WO1993001214A1 - Recombinant human interleukin 6 with homogeneous n-terminus and production thereof - Google Patents

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WO1993001214A1
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pro
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Masakazu Hasegawa
Tetsuro Orita
Norimichi Ochi
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • C07K14/5412IL-6
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant human interleukin 6 consisting of a uniform peptide molecular species whose N-terminus starts with valine (Val) and is modified by a sugar chain, and a method for producing the same.
  • a recombinant human interleukin 6 consisting of a uniform peptide molecular species whose N-terminus starts with valine (Val) and is modified by a sugar chain
  • an object of the present invention is to provide human interleukin 6 having a uniform N-terminus and a method for producing the same.
  • the present inventors have conducted various studies on the homogenization of the N-terminus of interleukin 6, and as a result, using the signal peptide of human granulocyte clonal stimulating factor and the N-terminus of interleukin 6 Was completed, the present invention was completed by finding that the selection of Val as the target yields interleukin 6 with a uniform N-terminus and sugar chain modification produced by Chinese hamster ovary cells. did. It has an excellent advantage that interleukin 6 having a uniform N-terminal and sugar chain modification can be obtained without changing the conventional culture and purification system.
  • the present invention provides a recombinant interleukin 6 having a uniform N-terminus, in which the N-terminus starts with Val and consists of a peptide molecular species having a sugar chain.
  • the present invention further provides the method for producing human interleukin 6, which comprises human interleukin 6 whose N-terminus starts with Val, and a signal peptide other than the original signal peptide of human interleukin 6.
  • FIG. 1 shows the process of preparing the expression plasmid prIL-6 for native interleukin 6.
  • Figure 2 shows the construction of the expression plasmid prIL-6GA for human IL-6 with N-terminal Ala and the expression plasmid prIL-6GV for human IL-6 of the present invention with N-terminal Val. Show the process.
  • FIG. 3 is an electrophoretic diagram showing that human IL-6 of the present invention has a sugar chain. Specific description
  • the present invention provides a method for obtaining a recombinant human interleukin 6 (hereinafter abbreviated as human IL-6) having a uniform N-terminus using an animal cell as a host by substituting a signal peptide. And a recombinant human IL-6 produced by this method.
  • human IL-6 a recombinant human interleukin 6 having a uniform N-terminus using an animal cell as a host by substituting a signal peptide.
  • a recombinant human IL-6 produced by this method.
  • Examples of the signal peptide include those of human granulocyte colony stimulating factor (hereinafter abbreviated as human G-CSF).
  • human G-CSF human granulocyte colony stimulating factor
  • the human IL-6 signal peptide is pro-rich, which is rarely found in the signal peptide, and is the distance from the hydrophobic core, which seems to be buried in the cell membrane, to the cleavage point. Is short.
  • the signal peptide of human G-CSF does not bind to Pro near the cleavage point, has a sufficient distance from the hydrophobic core, and has a negatively charged Glu at the 12-position. It has the characteristic that it can be repelled by the surface charge of, and can surely expose the vicinity of the break point to the outside of the cell membrane.
  • a signal peptide having a property similar to that of human G-CSF can be used in the present invention.
  • a signal peptide for example, Mavus IL -6, mouse granulocyte colony stimulating factor, human sulopoietin, mouse erythropoietin, human granulocyte macrophage colony stimulating factor, mouse granulocyte macrophage phage colony stimulating factor, human Mouse I, Mouse IL-2, Human I 3, Mouse IL-3, Human I 4, Mouse IL-4, Human U-5, Mouse IL-5, Human I 7. Mouse IL-7 7. Human interferon (IFN) ⁇ , mouse IFN ⁇ , human IFN ⁇ . Mouse IFN r, human macrophage choloney stimulator, mouse macrophage stimulator And the like.
  • IFN Human interferon
  • the original signal peptide of human IL-6 may have a modified C-terminal.
  • Animal cells used as hosts include, for example, Chinese hamster ovary cells (hereinafter abbreviated as CH0 cells).
