WO1992017603A1 - Anticorps anti-ace et leurs applications a la detection specifique et eventuellement a la numeration des enterobacteries entieres, par une methode immunochimique - Google Patents

Anticorps anti-ace et leurs applications a la detection specifique et eventuellement a la numeration des enterobacteries entieres, par une methode immunochimique Download PDF

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WO1992017603A1
WO1992017603A1 PCT/FR1992/000311 FR9200311W WO9217603A1 WO 1992017603 A1 WO1992017603 A1 WO 1992017603A1 FR 9200311 W FR9200311 W FR 9200311W WO 9217603 A1 WO9217603 A1 WO 9217603A1
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enterobacteria
antibodies
whole
enterobacteriaceae
possibly
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PCT/FR1992/000311
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Inventor
Michel Van Hoegaerden
Stéphane LEVASSEUR
Jean-Louis Drocourt
Original Assignee
Chemunex
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia

Definitions

  • the present invention relates to new antibodies directed against the common enterobacteria antigen (CEA), capable of recognizing all of the whole enterobacteria as well as their applications to specific detection and possibly to the counting of whole enterobacteria.
  • CEA common enterobacteria antigen
  • the present invention also relates to the antigenic fragments of ACE which couple specifically to said antibodies.
  • Enterobacteriaceae are Gram-negative bacilli, often polymorphic, mobile thanks to a peritrichial cilia or immobile, a number of which are pathogens which can be responsible for serious intoxications, when they are found in particular in food or drink. 'potable water. Their detection and enumeration in pharmaceutical and agrifood products are therefore increasingly tightly regulated and controlled.
  • the screening techniques currently used routinely are based on sowing of selective culture media such as lactose broth.
  • selective culture media such as lactose broth.
  • BVB brilliant green
  • Mossel mossel
  • the major drawback of these classical microbiological techniques lies, as explained above, in the response time, which is never lower 24 or 48 hours depending on the genus and species of enterobacterium to be sought and which does not allow rapid intervention on production, which can have significant economic consequences.
  • Tests based on seeding of selective culture media, but of rapid realization have been developed. Mention may in particular be made of the "COLILERT” test, developed by the company ACCESS ANALYTTCAL SYSTEMS, colorimetric test, which is carried out by incubating for 24 hours the sample to be tested with a particular medium. This test is simple to implement but cannot be carried out in less than 24 hours and only applies to a family of enterobacteria: the con ⁇ forms.
  • ACE is a polysaccharide; in certain bacteria, the mutants R, containing the nucleus R ⁇ _ or R, the ACE is chemically linked to this nucleus and thus forms part of the lipopolysaccharide.
  • ⁇ û, 2, 459-466 established a cell line hybrid producing monoclonal antibodies directed against the common enterobacterial antigen (CEA) and a substructure of the lipopolysaccharide outer envelope of different Escherichia coli.
  • the anti-ACE antibodies designated 865 and 898 react with the ACE of heated E. coli extracts and with LPS preparations containing ACE bound to the R-_ or R nucleus, as well as with a purified ACE sample of Salmonella ontevideo.
  • Antibody 865 is an immunoglobulin of the IgM type and antibody 898 is an immunoglobulin of the IgG2a type.
  • Application EP 387,850 in the name of BOEHRINGER MANNHEIM GmbH, describes anti-enterobacterial monoclonal antibodies obtained by immortalization of B lymphocytes from patients having an infection due to an enteric bacterium and by selection of the cells which provide the desired activity . It is in particular specified, in this Application, that the selection is carried out by detection of the fixing of the antibodies produced on prepa ⁇ rations of lipopolysaccharides (LPS) of enterobacteria, which contain non-negligible amounts of ACE, by means of an ELISA test. It is also specified, in example 1 of this Application, that the selection is carried out by means of an ELISA test, using as antigen, purified CEA, isolated from Salmonella montevideo.
  • LPS lipopolysaccharides
  • the present invention has therefore set itself the aim of providing monoclonal antibodies, which meet an important need, which is that of detecting the presence of a whole enterobacterium whatever it is and in particular toxic contaminating enterobacteria , in different substances or fluids, and in particular in food products and which allow the realization of a specific and reliable immunological test, directly on the sample, possibly dissolved, not requiring the intervention of specialists and, therefore, suitable to be put in the form of an easily usable detection kit.
  • the subject of the present invention is anti-enterobacteria antibodies, characterized:
  • hybridomas prepared in an appropriate manner by:
  • Hybridomas are prepared in a known manner in itself:
  • the first sorting (a) is carried out using at least 5 living enterobacteria.
  • the monoclonal antibodies according to the invention are in particular of the IgG2a type and have unexpected property, in particular due to the selection of said antibodies using at least two different whole enterobacteriaceae, and not using of an enterobacteria extraction product, to recognize a part of the ACE corresponding to an antigenic determinant present only on the surface of whole enterobacteria.
  • Such antibodies have the particular advantage of solving the problem of detecting any enterobacterium, directly in the sample to be analyzed, with excellent reliability.
  • the antibodies according to the invention are therefore particularly suitable for the detection of any enterobacterium which is capable, in particular, of contaminating food products, in particular by immunofluorescence techniques, immunoenzymatic techniques, in particular the method ELISA, and radioimmunological techniques, direct or indirect.
  • Pathogenic or potential enterobacteria ment pathogens recognized by the antibodies in accordance with the invention notably include the following genera: Ci trobacter, Edwards iel la, Enterobacter, Erwinia, Eschrichia, Hafnia, Klebsiella, Levinea, Proteus, Providentia, Sal onella, Serratia, Shigella and Yersinia.
  • Unrecognized bacteria include Pseudo onas, Xanthomonas, Acinetobacter, Achromobac ter, Streptococcus, etc.
  • said monoclonal antibodies are obtained from a cell line of murine hybrid cells, resulting from the fusion of mouse rrryeloma cells, preferably non-secreting cells and from plasma cells of immunized mice using a supernatant suitably prepared from an enterobacterium chosen from the group which comprises E. Coli 014: K7 (ATCC 19110) and E. Coli 0124: B17 (ATCC 12806).
  • the present invention also relates to antigenic fragments, characterized in that they are recognized by the antibodies in accordance with the invention and in that they consist of a fragment of the common antigen of enterobacteria (ACE) present at the surface of whole enterobacteria, which fragment is directly accessible to said antibodies and constitutes at least one antigenic determinant of ACE.
  • ACE common antigen of enterobacteria
  • the present invention also relates to an immunological reagent, usable for the detection of whole enterobacteria, characterized in that it comprises an antibody in accordance with the invention or a fragment thereof, one or the other optionally modified by labeling with any appropriate marker, in particular enzyme, fluorochrome, and / or fixed on a solid support.
  • an immunological reagent usable for the detection of whole enterobacteria, characterized in that it comprises an antibody in accordance with the invention or a fragment thereof, one or the other optionally modified by labeling with any appropriate marker, in particular enzyme, fluorochrome, and / or fixed on a solid support.
  • the monoclonal anti-ACE antibodies according to the invention can be labeled or not, and they can optionally be fixed on a solid support allowing their use as immuno-agents. adsorbents in affinity chromatography methods or as reagents in analysis methods based on the antigen-antibody reaction (radioimmunological, immunofluorescence, enzymatic techniques in particular).
