deuxième constituant est le peptide de formule :
LysSerAspSerAsnHisLysSerAspHisAsnHisLysSerAspSerAsn
HisMetSerAspHisAsnHisMetSerAspHisAsnHisLysSerAspHisAsnHis
SerAspAsnAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSerAspSerAsnHisLysSer
SerAsnHisLysSerAspHisAsn ou une protéine de fusion contenant la précédente séguence peptidigue.
FEUILLE DE REMPLACEMENT - le troisième constituant est un polypeptide dont la séguence peptidique est représentée ci-dessous :
1/1 31/11
GGA TCC GTA ACT GAA GAA GTT GTA GGA GAA GAA AAA TTA GTT AGT GAA GAA ATA GTA A gly ser val thr glu glu val val gly glu glu lys leu val ser glu glu ile val t
61/21 91/31
GAA GAA GGA TCT GTT GCT CAA GAA ATA GTA GAA GAA GAT GCA CCA GCT ACT GAA GAA A glu glu gly ser val ala gin glu ile val glu glu asp ala pro ala thr glu glu i
121/41 151/51
GAT GAA ATA GAA TCA GTT ACT GAA GAA GTT GTC GAA GAA GAA GGA CCT GTT GAT GAA G asp glu ile glu ser val thr glu glu val val glu glu glu gly pro val asp glu g
181/61 211/71
ATT GTA CAA GAA GAA GGT ACA GTT ACT GAA GAA ATA ATA CAA GGA GAA TCT AAA GTT G ile val gin glu glu gly thr val thr glu glu ile ile gin gly glu ser lys val g
241/81 271/91
GAG GTC GTA GAA GAA CAA GGA TCT GAA AAT GAA GAA ATA TTC GTA GAA GAA GTA TCA G glu val val glu glu gin gly ser glu asn glu glu ile phe val glu glu val ser al
301/101 331/111
TCT CAA GAA ATA GTA CAA AAT GAA TCA GGT ACC GAA GAA ATA TTG GAA AAA GTA TCA G ser gin glu ile val gin asn glu ser gly thr glu glu ile leu glu lys val ser al
361/121 391/131
TCT CAA GAA ATA GTA CAA GAT GGA TCA GTT ACT GAA CAA ATA ATA GGA ATT ser gin glu ile val gin asp gly ser val thr glu gin ile ile gly ile
ou par une protéine de fusion contenant la précédente séguence peptidigue.
3. Mélange selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la proportion de chacun des constituants est en une proportion comprise entre 5% et 80%, notamment entre 20 et 80% en moles de mélange, étant naturellement entendu gue le total des trois proportions choisies ne saurait excéder 100 % en moles.
4. Polypeptide de fusion incluant en une seule molécule des séquences correspondant à celles des trois constituants du mélange selon la revendication 1 ou la revendication 2.
5. Mélanges d'anticorps spécifigues gui peuvent être obtenus à partir des constituants respectifs des mélanges de polypeptides selon la revendication 1 ou la revendication 2.
6. Composition immunogène contenant les constituants des compositions des revendications 1 à 4,
FEUILLE DE REMPLACEMENT associées à un véhicule pharmaceutiguement acceptable facilitant leur administration in vivo sous forme de vaccin.
7. Fragments d'acides nucléiques recombinés ou non avec des séquences d'ADN hétérologues, caractérisés en ce gu'ils codent pour les polypeptides des constituants des mélanges selon la revendication 1 ou la revendication 2 ou pour le polypeptide de fusion de la revendication 4.
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