  • CH0 cells have a number of achievements, including recombinant human G-CSF, and the structure of the added sugar chain is closest to that of the natural type.
  • animal cells as a host are not limited to CH0, and various cell lines such as NIH3T3, C127, BHK, and Namalva can also be used.
  • Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp- is selected as the N-terminal sequence of human I-6.
  • the signal peptide is simply substituted and Ala-Pro-Va-t Pro-Pro-Gly- is selected as the N-terminal sequence, one having a uniform N-terminal cannot be obtained, and Val-Pro-Pro-Gly- Glu-Asp- Only those that had a uniform N-terminus were obtained. It is clear that these are not easily conceivable from the structure of human I6. In addition, this sequence is also found in the natural form, and there is no concern about antigenicity, etc., as seen in the artificially modified one.
  • the human produced by the host is mainly secreted extracellularly. Therefore, after culturing, a culture supernatant is obtained, which contains ammonium sulfate fraction, ethanol fraction, acetate fraction, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and inversion.
  • a culture supernatant which contains ammonium sulfate fraction, ethanol fraction, acetate fraction, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and inversion.
  • conventional purification means such as on-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, preparative electrophoresis, affinity chromatography, etc.
  • Recombinant human IL-6 can be obtained.
  • DHFR Dihydrofolate reductase
  • the human IL-6 gene Hirano, T., et a1 was added to the BamHI site of the plasmid pdR under the control of the SV40 early promoter. , Nature, 32, 73 (1986), insert from 19th to 678th, insert BamHI linkers at both ends, insert the resulting plasmid into prIL- 6 (see Figure 1).
  • the DHFR gene-deficient mutant, CH0 cell DXB-11 Graf, LH and Chas in, LA, ⁇ . Cell. Biol., 2, 93 (1982) was purified using the above plasmid prIL-6. Transformation was performed by the calcium acid method.
  • DHFR-positive cells were selected using nucleic acid-free Alpha MEM (GIBCO), and the selection was repeated in a medium supplemented with the folate analog methotrexate (hereinafter abbreviated as MTX).
  • MTX folate analog methotrexate
  • ⁇ or 50 nM MTX-resistant strains were cultured for 3 days in Iskov's medium (GIBC0) containing 1% fetal calf serum, and the culture supernatant was collected and used as a raw material.
  • the amino acid sequence near the N-terminus of IL-6 was determined using an online system of a gas-phase protein-sequencer type 470A and a PTH analyzer 120 (manufactured by ABRIDIO NOSYSTEM). It was broken.
  • the N-terminal amino acid sequence of the recombinant human IL-6 was found to be Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Gly- and Vapor Pro-Pro-G1y-Glu-Asp as in the natural form. -Mixture (see Table 2). This heterogeneity was not eliminated by cell cloning, indicating that one cell was producing a mixture with different N-termini.
  • a mutation was introduced into the gene sequence encoding the vicinity of the N-terminus of human IL-6 by the polymerase chain reaction method, and a new KpnI site was constructed (see Fig. 2). That is, a synthetic primer (GGATCCATA TGGTACCCCCAGGAGAAGATTCC, CGTCGACGGATCCGGTGCCCATGCTAC) having the sequence shown below and the plasmid prlL-6 harboring the human IL-6 gene described in Reference Example 1 were turned into a ⁇ type, and a GeneAmp kit And a thermal Cycler (Takara Shuzo) to amplify the fragment into which the mutation was introduced.
  • a synthetic primer GGATCCATA TGGTACCCCCAGGAGAAGATTCC, CGTCGACGGATCCGGTGCCCATGCTAC
  • This fragment was treated with BamHI and subcloned at the BamHI site of the plasmid pdR described in Reference Example 1 to obtain plasmid pTOM (see FIG. 2).