  • the antibodies according to the invention are modified by labeling, in particular with a radioactive tracer (such as iodine or indium, for example), fluorescent (for example fluorescein or rhodamine isothiocyanate), chromogenic, enzymatic (peroxidase or alkaline phosphatase) or colloidal (gold for example).
  • a radioactive tracer such as iodine or indium, for example
  • fluorescent for example fluorescein or rhodamine isothiocyanate
  • the enzymatic activity possibly present on the reagent in carrying out this test can be determined according to known methods with an appropriate substrate allowing, for example, revelation by colorimetry, by fluorescence, by luminescence, by potentiometry, etc. .
  • Said solid support can be made of any solid, biological or synthetic material, endowed with adsorbent properties or capable of fixing a coupling agent.
  • the present invention also relates to a method for detecting, and possibly counting, whole enterobacteria, possibly present in a sample to be analyzed, characterized in that it consists in bringing said sample to be analyzed together with at least an immunological reagent according to the invention, to which the whole enterobacteria bind, if the latter are present in the sample to be checked, then to detect the antibody-enterobacterium complexes possibly formed by any appropriate means, in particular EIA, flow cytometry.
  • the latter before contacting the antibody-sample, the latter is dissolved appropriately.
  • the present invention further relates to a kit or diagnostic kit for the specific detection, and optionally the count, of entero-bacteria, characterized in that it comprises at least: an immunological reagent in accordance with invention, optionally fixed on a suitable solid support, and
  • these boxes also include the reagents commonly used in detections of this type, namely: a) for immunofluorescence tests, antibodies coupled to a fluorochrome as well as appropriate buffers and supports; b) for the enzymatic tests: antibodies coupled to the enzyme, agents revealing the enzymatic activity, the appropriate buffers and supports; c) for radioimmunological tests, antibodies modified with a radioactive marker, as well as the appropriate buffers and supports.
  • enterobacteria The actual detection of enterobacteria is carried out either cell by cell using a microscope or a cytometer, or any other optical system, or globally by means of an immunoenzymatic or bioluminescence reaction.
  • the method according to the invention has the advantage of being specific to all of the Enterobact ries, and of making it possible to recognize any enterobacterial, even present in very small quantities.
  • the invention also relates to the use of anti-ACE antibodies as defined above, in the detection and possibly the enumeration of entero ⁇ bacteria, in particular in food products.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
  • Example 1 Preparation of monoclonal antibodies according to the invention.
  • E. Coli 014 K7 (ATCC 19110) cultivated for 18 hours at 37 ° C. in peptone broth are adjusted to 10- * --- 1 bacteria / ml in 0.15 M NaCl.
  • the suspension is then brought to 100 ° C. in a water bath for 1 hour, then centrifuged for 10 minutes at
  • the last immunization is carried out by injecting, intravenously, 100 ⁇ l of heated supernatant from a suspension at 10 9 bacteria / ml.
  • the myeloma cells and the plasma cells are fused, in the presence of 41% of polyethylene glycol weighing 1500 (Merck) according to the method of KOHLER and MILSTEIN (Nature, 256. 495-497, 1975); secreting hybridomas are cloned according to the limit dilution method in RPMI medium containing 10 to 20% of fetal calf serum associated with feeder cells. 3. Selection:
  • the bacteria are introduced alive into the ELISA microtiter plates and undergo no treatment other than drying. Each supernatant is tested against five enterobacteria of different genera and species (E. Coli, Citrobacter, Enterobacter, Proteus hauserii, Serratia marcescens) as well as, as a negative control, against a Gram bacterium - not belonging to the family of Enterobacteriaceae (Pseudomonas mal tophilia).
  • enterobacteria of different genera and species E. Coli, Citrobacter, Enterobacter, Proteus hauserii, Serratia marcescens
  • enterobacteria of different genera and species are notably selected from the following strains:
  • E. coli ATCC 10536, ATCC 25922, ATCC 4157, CIP 52170, NCTC 9855, NCTC 8621, NCTC 8623, NCTC 8959 and, preferably, ATCC 19110 and ATCC 12806; Ci trobacter freundii: in particular ATCC 8090, CUETM 86-86; Entero ⁇ bacter agglomerans: preferably ATCC 27155, CDC 1461-67, CUETM 82-84, CUETM 79-146, CUETM 83-13, CUETM 78-97, CUETM 79-16, CUETM 78-161, CUETM 83-21, CUETM 77-118.
  • a supernatant (and therefore the corresponding hybrid) must be positive (even weakly) against the five enterobacteria and be completely negative against the non-enterobacterium.
  • the monoclonal antibodies thus selected are then tested for their specific labeling property of enterobacteria by immunofluorescence on a slide.
  • PGT 10 mM phosphate buffer (PBS), 0.15 M NaCl containing 2.5 g / 1 of gelatin- (ref .: G2625; SIGMA) and 0.1% (V / V) of "TWEEN” 20.
  • PGT PBS + gelatin + "TWEEN”
  • chromogenic substrate adapted to the conjugate enzyme
  • the substrate is azino-bis (3-ethyl-benzthiazoline- 6) sulfonic (1.1 mg / ml) in 0.6% acetic acid (vol / vol) (pH 4.7) containing 0.015% hydrogen peroxide (vol / vol).
  • the colorimetric reaction is carried out for 15 to 30 minutes at room temperature in the dark.
  • the bacteria are cultured, washed and conditioned as described in the ELISA protocol.
  • This fluorochrome colors all bacteria red and facilitates the observation of bacteria not recognized by the antibody.
  • the clones from a positive primary culture were selected and injected into Balb / c mice (production of ascites), in order to obtain large quantities of antibodies.
  • Balb / c mice production of ascites
  • elderly Balb / c female mice were stimulated by an intraperitoneal injection of 0.3 ml of tetramethyl-pentadecane. After 4 days, 20 million hybrid cells were injected into the mice. After 15 days, the ascites liquids were collected and their anti-ACE activity was tested.
  • This antibody recognizes all whole enterobacteria and does not exhibit non-specific reactions with other bacteria.
  • detection of enterobacteria The results are shown in Table I below showing the recognition spectrum of the antibody Kun9 / 15A3; all recognized bacteria are specifically recognized.
  • the different strains examined are either strains accessible to one of the following Collections: ATCC (American Type Culture Collection, Rockville), CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms from the INSTITUT PASTEUR, Paris), NCTC (National Collection of Type Cultures, London), CDC (Centers for Disease Control or Communicable Disease Center, Atlanta), CUETM (Collection of Microbial Ecotoxicology Unit, Villeneuve d'Ascq), NCPPB (National Collection of Plant Pathogenic Bacteria * Harpenden), CGUG (Culture Collection of Universitât Gôtebôrg, Gôtebôrg), either strains detected in hospital or in the environment.
