WO1991014779A1 - Diagnostic for hepatitis virus - Google Patents

Diagnostic for hepatitis virus Download PDF

Info

Publication number
WO1991014779A1
WO1991014779A1 PCT/JP1991/000405 JP9100405W WO9114779A1 WO 1991014779 A1 WO1991014779 A1 WO 1991014779A1 JP 9100405 W JP9100405 W JP 9100405W WO 9114779 A1 WO9114779 A1 WO 9114779A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hcv
primer
sequence
hepatitis
pcr
Prior art date
Application number
PCT/JP1991/000405
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Takada
Nobuyuki Enomoto
Takayasu Date
Toshifumi Nakao
Original Assignee
Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated filed Critical Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated
Publication of WO1991014779A1 publication Critical patent/WO1991014779A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Another object of the present invention is to probe a nucleotide fragment having a nucleotide sequence of a specific length at a specific site in a HCV genomic or a sequence obtained by partially converting the nucleotide sequence with a probe (DNA or RNA).
  • the present invention provides a diagnostic agent for detecting the presence of HCV.
  • an antibody against HCV containing the peptide particularly an antibody against HCV contained in the serum or the like of a patient, that is, a gene product of a structural region gene of the HCV genomic or an HCV patient
  • the NS-5 region of the HCV genome produced in the liver can provide diagnostics for the detection of antibodies to RNA polymerase which encodes.
  • cDNA prepared from RNA extracted and separated from a patient sample is subjected to PCR, and the width of cDNA having a sequence as an indicator of the presence or absence of HCV is selectively determined as the index cDNA.
  • nucleotide fragment used as a primer for reverse transcription or a primer for PCR in the above-mentioned diagnostic method using PCR is a diagnostic agent used in the diagnostic method. It is useful.
  • RNA or DNA is also useful as a diagnostic agent for use in the above-mentioned diagnostic method using the novel hybridization.
  • FIG. 2 shows the positions on HCV-cDAN of the portions corresponding to the respective primers used for reverse transcription and PCR.
  • the portion corresponding to the first T at the 5 'end of the primer HCV1 was designated as 0 incense.
  • the obtained RNA extract is allowed to stand, and then centrifuged at a high speed of about 20.00 Xg for 5 to 20 minutes to collect the aqueous layer.
  • a random primer consisting of a 6-mer or 7-mer can be used as long as the desired cDNA can be synthesized. It can be used without restriction, including the For example, an amino acid sequence region in which the number of amino acid codons used is relatively low is selected from the R ⁇ polymerase region of a known HCV genomic and the 3 ′ side is selected. Oligonucleotides that are complementary to the nucleotide sequence of a specific length at a specific position, or a portion of the nucleotide sequence that is converted within a range that does not reduce the reverse transcription activity Oligonucleotides (conversion primers) having the obtained sequences can be used. The synthesis of the primer can be carried out by a known method.
  • the primer for reverse transcription may be a 5- to 50-mer oligonucleotide, preferably about 30-mer oligonucleotide or a short run.
  • Dam primers are available, such as those having the following sequence:
  • RNA obtained as described above 5 XMMLV buffer, dATP, dCTP, and other deoxyribonucleotides required for cDNA synthesis.
  • Mix primers for reverse transcription such as each of the above-mentioned sequences.
  • add water warm the mixture to about 70 ° C for 2 to 10 minutes, and then add an RNase inhibitor (for example, one manufactured by Promega) and a reverse transcriptase (for example, For example, add BRL-derived MMLV) and react at 37 ° C for 30 to 60 minutes.
  • RNase inhibitor for example, one manufactured by Promega
  • a reverse transcriptase for example, For example, add BRL-derived MMLV
  • the cDNA in the above reaction mixture for example, the following oligonucleotide was converted to a primer for polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the cDNA which can be amplified by the primers is amplified.
  • the amplification of the cDNA by PCR may be performed in the same container as the reverse transcription reaction and continuously with the reverse transcription reaction.
  • the primer for PCR can be used without limitation as long as it can selectively amplify a desired cDNA.
  • primer 32 The following sequence (primer 32) can be mentioned as a typical example of the primer 31.
  • the primers listed above for reverse transcription can be used for negative strand amplification.
  • Conversion primers The sequence conversion in the primer is performed within a range that does not impair the function as a PCR primer. As this sequence conversion, one obtained by converting at least one base every six bases can be used.
  • primers for PCR can be mixed and used.
  • HCV 1 shown in Fig. 1 and Fig. 2 can be made to have a width of 4 41 (HCV-T, HCV-KU), a primer ⁇ and a bra. 336 b ⁇ that can be amplified with the primer @ or ®, 22 bp that can be amplified with the primer 32 and the primer HCV 26, primer 3 and the primer It is possible to amplify a 195 bp cDNA or the like, which can be as wide as ⁇ in the primer 1.
  • various types of cDNAs having a sequence and a nucleotide length defined by the primer used are amplified.
  • the broadened cDNA can be separated and purified by a known method and used for a desired purpose.
  • the above procedure can be used as it is for the diagnosis of hepatitis C.
  • Step b and step c may be performed continuously in the same container.
  • Step e is performed as necessary. If no cDNA having a sequence characteristic of hepatitis C virus was detected in step d, step c In place of the primers used in step 2, a second PCR is performed using a primer corresponding to a specific position inside the corresponding HCV genomic portion with respect to these primers, and The presence or absence of cDNA is detected in the same manner as in step d.
  • the second PCR for this diagnosis was performed with one or both of the primers used in step c, and the primers used in step c. Use a primer located on the inside.
  • primer located inside refers to a primer used in the first PCR within a specific region of the HCV genomic defined by the primer used in the first PCR.
  • a primer that corresponds to a part located inside the immersion refers to a primer used in the first PCR within a specific region of the HCV genomic defined by the primer used in the first PCR.
  • the primer for the plus-strand amplification is located in the HCV genome within the region defined by the two primers used in the first PCR.
  • a primer corresponding to a site downstream (3 'side) of the site corresponding to the primer for primer amplification used in the first PCR can be used for the second PCR.
  • the primer for minus strand amplification is located in the HCV genome within the region defined by the two primers used in the first PCR.
  • a primer corresponding to a site located upstream (3 ′ side) of the site corresponding to the primer for negative-chain amplification used in the first PCR can be used for the second PCR. Wear .
  • the first primer for the second PCR for example, the first
  • the combination of HCV 1 and HCV 4 is used in P'CR, the combination of primers 1 and 3 or the combination of primers HCV 26 and When the combination is used, the combination of the primer HCV32 and 2 can be used. Note that the relationship between these The relationship is shown in Fig. 2.
  • the detection rate can be increased by performing the second PCR using a primer corresponding to a specific site further inside the HCV genome than that used in the first PCR. This is possible.
  • the primer used in step c may be an isolated nucleotide fragment or epitope of a specific length at a specific site from the HCV genomic from the previous patient.
  • primers for obtaining isolated nucleotide fragments having a sequence encoding a trap base sequences arbitrarily designed irrespective of HCV genomics
  • a variety of oligonucleotides are synthesized, and the oligonucleotides from which cDNA can be amplified by desired PCR can be selected from the synthesized oligonucleotides. You may get what you get.
  • oligonucleotides arbitrarily designed irrespective of the HCV genomic and obtained from the aforementioned HCV genomics derived from the patient It can also be used as a primer for PCR when preparing isolated nucleotide fragments having the sequence to be read.
  • the above-mentioned step d is, for example, a method of analyzing and detecting a nucleotide having a characteristic length of HCV and having a specific length and serving as an indicator of the presence of HCV by electrophoresis or the like, or Using a probe that can be hybridized with an array that is an indicator of the presence of a protein, the equilibration method, etc. It can be done by using.
  • nucleotide having a sequence and length characteristic of hepatitis C virus detected by a method using electrophoresis or the like a specific portion of the genome of the hepatitis C virus may be used.
  • DNA or RNA containing all or a part of a nucleotide sequence of a specific length can be used. For example, as shown in FIG. 1 and FIG. 1 bp, 3336 bp, 2225 bp, 195 bp, 162 bp cDNA and the like can be used.
  • the probe used in the method using the hybridisation method also contains a nucleotide sequence of a specific length in a specific portion of the genomic virus of hepatitis C virus. DNA or RNA containing all or part of the nucleotide sequence can be used.
  • all of the sequences in FIG. 1 or partially selected from these sequences can be selectively neutralized with HCV-derived cDNA from a sample.
  • a sequence capable of detecting HCV can be used.
  • cDNA prepared from RNA from a sample patient and all or all of a nucleotide sequence containing a nucleotide sequence of a specific length in a specific portion of the genomic virus of hepatitis C virus For example, by detecting the presence or absence of DNA or RNA containing a part of DNA or RNA, for example, the diagnosis of hepatitis C patients and the subtype of HCV infection can be tested. it can . In this subtype test, the probe used for the detection using the above-described neutralization is also used as a probe specific to the sub evening. You can select and use the one that gives you the redirection. Also useful is a method in which cDNA amplified by PCR is treated with various restriction enzymes, and then DNA fragments separated by electrophoresis or the like are analyzed.
  • the expressed protein was attached to a carrier consisting of plastic, glass, etc., and was induced in HCV-infected patients by an agglutination method, ELISA, RIA, or other analytical method. Antibodies can be detected and measured.
  • the expressed protein may be used as a mouse, rat, nose, musta, mormot, porcelain, goat, sheep, porcelain, or porcine. Immunizing monkeys, etc., to produce monoclonal and polyclonal antibodies against the protein, and then to use these antibodies in plastics and glasses.
  • the protein antigens in the blood of HCV-infected patients, liver tissues, etc. can be detected and measured by analysis methods such as ELISA and RIA by adsorbing them on a carrier made of such as. And can .
  • End code HCV 1 and HCV 4 are the same as the cDNAs described below. It was also used for width. These primers are the RNA polymerase region of the base sequence of the HCV gene, which is proposed by Houghton et al., And are relatively amino acid codons. The amino acid sequence region of low use was selected and designed so that it would be convenient for cloning to the vector using EcoRI and BamHI after amplification by PCR. The nucleotide sequence differs from the nucleotide sequence disclosed by J. et al. In the cDNA, HCV4 present on the 3 ′ side was used not only for amplification of cDNA but also for cDNA synthesis shown in (3) below.
  • each of the primers (HCV 11, 21, 22, 23, 24, 25, 26, each having the above-mentioned sequence by a known method, respectively) is used. 27, 28, Primers 1, 2, 3, 11, 12, 21, 31, 8, ® and ⁇ ) were also synthesized.
  • a DNA Thermal Cycler from Perkin Elmer Cetus was used for this PCR.
  • the amplification conditions were as follows.
  • This PCR can be carried out in the same container continuously after the completion of the reverse transcription reaction described in the above (3).
  • the electrophoresis was performed in a system containing no urea and using a TBE swimming buffer. This electrophoresis is hereinafter referred to as Native PAGE.
  • Electrophoresis was performed on an 8% polyacrylamide gel (containing 6 M urea), and the gel was dried and exposed to room temperature for 2 days.
  • [(A / G) indicates that it is A or G, and may be a mixture of A and G. * Corresponds to base number 6405.
  • the primers 5 '6081 and 5' having the following sequences were used. out 3
  • cDNA was amplified to prepare a PCR product, and the sequence was determined in the same manner as described above.
  • a primer 3′7 having HCV1 and the following sequence corresponding to the sequence downstream of the portion corresponding to HCV4 in the HCV genome Using 130, amplify the cDNA according to the method described in the above (3) to (6) to prepare a PCR product, and further, The sequence was determined as follows. Primer 3 '7 1 3 0
  • the starting material was a 5776 bp DNA fragment which was widened by using the primer HCV1 and the primer 3 ′ 7130.
  • a second PCR was performed using HCV 5'exp and 3'7130 in order to express the peptide encoded by the 5776 bp DNA in E. coli.
  • a vector pET8C with a T7 promoter was used.
  • This PET8C has a restriction enzyme BamHI cleavage site downstream of the initiation codon as shown below.
  • a part of the obtained reaction product is introduced into Escherichia coli, cultivated, and subjected to a colony-free hybridization method using HCV 5 'exp as a probe.
  • the selected plastic PET 8C-1 was selected.
  • G ly Arg lie Met Gly Phe Ser Ty r Asp Thr Arg GGT CGG ATC ATG GGG TTC TCG TAT GAT ACC CGC
  • the BL21 strain has the T7 phage RNA polymerase gene under the control of the lacUV5 promoter in the genome.
  • the clone BL211-CPT1 obtained by the above operation (b) was added to 20 ml of 2XYT medium (0.32 g of noctotripton, yeast).
  • the extract was cultured with 0.2 g of extract (NaCJg 0.1 lg), and when the D of the culture broth at 600 nm was 0.2, 1/3 of isopropyl was obtained.
  • D Chlorogalactosylanoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM, and the culture was continued for another 4 hours.
  • the cells were collected (wet cell weight 20 mg), washed with 50 mM Tris ⁇ Cl, 50 mM NaCl, pH 8 and 2 ml, and the obtained cells were washed with 700 JS Treated with 10% sucrose, 10 mM tris-HCJG (pH 8.0), 5 mM EDTA, 20) Ug lysozyme solution at 4 for 30 minutes, and updated. Ultrasonic treatment was performed.
  • the mixture was centrifuged at 20,000 X g for 10 minutes, separated into a supernatant fraction and a precipitate fraction, and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. It was confirmed that a large amount of protein was contained in the sediment fraction in clones containing HCV-T.
  • the total weight of the obtained proteins was 2 mg in wet weight, 90% of which was a protein corresponding to HCV-derived 5776 bp nucleotide. .
  • the precipitate obtained is solubilized in a 1 m ⁇ solution of urea (8 ⁇ urea, 5%
  • PVDF manufactured by Millipore
  • the 22k dalton peptide is estimated to be a degradation product of the 25k dalton peptide.
  • each of the PCR products obtained in the above section (5) from each of the plasmas to which HCV-T and HCV-KU had been given was used individually, and digoxigenin-dUTP (Beringer gas) was used under the following reaction conditions. Amplification was performed by labeling with DNA labeling and detection kit (manufactured by Mandom Corporation).
  • composition of the amplification solution
  • the reaction product after the amplification reaction is recovered by precipitation in ethanol, and further dissolved in a small amount of TE buffer. After passing through a column, about 500 ng of a digoxigenin-labeled PCR fragment was obtained.
  • Each of the obtained 150 PCR products was slot-blotted onto a Pall biodyne nylon filter. Prepare two copies of the same, and separately hybridize each of the PCR products obtained in the above (5) from each plasma to which HCV-T and HCV-KU have been given. I let you go.
  • Neubridization is 50% home amide, 2 hours running at 5 XSSC, and then filtering is done at 65 ° C. Then, the plate was washed twice with 0.1 XSSC for 15 minutes, and developed with alkaline phosphatase according to the kit's manual.
  • HCV-T and nouribize As a result, 13 out of 19 cases showed HCV-T and nouribize, and 6 cases showed HCV-KU and nouribize.