  • Linker A was composed of two synthetic oligonucleotides having the following sequences (TGCACTCTGGACAGTGCAGGAAGCC GCCCCAGTAC, TGGGGCGGCTTCCTGCACTGTCCAGAG) c
  • Plasmid Kpn I / Xho I fragment of pTOM (6.0 kb)
  • Plasmid PV2DB1 harboring the human G-CSF gene (described in Tokuhei 1 — 5395. Almost the same structure as prl 6) ) was ligated with the synthetic linker A described above, and the resulting plasmid was designated as prIL-6GA (see Fig. 2).
  • the linker V was composed of two oligonucleotides having the following sequences (TGCACTCTGGACAGTGCAGGAAGCCGTAC. GGCTTCCTGCACTGTCCAGAOc
  • the N-terminal amino acid sequence was a single Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp- (see Table 2). In addition, no difference was observed in the modification and biological activity with sugar sugars from that obtained in Reference Example 1, and there was no effect of the artificial modification.
  • a uniform human IL-6 modified with a sugar chain having N-terminal Val can be obtained.
  • Sequence type nucleic acid
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Description

明 細 書 均一な N末端を有する組換え型ヒ トイ ンターロイ キ ン 6 及びその製造方法 技 術 分 野
本発明は、 N —末端がバリ ン(Va l ) から始まり、 糖鎖によ り修飾されている均一なペプチ ド分子種から成る組換え型ヒ トイ ンターロイ キ ン 6及びその製造方法に関する。 背 暈 技 術
イ ンターロイキン 6 は、 造血細胞の成育支持などの生物学 的活性のゆえに医薬として、 特に血小板増多因子としての用 途が期待されている生理活性物質である。 天然型としてヒ ト 細胞を培養する こ とにより得られたィ ンターロイ キ ン 6 は、 糖鎮による修飾を受けた糖蛋白質であり、 その N末端ア ミノ 酸配列は表 1 に示すように異なる数種のものが舍まれる。 組換え D N A技術により、 イ ンターロイキ ン 6遺伝子をク ローン化し、 動物細胞たとえばチャイ ニーズハムスター卵巣 細胞に導入して、 その細胞を培養することによりイ ンター口 ィキ ン 6を生産する方法が開発された。 精製されたイ ンター ロイ キン 6 は、 天然型と同様に糖鎖による修飾を受けていた が、 N末端ア ミノ酸配列は不均一であった。 M l
N末端ア ミノ酸配列 由 来 文献
A-P-V-P-P-G-E- (45%) MG-63 Eur , j . B 1 ochem , V-P-P-G-E- (55%) ヒ ト骨肉腫細胞 168,543 (1987)
A-P-V-P-P-G-E- ( + + ) J . Immunol.
P-V-P-P-G-E- ( +) ヒ ト白血球 140, 1534(1988) V-P-P-G-E- ( + + )
A-P-V-P-P-G-B- ( +) 組換え型 Agric, Biol,
P-V-P-P-G-E- ( +) CHO宿主 Chem ,
V-P-P-G-E- ( + + )
P-P-G-E- ( +) 54,2685(1990) P-G-B- ( +)
G-E- ( + + )
A-P-V-P-P-G-E- ( + + ) 組換え型
P-V-P-P-G-B- ( +) NIH3T3宿.