  • ATCC American Type Culture Collection, Rockville
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms from the INSTITUT PASTEUR, Paris
  • NCTC National Collection of Type Cultures, London
  • CDC Centers for Disease Control or Communicable Disease Center, Atlanta
  • CUETM Cold Selection of Microbial Ecotoxicology Unit, Villeneuve d'A
  • Figures l.a. and l.b. illustrate the specificity of the antibody Kun9 / 15A3. They show, in the same microscope field, labeling by indirect immunofluorescence with Kun9 / 15A3 on a slide, of a mixture of E. Coli 014: K7 (short bacilli) and Lactobacillus _fejr_ne. ⁇ tu- ⁇ (elongated bacilli).
  • Figures l.a. and l.b. illustrate the detection by immunofluorescence (green) with the antibody Kun9 / 15A3 and non-specific staining (red) with Evans blue.
  • Photo lb illustrates the specificity of recognition of the antibody Kun9 / 15A3. Indeed, it is observed that only the enterobacteria (small oval bacteria) are colored green, ("BLUE" filter X1250), witnessing the immunological reaction with the antibody Kun9 / 15A3. Lactobacilli (long bacteria) do not exhibit this marking. On the other hand, there is a low fluorescence emission due to Evans blue (in red). This is due to overlapping of the fluorescence emission spectra of the two fluorochromes. The emission filter used is not selective enough and cannot be restricted to a single wavelength. The interest of this photo lies in the visualization of the two bacterial populations, one recognized by the antibody and the other not recognized.
  • Example 2 Detection method according to the invention: search for enterobacteria in food products.
  • the detection protocol is started directly from the filtration step.
  • the sample is placed in a 40 ml tube fitted with a filter of porosity 30 ⁇ m. Centrifuge for 5 minutes at 1500 g. 6. Remove the supernatant by aspiration and wipe the tube as before.
  • All the buffers and reagents used during this manipulation are previously filtered with a filter of porosity 0.2 ⁇ m. 1.
  • the 3 ml of bacterial suspension prepared as above or 250 ml of mineral water are filtered through a membrane with a porosity of 0.4 ⁇ m.
  • Example 3 Comparison of antibody 898 of the prior art / antibody Kun9 / 15A3 in accordance with the invention:
  • Photographs of i * ranunprints figure 2.A. shows that the common antigen of enterobacteria is not recognized in the same way by the antibody Kun9 / 15A3 (a single large band recognized) and by the antibody 898 (image in "ladder”); it appears from the above, that these two antibodies do not recognize the same antigenic determinant.
  • Figure 2.A illustrates the revelation effected using the monoclonal antibody Kun9 / 15A3, in accordance with the invention and comprises in column 1: Pseudomonas mal tophila, in column 2: Citrojbacter freundii, and in column 3: E. Coli 014: K7.
  • Figure 2.B. illustrates a coloration not specific (silver) of all the proteins and polysaccharides present in the enterobacteria supernatant introduced into the gel
  • Figure 2.C. corresponds to commercial molecular weight markers, which allow each band to be well placed in the gel and on the western blot.

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Abstract

Nouveaux anticorps dirigés contre l'antigène commun des entérobactéries (ACE), capables de reconnaître l'ensemble des entérobactéries entières ainsi que leurs applications à la détection spécifique et éventuellement à la numération des entérobactéries entières. Fragments antigéniques de l'ACE qui se couplent spécifiquement auxdits anticorps. Lesdits anticorps sont constitués par des anticorps monoclonaux capables de reconnaître toutes les entérobactéries entières, c'est-à-dire n'ayant subi notamment aucune opération d'extraction, par liaison avec un déterminant antigénique de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface desdites entérobactéries entières et directement accessible auxdits anticorps, et sont sélectionnés, à partir d'hybridomes préparés de manière appropriée, par: (a) un premier tri de chaque surnageant d'hybride à l'aide d'une méthode ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, au moins deux entérobactéries vivantes, éventuellement traitées de manière appropriée, et au moins une bactérie n'appartenant pas à la famille des entérobactéries, puis (b) un deuxième tri, par immunofluorescence, du/des surnageant(s) sélectionné(s) en (a).

Description

ANTICORPS ANTI-ACE ET LEURS APPLICATIONS A LA DETECTION SPECIFIQUE ET EVENTUELLEMENT A LA NUMERATION DES ENTEROBACTERIES ENTIERES, PAR UNE METHODE IMMUNOCHIMIQUE.
La présente invention est relative à de nou- veaux anticorps dirigés contre l'antigène commun des entérobactéries (ACE) , capables de reconnaître l'ensemble des entérobactéries entières ainsi qu'à leurs applica¬ tions à la détection spécifique et éventuellement à la numération des entérobactéries entières. On entend par entérobactéries entières, au sens de la présente invention, des entérobactéries, vivantes ou mortes, n'ayant subi aucune extraction et ayant conservé l'ensemble de leurs déterminants anti- géniques . La présente invention est également relative aux fragments antigéniques de l'ACE qui se couplent spé¬ cifiquement auxdits anticorps.
Les entérobactéries sont des bacilles a Gram négatif souvent polymorphes, mobiles grâce à une cilia- ture péritriche ou immobiles, dont un certain nombre sont des agents pathogènes qui peuvent être responsables d'intoxications graves, lorsqu'on les retrouve notamment dans les aliments ou l'eau potable. Leur détection et leur dénombrement dans les produits pharmaceutiques et agro-alimentaires sont ainsi de plus en plus sévèrement réglementés et contrôlés.
Il est usuel dans l'industrie agro-alimen¬ taire, de réaliser la détection des micro-organismes dans les produits alimentaires par des techniques microbiolo- giques classiques telles que la culture ; cependant, une telle méthode a pour inconvénient majeur d'être longue puisqu'elle nécessite de 24 à 72 heures pour donner des résultats utilisables.
En ce qui concerne plus particulièrement les entérobactéries, les techniques de dépistage actuellement utilisées en routine reposent sur des ensemencements de milieux de culture sélectifs tels que le bouillon lactose bilié au vert brillant (BLBVB) , le Mossel, le DEV lactose peptone... L'inconvénient majeur de ces techniques de mi¬ crobiologie classique réside, comme précisé ci-dessus, dans le délai de réponse, qui n'est jamais inférieur à 24 ou 48 heures selon le genre et l'espèce d"entérobactérie à rechercher et qui ne permet pas d'intervenir rapidement sur la production, ce qui peut comporter des conséquences économiques importantes.
Des tests, basés sur des ensemencements de milieux de culture sélectifs, mais de réalisation rapide ont été mis au point. On peut citer notamment le test "COLILERT", développé par la Société ACCESS ANALYTTCAL SYSTEMS, test colorimétrique, qui est mis en oeuvre en incubant pendant 24 heures l'échantillon à tester avec un milieu particulier. Ce test est simple à mettre en oeuvre mais ne peut être réalisé en moins de 24 heures et ne s'applique qu'à une famille d'entérobactéries : les con¬ formes.
On peut également citer le système "FLUOROCULT", développé par DIAGNOSTICA MERCK, qui est un test fluorimétrique sur bandelettes, qui repose sur l'utilisation d'un substrat fluorophore, appelé MUG, qui devient fluorescent sous l'action d'une enzyme produite par la bactérie. Ce test est rapide (1 à 2 heures) , mais n'est applicable qu'à Escherichia coll .