  • HCV - was also T and the hive Li Da I's of the the K type, HCV - KU and Roh ⁇ Yi Breakfast was also re-da I's of was the K 2 type.
  • Throttle blot noise reduction in item (a) above was performed on a large number of patients with hepatitis C, and 37 types of K1 and 12 types of K2 were selected. And from each example
  • a PCR product is prepared according to the method described in (1) to (4), and a sample obtained by diluting it by 10 times, or these PCR products are further subjected to the method described in (5) above.
  • the purified DNA sample obtained by the purification was subjected to PCR using HCV1 and HCV4 as primers to amplify a fragment of 401 bp. ⁇ Width reaction was 10 X PCR buffer 20) «C, 2 mM dNTPs 20 £, HCV 140 pmo 1, HCV 44 pmol, 4 units of Taq DNA polymerase and Samples (distilled water was added to a 10-fold dilution of the PCR product with distilled water to make 200 ⁇ m), or purified water was added to distilled D ⁇ ⁇ sample to make 200 ⁇ J. ), And the amplification conditions are as described in (6) above.
  • reaction solution after the amplification of the sample obtained from each example by the above operation was subjected to ethanol precipitation,
  • the precipitate is collected and dissolved in 10 ⁇ £ of TE buffer, and 3 ⁇ l of the solution is collected and used for digestion with Alul, Sau96I and AccII, respectively.
  • These digestion reactions were performed in a reaction solution of 20 ⁇ ⁇ , and 5 ⁇ l thereof was used for analysis by polyacrylamide electrophoresis. The results of the treatment with each restriction enzyme are shown below.
  • the K2 type also has two turns, eight turns (A luk 2 — 1) giving a single band of 369 bp, and two turns of 261, bp and 140 bp. Notation (A luk 2-2), notation (A 1 uk 2-3) giving a single node of 401, and 270 bp and 99 bp
  • Four types of RFLP patterns (A 1 uk 2-4), which give two of these two patterns, were obtained, and as shown in Table 1, all of the 12 types of RFLP patterns were obtained. Turns were classified.
  • each subtype-specific RFLP pattern shown in Table 2 was obtained.
  • Table 4 shows the results of base sequence analysis and classification by slot blot noise reduction and RFLP in all examples.
  • the 5 'untranslated region 24 bp fragment was similarly amplified by PCR and cut with HaeII. Both had one cleavage site.
  • the cleavage at this sample of S au 3 A but one case has shown a similar path Turn-down and K i-type, an example was shown of the type 2 K.
  • RFLP analysis was use Rere the S au 3 A and H aem, the type, K 2 type, Ru effective der to [rho T-type classification.
  • RNAs from various patients such as chronic hepatitis C patients and cirrhosis patients, were extracted and analyzed in the above (3) and (3).
  • the antibody diagnosis was carried out in accordance with the method proposed by Houghton in the section of the prior art.
  • Table 8 shows the results for the positive (P) sample for the 401 bp fragment
  • Table 9 shows the test for the negative (N) sample for the 401 bp fragment. The results at are shown.
  • Sample Nos. 29, 128, 146 and 331 are alcoholic liver disease patients, 401 is hepatitis B patients, and 190 is drug-induced liver disease. Patients with disabilities and others are chronic hepatitis C patients.
  • the total number of specimens for which 401 bpc DNA fragments amplified by the combination of HCV 1 primer and HCV 4 primer could be detected was counted.
  • the ratio was 0 to 10 in patients with hepatitis B, 0/10 in patients with alcoholic liver disease, and 1Z10 in patients with normal liver function.
  • the detection rates were high as shown in Table 7.
  • RT PCR—Detection of HCV by the PCR method After the PCR (1st PCR) in section (a) above, the HCV is also higher than the primer used in the 1st PCR.
  • the detection rate can be expected to be improved by performing the second PCR for diagnosis using primers corresponding to specific sites inside the genome.
  • PCR using various combinations of primers can achieve the same or better results as described above. You can also get diagnostic results.
  • the DNA diagnostic method of the present invention has high sensitivity and good reproducibility, and HCV-K! Type and HCV - can in the detection of K 2 type of both the Thailand-flops, the advantage cormorants have If you provide the data you Do not complement it Let's have and show a positive also for the negative examples in or antibody diagnosis It was clear that they had.
  • HCV hepatitis C virus
  • the detection and diagnosis of a DNA fragment of a specific length at a specific site in the HCV genomic or a DNA fragment encoding the epitope is considered to It has been clarified that it is useful for finding and diagnosing patients with acute hepatitis who have not yet produced such antibodies. This may be due to the success of treatment with antiviral agents such as interferon during the early stages of hepatitis or during the course of the disease.
  • antiviral agents such as interferon during the early stages of hepatitis or during the course of the disease.
  • As a method for monitoring the presence or absence of a marker it indicates that the reverse transcription-PCR method of the HCV genomic fragment according to the present invention is useful.
  • the HCV screening of blood donation for transfusion is not only performed by antibody test, but also by RNA fragment, DNA fragment or evening fragment derived from HCV infection of the present invention. It is suggested that simultaneous testing of protein antigens is also essential. References to deposited microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書 肝炎ウ ィ ルス診断薬 技 術 分 野
本発明 は 、 ウ ィ ルス 性肝炎を 引 き 起す肝炎 ウ ィ ル ス 、 特に C 型肝炎ウ ィ ルス （以下 H C V と 略称す る ） の感染診断 に有用 な診断薬、 診断方法等に関す る 。 背 景 技 術
肝炎 ウ ィ ルス は、 A型、 B 型、 C型、 D 型、 E型が あ り 、 こ れ ら の ウ ィ ルスの う ち、 B 型及び C型 （ H C V ) は慢性肝炎、 肝硬変及び肝癌な どの重篤な肝病変 を 引 き 起す も のであ る 。
B 型肝炎 について は、 多 く の研究がなさ れ、 B 型肝 炎 ウ ィ ルスの分離、 B 型肝炎ウ ィ ルスゲノ ムのク ロ ー ニ ン グ、 B 型肝炎ウ ィ ルス抗原タ ンパ ク質の生産がな さ れ、 ウ ィ ルス タ ンパ ク質に対す る抗体診断法や抗原 診断法 も 確立 し 、 ワ ク チ ン も 生産さ れ る に至 っ て い る 。
こ れに対 し 、 C型肝炎について も その診断法、 予防 法の確立が急務 と な っ て い る に も かかわ らず、 H C V につ いて の研究や、 H C V の感染を検出 . 診断す る方 法の開発は、 立ち遅れて い たのが現状であ り 、 H C V 感染を検出 ♦ 診断する方法及び診断薬はごく 最近まで 存在しなかっ た。
H C V に関 しては、 最近になって、 ホー ト ン （Hough ton)らが、 ヨ ーロ ッ パ特許公開 EP 0318216A1号公報及 び PCT W0 89 / 04669 号公報に、 H C Vのゲノ ムの塩 基配列、 H C V感染の診断薬及びこれに対する ヮ クチ ンを開示し た。
―方、 有馬 ら [ Gastroenterologia Japonica, 24 ( 5 ) 、 540〜 544 (1989) 、 及び Gastroentero logia Japonica, 24 (5) , 545 ~ 548 (1989) ] は、 H C Vゲノ ム の部分塩基配列を示し、 H C V感染の診断法と診断 結果を開示している。
と こ ろ が、 上述のホー ト ン らによ る抗体診断法及び 有馬 ら によ る抗体診断法については、 C型慢性肝炎患 者の 1 0 0 %近く を検出する までには至っ ていない。 ま た、 H C V に対する抗体の存在と H C Vの感染状態 と の 関連性 は ま だ 明確 に さ れて い な い 。 そ し て 、 H C V感染で生じ る抗体を検出 して診断する方法 （抗 体診断） は、 抗体がま だ産生されていない急性肝炎患 者の診断には役立たないなどの問題点が指摘されてい る 。 発 明 の 開 示
本発明は、 C型肝炎における上述のよ う な従来技術 の現状 に鑑み、 C型肝炎の診断や予防に関す る新たな 技術を提供すべ く なさ れた も のであ り 、 以下の 目 的を 有す る 。
本発明の 目 的は、 C型肝炎の診断や予防に関す る新 た な技術の提供に有用であ り 、 5 ' 非翻訳領域、 ま た は H C V ゲノ ムの構造領域も し く は非構造領域の遺伝 子産物のェ ピ ト ープを コ 一 ド す る部分を含む塩基配列 を有す る 、 分離精製された、 あ る いは組換え られたヌ ク レ オ チ ド 断片を提供す る こ と にあ る 。
本発明 の他の 目 的は、 該ヌ ク レオチ ド 断片の分離精 製方法を提供す る こ と にあ る 。
本発明 の他の 目 的は、 該ヌ ク レオチ ド 断片の製造法 を提供す る こ と にあ る 。
本発明 の他の 目 的は、 該ヌ ク レオチ ド 断片を含む組 換えベ ク タ ー及び該組換えベク ターを大腸菌、 酵母等 の宿主で発現させて得 られる H C V ゲノ ムの構造領域 も し く は非構造領域の遺伝子産物のェ ピ ト ーブを有す る べプチ ド を提供す る こ と にあ る 。
本発明 の他の 目 的は H C Vェ ピ ト ープを有す る ぺプ チ ド を用 い た C型肝炎用 ワ ク チ ン を提供す る こ と にあ る 。
本発明 の他の 目 的は、 患者検体か ら R N A を抽出、 分離 し 、 該 R N Aか ら c D N A を合成 し た後、 H C V 由来のゲノ ム に対応す る一部の塩基配列を有す る 、 あ る いは一部塩基を変換した D N A配列をォ リ ゴヌ ク レ ォチ ド ブラ イ マーと して用いて P C R法を行レヽ、 特定 の D N A断片を増幅合成させ、 必要に応じて制限酵素 で処理し た後、 電気泳動等によ り 分画し、 特定の長さ の D N A を検出し、 H C V感染を診断する方法および 該ォ リ ゴヌ ク レオチ ドプライ マ一を含む診断薬を提供 する こ と にある。
本発明の他の目的は、 H C Vゲノ ム中の特定の箇所 の特定の長さの塩基配列、 ま たはその一部を変換した 配列を有する ヌ ク レオチ ド断片をプローブ （ D N A ま たは R N A ) と して含む H C Vの存在を検出する診断 薬を提供する こ と にある。
本発明の他の目的は、 H C Vゲノ ムの構造領域も し く は非構造領域の遺伝子産物のェピ トープを有するぺ プチ ド を有効成分と して含有する H C V に対する抗体 を検出する ための診断薬を提供する こ と にある。
本発明の他の目的は、 H C Vのェピ トープを有する ぺプチ ド に対する抗体および該抗体を生産する方法、 な らびに該抗体を含む H C Vの存在を検出する ための 診断薬を提供する こ と にある 。
本発明者らは、 上記目的の達成のために、 まず、 曰 本における輸血後慢性肝炎患者保有の H C Vゲノ ム中 に ホー 卜 ン ら に よ っ て 開示さ れた も の と かな り 異な る 、 H C V に特異的な塩基配列の存在を推定した。 ま た、 本発明者 ら は、 急性肝炎ま で診断で き る方法 を確立す る に は、 抗体診断を補完す る か、 よ り 直接的 な抗原を検出 して診断す る方法 （抗原診断） あ る いは ウ ィ ルスゲノ ムを検出 し て診断す る方法 （ ウ ィ ルスゲ ノ ム 診 断 ） 、 特 に H C V 由 来 の D N A ( あ る い は R N A ) を 検 出 し て 診 断 す る 方法 （ D N A ま た は R N A診断） が必須であ る と考え た。