V-P-P-G-B- ( + + )
P-P-G-E- ( +)
? -G-E- ( +)
G-E- ( +)
この Ν末端配列の不均一性は、 精製蛋 ¾の純度検定に支障 をきたす。 また、 それぞれの成分の単離は困難であり、 個々 の成分の安定性評価、 薬効評価、 吸収、 代謝、 排泄の評価お よび毒性評価等は不可能であった。 そして、 これらの理由に より、 ヒ トイ ンターロイ キン 6を医薬として使用する ことは 実質的に不可能であつた。
なお、 微生物、 たとえば大腸菌により産生する方法で、 均 一な Ν末端を有する組換え型ヒ トイ ンターロイキ ン 6の製造 は可能である Tonouchi,N.,et al., J.Biochem. ,104,30 (1988) が、 糖鎖が付加しておらず、 本来糖鎖でおおわれているポリ ペチ ド部分が露出することにより抗体が産生されるため抗原 性等の点で問題がある。 発 明 の 開 示
従って本発明は N末端が均一なヒ トイ ンターロイ キ ン 6及 びその製造方法を提供しよう とするものである。
本発明者らは、 イ ンターロイキン 6の N末端の均一化につ いて種々研究を重ねた結果、 ヒ ト顆粒球コ ロニー刺激因子の シグナルペプチ ドを用い、 かつィ ンターロイ キ ン 6 の N末端 として Va lを選択することにより、 チャイ ニーズハムスター 卵巣細胞の産生する、 均一な N末端を有し、 かつ糖鎖の修飾 を受けたィ ンターロイキン 6が得られることを見出し、 本発 明を完成した。 従来の培養および精製の系を変更すること無 く、 均一な N末端を有し、 かつ糖鎖の修飾を受けたィ ンター ロイキン 6が得られるという優れた利点を有している。
従って本発明は、 N末端が Va lから始まり且つ糖鎖を有す るペプチ ド分子種から成る、 均一な N末端を有する組換え型 イ ンターロイ キン 6を提供する。
本発明はさらに、 前記のヒ トイ ンターロイキ ン 6製造方法 であって、 N末端が Valから始まるヒ トイ ンターロイキン 6 と、 ヒ トイ ンターロイキン 6の本来のシグナルペプチ ド以外 のシグナルペプチ ドとから成る融合蛋白質をコー ドする D N Aにより形質転換された動物細胞を培養し、 得られた培養物 から該ィ ンターロイキ ン 6を採取することを特徴とする N末 端が均一なヒ トイ ンターロイキ ン 6 の製造方法を提供する。 1 面の簡単な説明
図 1 は天然型ィ ンターロイ キ ン 6のための発現ブラス ミ ド prIL-6の作製過程を示す。
図 2 は N末端が Alaであるヒ ト IL-6のための発現ブラスミ ド prIL-6GA及び N末端が Valである本発明のヒ ト IL-6のため の発現プラス ミ ド prIL-6GVの作製過程を示す。
図 3 は本発明のヒ ト IL-6が糖鎮を有することを示す電気泳 動図である。 具体的 な説明
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、 シグナルペプチ ドを置換するこ とにより、 動物 細胞を宿主とした、 均一な N末端を有する組換え型ヒ トイ ン ターロイキン 6 (以下ヒ ト IL-6と略記する) を得る方法、 及 びこの方法により製造される組換型ヒ ト IL-6を提供する。
シグナルべプチ ドとしては、 例えばヒ ト顆粒球コ ロニー剌 激因子 (以下ヒ ト G-CSF と略記する) のものなどが含まれる。 ヒ ト IL-6のシグナルべプチ ドは、 統計学的にシグナルべプチ ド中にはあまり見かけられない Pro に富み、 かつ細胞膜に埋 れていると思われる疎水性コァから切断点までの距離が短い。 ヒ ト G-CSF のシグナルペプチ ドは切断点近傍に Pro を舍まず、 疎水性コアからの距離も十分であり、 かつ一 2位に負の電荷 を持つ Glu を有するためリ ン脂質二重膜の表面電荷と反発し、 切断点近傍を確実に細胞膜外へ露出させ得る特徴を持つ。