Il s'est donc avéré nécessaire de pouvoir dis¬ poser de méthodes très sensibles et plus rapides. C'est ainsi qu'a été proposée l'application des méthodes i mu- nologiques mises au point pour le diagnostic des maladies de l'Homme et des maladies de l'animal, à la détection de microorganismes toxiques dans les produits alimentaires.
Ces tests immunologiques, de manière générale, mettent en oeuvre des anticorps monoclonaux qui présen¬ tent une grande spécificité vis-à-vis de l'antigène qui a servi à leur production ; leur application aux entérobac¬ téries a été possible, à partir de la mise en évidence, en 1962, par KU IN et son équipe (Proc. Soc. Exp. Biol . Med., 1962, 111. 160-166) de l'existence d'un antigène de surface commun aux entérobactéries sauvages, baptisé "antigène commun des entérobactéries" (ACE) ; cette mise en évidence a conduit à la mise au point de "marqueurs" de l'ACE (sérums ou anticorps onoclonaux) . AOKI et al. (Proceedings of the Society for Expérimental Biology and Medicine, 1966, 121, 230-234) a évalué l'utilisation d'antisérum anti-ACE pour marquer les entérobactéries par immunofluorescence. Dans ce travail, AOKI et al. ont confirmé les travaux de KUNIN et al. et ont démontré la présence de l'ACE à la surface ou dans la paroi cellu¬ laire des entérobactéries. Toutefois, il faut noter que de tels sérums anti-ACE. ne présentent pas, dans le cadre d'un test de détection, une spécificité suffisante, pour une détection fiable d'une entérobactérie.
C. LUGO SKI et al. (Carbohydrate Res . , 1983, 118, 173-181) ont identifié une unité trisaccharidique répétée dans l'antigène commun des entérobactéries. L'ACE est un polysaccharide ; chez certaines bactéries, les mu¬ tants R, contenant le noyau R~_ ou R , l'ACE est chimique¬ ment lié à ce noyau et fait partie ainsi du lipopolysac- charide. En plus des constituants décrits précédemment, 2-acétamido-2-désoxy-D-glucose et acide 2-acétamido-2- désoxy-D-manuronique, les Auteurs de cet Article ont mis en évidence un autre composant majeur de l'ACE : le 4- acétamido-4, 6-didésoxy-D-galactose (D-Fuc4Nac) et ont montré que les unités trisaccharidiques constituent 70 % ou plus de cet antigène : -.4) -β-D-ManpNAcA- (1-.4) -α-D-GlcpNAc- (1→3) -α-D-Fucp4NAc-
(l→.
Plusieurs techniques, mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux, notamment pour pallier les incon¬ vénients des techniques précitées ont été décrites : - H. PETERS et al. (Infection and Immunity,
1985, ϋû, 2, 459-466) ont établi une lignée cellulaire hybride produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre l'antigène commun des entérobactéries (ACE) et une sous-structure de l'enveloppe externe lipopolysacchari- dique de différents Escherichia coli . Les anticorps anti- ACE dénommés 865 et 898 réagissent avec l'ACE d'extraits d ' E. coli chauffés et avec des préparations de LPS conte¬ nant de l'ACE lié au noyau R-_ ou R , aussi bien qu'avec un échantillon purifié d'ACE de Salmonella ontevideo .
L'anticorps 865 est une immunoglobuline de type IgM et l'anticorps 898 est une immunoglobuline de type IgG2a.
Il est également spécifié, dans cet article, que les comportements de ces deux anticorps vis-à-vis des bactéries entières, c'est-à-dire intactes, indiquent que les épitopes reconnus par ces anticorps ne sont pas fa¬ cilement accessibles aux anticorps.
- E.C. BOTTGER et al. (J. Clin. Microbiol., 1987, i_., 2, 377-382) décrivent une détermination quali¬ tative et quantitative de l'ACE par le même anticorps o- noclonal 898 et précisent à nouveau que l'utilisation de la bactérie intacte n'est pas favorable, dans la mesure où les polysaccharideε capsulaires aussi bien que les LPS de bactéries non encapsulées interfèrent constamment pour l'accessibilité de l'épitope de l'ACE reconnu par l'anticorps monoclonal 898.
- V. OBST et al. (Aqua, 1989, 136-142) dé¬ crivent une méthode immunologique utilisant les anticorps monoclonaux développés par H. PETERS et al., pour détec¬ ter des entérobactéries dans l'eau de boisson. Le groupe de coliformes étant considéré comme un bon indicateur de la présence d'une entérobactérie, les Auteurs de cet article ont développé un test ELISA utilisant l'anticorps monoclonal 898 précité. Une quan¬ tité définie d'anticorps 898 est déposée sur les parois d'une plaque de icrotitration. Il est spécifié que, dans la mesure où l'ACE est un lipopolysaccharide polymérique, il présente plusieurs épitopes antigéniques identiques qui restent libres en dépit de la liaison avec les anti¬ corps . Ces épitopes non liés peuvent donc réagir avec une quantité additionnelle d'anticorps anti-ACE 898, marqués à l'aide d'une enzyme appropriée, notamment de la β-ga- lactosidase.
Les Auteurs décrivent donc une méthode sand¬ wich, dans laquelle le même anticorps est utilisé pour capturer l'antigène et pour détecter l'antigène capturé. Toutefois, il ressort de cet article que cette méthode a l'inconvénient de requérir un pré-enrichisse¬ ment de 10 à 14 heures et une solubilisation de l'ACE.
La Demande EP 387 850, au nom de BOEHRINGER MANNHEIM GmbH, décrit des anticorps monoclonaux anti- entérobactéries obtenus par immortalisation de lympho¬ cytes B de patients ayant une infection due à une entéro- bactérie et par sélection des cellules qui fournissent l'activité souhaitée. Il est en particulier précisé, dans cette Demande, que la sélection est réalisée par détec- tion de la fixation des anticorps produits sur des prépa¬ rations de lipopolysaccharides (LPS) des entérobactéries, qui contiennent des quantités non négligeables d'ACE, au moyen d'un test ELISA. Il est également précisé, à l'exemple 1 de cette Demande, que la sélection est réali- sée au moyen d'un test ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, de l'ACE purifié, isolé de Salmonella montevideo .
Aussi bien les tests de détection que les an¬ ticorps monoclonaux de l'Art antérieur, sélectionnés en utilisant des extraits d'ACE, ne permettent pas une détection fiable de n'importe quelle entérobactérie, dans un échantillon à contrôler ; en effet, un produit alimen¬ taire peut être contaminé par une ou plusieurs entéro¬ bactéries différentes ; il faudrait donc pouvoir dispo- ser, pour réaliser le test de détection immunologique, d'anticorps anti-entérobactéries qui reconnaissent notam- ment toutes les entérobactéries entières, directement dans l'échantillon à contrôler.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des anticorps monoclonaux, qui répondent à un besoin important, qui est celui de la détection de la présence d'une entérobactérie entière quelle qu'elle soit et notamment des entérobactéries contaminantes toxiques, dans différentes substances ou fluides, et notamment dans les produits alimentaires et qui permettent la réalisation d'un test immunologique spécifique et fiable, directement sur l'échantillon, éventuellement solubilisé, ne nécessitant pas l'intervention de spécialistes et, par suite, apte à être mis sous la forme d'une trousse de détection aisément utilisable.