そ こ で、 本発明者 らは、 慢性肝炎患者な どの血清や 血漿か ら ウ ィ ルス を抽出 し た後、 抽出 し た ゥ イ リレスの R N A に対す る c D N Aを作製 し た。
そ し て 、 そ の一部の塩基配列を決定 し た と こ ろ 、 C 型肝炎患者の血清 由来の H C V の R N A に 、 上述の ホー ト ン ら に よ っ て開示さ れた ウ ィ ルスゲノ ム R N A と 同一場所の塩基配列が異な る も のが少な く と も 2 種 類存在す る こ と 、 ま たそれぞれの種類に属す る塩基配 列 は患者間でわずかずつ変異 して い る こ と が明 らか と な っ た。
多 く の患者血清で、 本発明者 らが最初に決定 し た塩 基配列の一部の、 H C V由来の 2種の 4 0 1 塩基対 （ b p ) の ヌ ク レオチ ド か ら な る c D N A断片をプロ一 ブ と し て ノ\イ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ン テス ト を実施 し た と こ ろ 、 ほ と ん ど全ての C型慢性肝炎患者の血清 R N A か ら調製さ れた c D N Aがこ の 2 種のプロ ーブ と ノ\ィ ブ リ ダィ ズす る こ と が確認さ れた。 こ の 2 種の ヌ ク レ ォチ ド配列を H C V — T、 H C V — K U と した。
本発明者らは、 更に他の多く の慢性肝炎患者血清等 の R N A を も と に c D N Aを作製し、 ベク ターへの組 み込み、 P C Rな どの増幅操作を行っ た上で、 多数例 の塩基配列を決定した。
ま た、 上記ヌ ク レオチ ド プローブの 5 ' 末端部分及 び 3 ' 末端部分の一定の長さのヌ ク レオチ ド断片をプ ラ イ マー （ H C V 1 、 H C V 4 など） と して各患者血 清 R N A 由来の c D N Aを増幅し、 しかる後、 電気泳 動を行レヽ 4 0 1 b p のヌ ク レオチ ド断片 （ c D N A断 片） のバ ン ド を検出す る こ と に よ っ て患者血清中の H C Vの存在を診断した と こ ろ、 C型肝炎患者では高 頻度に H C Vの感染が確認された。
更 に 、 本発明者 ら は 多数 の患者の H C V 由来の c D N Aの塩基配列を相互に比較検討し、 共通性の高 い部分の塩基配列を含むォ リ ゴヌ ク レオチ ド を他のプ ラ イ マー と して合成し、 上記と 同様に、 個々 の患者由 来 の R N A を 該 プ ラ イ マ ー を 用 い て 逆転写 し て c D N A を作製し た上、 P C R法で増幅し、 更に電気 泳動を行い H C Vの存在を示し得る一定の長さのヌ ク レオチ ド のバン ド を検出する操作を行い、 H C Vの存 在の有無を診断し た。
こ のよ う に して、 各種のオ リ ゴヌ ク レオチ ド プライ マ一間の逆転写および c D N Aの増幅能力の比較、 前 述のホー 卜 ン らの開示 し た抗体診断法 と の相互比較を 行っ た。
ま た、 患者検体 と して は、 慢性肝炎患者、 アルコ ー ル性肝炎患者、 肝硬変患者、 肝癌患者な どの血清、 血 漿、 肝臓組織等よ り 抽出 · 分離さ れた R N Aを用 い、 逆転写お よ び P C R を行い測定可能な量の c D N Aを 調製 し た。
本発明者 ら は、 こ れ らの知見を も と に本発明 を完成 す る に至っ た。
本発明 に よ れば、 R N A ゥ イ リレスであ る H C V由来 のゲノ ム に対応す る D N A配列を含む D N A断片、 該 D N A断片を含む組換え体プラ ス ミ ド 、 該組換え体ブ ラ ス ミ ド に よ り 形質転換 し た宿主細胞、 該形質転換細 胞を培養す る こ と に よ る H C Vェ ピ ト ープを有す る ぺ プチ ド の製造方法及び該ぺプチ ド の精製方法を提供す る こ と がで き る 。
ま た、 該ペプチ ド を含む、 H C V に対す る抗体、 特 に患者の血清等に含ま れる H C V に対す る抗体、 すな わ ち H C Vゲ ノ ムの構造領域遺伝子産物も し く は H C V患者の肝臓内で造 られる H C Vゲノ ムの N S — 5領 域が コ 一 ド す る R N Aポ リ メ ラ ーゼに対す る抗体の検 出用 の診断を提供す る こ と がで き る 。
更に 、 該ペプチ ド は、 H C V用 ワ ク チ ン の成分 と し て 有用 で あ る 。 ま た該ペプチ ド に対す る 抗体を生産 し 、 得 られた抗体を用いて、 H C V に 由来す る タ ンパ ク 質抗原を検出する ための診断薬、 抗 H C V剤を提供 す る こ と がで き る 。
ま た、 本発明 に よれば、 患者検体か ら抽出、 分離 し た R N Aか ら調製 し た c D N Aを P C Rにかけ、 電気 泳動に よ る 分画に よ っ て、 H C Vの存在の有無の指標 と な る 特定配列の特定の長さ の c D N Aの增幅を検出 す る こ と に よ る H C V感染の診断法を提供す る こ と が で き る 。
ま た、 患者検体か ら抽出、 分離 し た R N Aか ら調製 し た c D N Aを P C R にかけ、 H C Vの存在の有無の 指標 と な る配列を有する c D N Aの增幅を、 該指標 c D N A と 選択的にハイ ブ リ ダィ ズす る プロ ーブを用 レヽ た八イ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ン に よ っ て検出する過程を有 す る H C Vの検出及び H C V感染の診断方法を提供す る こ と がで き る 。
なお、 上記 P C R を利用す る診断方法におけ る逆転 写用 プラ イ マー、 P C R用ブラ イ マー と し て用 レヽ う る ヌ ク レオ チ ド 断片は、 該診断方法に用 い る診断薬 と し て有用 であ る 。
更に 、 上記プロ ーブ （ R N A ま たは D N A ) も上記 ノ\イ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン を利用す る診断方法に用 い る 診断薬 と し て有用である 。 図面の簡単な説明
第 1 図 （ A ) 〜 （ I ) は 7名の患者由来 H C Vゲノ ム及びホー ト ン らが開示し た H C Vプロ 卜 タイ プの一 部の塩基配列及びア ミ ノ 酸配列の比較図であ る 。 な お、 7 名 の患者か ら の配列 （ H C V — I 、 H C V - T 、 H C V - K A 、 H C V - K U 、 H C V - M 、 H C V — Y及び H C V — N ) については、 H C Vプロ ト タ イ プと異なる部分のみを示す。 ま た、 ア ンダーラ ィ ン を引いた部分は表示の各プライ マーに対応し た部 分を示す。
第 1 図 （ A ) 及び （ B ) は、 塩基番号 6 1 1 0 から 6 5 5 7 の塩基配列を示す。 第 1 図 （ C ) 〜 （ G ) は、 塩基番号 6 5 5 6 か ら 6 9 5 6 の塩基配列を示 し、 プラ イ マー H C V 4 と H C V 1 によっ て增幅され る 4 0 1 b p に相当す る 。 第 1 図 （ H ) は塩基番号 6 9 5 7 〜 7 1 0 0 の配列を示す。 第 1 図 （ I ) は 5 ' 非翻訳領域の塩基配列 を示 し 、 H C V — I 、 H C V — K U及び H C V — N については H C V — T と 異なる部分のみ示す。
なお、 これらの塩基番号は、 先に挙げたホー ト ン （H oughton)ら に よ っ て開示された H C Vゲノ ムの塩基配 列 （ プロ ト タ イ プ ： P T ) におけ る も のであ る 。 ま た、 ア ミ ノ 酸残基は以下の各アルフ ァベッ ト で表わ し た。 A Al 1 Λ . n —
： a し ： u s U ： As ∑L . U丄 U
F ： P he Lr ： ϋ 1 ττ . His T T 1 Λ
丄 ： 丄丄 e
： L y s Τ
匕 ： Leu Μ ： Me i\ ： A s n r ： r Γ 0 Q ： Gin R ： A r g · 0 β Γ
T ： Thr V ： Val W ： Tr p Y ： Tyr
第 2 図は 、 逆転写及び P C R に用いた各プライ マー と対応する部分の H C V — c D A N上の位置を示す。 なお、 プラ イ マ一 H C V 1 の 5 ' 末端の最初の Tに相 当する部分を 0香と した。 発明を実施する ための最良の形態
以下、 上述の多数例の患者由来の H C Vゲノ ムから 特定のゲノ ム部位ある いは特定のェピ 卜一プをコ一 ド する配列を有する単離ヌ ク レオチ ド断片を c D N Aの 形で得る ための方法の一例について述べる。 なお、 ェ ピ 卜 一プを コ ー ドする配列と は、 抗原と して作用 し う る構造を コ ー ドする配列をいう 。
c D N A作製のための H C Vゲノ ム由来の R N A と しては、 C型と診断された肝炎患者、 肝硬変患者、 肝 癌患者等の血清、 血漿、 肝臓組織等よ り抽出 · 分離さ れた ものが利用でき る。
血清や血漿か ら R N A を抽出する方法 と し ては、 公知の各種方法、 例 え ば Chomczynski ら の方法 [ Analytical B i ochem i s t ry、 162、 156、 （ 1987 ) ] 等の方法 が利用 で き る 。
例 え ば、 ま ず、 患者の血清や血漿にポ リ エチ レ ン グ リ コ ールを加え、 低温で適当な時間静置す る 。 その際 の温度 と し て は 0〜 1 0 での範囲で、 時間は 3 0分以 上 3 時間 ま でが好ま し い。
次に、 20 , Q Q Q X g 程度の高速で 1 0 〜 3 0 分間遠心 し 、 精製 し た粒子,状のペ レ ツ 卜 を回収す る 。 こ のペ レ ヅ ト を 、 4Mチオ シ ア ン酸グァニジ ン に溶解さ せ、 得 ら れた溶液に 、 フ エ ノ ール と 、 ク ロ ロ ホノレム一イ ソ ア ミ ルアルコ ール混合液等を加えて抽出す る 。 なお、 フ エ ノ ールは、 pH4. 5 〜 5. 5 の酢酸の アルカ リ 塩等で飽和 さ せて お く 。
得 られた R N Aの抽出液は、 静置後、 20. Q00 X g 程 度の高速で 5 〜 2 0 分間遠心 し 、 そ の水層 を 回収す る 。
回収 し た水層 に エ タ ノ ールな ど の ア ル コ ールを加 え 、 一 8 0 。Cで 5〜 2 0 分間静置 し 、 更に 20, 000 X g 程度の高速で 5 〜 2 0 分間遠心 し て 、 ペ レ ツ 卜 を得 る 。 こ のペ レ ッ ト を 6 0〜 8 0 %のエ タ ノ ールで数回 洗い、 最後 にペ レ ツ ト を水に溶か し て抽出 R N A溶液 と し た 。 こ の抽 出 R N A溶液は一 8 0 °Cで保存で き る 。
次に 、 こ う し て得 られた R N A に、 c D N Aの合成 に必要なデォ キ シ リ ボヌ ク レオチ ド 、 R N A分解酵素 ( リ ボ ヌ ク レ アーゼ、 RNase)阻害剤、 逆転写酵素 （ リ バース 卜 ラ ンス ク リ プターゼ） 及びプラ イ マーを反 応さ せて c D N A を合成する 。
こ の 逆 転 写 用 の プ ラ イ マ 一 と し て は 、 所 望 の c D N Aの合成を可能 と す る ものであれば、 6 m e r あ る い は 7 m e r か らな る ラ ン ダムプラ イ マーを含め 制限な く 利用で き る 。 例え ば、 公知の H C Vゲノ ムの R Ν Αポ リ メ ラ ーゼ領域で、 比較的ア ミ ノ 酸の コ ド ン 使用数の低い ア ミ ノ 酸配列領域を選択 し、 その 3 ' 側 に位置す る特定箇所の特定の長さ の塩基配列 に相補的 なオ リ ゴヌ ク レオチ ド 、 ま たは該塩基配列を逆転写活 性を落さ ぬ範囲内でその一部を変換 して得た配列を有 す る オ リ ゴヌ ク レオチ ド （変換プラ イ マー） を利用で き る 。 なお、 プラ イ マーの合成は、 公知の方法に よ つ て行 う こ と がで き る 。
こ の逆転写用プラ イ マー と して は、 5〜 5 0 m e r のオ リ ゴヌ ク レオチ ド 、 好ま し く は 3 0 m e r前後の ォ リ ゴヌ ク レ オチ ド ま たは短いラ ン ダムプラ イ マーが 利用 で き 、 そ の よ う な もの と して例え ば以下の配列を 有す る も の を挙げる こ と がで き る 。
H C V 4 ：
5 ' GGC GGA ATT CCT GGT CAT AGC CTC CGT GAA3 ' プラ イ マー③ ：
s 'TCG TAG GCT CGC CGC ATC CTC CT 3 ' プラ イ マー ® ：
5 * TCT CAG GTT CCG CTC GTC CTC CT 3 '
プラ イ マー① ：
5 'GGC TCT TAG GTT TCG CGC GTC CTC CT 3 '
プ ラ イ マー② ：
5 'TTC GCT TTC AGA GAT GAC GAC (A/T) AG GTC
GTC3 '
[ (A/T) は、 A ま たは T であ る こ と を示 し、 A であ る も の と 、 T であ る も の と の混合物をプラ イ マー② と し て使用 し て も良い。 ]
ラ ン ダム ブラ イ マー （ N ) 6
ラ ン ダム プラ イ マー （ N ) 7
ま た、 変換プラ イ マー と し て は、 H C V 4 の一部を 変換 し た下記配列を有す る H C V 2 1 、 H C V 2 2 、 プ ラ イ マ ー① を変換 し た プ ラ イ マー⑪、 ⑫、 ブ ラ イ マー②を変換 し たブラ イ マー 21等を挙げる こ と がで き る 。
H C V 2 1 ：
5 ' GGC AGA GTA TCT TAG TAT AG (T/C) (T/C) TC
TGT GAA3 '
H C V 2 2 ：
5 ' GGC AGA ATA CCT AGT TAT AG (T/C). (T/C) TC
TGT GAA3 '
[ (T/C). は、 T ま たは C であ る こ と を示 し 、 T であ る も の と 、 C で あ る も の の 混 合 物 で あ っ て も よ い。 ]
H C V 2 3 ：
5 1 GGC AGA GTA TCT AGT TAT GGC CTC TGT GAA3 '
H C V 2 4
5 ' GGC AGA ATA CCT AGT TAT GGC CTC TGT GAA3
H C V 2 5
5 * GGC AGA GTA TCT AGT CAT GGC CTC TGT GAA3 '
H C V 2 6
5 ' GGC AGA ATA CCT AGT CAT GGC CTC TGT GAA3 '
H C V 2
5 * GGC AGA ATA TCT AGT TAT GGC CTC TGT GAA3
H C V 2 8 ：
5 ' GGC AGA ATA TCT AGT CAT GGC CTC TGT GAA3 ' プラ イ マー⑪ ：
5 ' GGT TCT TAG GTT TCG CGC GTT CTC CT 3 '
プラ イ マー⑫ ：
5 'GGC TTT TAG GTT TCG CGC GTT CTC CT 3 '
プラ イ マ一 21 :
5 'TTC GTT TTC AGA GAT GAC GAC AAG GTT GTC3 '
c D N Aの合成は、 具体的 には、 上記の よ う に して 得た R N A と 5 X M M L V緩衝液、 c D N Aの合成に 必要な dATP、 dCTPな ど の各デォ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド 、 上記の各配列 な ど の逆転写用 プ ラ イ マ一 を混合 し 、 こ れに水を加え、 これを 7 0 °C前後に 2 〜 1 0分 間温め た後、 R N a s e 阻害剤 （例え ば、 プロ メ ガ社 製の も の ） と 逆転写酵素 （例え ば B R L社製の M M L V 由来の も の ） を加えて、 3 7 °Cで 3 0〜 6 0分間反 応さ せ る 。
反応終了後、 得 られた反応混合物 （ c D N Aを含む ) を 1 0 0 でで 3〜 1 0分間処理す る 。 こ の加熱処理 し た反応混合物は、 一 2 0 °Cで保存可能であ る 。
次に 、 上記の反応混合物中の c D N Aを、 例え ば下 記のオ リ ゴヌ ク レオチ ド をポ リ メ ラ ーゼチ ェ イ ン リ ア ク シ ヨ ン ( Polymerase Chain Reaction: P C R ) 用プ ラ イ マ ー と し て 含む P C R 用溶液 に加 え 、 該プ ラ イ マ一 に よ っ て増幅で き る c D N Aの増幅を行な う 。
こ の c D N Aの P C R に よ る増幅は、 上記逆転写反 応 と 同一容器内で、 逆転写反応に連続 し て行な っ て も 良い。
該 P C R用 ブラ イ マー と し て は、 所望の c D N Aの 選択的増幅を可能 と す る も のであれば、 制限な く 利用 で き る 。
例 え ば、 プラ ス鎖増幅用 と して は、 以下の配列を有 す る オ リ ゴヌ ク レオチ ド か ら な る プラ イ マーや、 こ れ ら プラ イ マーの塩基配列をプラ イ マー と し て の機能を 落さ ぬ範囲内でその一部を変換 し た配列を有す る ォ リ ゴヌ ク レ オ チ ド な どが利用で き る 。 プラ ス鎖増幅用 ：
H C V 1 ：
5 ' TGG GGA TCC CGT ATG ATA CCC GCT GCT
TTG A 3 '
プラ イ マー◎ ：
5 'TCA ACC GTC ACT GAG AGA GAC AT 3 '
プラ イ マー③ ：
5 ' TGC GGT TAT TGC CGT TGC CGC GCC AGC GG3 '
H C V 1 1 ： .