従って、 ヒ ト IL- 6の本来のシグナルペプチ ドの上記性質に 対比してヒ ト G- CSF のシグナルべプチ ドのような性質を有す るシグナルペプチ ドを本発明において使用することができる, このよ う なシグナルペプチ ドと して、 例えば、 マヴス I L- 6、 マゥス顆粒球コ ロニー刺激因子、 ヒ ト ヱ リ スロポェチ ン、 マ ウスエ リ ス ロポエチ ン、 ヒ ト顆粒球マク ロ フ ァ ージコ ロニー 刺激因子、 マウス顆粒球マク 口 フ ァ ージコロニー刺激因子、 ヒ ト Iい 2、 マウ ス IL-2、 ヒ ト Iい 3、 マウス IL-3、 ヒ ト Iい 4、 マウ ス IL-4、 ヒ ト U- 5、 マウ ス IL-5、 ヒ ト Iい 7、 マウス IL- 7. ヒ ト イ ンターフェ ロ ン(IFN) α、 マウ ス IFN ^、 ヒ ト IFN γ . マウス IFN r、 ヒ ト マク ロ フ ァ ージコ ロニー剌激因子、 マゥ スマクロフア ジコ ロニー刺激因子等のシダナルぺプチ ドが挙 げられる。
また、 ヒ ト IL- 6の本来のシグナルぺプチ ドの C末端を改変 したものであってもよい。
宿主とする動物細胞としては、 例えばチャ イ ニーズハムス ター卵巣細胞 (以下 CH0 細胞と略記する) などが含まれる。
CH0細胞は組換え型ヒ ト G-CSF など数多く の実績があり、 こ れにより付加される糖鎖の構造は最も天然型のものに近い。 しかしながら、 宿主としての動物細胞に CH0 に限られるので はなく、 例えば NIH3T3, C127, BHK , Namalva 等種々の細胞 系を用いることもできる。
ヒ ト Iい 6の N末端配列としては、 Val-Pro-Pro-Gly-Glu- Asp-が選ばれる。 単純にシグナルペプチ ドを置換し、 N末端 配列として Ala- Pro-Va卜 Pro-Pro-Gly-を選んだ場合、 均一な N末端を有するものは得られず、 Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp- を選んだ場合にのみ均一な N末端を有するものが得られた。 これらのことはヒ ト Iい 6の構造からは容易に考えつく もので はないことは明らかである。 またこの配列は、 天然型でも見 られるものであり、 人為的改変を加えたものに見られるよう な抗原性などの心配は全く ない。
本発明の方法においては、 宿主により生産されたヒ ト は主として細胞外に分泌される。 従って、 培養後、 培養上清 を得、 これに硫安分画、 エタノール分画、 アセ ト ン分画、 ゲ ル濾過ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 逆相ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 陰ィ オ ン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 疎水性ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 調製用電気泳動、 ァフィ 二ティ クロマ トグラフィー等の常用 の精製手段を適用するこ とによ り、 本発明の組換え型ヒ ト IL -6を得ることができる。 実 施 例
以下本発明の実施例を示す。 特に記さない限り遺伝子操作 は Molecular Cloning Cold Spring Harbor Labora tory (1989) に従って行ない、 酵素類は宝酒造より購入した。 また、 オリ ゴヌ ク レオチ ドは自動 D N A合成機( ァプラ イ ド ' バィ オ シ ステム社製) を用いて合成し、 D N A断片は低融点ァガロー ス電気泳動法により調製した。
参考 1. 組換え型ヒ ト IL- 6の発現
ブラ ス S KpAdD26SVpA Kauf man. R. J. , and Sharp, P. A. , Mol . Cell. Biol. ,2.1304 (1982) のジヒ ドロ葉酸還元酵素 (以下 DH FRと略記する) 発現ュニッ トを舍む 2. 0 kbの EcoR I/BamH I 断片を、 Klenow酵素により平滑末端化した。 プラス ミ ド pdKCR O'Fukunaga.R.et a 1. , Proc. a 11. Acad . Sci . USA , 81 , 5086 (1984) の Hind III部位を同様に平滑末端化し、 前記の断片とライゲ ーシヨ ンさせ、 得られたプラ ス ミ ドを pdR とした (図 1参照) プラス ミ ド pdR の SV40初期プロモータ一制御下にある BamH I部位に、 ヒ ト IL-6遺伝子 Hirano,T.,et a 1. , Na ture , 32 , 73 (1986)に記載される 19番目から 678番目までを舍み、 両端に BamH Iリ ンカ一を付加したもの を挿入し、 得られたプラ ス ミ ドを prIL-6とした (図 1参照) 。