La présente invention a pour objet des anti¬ corps anti-entérobactéries, caractérisés :
- en ce qu'ils sont constitués par des anti¬ corps monoclonaux capables de reconnaître toutes les entérobactéries entières, c'est-à-dire n'ayant subi notamment aucune opération d'extraction, par liaison avec un déterminant antigenique de l'antigène commun des enté¬ robactéries (ACE) présent à la surface desdites entérobactéries entières et directement accessible auxdits anticorps, et
- en ce qu'ils sont sélectionnés, à partir d'hybridomes préparés de manière appropriée, par :
(a) un premier tri de chaque surnageant d'hybride à l'aide d'une méthode ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, au moins deux entérobactéries vivantes, éventuellement traitées de manière appropriée, et au moins une bactérie n'appartenant pas à la famille des entérobactéries, puis
(b) un deuxième tri, par immunofluorescence, du/des surnageant (s) sélectionné(s) en (a) .
Les hybridomes sont préparés de manière connue en soi :
- soit conformément à la méthode de KOHLER et MILSTEIN, par fusion de cellules myélomateuseε appro¬ priées et de cellules spléniques d'animaux choisis dans le groupe qui comprend les mammifères non humains conve¬ nables, immunisés à l'aide d'un surnageant d'une entéro¬ bactérie dont l'ACE est immunogène ; soit à partir de lymphocytes B humains appropriés, immortalisés par fusion avec des cellules de myélome appropriées ou transformés par exemple par le virus d'Eptsein-Barr.
Selon un mode de réalisation avantageux desdits anticorps, le premier tri (a) est réalisé à l'aide d'au moins 5 entérobactéries vivantes. Les anticorps monoclonaux conformes à l'invention sont notamment de type IgG2a et ont la pro¬ priété inattendue, notamment en raison de la sélection desdits anticorps à l'aide d'au moins deux entérobacté¬ ries entières différentes, et non à l'aide d'un produit d'extraction d' entérobactérie, de reconnaître une partie de l'ACE correspondant à un déterminant antigenique pré¬ sent uniquement -à la surface des entérobactéries entières .
De tels anticorps ont notamment l'avantage de résoudre le problème de la détection de n'importe quelle entérobactérie, directement dans l'échantillon à analyser et ce, avec une excellente fiabilité.
Les anticorps conforme à l'invention convien¬ nent donc particulièrement bien pour la détection d'une entérobactérie quelle qu'elle soit, susceptible notamment de contaminer les produits alimentaires, notamment par des techniques d' immunofluorescence, les techniques immunoenzymatiques, en particulier la méthode ELISA, et les techniques radioimmunologiques, directes ou indi- rectes.
Les entérobactéries pathogènes ou potentielle- ment pathogènes, reconnues par les anticorps conformes à l'invention comprennent notamment les genres suivants : Ci trobacter, Edwards iel la, Enterobacter, Erwinia, Esche- richia, Hafnia, Klebsiella, Levinea, Proteus, Providen- tia, Sal onella, Serratia, Shigella et Yersinia .
Les bactéries non reconnues sont notamment Pseudo onas , Xanthomonas , Acinetobacter , Achromobac ter, Streptocoque, etc..
Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, lesdits anticorps monoclonaux sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides murines, résultant de la fusion de cellules de rrryélome de souris, de préférence non sécrétantes et de plasmocytes de souris immunisées à l'aide d'un surnageant convenablement préparé à partir d'une entérobactérie choisie dans le groupe qui comprend E. Coli 014:K7 (ATCC 19110) et E. Coli 0124:B17 (ATCC 12806).
La présente invention a également pour objet des fragments antigéniques, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par les anticorps conformes à l'invention et en ce qu'ils sont constitués par un fragment de l'antigène commun des entérobactéries (ACE) présent à la surface des entérobactéries entières, lequel fragment est directement accessible auxdits anticorps et constitue au moins un déterminant antigenique de l'ACE.
La présente invention a également pour objet un réactif immunologique, utilisable pour la détection des entérobactéries entières, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps conforme à l'invention ou un frag- ment de celui-ci, l'un ou l'autre éventuellement modifié par marquage par tout marqueur approprié, notamment enzyme, fluorochrome, et/ou fixé sur un support solide.
En effet, les anticorps anti-ACE monoclonaux conformes à l'invention peuvent être marqués ou non, et ils peuvent éventuellement être fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immuno- adsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyses fondées sur la réaction antigène-anticorps (techniques radioimmunologiques, d'immunofluorescence, enzymatiques notamment) .
A cet effet, les anticorps conformes à l'invention sont modifiés par marquage, notamment avec un traceur radio-actif (tel que l'iode ou l'indium, par exemple) , fluorescent (par exemple isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine) , chromogène, enzymatique (peroxydase ou phosphatase alcaline) ou colloïdal (or par exemple) .
L'activité enzymatique éventuellement présente sur le réactif dans la réalisation de ce test, peut être déterminée selon les méthodes connues avec un substrat approprié permettant par exemple une révélation par colo- rimétrie, par fluorescence, par luminescence, par poten- tiométrie, etc..
Ledit support solide peut être réalisé en tout matériau solide, biologique ou synthétique, doué de pro¬ priétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de cou¬ plage.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection, et éventuellement de numération, d'entérobactéries entières, éventuellement présentes dans un échantillon à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en présence ledit échantillon à analy¬ ser avec au moins un réactif immunologique conforme à l'invention, auquel se lient les entérobactéries entières, si ces dernières sont présentes dans l'échantillon à contrôler, puis à détecter les complexes anticorps-entérobactéries éventuellement formés par tout moyen approprié, notamment EIA, cytométrie en flux.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon l'invention, préalablement à la mise en contact anticorps-échantillon, ce dernier est solubilisé de manière appropriée.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit ou trousse de diagnostic pour la détection spéci¬ fique, et éventuellement la numération, d'entéro- bactéries, caractérisé en ce qu'il comprend au moins : un réactif immunologique conforme à l'invention, éventuellement fixé sur un support solide approprié, et
- des quantités ou doses appropriées d'une substance de révélation, si nécessaire.
Bien entendu ces coffrets comprennent égale¬ ment les réactifs couramment utilisés dans les détections de ce type, à savoir : a) pour les tests par immunofluorescence, des anticorps couplés à un fluorochrome ainsi que des tampons et des supports appropriés ; b) pour les tests par voie enzymatique : des anticorps couplés à l'enzyme, les agents révélateurs de l'activité enzymatique, les tampons et les supports ap- propriés ; c) pour les tests radioimmunologiques, des an¬ ticorps modifiés par un marqueur radioactif, ainsi que les tampons et supports appropriés .
La détection proprement dite des entérobacté- ries est réalisée soit cellule par cellule à l'aide d'un microscope ou d'un cytomètre, ou de tout autre système optique, ou de façon globale grâce à une réaction immunoenzymatique ou de bioluminescence.
Le procédé conforme à l'invention a l'avantage d'être spécifique de l'ensemble des Entérobact ries, et de permettre de reconnaître n'importe quelle entérobacté¬ rie, même présente en très petites quantités.