5 'TGG GCT TCT CAT ATG ACA CCT GCT GTT
TTG A3 '
プラ イ マー 3 1 :
5 'TGC GGT TAT TGC CGT TGX XGX GCC AGC GG3 '
( X は C ま たは Tであ り 、 3 つの X の う ちの少な く と も 1 つが T であ る 。 ）
なお、 プラ イ マー 3 1 の代表例 と して以下の配列の も の （プラ イ マー 3 2 ) を挙げる こ と がで き る。
ブラ イ マー 3 2 ：
5 "TGC GGT TAT TGC CGT TGT CGC GCC AGC GG3 ' ま た、 マイ ナス鎖増幅用 と し て は先の逆転写用 と し て挙げたプラ イ マーを利用で き る 。 なお、 変換プラ イ マー にお け る 配列の変換は、 P C R 用プラ イ マー と し て の機能を落さ ぬ範囲内で行われる 。 こ の配列変換 と して は、 少な く と も 6塩基ご と に 1 塩基を変換さ せた も のが利用 で き る 。
ま た、 こ れ らの P C R用プラ イ マーは混合 し て利用 す る こ と がで き る 。
こ の よ う に し て第 1 図及び第 2 図に示す H C V 1 と 1^ 〇 ¥ 4 で 增 幅 で き る 4 0 1 （ H C V — T 、 H C V - K U ) 、 プラ イ マー © と 、 ブラ イ マー @ま た は ®で増幅で き る 3 3 6 b ρ 、 プラ イ マ一 3 2 と ブラ イ マ一 H C V 2 6 で増幅で き る 2 2 5 b p 、 プ ラ イ マ ー ③ と プ ラ イ マ 一 ① で 增 幅 で き る 1 9 5 b p の c D N A等を増幅す る こ と がで き る 。 なお、 上述の各 プラ イ マーの各種組合せに応 じ て 、 用 い たプラ イ マー に よ っ て 規定 さ れ た配列及びヌ ク レ オ チ ド 長の各種 c D N Aが増幅さ れる 。
增幅さ れた c D N Aは公知の方法に よ り 分離精製 し て所望の 目 的 に利用で き る 。
以上の操作はそのま ま C型肝炎の診断法に利用で き る 。
す なわ ち 、 本発明の C型肝炎の診断法は、
a ) 患者検体か ら R N A を抽出、 分離す る過程 と 、 b ) 得 ら れ た R N A か ら c D N A を 合 成 す る 過程 と 、
c ) 合成さ れた c D N Aを、 C型肝炎ウ ィ ルス に特徴 的な配列を有す る c D N Aの增幅を可能 と す る プラ イ マーを用 い た P C R (診断用 の第 1 P C R ) にかけ る 過程 と 、
d ) P C R に よ っ て得た反応液中の C型肝炎ウ ィ ルス に特徴的な配列を有する c D N Aの存在の有無を検出 す る 過程 と 、
e ) 過程 d で C型肝炎ウ ィ ルス に特徵的な配列を有す る c D N A の存在が検出 さ れなか っ た反応液に対 し て 、 必要に応 じて、 過程 c で用 いたプラ イ マーよ り も 内側に位置す る プラ イ マーを用 いた第 2 P C R (診断 用 の第 2 P C R ) を行い、 C型肝炎ウ ィ ルスに特徵的 な配列 を有す る c D N Aの存在の有無を検出 す る 過 程、
と を有す る こ と を特徴 と す る 。
なお、 過程 b と過程 c は同一容器内で連続 し て行つ て も良い。
ま た、 過程 e は、 必要に応 じて行われる も ので、 過 程 d にお いて C型肝炎ウ ィ ルス に特徴的な配列を有す る c D N Aが検出さ れなかっ た場合、 過程 c で用 いた プラ イ マーの代わ り に、 こ れ らのプラ イ マーが対応す る H C Vゲノ ムの部分よ り も 内側の特定位置に対応す る プラ イ マーを用 いて第 2 P C Rを行い、 過程 d と 同 様に し て c D N Aの存在の有無を検出.す る 。
こ の診断用 の第 2 P C R は、 過程 c で用 い たプラ イ マーの一方ま たは両方に、 過程 c で用いたプラ イ マー よ り も 内側 に位置す る プラ イ マーを用 いて行 う 。
本発明 に お け る 「 内側 に 位置す る プ ラ イ マー」 と は、 第 1 P C Rで用 いたプラ イ マーで規定さ れる H C Vゲノ ム の特定領域内の、 第 1 P C Rで用 い たプラ イ マー よ り も 内側に位置す る部位に対応す る プラ イ マー を言 う 。
例 え ば 、 プ ラ ス 鎖増 幅 用 プ ラ イ マ ー と し て は 、 H C V ゲ ノ ム の 、 第 1 P C R で用 い た 2 つ の プ ラ イ マーで規定さ れる領域内に位置 し 、 かつ第 1 P C Rで 用 い たプラ ス鎖増幅用プラ イ マー に対応す る部位よ り も下流 （ 3 ' 側） にある部位に対応す る プラ イ マーが 第 2 P C R に利用で き る 。
ま た 、 マ イ ナ ス 鎖増 幅 用 プ ラ イ マ ー と し て は 、 H C V ゲ ノ ム の 、 第 1 P C R で用 レヽ た 2 つ の プ ラ イ マーで規定さ れる領域内に位置 し 、 かつ第 1 P C Rで 用 い たマ イ ナス鎖増幅用プラ イ マーに対応す る部位よ り も上流 （ 3 ' 側） にあ る部位に対応す る プラ イ マー が第 2 P C R に利用で き る 。
第 2 P C R用プラ イ マー と し て は、 た と え ば、 第 1
P' C R で H C V 1 と H C V 4 の組合せを用 いた場合に はプラ イ マー① と ③の組合せを、 あ る いは第 1 P C R でプラ イ マ一 H C V 2 6 と プラ イ マ一 3 2 の組合せを 用 い た場合に はプラ イ マー H C V 3 2 と ②の組合せを 用 い る こ と がで き る 。 なお、 こ れ らのプラ イ マーの関 係を第 2 図 に示 してある 。
こ の よ う に、 第 1 P C Rで用 レヽ た も の よ り も H C V ゲノ ム の更に内側の特定部位に対応す る プライ マーを 用 いて第 2 P C Rを行う こ と で、 検出率を高め る こ と が可能 と な る 。
ま た、 過程 c で用 いる プラ イ マー と し て は、 先の患 者由来の H C Vゲノ ムか らの特定の部位の特定の長さ の単離ヌ ク レオチ ド 断片あ る いはェ ピ 卜 一プを コ一 ド す る 配列を有す る単離ヌ ク レオチ ド 断片を得る ための P C R用 のプラ イ マーの他に、 H C Vゲノ ム に関係な く 任意に設計 し た塩基配列を有す る種々 のォ リ ゴヌ ク レ オ チ ド を合成 し 、 こ れ ら か ら所望の P C R に よ る c D N Aの増幅を可能 と す る オ リ ゴヌ ク レオチ ド を選 択 し て 得 た も の で あ っ て も よ い 。 な お 、 こ の よ う に H C Vゲノ ム に関係な く 任意に設計 して得たォ リ ゴヌ ク レ オ チ ド は前述の患者由来の H C Vゲノ ムか らのェ ピ ト ープを コ ー ド す る配列を有す る単離ヌ ク レオチ ド 断片の調製の際の P C R用プラ イ マー と して も利用で き る 。
上記過程 d は、 例えば、 H C V に特徴的な配列で特 定の長さ の、 H C Vの存在の指標 と な る ヌ ク レオチ ド を電気泳動等で分析、 検出す る方法、 あ る いは H C V の存在の指標 と な る配列 と ハイ ブ リ ダィ ズす る こ と の で き る プロ ーブを用 いたノ、イ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ン法等 を利用 し て行 う こ と がで き る 。
電気泳動等を用 い る方法において検出さ れる C型肝 炎 ウ ィ ルス に特徴的な配列、 長さ のヌ ク レオチ ド と し て は、 C型肝炎ウ ィ ルスのゲノ ムの特定箇所の特定の 長 さ の ヌ ク レ オ チ ド 配列 の 全 部 ま た は 1 部 を 含 む D N Aや R N Aな どが利用で き 、 例え ば、 第 1 図及び 第 2 図 に示 し た 、 4 0 1 b p 、 3 3 6 b p 、 2 2 5 b p 、 1 9 5 b p 、 1 6 2 b p の c D N A等を利用す る こ と がで き る 。
ま た、 ハイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ン を利用す る方法に用 い る プロ ーブ と し て も 、 C型肝炎ウ ィ ルスのゲノ ムの 特定箇所の特定の長さ の塩基配列を含むヌ ク レオチ ド 配列の全部ま たは一部を含む D N Aや R N Aな どを用 い る こ と がで き る 。
例 え ば、 第 1 図の各配列の全部、 あ る いは こ れらか ら部分的 に選択 し た配列で、 検体か らの H C V由来の c D N A と 選択的 にノ\イ ブ リ ダィ ズす る こ と で H C V の検出 を可能 と す る配列が利用で き る 。
ま た、 検体患者か らの R N Aか ら調製 し た c D N A と 、 C型肝炎 ウ ィ ルスのゲノ ムの特定箇所の特定の長 さ の塩基配列 を含むヌ ク レオチ ド 配列の全部ま たは一 部を含む D N Aや R N A と のノ、イ ブ リ ダィ ズの有無を 検出す る こ と に よ っ て、 例え ば、 C型肝炎患者の診断 やそ の感染 H C Vのサブタ イ プを検定で き る 。 こ の サ ブ タ イ プの検定 に も 、 上述のノ\ ィ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン を利用 し た検出 に用 い る プロ ーブでサブ夕 イ ブに特異的なノ\イ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ンが得 られる も の を選択 し て利用する こ と がで き る 。 ま た、 P C R に よ っ て増幅 し た c D N Aを各種の制限酵素に よ っ て処 理 し た後、 電気泳動等で分離 し た D N A断片を解析す る 方法も有用 であ る 。
第 1 図の各配列の c D N Aを適当な発現ベク ターに 組み込み 、 大腸菌等の微生物な ど適当 な宿主 に導入 し 、 そ う し て得 られた形質転換体を培養す る こ と で、 対応 す る H C V 遠伝子 由 来 タ ン パ ク 質 を 発現 で き る 。
発現 し た タ ンパ ク質をプラ スチ ッ ク 、 ガラ ス等か ら な る 担体な ど に は り つけて、 凝集法、 ELISA 、 RIA な どの分析方法に よ り 、 H C V感染患者に惹起された抗 体を検出、 測定す る こ と がで き る 。
ま た 、 こ の発現 さ せ た タ ン パ ク 質をマ ウ ス 、 ラ ッ 卜 、 ノ、 ム ス タ ー 、 モ ルモ ッ ト 、 ゥ サギ、 ャ ギ、 ヒ ッ ジ、 ゥ マ、 ィ ヌ 、 サルな どに免疫 し て、 該タ ンパ質に 対す る モ ノ ク ロ ーナル抗体、 ポ リ ク ロ ーナル抗体を作 製 し 、 し か る のち こ れら抗体をプラ スチ ッ ク 、 ガラ ス 等か ら な る 担体な どに吸着させて 、 ELISA 、 RIA な ど の分析方法に よ り 、 H C V感染患者血中、 肝臓組織等 中 の該 タ ン パ ク 質抗原 を検出 、 測定す る こ と がで き る 。
[実施例 ]
実施例 1
( 1 ) R N A の調製
C型肝炎の種々 の患者か らの血漿をぞれぞれ用 い以 下の操作に供 し た。
血漿 1 m JB に、 3 0 %ポ リ エチ レ ン グ リ コ ール 6000 の 2 5 0 μ を加え、 4 °Cで 1 時間静置さ せ た。
静置後 、 こ の溶液 を 20 , 000 X g で 1 5 分間遠心 し て 、 粒子状のペ レ ツ 卜 を回収 し 、 これを 4 Mチオ シ ァ ン酸グァニ ジ ン 、 2 5 m M ク ェン酸ナ ト リ ウ ム （ p H 7 . 0 ) 、 0 . 5 % サル コ シル （Sarcosyl)及び 1 % /3 — メ ルカ プ ト エタ ノ ールを含む溶液 （ p H 7 . 0 ) の 2 5 0 ju £ に溶解 し た 。 つづレヽ て 、 こ の溶液 に 、 フ エ ノ ール [ 1 0 O m M酢酸ナ 卜 リ ゥ ム （ pH5.2)飽禾ロ ] の 2 0 0 μ £ と 、 ク ロ 口 ホ ルム 一 イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル混合液 （ 容量比、 4 9 ： 1 ) の 4 0 μ と 、 2. 5 Μ酢酸ナ ト リ ウ ム （ ρ Η 5 . 2 ) の 3 0 μ £ と 、 2 m g ノ m Jg 酵母 t R N A の 1 0 μ と を力□え、 3 0 秒間 vo i t e Xで よ く 攪拌 し た後、 4 °Cで 1 5 分間静置 し た。
静置後、 混合液を 20, DOO X g で 1 0 分間遠心 し て、 水層 を回収 し 、 こ れに 5 0 0 μ ·β のエ タ ノ ールを加え て 一 8 0 °C で 1 0 分 間 さ ら に 静置 し た 。 そ の 後 、 20, 000 X g で 1 0 分間遠心 し 、 得 られたペ レ ツ 卜 を 7 0 %エ タ ノ ー ルで 2 回洗浄 し 、 最後 にペ レ ッ ト を 2 0 μ £ の水に溶解させて一 8 0 eCで保存 し た。 ( 2 ) P C R增幅用プラ イ マーの調製 従来の技術の項において挙げたホー 卜 ン ら に よ っ て 開示さ れた H C Vの有す る塩基配列を基に下記の塩基 配列 を有す る オ リ ゴヌ ク レオチ ド を公知の方法を用 い て P C R増幅用プラ イ マ一 と して合成し た。 第 1 P C R用 ； オ リ ゴヌ ク レ オチ ド H C V 1 ( 3 1 m e r )
5 ' TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA3 '
BamH I オ リ ゴヌ ク レオチ ド H C V 4 ( 3 0 m e r )
5 ' GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA3 '
EcoR I 第 2 P C R ( ァ シメ ト リ ッ ク P C R ) 用 ； オ リ ゴヌ ク レオチ ド H C V 5 ' e X p
( 2 4 m e r )
5 ' ATG GGG TTC TCG TAT GAT ACC CGC3 '
開始 コ ド ン オ リ ゴヌ ク レ オチ ド H C V 3 ' e X p
( 2 4 m e r )
5 'TCA GGC GGA GTA CCT GGT CAT AGC3 '
終了 コ ド ン なお 、 H C V 1 、 H C V 4 は、 後述の c D N Aの增 幅用 と し て も利用 し た。 こ れ らのプラ イ マーはホー 卜 ン ら に よ っ て 閧示さ れた H C V遺伝子の有す る塩基配 列の R N A ポ リ メ ラ ーゼ領域で、 比較的ア ミ ノ 酸の コ ド ン使用数の低い ア ミ ノ 酸配列領域を選び、 P C R に よ る 增幅後に EcoR I と BamH I を利用 し たベク ターへの ク ロ ーニン グに便利な よ う に設計 し た も ので、 ホー ト ン ら に よ っ て 開示さ れた塩基配列 と 2 塩基異な る 。 ま た 、 c D N A で は 3 ' 側 に 存在 す る H C V 4 は 、 c D N A の 増 幅 用 の み な ら ず 、 下記 （ 3 ) で 示 す c D N A合成用 と して も用 い た。
更に 、 公知の方法に よ っ て先に挙げた配列をそれぞ れ有す る 各プ ラ イ マ ー （ H C V 1 1 、 2 1 、 2 2 、 2 3 、 2 4 、 2 5 、 2 6 、 2 7 、 2 8 、 プ ラ イ マ ー ①、 ②、 ③、 ⑪、 ⑫、 21、 31、 ⑧、 ®及び © ) も合成 し た。
( 3 ) c D N A の合成
上記 （ 1 ) 項で得 た R N A 水溶液の 1 μ £ 、 5 X MMLV緩衝液 （ 0.25Μ 卜 リ ス 一塩酸、 ρΗ8.3、 0.375Μ塩化 カ リ ウ ム 、 15mM塩化マグネ シ ウ ム、 50mMジチオス レィ ト ー ノレ ） の 1 μ 、 1 OmM N T P s ( d A T P 、 d G T P 、 d C T P 、 d T T P ) 0 . 5 μ £ 及 び H C V 4 の 5 p m o l を水 に力 Π え 、 合計 5 ^ JG に し て 、 こ れを 70°Cで 4分間温め た後、 R N a s e 阻害剤