DHFR遺伝子の欠損変異株である CH0細胞 DXB- 11 Graf , L.H and Chas in,L. A. ,ΜοΙ. Cell. Biol. ,2,93 (1982) を、 前記のプ ラスミ ド prIL- 6を用いてリ ン酸カルシウム法により形質転換 した。
核酸を含まないアルフ ァ MEM(GIBCO)で DHFR陽性細胞を選択 し、 葉酸アナログであるメ ト ト レキセー ト (以下 MTX と略記 する) を添加した培地で選択を操返すことにより、 導入され た遺伝子の増幅を行なった。 ΙΟΟηΜもし く は 50nM MTX耐性株 を 1 %牛胎児血清を舍むィスコ フ培地(GIBC0) で 3 日間培養 し、 その培養上清を集め、 これを原材料とした。
精製はゲル濾過および逆相ク口マ トグラフィーを用いて行 なった。 即ち培養上清を Amicon PM- 10膜 (ア ミコ ン社製) を 用いた限外瀘過法で約 8倍に濃縮した後、 150mM NaClおよび 0.05% Tween 20 を舍む 50mMト リ ス一塩酸緩衝液 (PH7. 4 ) 溶液で平衡化した TSK-G3000SW(21.5mmX60cm, 東ソー製) に 添加し、 同緩衝液中、 流速 3.75ml/分で展開した。 分取した画分を抗 IL-6抗体(Genzyme) で検出した結果、 IL -6は保持時間 42分〜 50分で溶出された。 IL-6を舍む画分を集 め、 再度 PM- 10 膜で濃縮後、 逆相一 HPLCにかけた。 0: 1 % ト リ フルォロ酢酸を含む 35%ァセ トニ ト リルで平衡化した Vydac protein C4カ ラム (バイダフ ク社製)(4.6 mm X 25cm) に試料 を注入後、 流速 1 mlノ分でァセ トニ ト リル濃度を 35%から 80 %まで 0. 5
Figure imgf000010_0001
の直線勾配で上げていき吸着蛋白質を溶 出させた。
分取した画分を前述の抗体で検出した結果、 Iレ 6はァセ ト 二 ト リル濃度 43%〜 48%のところに溶出された。 Iい 6を含む 画分に蒸留水を加え 2倍に希釈した後、 再度逆相— HPLCにか け同一条件で溶出させ、 精製 IL-6を得た。
IL- 6の N末端近傍のァミノ酸配列は、 気相式プロティ ン - シークェ ンサ一 470A型及び PTH アナライザー 120 型のオ ンラ イ ンシステム (アブラ イ ド · ノ ィ ォ システム社製) を用いて 分折した。
その結果、 組換え型ヒ ト IL- 6の N末端ァミノ酸配列は、 天 然型と同様 Ala-Pro- Val -Pro- Pro-Gly-および Va卜 Pro- Pro- G 1 y -Glu-Asp- の混合物であった (表 2参照) 。 この不均一性は 細胞のク ローニングでは解消されず、 ひとつの細胞が異なる N末端を持った混合物を産生していることがわかった。
参考例 2. シグナルべプチ ドの置換(Alaで接続したもの)
ヒ ト IL- 6の N末端近傍をコー ドする遺伝子配列上にポリ メ レースチヱイ ンリアク ショ ン法により変異を導入し、 新たに Kpn I 部位を構築した (図 2参照) 。 即ち、 以下に示す配列を持った合成ブラィ マ一(GGATCCATA TGGTACCCCCAGGAGAAGATTCC, CGTCGACGGATCCGGTGCCCATGCTAC)お よび参考例 1で述べたヒ ト IL-6遺伝子を舍むプラス ミ ド prlL -6を鐯型にして、 GeneAmp kit 及び Thermal Cycler ( 宝酒造) を用いて変異を導入した断片を増幅した。