L'invention concerne également l'utilisation des anticorps anti-ACE tels que définis ci-dessus, dans la détection et éventuellement le dénombrement d'entéro¬ bactéries, en particulier dans des produits alimentaires. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré¬ fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Préparation d'anticorps monoclonaux conformes à l'invention.
1. Immunisation :
Le protocole d'immunisation des trois souris utilisées pour les fusions ayant donné naissance aux anticorps anti-entérobactéries conformes a l'invention, est le suivant : a. Préparation de l'antigène :
Des E. Coli 014:K7 (ATCC 19110) cultivées 18 heures à 37 'C en bouillon peptoné sont ajustées à 10-*---1 bactéries/ml dans du NaCl 0,15 M.
La suspension est alors portée à 100'C au bain-marie pendant 1 heure, puis centrifugée 10 minutes à
2 500 g et le surnageant est prélevé ,- ce surnageant contient (entre autres) l'ACE en solution. C'est ce surnageant qui est injecté aux souris. b. Immunisation :
Au jour J0, 100 μl de surnageant issu d'une suspension à ÎO10 bactéries/ml sont émulsionnés avec 100 μl d'adjuvant de Freund complet puis injectés par voie sous-cutanée aux souris.
A J28, 100 μl du même surnageant est émul- sionné avec 100 μl d'adjuvant de Freund incomplet puis injectés par voie sous-cutanée aux souris.
Après au moins 1 mois de repos (J>56) , la der- nière immunisation est effectuée en injectant, par voie intraveineuse, 100 μl de surnageant chauffé issu d'une suspension à 109 bactéries/ml. 2. Fusion :
La fusion cellulaire est effectuée trois jours et demi après. Des cellules de myélo e de souris Balb/c (NSI) sont utilisées pour la fusion.
Les cellules de myélome et les plasmocyteε sont fusionnés, en présence de 41 % de polyéthylèneglycol d'un poids de 1500 (Merck) selon la méthode de KOHLER et MILSTEIN (Nature, 256. 495-497, 1975) ; les hybridomes sécrétants sont clones conformément à la méthode des dilutions limites dans un milieu RPMI contenant 10 à 20 % de sérum de veau fétal associé à des cellules nourricières. 3. Sélection :
- Principe :
Les bactéries sont introduites vivantes dans les plaques de microtitration ELISA et ne subissent pas d'autre traitement qu'un séchage. Chaque surnageant est testé contre cinq enté¬ robactéries de genres et d'espèces différents { E. Coli , Citrobacter, Enterobacter, Proteus hauserii , Serratia marcescens) ainsi que, à titre de contrôle négatif, contre une bactérie à Gram - n'appartenant pas à la famille des Entérobactéries { Pseudomonas mal tophilia ) .
Certaines des cinq entérobactéries de genres et d'espèces différents sont notamment sélectionnées parmi les souches suivantes :
E. coli : ATCC 10536, ATCC 25922, ATCC 4157, CIP 52170, NCTC 9855, NCTC 8621, NCTC 8623, NCTC 8959 et, de préférence, ATCC 19110 et ATCC 12806 ; Ci trobacter freundii : notamment ATCC 8090, CUETM 86-86 ; Entero¬ bacter agglomerans : de préférence ATCC 27155, CDC 1461-67, CUETM 82-84, CUETM 79-146, CUETM 83-13, CUETM 78-97, CUETM 79-16, CUETM 78-161, CUETM 83-21, CUETM 77-118. Pour être sélectionné, un surnageant (et donc l'hybride correspondant) doit être positif (même faible¬ ment) contre les cinq entérobactéries et être totalement négatif contre la non-entérobactérie. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés sont ensuite testés quant à leur propriété de marquage spécifique des entérobactéries par immunofluorescence sur lame.
- ELISA : 1) Les bactéries sont cultivées 24 heures à
37*C en bouillon peptoné puis lavées 3 fois avec une solution aqueuse de NaCl 0,15 M filtrée (filtre 0,22 μm de diamètre) et remises en suspension dans une solution aqueuse de NaCl 0,15 M. 2) dans chaque puits de la plaque ELISA, 50 μl de suspension à 5.10° bactéries/ml (bactéries vivantes) sont introduits. On laisse évaporer une nuit à 4'C, puis les puits sont lavés 3 fois avec 200 μl de tampon PBS 10 M, pH 7,1. 3) Les plaques sont saturées par 100 μl de
PGT : tampon phosphate (PBS) 10 mM, NaCl 0,15 M contenant 2,5 g/1 de gélatine- (réf . : G2625 ; SIGMA) et 0,1 % (V/V) de "TWEEN" 20. (PGT = PBS + gélatine + "TWEEN" ) .
4) 50 μl de surnageants d'hybrides, dilués au demi avec du milieu de culture RPMI, sont déposés dans les puits et laissés incuber pendant 2 heures à 37 'C.
5 lavages sont effectués avec du PBST : tampon phosphate 10 mM, NaCl 0,15 M contenant 0,1 % de Tween 20.
5) 50 μl de conjugué anti-Ig de souris-enzyme (à la dilution préconisée par le fabricant) sont déposés dans chaque puits et placés à 37 'C pendant 1 heure. 5 lavages sont effectués avec du PBST.
6) Dans chaque puits sont ajoutés 100 μl de substrat chromogène adapté à l'enzyme du conjugué. Dans le cas où l'enzyme est de la peroxydase de raifort, le substrat est de l'acide azino-bis (3-éthyl-benzthiazoline- 6) sulfonique (1,1 mg/ml) dans de l'acide acétique à 0,6 % (vol/vol) (pH 4,7) contenant du peroxyde d'hydrogène 0,015 % (vol/vol) . La réaction colorimétrique s'effectue 15 à 30 minutes à température ambiante, à l'obscurité.
7) La lecture des densités optiques se fait à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde adap¬ tée au substrat chromogène choisi (405 nin lorsqu'il s'agit de la peroxydase) . - Immunofluorescence sur lame :
Les bactéries sont cultivées, lavées et condi¬ tionnées comme décrit dans le protocole ELISA.
1) 10 μl de suspension bactérienne à 10° cellules/ml sont déposés sur chaque puits de la lame. Les lames sont portées à 1 ' étuve à 37 *C jusqu'à assèche¬ ment des puits .
2) Les bactéries sont fixées par addition d'une goutte d'éthanol à 70 % par puits.
Laisser agir 5 minutes puis retirer l'éthanol. 3) Les puits sont saturés par dépôt de 10 μl de PGT dans chaque puits. 30 minutes d'incubation à 37 'C en atmosphère humide. Lavage à la pissette avec du PBST.
4) 10 μl de solution d'anticorps, diluée en PGT, sont déposés dans les puits. 1 heure à 37 'C en atmosphère humide. Lavage à la pissette avec du PBST.
5) 10 μl de solution de conjugué anti-Ig de souris-FITC, diluée en PGT, sont déposés dans les puits. 1 heure à 37*C en atmosphère humide à l'obscurité. Lavage à la pissette avec du PBST. 6) Dépôt d'une goutte de bleu Evans dans chaque puits. 5 minutes d'incubation à température ambiante. Lavage à la pissette avec du PBST.
Ce fluorochrome colore en rouge toutes les bactéries et facilite l'observation des bactéries non reconnues par l'anticorps.