( プロ メ ガ社製） の 0 . 2 5 /i jg ( 20単位） と 逆転写 酵素 （ B R L社製の M M L V由来のもの） の 0 . 2 5 μ を加えて、 3 7 °Cで 4 5分間反応させた。
次に、 反応液を 1 0 0 °Cで 5分間加熱処理し、 冷却 してか ら、 一 2 0 °Cで保存した。
( 4 ) 第 1 P C R
上記 （ 3 ) 項で得 た反応液の 5 μ £ と 、 1 0 X P C R 緩衝液の 2 . 5 μ と 、 2 m M d N T P s の 2 . 5 μ £ と 、 H C V 1 の 5 p m o l を、 蒸留水に加 え て 全体を 2 5 μ £ と し 、 得 ら れ た溶液 に T a q D N A ポ リ メ ラーゼの 0 . 1 μ £ ( 1 単位） を加え、 更に水分の蒸発を防止す る ため に、 鉱油を 1 滴加え て、 P C R反応に供した。
こ の P C R に は 、 Perkin Elmer Cetus社 の DNA Thermal Cyclerを使用 した。 増幅条件は以下の と お り であっ た。
9 4 °〇 1 分— 3 7 2分— 7 2 °〇 1 分を 2 サィ クル 行なレ、、 続いて 9 4 °C 1 分— 4 0 °C 1 分— 7 2。C 1 分 を 5 0 サイ クル行ない、 最後に 7 2 °C 7分、 反応を行 なっ た後、 反応液を 4 eCに し た。
反応後、 反応液にク ロ 口 ホルム 5 0 / を加えて抽 出処理を行ない、 反応液から鉱油を除去した。
更に、 同様に して H C V 1 、 H C V 4 の代わ り に、 例えばプラ イ マー ©とプライ マ一 @の組合せ、 プライ マー ©とプラ イ マー ®の組合せ、 プライ マー③とプラ イ マー①の組合せ、 ブラ イ マー③ と プラ イ マー②の組 合せ、 H C V 1 と プラ イ マー①の組合せ、 プラ イ マー ◎ と プラ イ マー①の組合せ、 プラ イ マー③ と H C V 4 の組合せ、 プラ イ マー © と H C V 4 の組合せ、 プラ イ マー 3 2 と H C V 2 6 の組合せな どの各種組合せを用 レヽて c D N A の増幅を行っ た。
なお、 こ の P C R は、 上記 （ 3 ) 項の逆転写反応の 完了後連続 し て 同一容器内で行 う こ と も で き る 。
( 5 ) D N A の精製
上記 （ 4 ) 項で H C V 1 と H C V 4 を用 レヽ た P C R を利用 し て得た鉱油除去後の反応液の 7 μ Ά を取 り 、 こ れを 4 % ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲルを用 い た電気泳動 にかけ 、 4 0 1 b p の D N A断片を検出 （ l O O n g 程度） し 、 こ の部分のゲルを切 り 出 し 、 碎 き 、 こ れに 1 0 0 μ £ の T E緩衝液を加え、 時折 り voltexをかけ なが ら D N A を溶出さ せた。
なお、 電気泳動は、 尿素を含ま ない系で、 T B E泳 動用 緩衝液 を 用 い て行 な っ た。 こ の電気泳動 を以下 Native PAGE と レヽ う 。
次 に 、 D N A が溶 け 出 し た T E 緩衝液 （ P C R 産 物） を回収 し 、 一 2 0 °Cで保存 し た。
( 6 ) 第 2 P C R [ ァ シ メ ト リ ッ ク （Asymmetr ic) P C R ]
こ の ァ シメ ト リ ッ ク P C R は、 塩基配列の決定の た めに行なつ た。
以下のプラ イ マーの組合せ A 、 B を個 々 に用 いて P C R を行なっ た。
A ： H C V 5 ' e x p の 4 0 p m o 1 と H C V 3 ' e x p の 4 p m o l
B ： H C V 5 ' e x p の 4 p m o l と H C V 3 ' e x p の 4 0 p m o l
反応液は、 1 ズ ？ 〇 11緩衝液の 1 0 、 2 m Mの d N T P s の 1 0 μ £ 、 プライ マーの組合せ Αま たは B の 4 0 p m o l 、 T a q D N Aポ リ メ ラーゼの 2 単位及び上記 （ 5 ) 項で得た P C R産物の 1 μ £ の混 合物に蒸留水を加えて 1 0 0 μ £ と し たものを使用 し た。
增幅条件は、 9 0 °C 1 分— 4 0 °C 1 分— 7 2 。C 1 分 を 5 0 サイ ク ルに設定し、 増幅は 4 %ポ リ アク リ ルァ ミ ド ゲルの Native PAGE で確認した。
( 7 ) 塩基配列の決定
上記 （ 6 ) 項で得られた各 P C R産物をエタノ ール にそれぞれ沈殿させて回収し、 それらを微量の T E緩 衝液に溶解させた後、 P — 1 0 カ ラ ム （バイ オラ ッ ド 社製 ） に 通 し て 、 未反応の d N T P s が除かれた P C R産物溶液の約 2 0 μ をそれぞれ調製し、 以下 の操作に用いた。
H C V 5 ' e x p と H C V 3 ' e x p のそれぞれ 4 p m o l を用レヽ、 0 . 4 M B q の （ 丫 一 32 P ) A T P ( N E N リ サーチ プロ ダク ツ社製） でそれぞれの 5 * 端を標識し た。
こ の よ う に して得た 32 P標識 H C V 3 ' e x p の 1 P m o 1 と上記第 6項におけるプライ マ一の組合せ A を用 いて得た P C R 産物 1 μ £ (約 l p m o l ) を 3 ' 側か らの配列決定のためにァニールし た。
ま た、 32P標識 H C V 5 ' e x p の l p m o l と上 記第 6 項におけるプライ マーの組合せ B を用いて得た P C R産物 1 μ ·β (約 l p m o l ) を 5 ' 側からの配 列決定のためにァニールした。
以下、 SequenaseTM Kit ( U B S社製） を使用 し、 そ の プロ 卜 コ ールに従っ て塩基配列の決定を行な つ た。
電気泳動は 8 %ポ リ アク リ ルア ミ ドゲル （ 6 M尿素 を含む） で行ない、 ゲルは乾燥させ、 室温に 2 日間露 出させた。
H C V 1 、 H C V 4プライ マ一部分の各患者の塩基 配列を決定す る ために、 H C Vゲ ノ ム における H C V 1 に相当す る部分よ り も上流側の配列に対応する以下 の配列を有するプライ マ一 5 ' 6 4 0 5 と 、 H C V 4 を 用 い て 、 上記 （ 3 ) 〜 （ 6 ) 項 の方法 に従 っ て c D N A を増幅して P C R産物を調製し、 更に上記と 同様に して配列を決定した。 5 ' ATG GGC GTG CGC GTG TGC GAA AA (A/G) ATG
*
GC 3，
[ (A/G) は Aま たは Gであ る こ と を示 し、 Aであ る も の と 、 Gであ る もの と の混合物であ っ て も よ い。 * は 塩基番号 6 4 0 5番目 に対応。 ] ま た、 塩基番号 6 4 0 5 よ り 上流の塩基配列を決定 す る た め に 、 以下 の 配列 を 有 す る プ ラ イ マ 一 5 ' 6 0 8 1 と プ ラ イ マ ー 5 ' o u t 3 を用 い て 、 上記
( 3 ) 〜 （ 6 ) 項の方法に従っ て c D N Aを増幅 し て P C R産物を調製し、 更に上記と 同様に して配列を決 定 し た。
プラ イ マ一 5 ' 6 0 8 1
5 * ATG CAA GTT CTG GAT AGC CAT TAT CAG GA 3 '
*
[ * は塩基番号 6 0 8 1 番目 に対応。 ] プラ イ マー 5 ' o u t 3
5 ' TCA AAG CAG CGG GTG TCA TAT GAG AAC CCC AT 3 ' *
[ * は塩基番号 6 5 8 5番目 に対応。 ] 更に 、 こ れ と は別 に、 H C V 1 と 、 H C Vゲノ ム に お け る H C V 4 に相当す る部分よ り も下流側の配列 に 対応す る 以下の配列を有する プラ イ マー 3 ' 7 1 3 0 を用 いて、 上記 （ 3 ) 〜 ( 6 ) 項の方法に従っ て c D N A を増幅 し て P C R産物を調製 し、 更に上記 と 同様 に し て配列 を決定 し た。 プラ イ マ一 3 ' 7 1 3 0
5 ' TCA GAC TGG AGT GTG TCT TGC TGT (T/G) TC
*
CCA 3 '
[ (T/G) は Tま たは Gであ る こ と を示 し 、 Tであ る も の と 、 Gであ る も の と の混合物であ っ て も よ い。 * は 塩基番号 7 1 3 0番目 に対応。 ] なお、 こ れ らのプラ イ マーが相当す る部位の塩基番 号は、 先に挙げたホ ト ーン ら に よ り 開示さ れた H C V ゲ ノ ム の塩基配列 におけ る番号に相当す る 。 ま た 、 5 ' 非翻訳領域の塩基配列 を決定す る た め に 、 下記配列 を有す る プ ラ イ マ 一 S 5 ' と A S 5 ' を 用 い て 、 上記 （ 3 ) 〜 （ 6 ) 項 の 方法 に 従 っ て c D N A を増幅 して P C R産物を調製 し 、 更に上記 と 同様に し て配列を決定 し た。 プラ イ マー S 5 '
5 'ACT CCA CCA TAG ATC ACT CC 3 ' プラ イ マ一 A S 5 '
5 ' AAC ACT ACT CGG CTA GCA GT 3 ' 以上の操作で、 多数例の異な る患者の血漿よ り 2種 類のプロ ーブに対す る反応性の違いか ら 2 種類の タ イ プの ヌ ク レ オ チ ド配列 （ H C V — T、 H C V — K U ) を有す る c D N Aが得 られた。 各々 の タ イ プに属す る 患者 ご と に ヌ ク レ オ チ ド 配列 は若干ずつ変異 して い た。 代表的な配列を第 1 図に示す。 なお、 H C V - T を代表 と す る サブタイ プ K t 型に含まれる も のの例 と し て 、 H C V — M及び H C V — K A を挙げた。 ま た、 H C V — K U を代表と す る サブタ イ プ K 2 型に含ま れ る も のの例 と して、 H C V — Υ及び H C V — Ν を挙げ た。 先に挙げたホ ト ーン らに よ り 開示さ れた H C Vゲ ノ ム の塩基配列は、 プロ 卜 タ イ プ （ Ρ Τ ) と して併記 し て あ る 。
( 8 ) P C R 産物のク ロ ーニング
( a ) 第 2 P C R
上記 （ 7 ) 項で、 プラ イ マー H C V 1 と プラ イ マー 3 ' 7 1 3 0 を用 レヽて增幅 し た 5 7 6 b p の D N A断 片を出発材料 と し た。
大腸菌で こ の 5 7 6 b p D N A に コ ー ド さ れたぺプ チ ド を 発現 さ せ る た め に H C V 5 ' e x p と 3 ' 7 1 3 0 を用 いて第 2 P C R を行っ た。
反応液は、 1 0 X P C R緩衝液 1 0 μ £ 、 2 m Μ d N T P s 1 0 μ £ 、 H C V 5 ' e x p 4 0 p m o l 、 プラ イ マー 3 ' 7 1 3 0 4 0 p m o 1 T a q D N A ポ リ メ ラ ーゼ 2 単位及び上記 （ 7 ) 項 で、 プラ イ マー H C V 1 と プラ イ マ一 3 ' 7 1 3 0 を 用 い た P C R で得た P C R産物 2 a の混合物に蒸留 水を加えて 1 0 0 £ と し た も のを使用 し た。 増幅条件は、 9 0 °C 1 分— 4 0 °C 1 分— 7 2 °C 1 分 を 4 0 サイ ク ルに設定 し 、 増幅は 4 % ポ リ ア ク リ ルァ ミ ド ゲルの Native PAGE で確認後、 上記 （ 5 ) 項の方 法に し たがっ て D N A を精製 し た。 ( b ) 発現ベ ク ターの構築
T 7 プロ モーターを もつベク ター p E T 8 C を使用 し た。 こ の P E T 8 C は、 以下に示す よ う に開始コ ド ン の 下流 に制限酵素 B a m H I 切断部位を有す る 。
SD Met Ala Ser Met Thr Gly
5 ' ·♦· AAGGAGATATACC ATG GCT AGC ATG ACT GGT
Gly Gin Gin Met Gly Arg I le
GGA CAG CAA ATG GGT CGG ATC CGGCTGCTA ··· 3 '
BamH I なお、 S Dは シ ャ イ ン ダルガーノ 配列を示す。 こ のべ ク タ 一 P E T 8 C を B a m H I で処理 し 、 更 に ク レ ノ ゥ フ ラ グメ ン 卜 で切断末端を平滑化 し 、 線状 ベ ク タ ーを得た。 なお、 こ の処理で得 られた 5 ' 及び 3 ' 末端は以下 の配列 を有 し て い た。
5 '… CAA ATG GGT CGG ATC3 ' 5 ' GAT CCG GCT GCT A ·♦· 3 ' 一方、 上記 （ 8 ) 項の （ a ) で增幅 し た D N A断片 の 0 . 6 /u g を用 い、 ポ リ ヌ ク レオチ ド キナーゼでそ の 5 ' 末端を リ ン酸化 し 、 そ の 0. 1 を用 いて前記 の線状ベ ク タ ー 0.5 β g ヒ のラ イ ゲーシ ョ ン反応を行 つ た。
得 られた反応生成物の一部を大腸菌に導入 して、 培 養 し 、 H C V 5 ' e x p をプローブ と して コ ロ ニーノ\ イ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ン法に よ っ て、 目 的 と す る プラ ス ミ ド P E T 8 C — 1 を選択 し た。
なお、 目 的 と す る ク ローン化遺伝子は、 その 5 ' 及 び 3 ' 側に以下に示す よ う に增幅に用 いた 2 種のブラ ィ マー由来の配列を有 して、 ベク ター中に ク ロ ーニン グさ れて レヽ る こ と を確認 し た。
G ly Arg l ie Met Gly Phe Ser Ty r Asp Thr Arg GGT CGG ATC ATG GGG TTC TCG TAT GAT ACC CGC
(b)
Arg Trp G 1 u Thr A 1 a Arg CGC 目 的 と す る遺伝子 T6G GAA ACA GCA AGA
(c)
His Thr Pro Val Stop
CAC ACT CCA GTC TGA
(a) ： 平滑末端化 し た B a m H I 部位
(b) ： H C V 5 ' e x p 由来
(c) ： プラ イ マー 3 ' 7 1 3 0 由来
さ ら に 、 p E T 8 C — 1 を E c o R V、 B g l ll で 消化後、 得 られた消化物か ら H C V由来 D N Aを含む E c o R V — B g l ll 断片を精製し 、 平滑末端化 して P U C 1 1 8 の P v u II切断部位に挿入 し 、 プラ ス ミ ド C P T 1 を得た。 こ のプラ ス ミ ド C P T 1 を大腸菌 B L 2 1 株に導入 し て ク ロ ー ン B L 2 1 — C P T 1 を 得た。
( c ) 大腸菌に よ る H C Vペプチ ド の生産
B L 2 1 株は 、 ゲ ノ ム 中 に l a c U V 5 プロ モー 夕 一の支配下にあ る T 7 フ ァ ージの R N Aポ リ メ ラ ー ゼ遺伝子を も つ。
そ こ で、 上記 （ b ) の操作で得た ク ロ ーン B L 2 1 一 C P T 1 を 20 m£ の 2 X Y T培地 （ ノ ク 卜 卜 リ プ ト ン 0 . 3 2 g 、 イ ース ト エキス ト ラ ク 卜 0 . 2 g 、 N a C Jg 0 . l g ) で培養 し 、 培養液の 6 0 0 n mにお け る 0 D が 0 . 2 の と き にイ ソ プロ ピル一 /3 — D — チ ォ ガ ラ ク 卜 ビ ラ ノ シ ド （ I P T G ) を最終濃度が 1 m M と な る よ う に培養液に加え、 更に 4時間培養を続 け た。
集菌 （菌体湿重量 2 0 m g ) し 、 5 0 mM T r i s ♦ C l 、 5 0 m M N a C l 、 p H 8 、 2 m l で洗浄 後、 得 られた菌体を 7 0 0 JS の 1 0 % シ ョ 糖、 1 0 m M 卜 リ ス一 H C JG ( p H 8 . 0 ) 、 5 m M EDTA 、 2 0 )U g リ ゾチーム溶液で 4で、 3 0分間処理 し 、 更 に超音波処理を行つ た。