この断片を BamH I処理し、 参考例 1 で述べたブラス ミ ド pdR の BamH I部位にサブクローユングしたものを、 プラス ミ ド pTOMとした (図 2参照) 。
以下に示す配列を持つた 2本の合成ォリ ゴヌク レオチ ドか らなるものをリ ンカー Aとした(TGCACTCTGGACAGTGCAGGAAGCC GCCCCAGTAC, TGGGGCGGCTTCCTGCACTGTCCAGAG) c
プラス ミ ド pTOMの Kpn I/Xho I 断片(6.0kb) 、 ヒ ト G-CSF 遣伝子を舍むプラス ミ ド PV2DB1 (特公平 1 — 5395に記載され るもの。 prlい 6とほぼ同じ構造) の Xho I /ApaL I断片(0.9 Kb) および前記の合成リ ンカー Aをライゲーショ ンさせ、 得 られたブラス ミ ドを prIL-6GAとした (図 2参照) 。 これはヒ ト G-CSF のシグナルペプチ ドにヒ ト IL-6の Ala- Pro- Val- Pro- Pro-Gly-以降を接続したものである。
プラスミ ド prlい 6の代りに prIL-6GAを用いること以外は、 参考例 1 の記載と同様の方法で解析を行なつた。 その結果、 N末端ァ ミノ酸配列は、 依然 Ala-Pro-Val- Pro- Pro-Gly-> Va卜 Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-の混合物であった (表 2参照) 。 実施例 1. シグナルペプチ ドの置換(Valで接続したもの)
以下に示す配列を持った 2本のォリ ゴヌク レオチ ドからな るものをリ ンカー Vとした(TGCACTCTGGACAGTGCAGGAAGCCGTAC. GGCTTCCTGCACTGTCCAGAOc
前記の合成リ ンカー Vを用いること以外は、 参考例 2の記 載と同様の方法でプラス ミ ド prIL- 6GVを得た (図 2参照) 。
これはヒ ト G-CSF のシグナルぺプチ ドにヒ ト -6の Va Pro- Pro- Gly-Glu-Asp-以降を接続したものである。
プラスミ ド prIL-6の代りに prlい 6GVを用いること以外は、 参考例 1 の記載と同様の方法で解折を行なつた。 その結果、
N末端ァ ミノ酸配列は Val-Pro-Pro-Gly-Glu-Asp-の単一物で あった (表 2参照) 。 また参考例 1 で得られたものと、 糖鎮 による修飾、 生物活性において差は認められず、 人為的改変 による影響は全く無かった。
以上の結果を次の表 2にまとめる。
M 2_
精製した組換型ヒ ト IL- 6の N末端近傍のァ ミノ酸配列
( )内は pmol数
サイ クル数 1 2 3 4 5 6 参考例 1 Ala(203) Pro(164) Val(98) Pro(127) Pro(138) G (95)
Val ( 5) Pro (60) Gly ( 40) Glu( 32) Asp(37) 参考例 2 Ala( 29) Pro ( 21) Val (20) Pro ( 20) Pro ( 22) Gly(95)
Val ( 7) Pro( 7) Gly ( 7) Glu( 3) AsP( 4) 実施例 1 Val( 64) Pro( 55) Pro(56) Gly( 50) Glu( 28) Asp(18)
荬施例 2. Valを N末端とする組換型ヒ ト IL-6の糖鑌構造の
解折
実施例 1で得られた Valを N末端とする組換型ヒ ト IL- 6を SDS—ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 (以下 SDS- PAGEと略 す) と抗 rhIL- 6抗体を使用した Western Blottingを行なった ところ分子量 24kDと 28kDに相当する位置にバン ドが検出され (図 3、 レーン 2 ) 、 大腸菌由来の組換型ヒ ト IL- 6(Amercham) (図 3、 レーン 5 ; 22kD) より も分子量が大きいことがわか つた。 これは、 天然型ヒ ト Iい 6 〔 Van Damme J..et.al, , J. Immunol. ,140,1534 (1988) 〕 と同様に糖鎖が結合しているた めと考えられた。