7) L'observation se fait à l'aide d'un microscope à épifluorescence avec les filtres adaptés aux fluorochromes (FITC et bleu Evans) .
Plusieurs anticorps monoclonaux, dont celui dénommé Kun9/15A3 ou CX9/15, ont été en particulier sélectionnés pour leur reconnaissance de toutes les entérobactéries testées.
Les clones issus d'une culture primaire po¬ sitive, ont été sélectionnés et injectés à des souris Balb/c (production d'ascite), pour obtenir de grandes quantités d'anticorps. A cet effet, des souris femelles âgées Balb/c ont été stimulées par une injection intrapéritonéale de 0,3 ml de tétraméthyl-pentadécane. Après 4 jours, 20 millions de cellules hybrides ont été injectées aux souris. Au bout de 15 jours, les liquides d'ascites ont été récoltés et leur activité anti-ACE a été testée.
4. Caractéristiques de l'anticorps monoclonal Kun9/15A3 :
Cet anticorps reconnaît toutes les entéro- bactéries entières et ne présente pas de réactions non spécifiques avec d'autres bactéries. a. détection des entérobactéries : Les résultats sont représentés dans le Tableau I ci-après montrant le spectre de reconnaissance de l'anticorps Kun9/15A3 ; toutes les bactéries reconnues, le sont de manière spécifique.
Figure imgf000017_0001
TABLEAU I
Figure imgf000018_0001
Klebsiella pneumoniae
1 2
4 6 1
4 12 1 11 6 3 3
Figure imgf000018_0002
1
Ha f ia alvei
7 5 9 1 6 5 2
12
Figure imgf000018_0003
2
Morganella morganii Espèces Nombre de sou¬ Nombre de résul¬ ches examinées-*-, tats positifs
Providencia rettgeri 1 1
P. alcalifaciens 1 1
P. stuartii 2 2
Yersinia enterocolitica 2 2
Y. aldovae 4 4
Y. pseudotuberculosis 3 3
Y. ruckeri 2 2
Y. frederiksenii 1 1
Y. intermedia 1 1
Rahnella aquatilis 6 6
Buttiauxella agrestis 4 4
Kluyvera ascorbata 5 5 K. cryocrescens 2 2
Edwardsiella tarda 2 2 Ed. hoshinae 3 3
Pragia fontium 2 2
Budvicia aquatica 1 1
Erwinia herbicola 1 1
Obesumbac ter ium proteus
0
16 0 1 0 4 0
23 0 4 0 3 0 5 0
Figure imgf000019_0001
4 0 Espèces Nombre de sou¬ Nombre de résul¬ ches examinées**• tats positifs
Ps . pseudomallei 1 0
Ps . picketti 2 0
Ps . paucimobilis 3 0
Ps . cepacia 1 0
Xantho onas altophilia
Acinetobacter calcoaceticus 1 0
A. haemolyticus 6 0
A. junii 4 0
A . johnsonii 1 0
A. Iwoffi 5 0
A. baumanii 2 0
A chromoba cter xylososidans
Alcaligenes faecalis 2 0 A. deni trificans 1 0
Pasteurella haemolytica
Haemophilus influenzae 1 0
Vibrio sp 1 0
Pleisomonas shigelloides 1 1
Aeromonas hydrophilia 1 1
Bacteroldes fragilis 5 0
Streptocoque hémoly- tique A, B, C, G
Figure imgf000021_0001
1 les différentes souches examinées sont, soit des souches accessibles à l'une des Collections suivantes : ATCC (American Type Culture Collection, Rockville) , CNCM (Collection Nationale des Cultures de Microorganismes de 1' INSTITUT PASTEUR, Paris), NCTC (National Collection of Type Cultures, Londres), CDC (Centers for Disease Control or Communicable Disease Center, Atlanta) , CUETM (Collection de l'Unité Ecotoxicologie Microbienne, Villeneuve d'Ascq) , NCPPB (National Collection of Plant Pathogenic Bacteria* Harpenden) , CGUG (Culture Collection of Universitât Gôtebôrg, Gôtebôrg) , soit des souches détectées à l'hôpital ou dans l'environnement. b. spécificité de l'anticorps Kun9/15A3 :
Deux photographies (figures l.a. et l.b.) illustrent la spécificité de l'anticorps Kun9/15A3. Elles montrent, dans un même champ de microscope, le marquage par immunofluorescence indirecte avec Kun9/15A3 sur lame, d'un mélange de E. Coli 014 :K7 (bacilles courts) et de Lactobacillus _fejr_ne.αtu-π (bacilles allongés) .
Les figures l.a. et l.b. illustrent la détec¬ tion par immunofluorescence (vert) avec l'anticorps Kun9/15A3 et une coloration non spécificjue (rouge) par le bleu Evans .
La photo l.b. illustre la spécificité de reconnaissance de l'anticorps Kun9/15A3. En effet, on observe que seules les entérobactéries (petites bactéries ovales) sont colorées en vert, (filtre "BLUE" X1250), témoin de la réaction immunologique avec l'anticorps Kun9/15A3. Les lactobacilles (longues bactéries) ne pré¬ sentent pas ce marquage. Par contre, on observe une faible émission de fluorescence due au bleu Evans (en rouge) . Ceci est dû à un recouvrement des spectres d'émission de fluorescence des deux fluorochromes. Le filtre d'émission utilisé n'est pas assez sélectif et ne peut être restreint à une seule longueur d'onde. L'intérêt de cette photo réside dans la visualisation des deux populations bactériennes, l'une reconnue par l'anticorps et l'autre non reconnue. Le champ de la photo l.a. est identique à celui de la photo l.b., seul le filtre change. Toutes les bactéries sont colorées en rouge (filtre "GREEN", X1250) . Comparée à la photo l.b., elle permet de vérifier que toutes les entérobactéries sont reconnues par l'anticorps Kun9/15A3 et elles seules.
Exemple 2 : Procédé de détection conforme à 1'invention : recherche d'entérobactéries dans des produits alimen¬ taires.
A) Extraction : Une extraction est nécessaire lorsque l'on recherche des bactéries dans des produits non filtrables. Le protocole décrit ci-dessous a été mis au point pour un fromage (le "Philadelphia" ) et pour du ketchup mais convient certainement pour beaucoup d'autres produits alimentaires.
Pour des produits filtrables, tels que l'eau minérale, on commence le protocole de détection directe¬ ment à partir de l'étape de filtration.
1. A 5 g de "Philadelphia", on ajoute 45 ml de Milieu MOSSEL, puis on homogénéise.
2. On prélève 10 ml de l'homogénat puis on le centrifuge 5 minutes à 1500 g.
3. On aspire et jette le surnageant puis on sèche la paroi du tube avec un papier absorbant.
4. On ajoute 14 ml d'un tampon de solubilisa- tion convenable tel que PBS et on incube 8 minutes à
40'C.
5. On place l'échantillon dans un tube de 40 ml équipé d'un filtre de porosité 30 μm. On centrifuge 5 minutes à 1500 g. 6. On élimine le surnageant par aspiration et on essuie le tube comme précédemment.
7. On ajoute 3 ml de NaCl à 9 g/1. L'échantillon est prêt pour le marquage. B) Marquage sur filtre : Les filtrations sont réalisées en provoquant un vide sous le filtre.
Tous les tampons et réactifs utilisés au cours de cette manipulation sont préalablement filtrés avec un filtre de porosité 0,2 μm. 1. On filtre les 3 ml de suspension bacté¬ rienne préparée comme précédemment ou 250 ml d'eau miné¬ rale sur une membrane de porosité 0,4 μm.
2. On fait sécher le filtre dans une étuve à 37*C. 3. On fixe en déposant sur le filtre de
1'éthanol.
4. On lave par filtration avec du PBS-Tween.
5. On dépose l'anticorps Kun9/15A3, dilué en PBS-Tween-BSA. 6. On incube à 37'C.
7. On lave par filtration avec du PBS-Tween.
8. On dépose le second anticorps biotinylé, dilué en PBS-Tween-BSA.
9. On incube à 37'C. 10. On lave par filtration avec du PBS-Tween.
11. On dépose la streptavidine-FITC, diluée en PBS-Tween-BSA .
12. On lave par filtration avec du PBS-Tween.
13. On observe avec un microscope à épifluo- rescence. Si l'échantillon contient des entérobactéries, seules celles-ci apparaîtront vert fluorescent.
Exemple 3 : Comparaison anticorps 898 de l'art antérieur/anticorps Kun9/15A3 conforme à l'invention :
1. Des photographies d'i*ranunoempreintes figure 2.A. (ou "western blot") montre que l'antigène commun des entérobactéries n'est pas reconnu de la même façon par l'anticorps Kun9/15A3 (une seule bande importante recon¬ nue) et par l'anticorps 898 (image en "échelle") ; il ressort de ce qui précède, que ces deux anticorps ne ' reconnaissent pas le même déterminant antigenique.
L'expérience a été effectuée dans les condi¬ tions décrites par PETERS et al. dans "Infection and Immunity", vol. 50, n* 2, p. 459 (1985). L'E. Coli 2506 présentée dans cet article (figure 2, page 464, ligne 2), est l'E. Coli 014:K7 (voir tableau 2, page 460 du même article) . La même bactérie a été utilisée pour l'expérience. Les images sont nettement différentes.
Le traitement des bactéries, 1'électrophorèse et le transfert sur nitrocellulose ont été effectués comme cela a été décrit par PETERS et al. dans "Infection and Immunity", vol. 50, n" 2, p. 459 (1985).
La figure 2.A. illustre la révélation effec¬ tuée en utilisant l'anticorps monoclonal Kun9/15A3, conforme à l'invention et comprend en colonne 1 : Pseudo- monas mal tophila , en colonne 2 : Citrojbacter freundii , et en colonne 3 : E. Coli 014:K7.
On constate que le profil de la colonne 3 (1 seule bande) est nettement différent de celui présenté dans l'article cité ci-dessus (figure 2, colonne 2 ; image en "échelle").
La figure 2.B. illustre une coloration non spécifique (argent) de tous les protéines et poly- saccharides présents dans le surnageant d'entérobactérie introduit dans le gel ; la figure 2.C. correspond à des marqueurs de poids moléculaires du commerce, qui per- mettent de bien situer chaque bande dans le gel et sur le western blot.
La comparaison de la figure 2.B./2.C. avec la figure 2.A., illustre la spécificité de l'anticorps conforme à l'invention. WESTERN BLOT
- Principe :
Il permet de détecter des protéines après leur immobilisation sur une membrane de nitrocellulose à l'aide d'anticorps marqués à la peroxydase. Il s'agit de transférer les protéines sur la membrane après séparation dans un gel. On obtient donc la réplique exacte du gel et grâce à la propriété intrinsèque de la membrane, ces pro¬ téines sont immobilisées et gardent toutes leurs proprié¬ tés antigènes ou anticorps. On incube alors ces empreintes avec des anticorps spécifiques qui vont se fixer sur les protéines contre lesquelles ils sont diri¬ gés. Ce lieu de fixation est repéré par le produit de la réaction enzymatique. L'électrophorèse et le transfert sont réalisés comme préconisé par le fabricant (LKB) . Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Anticorps anti-entérobactéries, caractéri¬ sés :
- en ce qu'ils sont constitués par des anti- corps monoclonaux capables de reconnaître toutes les entérobactéries entières, c'est-à-dire n'ayant subi notamment aucune opération d'extraction, par liaison avec un déterminant antigenique de l'antigène commun des enté¬ robactéries (ACE) présent à la surface desdites entérobactéries entières et directement accessible auxdits anticorps, et
- en ce qu'ils sont sélectionnés, à partir d'hybridom.es préparés de manière appropriée, par :
(a) un premier tri de chaque surnageant d'hybride à l'aide d'une méthode ELISA, mettant en oeuvre comme antigène, au moins deux entérobactéries vivantes, éventuellement traitées de manière appropriée, et au moins une bactérie n'appartenant pas à la famille des entérobactéries, puis (b) un deuxième tri, par immunofluorescence, du/des surnageant(s) sélectionné(s) en (a).
2') Anticorps selon la revendication 1, carac¬ térisés en ce que le premier tri (a) est réalisé à l'aide d'au moins 5 entérobactéries vivantes. 3') Anticorps selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de cellules hybrides murines, résultant de la fusion de cellules de myélome de souris, de préférence non sécrétantes et de plasmocytes de souris immunisées à l'aide d'un surnageant convenable¬ ment préparé à partir d'une entérobactérie choisie dans le groupe qui comprend E. Coli 014:K7 (ATCC 19110) et E. Coli 0124-B17 (ATCC 12806).
4") Fragments antigéniques, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus par les anticorps selon l'une quel¬ conque des revendications 1 à 3 et en ce qu'ils sont constitués par un fragment de l'antigène commun des enté¬ robactéries (ACE) présent à la surface des entérobacté¬ ries entières, lequel fragment est directement accessible auxdits anticorps et constitue au moins un déterminant antigenique de l'ACE.
5') Réactif immunologique utilisable pour la détection des entérobactéries entières, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou un fragment de celui-ci, l'un ou l'autre éventuellement modifié par marquage par tout mar¬ queur approprié, notamment enzyme, fluorochrome, et/ou fixé sur un support solide.
6') Procédé de détection, et éventuellement de numération, d'entérobactéries entières, éventuellement présentes dans un échantillon à analyser, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en présence ledit échantillon à analyser avec au moins un réactif immunologique selon la revendication 5, auquel se lient les entérobactéries entières, si ces dernières sont présentes dans l'échantillon à contrôler, puis à détecter les complexes anticorps-entérobactéries éventuellement formés par tout moyen approprié, not'amment EIA, cytométrie en flux.
7') Procédé selon la revendication 6, caracté¬ risé en ce que préalablement à la mise en contact anti- corps-échantillon, ce dernier est solubilisé de manière appropriée.
8") Kit ou trousse de diagnostic pour la dé¬ tection spécifique, et éventuellement la numération d'entérobactéries, caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
- un réactif immunologique selon la revendica¬ tion 5, et
- des quantités ou doses appropriées d'une substance de révélation, si nécessaire. 9*) Utilisation des anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans la détection spécifique, et éventuellement le dénombrement, d'entéro¬ bactéries, en particulier dans des produits alimentaires.
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