処理後.、 20 , 000 X g で 1 0分間遠心 し 、 上清画分 と 沈殿画分 に分け、 S D S —ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電 気泳動を行 つ た。 H C V — T を有す る ク ローンで大量の タ ンパ ク質が 沈殿画分に含有される こ と が確認された。
こ れ ら ク ロ ーン （ H C V — T を有す る ク ロ ーン、 B L 2 1 - C P T 1 ) は平成 2 年 1 0 月 2 9 日付けでブ タ ぺス ト 条約に基いて通商産業省工業技術院微生物ェ 業術研究所 （茨城県、 つ く ば市東 1 丁目 1 番 3 号、 干 3 0 5 ) に寄託された。 受託番号は F E R M B P — 3 1 4 4 であ る 。
なお、 得 られた全タ ンパ ク質の重量は、 湿重量で 2 m g であ り 、 その う ちの 9 0 %が H C V 由来の 5 7 6 b p ヌ ク レ オチ ド に対応す る蛋白質であっ た。
( d ) H C V ペプチ ド の N末端ア ミ ノ 酸配列の決定 上記 （ 8 ) 項 の （ c ) で 発現 し た タ ン パ ク 質 が H C V 由来であ る こ と は、 以下に示す よ う に N末端 の ァ ミ ノ 酸配列を決定す る こ と で確認し た。
上記 （ 8 ) 項 の （ c ) で 記述 し た 方法 に 従 っ て 2 5 Ο ηι ·β の ス ケ ールで形質転換体を培養後、 集菌 し 、 リ ゾチ ー ム 処理 を行 っ た 。 2 0 m M T r i s * C Ά ( p H 7 . 4 ) を加 え て 2 0 m に メ ス ア ッ プ し 、 P M S F ( フ エ二ルメ チルスルホニルフ リレオ ラ イ ド ） を最終濃度が 1 m M に な る よ う に加えてか ら超音 波処理を行っ た。 処理後、 4 M K C JG を 2 m £ 加 え 、 2 0 , O O O X g で 1 0 分遠心 し、 0 . 4 M K C J2 の l m で洗浄後、 さ ら に 2 0 , O O O X g で 2 〜 3 分遠心 し た。 得 られた沈殿を 1 m ·β の尿素溶液 ( 8 Μ 尿素、 5 % |3 — メ ルカ プ ト エ タ ノ ール、 1 0 m M T r i s · C £ 、 p H 7 . 6 ) に可溶化 し 、 最終 濃度が 5 0 m M と な る よ う に K C を加え、 D E A E S e p h a d e x A — 5 0 のカ ラ ム にかけ た。 吸 着後、 ペプチ ド を 1 0 0 m M〜 8 0 0 m Mの K C JG で 溶出 し た。 溶出後、 各画分の 0 D 26。 、 ◦ D 2 β。 の測 定お よ び S D S — P A G E でペプチ ド の含量を決定 し た 。 バ ン ド は 2 5 k ダル ト ン と 2 2 k ダル ト ン の二 本で あ っ た 。 最 も ペプチ ド の 多 い画分を 1 5 % ァ ク リ ルア ミ ド ゲルを用 い た S D S 電気泳動にかけ た後、 セ ミ ド ラ イ 法で フ ィ ルター （ l m m b i 1 o n
P V D F 、 ミ リ ポ ア社製） に転写させた。
commas ieで 5 分間染色後、 脱色 し 、 風乾後、 ァ ミ ノ 酸分析を行つ た。
N末端ア ミ ノ 酸配列は、 2 5 k ダル ト ン お よび 2 2 k ダル ト ン の ペプチ ド と も に 、 最初 の M e t がはず れ 、 A l a — S e r - M e t — T h r - G l y で あ り 、 塩基配列 か ら 予想 さ れ る ア ミ ノ 酸配列 と 一致 し た 。 なお 、 2 2 k ダル ト ン のペプチ ド は 2 5 k ダル ト ン のぺプチ ド の分解物 と 推定さ れる 。
( 9 ) C 型肝炎患者の分類
( a ) ス ロ ヅ ト ブロ ッ 卜 ノヽイ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン
C 型肝炎患者がどの よ う な型の H C V に感染し て い る かを迅速に調べる ため、 各患者から得た血清 P C R 産物をメ ンブレ ンフ ィ ルタ一上に載せ、 非放射性同位 元素で標識 し たプロ ーブを用 いてハイ ブ リ ダイ ゼー シ ョ ンを以下のよ う に して行なっ た。
まず、 H C V — T及び H C V — K U を与えた各血漿 か ら上記第 （ 5 ) 項で得た P C R産物のそれぞれを 個々 に用いて、 以下の反応条件を用いて digoxigenin- dUTP ( ベー リ ン ガ一マ ン ノヽィ 厶社の D N A ラ ベ リ ン グ 及び検出キ 、ソ 卜 ） で標識して、 増幅を行なっ た。
増幅用溶液の組成 ；
第 （ 5 ) 項で得た P C R産物 ··♦ 1 μ £
P C R緩衝液 ··· 5 μ
2 m M d N T P s - 5 μ £
digoxigenin-dUTP ( 350mM) , dTTP (650 μ ) ,
dATG, dCTP, dGTP (ImM) ·♦♦ 2 . 5 μ JG T a q D N Aポ リ メ ラーゼ … 0 . 3 β β
H C V 5 ' e x p ··· 2 0 ρ m ο 1
H C V 3 e x p ··· 2 0 ρ m ο 1 蒸留水 ···残部
(計 5 0 μ ）
増幅条件 ；
上記第 （ 6 ) 項の （ a ) と 同 じ。
増幅反応後の反応生成物は、 エタ ノ ールに沈殿させ て回収し、 更に微量の T E緩衝液に溶かしてから P — 1 0 カ ラ ム に通 し 、 約 5 0 0 n g の digoxigenin 標識 さ れた P C R断片を得た。
最初 に 1 9 例の C型肝炎患者か ら plasma R N Aを検 体 と し て 抽 出 し 、 抽 出 さ れ た 各 R N A か ら 個 々 に c D N A を合成 し 、 H C V 1 お よ び H C V 4 ブ ラ イ マー と し た P C R に よ り 4 0 1 b p の フ ラ グメ ン ト を 増幅 し た 。 増幅反応条件は上記 （ 4 ) 項 と 同様 と し た。
得 ら れ た P C R 産物の 1 5 0 の そ れぞれを Pall biodyneのナ イ ロ ン フ ィ ルターに slot blot し た。 同 じ も の を 2 枚用意 し 、 H C V — T及び H C V — K Uを 与え た各血漿か ら上記第 （ 5 ) 項で得た P C R産物の それぞれ と 個 々 にハイ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン さ せた。
ノ\イ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ン は 、 5 0 %ホ ル ム ア ミ ド 、 5 X S S C で 2 時間行 な レヽ 、 そ の後フ ィ ル タ 一 は 、 6 5 °C に お レヽ て 、 0 . 1 X S S C で 1 5 分 2 回洗浄 し 、 キ ッ ト の マ 二 ユ ア リレ に従っ て 、 ア ルカ リ 性ホ ス フ ァ タ ーゼで発色さ せた。
そ の結果、 1 9例の う ち 1 3 例が H C V — T と ノヽィ ブ リ ダィ ズを示 し 、 6例が H C V — K U と ノ\ィ ブ リ ダ ィ ズを示 し た。 なお、 H C V — T と ハイ ブ リ ダィ ズ し た も の を K 型 と し 、 H C V — K U と ノ\イ ブ リ ダィ ズ し た も の を K 2 型 と し た。
( b ) 制限酵素消化断片長多形 （ restriction enzyme f r agment length pol morphism 、 R F L P ) 解析
( b — l ) 4 0 1 b p断片の解析
多数の C型肝炎患者に対して上記 （ a ) 項のスロ ッ 卜 ブロ ッ 卜 ノヽイ ブリ ダィ ゼー シ ヨ ンを行い、 3 7例の K 1 型および 1 2例の K 2 型を選択し、 各例から上記
( 1 ) 〜 （ 4 ) 項の記載の方法に従っ て P C R産物を 調製し、 それを 1 0倍希釈し た試料、 またはこれらの P C R産物をさ らに上記 ( 5 ) 項に記載の方法に従つ て精製して得られた精製 D N A試料を、 H C V 1 およ び H C V 4 を プ ラ イ マー と し た P C R に 用 レヽて 、 4 0 1 b p のフ ラグメ ン ト をそれぞれ増幅させた。 增 幅反応は、 1 0 X P C R緩衝液 2 0 ) «C 、 2 m M d N T P s 2 0 £ 、 H C V 1 4 0 p m o 1 、 H C V 4 4 0 p m o l 、 T a q D N Aポ リ メ ラー ゼ 4単位および試料 （ P C R産物の 1 0倍希釈液に蒸 留水 を加 え て 2 0 0 μ と し た も の 、 ま た は精製 D Ν Α試料に蒸留水を加えて 2 0 0 μ JC と し たもの） を含む反応液で行 い 、 増幅条件 は上記 （ 6 ) 項の
( ) と 同様 と した。
さ ら に 、 ア メ リ カ 製の製剤 に よ る 感染者で そ の D N A塩基配列の解析から P T型と判定されている者 一例について も同様の P N A增幅を行っ た。
次に、 上記の操作で各例から得られたサンプルの增 幅後の反応液に対してエタノ ール沈殿処理を行い、 沈 殿物を回収 し て T E緩衝液 1 0 μ £ に溶解さ せ、 そ こ か ら 3 μ ずつを分取 し 、 それぞれ A l u l 、 S a u 9 6 I お よ び A c c II での消化反応に用 い た。 こ れ ら の消化反応は 2 0 μ £ の反応用の溶液中で行い、 その 5 μ を ポ リ ア ク リ ルア ミ ド 電気泳動での解析に用 い た。 各制限酵素での処理の結果を以下に示す。
① A 1 u I で の消化
K ！ 型 の 3 7 例 中 3 5 例 に お レヽ て 2 2 0 b p と 1 2 3 b p のノ ン ド が検出さ れ、 こ の二種のバ ン ド を 与え る R F L Pノ ター ン を A 1 u k 1 と し た。
P T型の例では 2 2 0 b p と 1 8 1 b p にノ Xン ド が 検出 さ れ、 こ の R F L P ノ タ ー ン を A 1 u p t と し た。
ま た、 K 2 型では、 3 6 9 b p の単一バン ド を与え る 八 タ ー ン ( A l u k 2 — 1 ) 、 2 6 1 b p お よ び 1 4 0 b p の 2 つのノ ン ド を与え る ノ タ ー ン （ A l u k 2 - 2 ) 、 4 0 1 の単一ノ ン ド を与え る ノ タ ー ン ( A 1 u k 2 - 3 ) お よ び 2 7 0 b p お よび 9 9 b p の 2 つ のノ、 ン ド を与え る ノ ター ン （ A 1 u k 2 - 4 ) の 4種の R F L Pパ ターン がえ られ、 表 1 に示す よ う に 1 2 例 は全て こ れ らのパ ター ン のいずれかに分類さ れた。
以上の結果か ら 、 A l u l で の R F L P に よ っ て K ！ 型、 K 2 型、 Ρ Τ型の分類お よ びそ のサブタ イ プ の解析が可能であ る こ と が解っ た。
② S a u 9 6 I での消ィヒ
上記①項 と 同様に して電気泳動法に よ っ て得 られた ノ ン ド を解析す る こ と に よ っ て、 表 2 に示すサブタ イ プに 固有の各 R F L Pパ ターン を得た。 表 2 の結果に 示さ れる よ う に、 こ の S a u 9 6 I での R F L P はな かで も K 2 型のサブタ イ プの分類に有効であ る 。
③ A c c II に よ る消化
上記①項 と 同様に して電気泳動法に よ っ て得 られた ノ ン ド を解析する こ と に よ っ て、 表 3 に示すサブタ イ プ に固有の各 R F L Pパ ター ン を得た。 表 3 の結果に 示さ れる よ う に、 こ の A c c II での R F L P は単独で は K i 型 と K 2 型 と を分類す る こ と はで き ないが、 他 の制限酵素を利用 し た R F L P と の併用 によ っ て よ り 確実な分類を行う 上で有用であ る 。
なお、 全て の例におけ る塩基配列の解析、 ス ロ ッ 卜 ブロ ヅ ト ノヽイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ン お よび R F L P での 分類の結果を表 4 に示す。
( b — 2 ) 2 2 5 b p断片の解析
多数の C型肝炎患者に対 して上記 （ a ) 項のス ロ ッ 卜 ブロ ウ ト ノ、イ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン を行レヽ 、 1 3 例の K ！ 型お よ び 1 2例の K 2 型を選択 し、 上記 （ b — 1 ) 項で得 た精製 D N A試料を用 いてプラ イ マー 3 2 お よ び H C V 2 6 を プ ラ イ マ一 と し た P C R に よ っ て 2 2 5 b p の フ ラ グメ ン ト をそれぞれ増幅 し た。 増幅 反応は上記 （ b — 1 ) 項 と 同様 と し た。
さ ら に 、 ア メ リ カ 製 の 製 剤 に よ る 感染者 で そ の D N A塩基配列の解析か ら P T型 と 判定さ れて い る者 一例 につ いて も 同様の D N A増幅を行っ た。
以下 、 制 限酵素 と し て A l u l のみ を 用 い る 以外 は、 上記 （ b — 1 ) 項 と 同様に し て R F L P解析を行 つ た。 そ の結果を表 5 に示す。
さ ら に 、 各例 について上記 （ b — 1 ) 項での 4 0 1 b p で の R F L P 解析 を行い 、 そ の結果か ら 2 2 5 b p での R F L P解析におけ る 分類を推定 し た結果を 表 6 に付記す る 。
以 上 の 結 果 か ら 、 A l u l で の R F L P 解析 は K ！ 、 K 2 、 P Tの分類お よびそ のサブタ イ プの解析 に有効で あ る こ と が解つ た。
表 1
Figure imgf000046_0001
その他のパターン Id ( 2)
表 2
Figure imgf000046_0002
その他のパターン Id ( 1) 、 K2 ( 1) * ： HCV— Κ2 3であり、 塩基配列の解析から K2b型であった。
3
Figure imgf000046_0003
その他のパターン K 2 ( 2) 表 4一 1
Figure imgf000047_0001
**： どの R F L Pパターンにも属していないパターン 表 4一 2
Figure imgf000048_0001
**： どの R F L Pパターンにも属していないパターン 表 5
Figure imgf000049_0001
表 6 検出されるバンド （bp) RF LPパターン サブタイプ（例数）
123、 50及び 44 Alukl-1 Ki (34)
123、 58及び 44 Alukl-2 Ki ( 2)
131 、 50及び 44 Alukl-3 Ki ( 1)
181及び 44 Alupt PT ( 1)
193及び 32 Aluk2-1 K2 ( 2)
140及び 85 Aluk2-2 K2 ( 4)
225 Aluk2-3 K2 ( 3)
99、 94及び 32 Aluk2-4 K2 ( 3) ( b - 3 ) 5 ' 非翻訳領域 2 4 2 b p断片の解析 上記 （ 7 ) 項でのプラ イ マー S 5 ' と A S 5 ' に よ る P C R で增幅さ れた 2 4 2 b p D N A断片に含ま れ る 第 1 図 （ I ) に示 さ れた 、 H C V — T 、 H C V — K U、 H C V — I 、 H C V — Nの 5 ' 非翻訳領域の塩 基配列の結果よ り 、 H a e lEを用 い る と 、 K 2 型に属 す る H C V — K U と H C V — Ν由来の断片のみが切断 さ れる こ と が示された。 なお、 第 1 図 （ I ) の塩基配 列は増幅さ れた 2 4 2 b p断片の内のプラ イ マー に対 応す る 部分 を 除 い た 2 0 2 b p部分の塩基配列 を示 す。
ま た、 S a u 3 Aを用 レヽ る こ と に よ り 、 K i 型に属 す る H C V — Tのみが切断される こ と が示さ れた。
そ こ で さ ら に、 K 型に属す るサン プル 1 2例 にお け る 5 ' 非翻訳領域 2 4 2 b p断片を P C R に よ り 、 前述の方法 に従っ て増幅 し、 S a u 3 Aま たは H a e ΙΠで切断後、 電気泳動 し た と こ ろ 、 いずれも H C V — T と 同様のパ ターン を示 し た。