そこで、 結合している糖鎮を解折するため組換型ヒ ト IL- 6 をノ イ ラ ミ ニダーゼ (生化学工業) 、 エ ン ド一 or— N—ァセ チルガラク トサ ミニダーゼ(Boehringer Mannheim) 及びグリ コぺプチダーゼ一 F (Boehringer Mannheim) で消化し、 それ ぞれの処理による分子量の変化を SDS-PAGE及び Western Blot tingで調べた。 結果は図 3に示したように、 ノ ィ ラ ミ ニダー ゼとェン ド一 or— N—ァセチルガラク トサ ミ ニダーゼで消化 する と レーン 3 のよう に分子量の減少がみられ、 これをさ ら にグリ コべプチダーゼ一 Fで消化する とレーン 4 にみられる ように大腸菌由来の組換型ヒ ト IL-6と同一の分子量 22kDに相 当する単一のバン ドと して検出された。
以上の結果をまとめると、 1 ) エン ド一 or— N—ァセチル ガラク トサ .ミ ニダーゼの基質特異性(Gal /5 l-3GalNAc を Ser または Thr から切断する) から、 組換型ヒ ト IL-6には天然型 ヒ ト IL-6と同様に Gal 13 l-3GalNAc のコアにシアル酸が結合 した形の糖鎖が結合している。 2 ) —部の分子には天然型ヒ ト U- 6と同様に N—グリ コ シ ド型糖鎖も結合している。 とい う ことが明かとなった。
本発明によれば N末端を Va lとする均一な、 糖鎖で修飾さ れた組換え型ヒ ト I L - 6が得られる。
【配列表】
配列番号 : 1
配列の長さ : 32
配列の型 : 核酸
トポ口ジー : 直鎖状
配列の種類 : 合成 D N A
配列 :
GGA TCCATAT GGTACCCCCA GGAGAAGATT CC 32 配列番号 : 2
配列の長さ : 27
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
トポ口ジー : 直鎖状
配列の種類 : 合成 D N A
配列 :
CGTCGACGGA TCCGG TGCCC ATGCTAC 27 配列番号 : 3
配列の長さ : 35
配列の型 : 核酸
鎮の数 : 一本鎖
トポロジー : 直鎮状 配列の種類 : 合成 D N A
配列 :
TGCACTCTGG ACAGTGCAGG AAGCCGCCCC AGTAC 35 配列番号 : 4
配列の長さ : 27
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
トポロ ジ一 : 直鎖状
配列の種類 : 合成 D N A
配列 :
TGGGGCGGCT TCCTGCACTG TCCAGAG 27 配列番号 : 5
配列の長さ : 29
配列の型 : 核酸
鎖の数 : 一本鎖
ト ポ口ジー : 直鎮状
配列の種類 : 合成 D N A
配列 :
TGCACTCTGG ACAGTGCAGG AAGCCGTAC 29 配列番号 : 6
配列の長さ : 21
配列の型 : 梭酸
鎖の数 : 一本鎖
ト ポ口 ジ一 : 直鎖状
配列の種類 : 合成 D N A 配列 :
GGCTTCCTGC ACTGTCCAGA G 21

Claims

請 求 の 範 囲
1. N末端が Va l であり且つ糖鎮を有するペプチ ド分子種 から成る、 均一な N末端を有する組換え型ヒ ト イ ンターロイ キ ン 6。
2. 請求項 1 に記載の組換え型ヒ トイ ンターロイ キ ン 6 の 製造方法であつて、 N末端が Va l である ヒ ト イ ンターロイ キ ン 6 と、 ヒ ト イ ンタ一ロイ キ ン 6 の本来のシグナルペプチ ド 以外のシグナルべプチ ドとから成る融合蛋白質をコー ドする D N Aにより形質転換された動物細胞を培養し、 得られた培 養物から該ヒ ト イ ンターロイ キ ン 6 を採取する ことを特徴と する、 N末端が均一なヒ ト イ ンタ一ロ イ キ ン 6 の製造方法。
3. 前記シグナルべプチ ドがヒ ト顆粒球コ ロニー剌激因子 のシグナルペプチ ドである、 請求項 2 に記載の方法。
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