一方、 K 2 型に属す る サンプル 2 例 について、 同様 に P C R に よ る 5 ' 非翻訳領域 2 4 2 b p断片の増幅 を行い、 H a e ΠΙで切断 し た と こ ろ 、 いずれも 、 少な く と も一か所切断部位を有 し て い た。 こ のサン プルの S a u 3 A で の切断で は、 1 例 が K i 型 と 同様の パ タ ー ン を示 し たが、 一例は K 2 型を示 し た。 以上の よ う に 、 5 ' 非翻訳領域の D N A断片 に対 し 、 S a u 3 A及び H a e m を 用 レヽ た R F L P 解析 は 、 型、 K 2 型、 Ρ Τ型の分類に有効であ る 。
( 1 0 ) 逆転写を行なわない場合の対照試験
上記 （ 3 ) 、 （ 4 ) 、 （ 9 ) 項等において C型肝炎 患者か ら の plasmaR Ν Αを、 逆転写せず P C R を行つ た と こ ろ 、 4 0 1 b p 、 3 7 1 b p 、 3 3 9 b p 、 2 2 5 b p , 1 9 5 b p等の断片の増幅は認め られな か っ た。 従 っ て 、 これらの D N A断片は血中の R N A に 由来 し て い る こ と が確認さ れた。
( 1 1 ) C型肝炎の診断
( ) R T — P C R法に よ る H C Vの検出
検体 と し て C型慢性肝炎患者、 肝硬変患者等、 種々 の患者か ら の R N Aを抽出 し 、 上記第 （ 3 ) 項及び第
( 4 ) 項の c D N Aの調製 と各種プラ イ マ一を用 い た P C R を行な い、 更に第 （ 5 ) 項で行な っ たの と 同様 の Native PAGE を行なレヽ、 ェチ ジ ゥ ムブ口 マイ ド で染 色 し 、 U V ( 3 1 2 n m ) で 4 0 1 b p 、 3 3 6 b p 、 1 9 5 b p 、 3 7 1 b p v 3 6 9 b p 、 3 6 8 b p 、 3 3 9 b p 、 3 3 8 b p 、 2 2 5 b p お よ び
1 6 2 b p の断片の検出 を行な っ た。 そ の結果の代表 例 を表 7 、 8 お よび 9 に示す。 表 7
Figure imgf000052_0001
表 8— 1
(a) (b) (c) 検体番号 401bp 第 1 PCR 笛 2 PCR サザーンブロヅ卜 抗体診断
の検出 1上R U?«dih UnJ
の νン檢 I 'Ψ山' の vン检 I ,山屮' プローブ プライ 一 (^) ブノラノイ Ί 7 λ- ( \¾¾
185 P ρ p
337 P ρ P +
8 P ρ P +
220 P ρ p +
204 P ρ p
29 P ρ P
36 P ρ p +
196 P pw PW +
23 P ρ P +
5 P Ρ P +
472 P Ρ P +
197 P Ρ P +
181 P PW PW +
163 P P P + 丄 O P P
482 P P P
503 P N P N +
596 P N P N + A
12 P P P +
401 P PW P 表 8— 2
(a) (b) (c) 検体番号 401bp 第 IPCR 第 2PCR サザーンブロヅ卜 抗体診断 の検出 225bp 162bp
の検出 の検出 プローブ
プライマ-② ブライマ- @
11 P P PW
37 P P P
9 P N N
10 P P P
14 P P P
46 P P P
59 P P P
28 P P P
56 P P P
128 P P P
224 P P P
228 P P P
368 P P P
468 P P N P
501 P P P
133 N/PPW P P +
442 N/PPW P N PW +
367 N/PPW P P
471 N/PPW P P +
146 N/PPW P P 表 9一 1
Figure imgf000055_0001
表 9— 2
(a) (b) (c) ， - »し=八 検体 401bp 第 IPCR 第 2PCR サザーンブロヅ卜 抗体 断
の検出 225bp 162bp
の検出 の検出 プローブ プライマ-② プライマ- ©
716 N P P P +
718 N PW P PW +
64 N N
190 N N
323 N N
331 N N
332 N N
445 N N
451 N P P P
452 N N
なお、 抗体診断は、 従来技術の項で挙げたホー ト ン ら の閧示 し た方法に従っ て行っ た も のであ る 。
表 7 〜 9 に示す結果では、 4 0 1 b p 、 3 3 6 b p 及び 1 9 5 b p な ど所定の断片が検出 さ れ た検体を H C V — R N A陽性 （ P ) 、 陽性であ る がバン ド が薄 い も の （ P W ) 、 陽性であ る が一度陰性の結果が出 た り 、 バ ン ド が薄かっ た も の （ N P P W ) 、 所定の断 片が検 出 さ れな か っ た も の （ H C V — R N A 陰性 ： N ) と 分類 し た。 ま た、 ホー ト ン らの抗体診断におけ る 陽性 を 「 十 」 、 有馬 1 4 抗体 [有馬 ら 、 Gastro- enterologia Japonica, 24 (5) 、 540〜 544 ( 1989 ) 、 及 Zf Gastroentero logia d a p o n i c a % 2 ( 5 ) 545 〜 D48 ( 1989 ) ] 陽性を 「 + A 」 、 陰性を 「 一 」 と し た。
なお、 表 8 は、 4 0 1 b p 断片について陽性 （ P ) の検体に お け る結果を示 し 、 表 9 は 4 0 1 b p 断片に つ い て 陰性 （ N ) の検体 に お け る 検査で の結果を示 す 。
ま た、 表 8 、 9 において、 検体番号 2 9 、 1 2 8 、 1 4 6 及び 3 3 1 はアルコ ール性肝障害患者、 4 0 1 は B 型肝炎患者、 1 9 0 は薬剤性肝障害患者、 それ以 外は、 C型慢性肝炎患者であ る 。
C 型肝炎患者以外の患者について、 H C V 1 プラ イ マー及び H C V 4 プラ イ マーの組合せ に よ り 増幅さ せ た 4 0 1 b p c D N A断片が検出で き た検体数を総 検体と の比で表わす と、 B型肝炎患者では、 0ノ 1 0 で あ り 、 ア ル コ ール性肝障害患者では 0 / 1 0 であ り 、 肝機能正常者では 1 Z 1 0 であ り 、 一方、 C型慢 性肝炎患者、 肝硬変患者では、 表 7 に示すよ う な高い 検出率である こ とが明かと された。
一方、 4 0 1 b p の c D N Aが検出された 型 6 例、 Κ 2 型 6例の患者検体について、 それぞれプライ マー @と プラ イ マー ©の組合せ、 およびプライ マー ® と プラ イ マー ©の組合せに よ り P C R を行っ た と こ ろ 、 Κ 2 型では 6例中 6例で 3 3 6 b p の断片の検出 がで き たが、 K i 型では 6例中 4例 しか 3 3 6 b p の 断片が検出されなかっ た。
ま た、 プラ イ マー⑨とブライ マ一◎の組合せによ る K 2 型検体での 3 3 6 b p の断片の検出率、 及びブラ イ マ一 ®と プライ マ一 ©の組合せによ る 型検体で の 3 3 6 b p の断片の検出率は高い も のではなかつ た。
他方、 プライ マー③と プラ イ マー①の組合せによ り P C R を行っ た と こ ろ、 4 0 1 b p の断片の検出され た検体で は殆 ど全て 1 9 5 b P の断片 も 検出 さ れ た。
ま た、 数例のアルコール性肝障害患者で 4 0 1 b p 断片は検出されなかっ たが、 1 9 5 b p断片は検出さ れた例があっ た （表 7 ) 。 更に 、 プラ イ マー 3 2 と H C V 2 6 プラ イ マーの組 合せ に よ り P C R を行い、 2 2 5 b p の断片の検出の 有無に よ る 診断を行っ た。 その結果を表 8 お よ び表 9 に示す。
( b ) R T — P C R — P C R法に よ る H C V の検出 上記 （ a ) 項 に お け る P C R (第 1 P C R ) の後 に 、 更 に第 1 P C R で用 い たプラ イ マーよ り も H C V ゲ ノ ム の内側の特定部位に対応す る プラ イ マーを用 い て診断用 の第 2 P C R を行 う こ と に よ っ て、 検出率の 向上が期待で き る 。
す な わ ち 、 ブ ラ イ マ ー 3 2 と H C V 2 6 の ブ ラ イ マーの組合せを用 いて、 上記 （ 4 ) 項の記載の方法に 従っ て第 1 P C R を行っ た後、 反応液 1 β Ά ヒ 1 0 X P C R 緩衝液 2 . 5 μ £ 2 m M d N T P s 2 . 5 μ ·β 、 ブラ イ マー 3 2 5 p m o l お よびプラ イ マー ②の 5 p m o l を混合 し 、 こ れに蒸留水を加えて 2 5 μ と し 、 更に こ れに T a q D N A ポ リ メ ラ ー ゼ 0 . 1 μ を加え、 第 2 P C R を行レヽ 1 6 2 b p の断 片の增幅を行っ た。 なお、 増幅条件は上記 （ 6 ) 項 と 同様 と し た。
表 8 に示す よ う に、 第 1 P C R で検出で き なかっ た 検体が第 2 P C R で検出で き る よ う に な っ た。
( c ) R T — P C R 後のサザー ン ブロ ッ ト に よ る H C V の検出 上記 （ a ) 項において、 前記 （ 4 ) 項に従っ た P C R を行 っ た後、 サザー ン ブロ ッ ト を行 う こ と に よ つ て 、 H C V 由来の c D N A断片が増幅された こ と を確 認で き る 。
す な わ ち 、 プ ラ イ マー 3 2 と H C V 2 6 での上記 ( 4 ) 項 に記載の方法 に従っ た第 1 P C R を行 っ た 後、 反応液の 1 0 μ を 1 . 5 %ァガロ ース電気泳動 に かけ、 ェチ ジ ゥ ムブ口 マイ ド で染色後、 サザ一ン ブ ロ ヅ 卜 法を用 いて、 D N Aをナイ ロ ンメ ンブ レ ン に移 し た。 32 Ρ標識し たプラ イ マー②ま たはプラ イ マー @ をプロ ーブ と してハイ ブ リ ダィ ゼーシ ョ ン を行っ た。 Λイ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン は、 ホルム ア ミ ド を使用 し な い 系 で 3 7 °C で 4 〜 5 時 間 行 っ た 後 、 5 X S S C ( 7 5 m M N a C j6 、 7 5 m Mク ェン酸ナ ト リ ウ ム、 P H 7 ) 、 0 . 1 % S D S 中で室温下 5分間行い、 そ の後二回洗浄 し 、 更に 5 0 eCで 5分間行っ た後二回洗 浄 し 、 乾燥 し てか ら、 オー ト ラ ジオグラ フ ィ 一を行つ た。 表 8 に示す よ う に、 プロ ーブ② と⑨を用 いる こ と に よ り 、 2 2 5 b pで増幅さ れた D N Aは全て陽性 （ P ) で あ っ た 。 従 っ て 、 増 幅 さ れ た 2 2 5 b p D N A は H C V由来であ る こ と が確認さ れた。
—方、 ホー ト ン らの抗体診断では 「 一 」 で示さ れた 例 で も 、 D N A 断片 は 陽性 （ P ) の例があ り 、 ま た D N A断片は陰性 （ N ) で も抗体診断では 「 十 」 の例 も あ り （表 7 お よび 8 ) 、 本発明の診断法 と 既存の抗 体診断法 と を併用 し て相補完 し合っ て H C Vの診断率 を高め る 必要があ る こ と が理解さ れる 。
ま た、 上述の組合せ以外に も 、 H C V 1 1 と プラ イ マー⑪の組合せな ど、 各種のプラ イ マーの組合せに よ る P C R を行 う こ と に よ っ て上記の結果 と 同等以上の 診断結果を得 る こ と も で き ょ う 。
以上の結果か ら本発明の D N A診断法は、 感度も高 く 、 再現性が良好であ り 、 同 じ プラ イ マーを用 いて H C V - K ！ 型 と H C V — K 2 型の両方の タ イ プを検出 で き 、 ま た抗体診断での陰性例 について も陽性を示す と い う よ う な補完す る データ を提供す る と い う 利点を 有す る こ と 明 らか と さ れた。
( 1 2 ) Mosquito Cell Line での H C Vの培養 フ ラ ボ ウ ィ ルス であ る 日本脳炎ウ ィ ルス は、 蚊の細胞で 增殖す る こ と が知 られて お り 、 フ ラ ボ ウ イ ルス に属す る H C Vが蚊の細胞に感染 し 、 增殖で き ないかを検討 し た。 H C Vが存在す る こ と を確認 し た患者血清を蚊 の細胞 cell line に加え培養を連続 して行い、 H C V を 感染 さ せ た 。 こ の感染細胞を用 い 、 R N A を抽 出 し 、 逆転写、 P C R 、 ノヽイ ブ リ ダィ ゼーシ ヨ ン で ウ イ ルス の確認を行な っ て い る 。 産業上の利用可能性 本発明 に よ っ て C型肝炎 ウ ィ ルス （ H C V ) の研 究、 H C V感染患者の診断、 サブタ イ プの分類等に有 用 な技術が提供さ れた。
ま た、 期待さ れたよ う に、 H C Vゲノ ムの特定部位 の特定の長さ の D N A断片あ る いはェ ピ ト ープを コ一 ド す る D N A断片の検出、 診断が、 H C Vに対す る抗 体がま だ産生さ れていない急性肝炎患者の発見、 診断 に役立つ こ と が明 らかにさ れた。 こ の こ と は、 肝炎の 発生初期 あ る い は病状の各過程 に おい て 、 イ ン タ ー フ エ ロ ン な どの抗ウ ィ ルス剤に よ る治療が奏功 して レヽ る か ど う かを、 モニターする方法、 マーカ ーな ど と し て も 、 本発明 に お け る H C Vゲ ノ ム 断片の逆転写一 P C R法が有用であ る こ と を示す も のであ る 。
ま た 、 本発明 の結果か ら 輸血用献血の H C Vス ク リ ー ニ ン グ に は 、 抗体検査 の み な ら ず 、 本発 明 の H C V感染由来の R N A断片、 D N A断片あ る いは 夕 ン パ ク 抗原の検査を同時に併行 して行う こ と も必須で あ る こ と が示唆さ れる 。 寄託微生物に関す る言及
H C V — T を有す る ク ローン （ B L 2 1 — C P T 1 ) 寄託機関
名称 通商産業省工業技術院微生物工業術研究所 住所 曰本国茨城県つ く ば市東 1 丁目 1 番 3号 (〒 3 0 5 )
寄託日 平成 2 年 1 0 月 2 9 曰 寄託番号 F E R M B P - 3 1 4 4

Claims

請 求 の 範 囲
1 . C型肝炎 ウ ィ ルスゲノ ムの 5 ' 非翻訳領域の塩基 配列 と 、 構造領域も し く は非構造領域の遺伝子産物の ェ ピ ト ープを コ一 ド す る塩基配列を含むヌ ク レオチ ド 配列 と し て の H C V — ！1、 H C V — K U、 H C V -
I 、 H C V — M、 H C V — K A、 H C V — Y ま た は
Η C V - Ν。
2 . 請求項 1 に記載のヌ ク レオチ ド配列の全部ま たは 一部を含む単離ヌ ク レオチ ド 断片。
3 . D N A ま たは R N A と し ての請求項 2記載の単離 ヌ ク レオ チ ド 断片。
4 . 請求項 2 に記載のヌ ク レオチ ド 断片の全部ま たは 一部を含む組換え体。
5 . C型肝炎患者か ら R N A を抽 出 、 分離す る 過程 と 、 得 られた R N Aか ら c D N Aを合成す る過程 と 、 合成さ れた c D N Aを、 請求項 1 に記載の ヌ 4ク レオチ ド 配列 を有す る c D N A の增幅を可能 と す る プ ラ イ マ ー を 用 い た P C R 法 に か け る 過程 と 、 増幅さ れた c D N A を分離精製す る過程 と を有す る こ と を特徴 と す る 請求項 1 記載のヌ ク レオチ ド 配列の製造法。
6 . プラ イ マーが、 C型肝炎ウ ィ ルスゲノ ムの特定箇 所の特定の長さ の塩基配列、 あ る いは該塩基配列の一 部をプラ イ マー と しての機能を損なわない範囲で変換 し た配列 を有す る ヌ ク レオチ ド であ る請求項 5 に記載 の製造法。
7 . a . 患者検体か ら R N A を抽出 、 分離す る 過程 と 、
b . 得 ら れ た - R N A か ら c D N A を 合成 す る 過程 と 、
c . 合成さ れた c D N Aを、 C型肝炎ウ ィ ルス に特徵 的な配列 を有す る c D N Aの増幅を可能 と す る プラ イ マーを用 い た P C R にかけ る過程 と 、
d . 過程 c に おけ る P C R に よ っ て得た反応液中の C 型肝炎 ウ ィ ルス に特徵的な配列を有す る c D N Aの存 在の有無を検出す る過程と 、
e . 過程 d で C 型肝炎 ウ ィ ルス に特徴的 な配列 を有 す る c D N A の存在が検出 さ れな か っ た反応液 に対 し て 、 必要 に 応 じ て 、 過程 c で用 い た プ ラ イ マー よ り も 内側 に 位置す る プ ラ イ マー を用 い た第 2 P C R を 行 い 、 C 型肝炎 ウ ィ ルス に特徴的 な配列 を有す る c D N Aの存在の有無を検出す る過程、
と を 有 す る こ と を 特徴 と す る C 型肝炎患 者 の 診 断 法。
8 . 過程 c で用 い る プラ イ マーが、 C型肝炎 ウ ィ ルス ゲノ ム の特定箇所の特定の長さ の塩基配列、 あ る い は 該塩基配列の一部をプラ イ マー と し て の機能を損なわ な い範囲で変換 し た配列を有す る ヌ ク レオチ ド であ る 請求項 7 に記載の診断法。
9 . 過程 c で用いるプライ マーが、 請求項 1 に記載の ヌ ク レオチ ド配列全部ま たは一部を含む配列、 ある い は該配列の一部をプライ マーと しての機能を損なわな い範囲で変換した配列を有するヌ ク レオチ ドである請 求項 8 に記載の診断法。
1 0 . 過程 が、 C型肝炎ウ ィ ルスゲノ ム に特徵的な 配列 と選択的に八イ ブリ ダィ ズし得るプローブを用い た Λイ ブ リ ダィ ゼ一シ ヨ ン法によっ て、 該プローブと ノ\イ ブ リ ダィ ズする c D N Aの存在の有無を検出する こ と に よ り 行われる請求項 7〜 9 のいずれかに記載の 診断法。
1 1 . 過程 d が、 P C R によ って得た反応液を電気泳 動法によ り 分析する こ と によ って、 C型肝炎ウィ ルス ゲノ ムに特徵的な配列を有する特定の長さの D N A断 片の検出する こ と によっ て行なわれる請求項 7〜 9 の いずれかに記載の診断法。
1 2 . 過程 d が、 P C R法によって得た反応液を制限 酵素に よ り 処理した後、 電気泳動法によ り 分析する こ と に よ っ て 、 C型肝炎ウ ィ ルスゲノ ム に特徴的な配列 を有す る 特定の長さ の D N A断片の検出す る こ と に よ っ て行なわれる請求項 7〜 9 のいずれかに記載の診 断法。
1 3 . 微生物で請求項 1 に記載の塩基配列にコー ド さ れたぺプチ ド を発現させる こ と を特徴 と す る C型肝炎 ウ ィ ルスゲノ ムの構造領域も し く は非構造領域の遺伝 子産物のェ ピ ト ープを有す る ぺプチ ド の製造方法。
1 4 . 請求項 1 3 に記載の製造法に よ っ て得たぺプチ ド を用 い る こ と を特徵 と す る被検体中の C型肝炎ウ イ ルス に対す る 抗体の測定方法。
1 5 . 請求項 1 3 に記載の製造法に よ っ て得たぺプチ ド を抗原 と し て用 い る こ と を特徵 と す る抗体の製造方 法。
1 6 . 請求項 1 5 に記載の製造法に よ っ て得た抗体を 用 いて C型肝炎ウ ィ ルスゲノ ムの構造領域も し く は非 構造領域の遺伝子産物のェ ピ 卜 ーブを有す る ぺプチ ド を測定す る こ と を特徴 と す る ぺプチ ド の測定方法。
PCT/JP1991/000405 1990-03-28 1991-03-28 Diagnostic for hepatitis virus WO1991014779A1 (en)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8018590 1990-03-28
JP2/80185 1990-03-28
JP2/154230 1990-06-13
JP15423090 1990-06-13
JP2/153979 1990-06-14
JP15397990 1990-06-14
JP30579590 1990-11-09
JP2/305795 1990-11-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1991014779A1 true WO1991014779A1 (en) 1991-10-03

Family

ID=27466405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1991/000405 WO1991014779A1 (en) 1990-03-28 1991-03-28 Diagnostic for hepatitis virus

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO1991014779A1 (ja)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992019743A2 (en) * 1991-05-08 1992-11-12 Chiron Corporation Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics
EP0532167A2 (en) * 1991-08-09 1993-03-17 Immuno Japan Inc. Non-A, Non-B Hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
US5428145A (en) * 1991-08-09 1995-06-27 Immuno Japan, Inc. Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
US5683864A (en) * 1987-11-18 1997-11-04 Chiron Corporation Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US5712087A (en) * 1990-04-04 1998-01-27 Chiron Corporation Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens
US6214583B1 (en) 1991-05-08 2001-04-10 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
US7157226B1 (en) * 1993-04-27 2007-01-02 Innogenetics S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
US7196183B2 (en) 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
US7473773B2 (en) 2004-01-07 2009-01-06 Third Wave Technologies, Inc. Determination of hepatitis C virus genotype
US8124747B2 (en) 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0318216A1 (en) * 1987-11-18 1989-05-31 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0318216A1 (en) * 1987-11-18 1989-05-31 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5683864A (en) * 1987-11-18 1997-11-04 Chiron Corporation Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US6312889B1 (en) 1990-04-04 2001-11-06 Chiron Corporation Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
US5712087A (en) * 1990-04-04 1998-01-27 Chiron Corporation Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens
WO1992019743A3 (en) * 1991-05-08 1993-11-25 Chiron Corp Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics
WO1992019743A2 (en) * 1991-05-08 1992-11-12 Chiron Corporation Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics
US6214583B1 (en) 1991-05-08 2001-04-10 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
US5428145A (en) * 1991-08-09 1995-06-27 Immuno Japan, Inc. Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
EP0532167A3 (en) * 1991-08-09 1993-03-31 Immuno Japan Inc. Non-a, non-b hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
EP0532167A2 (en) * 1991-08-09 1993-03-17 Immuno Japan Inc. Non-A, Non-B Hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems
US7157226B1 (en) * 1993-04-27 2007-01-02 Innogenetics S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
US7196183B2 (en) 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
US8124747B2 (en) 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof
US7473773B2 (en) 2004-01-07 2009-01-06 Third Wave Technologies, Inc. Determination of hepatitis C virus genotype
US8071750B2 (en) 2004-01-07 2011-12-06 Third Wave Technologies, Inc. Determination of hepatitis C virus genotype

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sauder et al. Detection of Borna disease virus (BDV) antibodies and BDV RNA in psychiatric patients: evidence for high sequence conservation of human blood-derived BDV RNA
EP1004670B1 (en) Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
Vunsh et al. The use of the polymerase chain reaction (PCR) for the detection of bean yellow mosaic virus in gladiolus
JPH07503143A (ja) Ｈｃｖ単離物のタイピング法
Chao et al. Molecular cloning and characterization of an isolate of hepatitis delta virus from Taiwan
Pham et al. Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus by real-time PCR with melting-curve analysis
Schwarz et al. Detection and characterization of European apple stem pitting virus sources from apple and pear by PCR and partial sequence analysis
Boye et al. Specific sequence amplification of bovine virus diarrhea virus (BVDV) and hog cholera virus and sequencing of BVDV nucleic acid
HU230244B1 (hu) Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz
Puthavathana et al. Typing of hantaviruses from five continents by polymerase chain reaction
JP6511544B2 (ja) 高病原性ウイルス性出血性敗血症ウイルス検出用バイオマーカー及び診断方法
US6020123A (en) Oligonucleotide sequences for the amplification of the genome of the retroviruses of the HIV-2 and SIV type, and their uses for in vitro diagnosis of the infections due to these viruses
WO1991014779A1 (en) Diagnostic for hepatitis virus
JP4142093B2 (ja) Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉのゲノムに由来する核酸配列、及び特に食料品中におけるサルモネラ属の細菌の存在のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のためのその使用
JPH04506608A (ja) 腸内伝達された非―ａ／非―ｂ肝炎ウイルス物質及びその特徴的なエピトープ
JPH06311885A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
Murphy et al. Synthesis of viral mRNA and polyadenylate by a ribonucleoprotein complex from extracts of VSV-infected cells
US5654401A (en) Borna disease virus-specific protein and kits
Díaz et al. Nucleotide sequence and infectious transcripts from a full-length cDNA clone of the carmovirus Melon necrotic spot virus
JPH07501712A (ja) 微量ｒｎａまはたｒｎａおよびｄｎａ検出用の一段ｒｎａおよび結合一段ｒｎａおよびｄｎａポリメラーゼ・チェイン・リアクション
JP5315519B2 (ja) コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法
Chen et al. Coexistence in lactate dehydrogenase-elevating virus pools of variants that differ in neuropathogenicity and ability to establish a persistent infection
JPH09173100A (ja) ホップ潜在ウイルスの遺伝子及び該ウイルスの検出方法
JP2007532110A (ja) Ｆｃレセプターの多型の同定のための核酸ベースのアッセイ
Muscillo et al. Comparison of cDNA probe hybridizations and RT-PCR detection methods for the identification and differentiation of enteroviruses isolated from sea water samples

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE