WO1990015133A1 - Method of producing core structure of retro virus and particle produced thereby - Google Patents

Method of producing core structure of retro virus and particle produced thereby Download PDF

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Hiroshi Shibuta
Tatsuo Shioda
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Nippon Zeon Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing particles consisting of a cleaved gag protein of virus belonging to the family Letrovirus, particles produced by the method, and an active ingredient comprising the particles. More specifically, at least the gag gene and the pol gene, including the et al. Gene of the virus belonging to the family Letrovirus, are described in detail. A virus that infected the integrated virus vector or that incorporated at least the gag gene, including at least the env gene of a virus belonging to the family Letrovirus.
  • virus vectors that contain at least ⁇ > ⁇ the env gene, including the env gene of a virus belonging to the vector and the retrovirus family Culturing and expressing animal cell cultures and pre-treating gag protein precursors
  • Method for producing particles composed of cleaved gag protein obtained by cleaving, particles produced in such a manner, and particles thereof The present invention relates to a vaccine containing, as an active ingredient.
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • various retroviruses which are thought to be the cause of AIDS and adult T-cell leukemia, were isolated and routinely isolated. The nucleotide sequence has been determined. As a result, they were reported to be class or class one.
  • HTLV-1 ⁇ , LAV, and ARV which are regarded as AIDS pathogenic viruses, are the same virus and have been unified as HIV (human immunodeficiency virus).
  • Retroviral particles are composed of many proteins, and are called env proteins, and in the case of type IV, they are precursors.
  • Env-gp165 is cleaved to gpl20 and two envproteins of gp41), reverse tillers (t-65 in the case of HIV-I, and p51), nuclear proteins (called gag proteins and in the case of HIV-I, the precursor gag-p55 is cleaved to form p17, p24, and P1
  • the amino acid sequence of gag-p55 is the amino acid sequence equivalent to P "17
  • the amino acid sequence equivalent to P24 is the amino acid sequence of gag-p55.
  • tat, vif, rev, ne which are said to be unique to HIV
  • gp120 an env protein that is not present in HIV particles other than V-products, has the function of immobilizing virus particles on cell membranes during infection.
  • gp41 has a function of invading the viral gene into cells
  • p24 a gag protein
  • p17 is considered to be a matrix protein.
  • Reverse transcriptase is encoded by the polII gene.
  • the pol gene is also P10 (protease protein) and P31 (endonuclease), and has integral activity. ), And these viral enzymes encoded by pol are called pol proteins. V if encodes p 23, which is thought to be involved in the construction of the virus particle.
  • gpl20 cell (CelI), 5_3, 483, (1998)
  • gpl20 cell (CelI), 5_3, 483, (1998)
  • infectivity has been selected as the most promising candidate, and studies that produce it by a gene manipulation technology that recombines the gene encoding this antigenic protein into Escherichia coli (for example, , Science 228, 93-96, (1985)), etc. have already been performed.
  • gag tamper which is a pair of virus particles
  • Genes encoding proteins and pol genes encoding reverse transcriptase may have a low probability of mutation, and the products of these genes are used as antigens.
  • Vaccines are considered to be advantageous, and studies that produce reverse transcriptase by genetic engineering that replaces E. coli (eg,
  • non-cleavable gag proteins such as gag-p55 has been confirmed by recombination of the entire retroviral gag gene.
  • expression of the cleaved gag protein was not confirmed, regardless of the presence or absence of the recombination of the pollosomes.
  • non-infectious retrovirus particles having gP16O and ⁇ 20 were known (W088 / 096770), but these were It is obtained by processing a retrovirus. Therefore, it is possible to produce a retrovirus ⁇ core structure that does not contain env protein without forming a lewis virus by using genetic recombination. Disclosure of invention not yet known>
  • gag protein was expressed in viral-infected cells without expressing the retroviral env protein.
  • Expression of protein and pol protein results in expression of the cleaved gag protein, and infectivity constituted by the cleaved gag protein It was found that a core structure particle of a retrovirus having the same antigenicity as a part of the structure of the retrovirus particle was obtained without any Brief description of the drawings leading to the completion of the invention>
  • Fig. 1 shows the procedure for constructing the plasmid PUHK
  • Fig. 2 shows the procedure for constructing the plasmid PNZ68K2
  • Fig. 3 shows the procedure for constructing the plasmid W-gag.
  • the term “en V protein” refers to an env protein that controls the infection and pathogenesis of retrovirus and its mutants and modifications, and its effects on infection. It does not mean a modified env protein that has lost its virulence.
  • "does not include the env gene” means that the gene encoding the env protein is not included so as to express it. Genes derived from the env gene that are not related to the infection or pathogenicity of the retrovirus (part of the env gene or the env gene) Children's modifications).
  • the retrovirus particle that does not contain gp160 and 9 ⁇ 20 disclosed in W088Z096970 does not contain 9P120, so that the contained gene is taken into the cell.
  • the gene Although it is unlikely that the gene will be incorporated, if the contained gene is taken into the cell, it has all the genes of letrovirus; There is a risk of constructing a virus, but there is no such risk since the particles of the present invention do not contain the env gene. However, even in the present invention, when a modified version of the env gene is included, the pathogenicity may be restored by mutation or the like. It is also preferred that it does not contain any modifications of the same.
  • the retrovirus used in the present invention is characterized by gag protein and / or pol protein in cultured animal cells that infect viruses. It is not particularly limited as long as it can be expressed and does not contain the env gene. For example, those belonging to the subfamily Lentivirus or those belonging to the subfamily Lentivirus, especially HIV-I, HIV-I,
  • the retroviral cDNA to be incorporated into the virus ⁇ vector can be used in an animal culture cell that infects the virus ⁇ vector.
  • the protein is not particularly limited as long as it can express the gag protein and / or the pol protein and does not contain the env gene.
  • coding the gag gene and pol gene of The cDNA not containing the env gene was PN-43 (journal ⁇ age ⁇ ve ⁇ ⁇ ge — (Virol.), 5_ £, 2, 284, (1986) Etc., such as HIV-1 which is incorporated into the chromosome of an AIDS patient in the form of a virus once; (using a phage, etc.
  • plasmid containing the entire HIV-I cDNA, or to reverse the HIV-1 I RNA genomics isolated from the patient. Copy and convert it to cDNA, then transfer to plasmid to construct a plasmid containing all HIV-I cDN ⁇ , and use the obtained plasmid as appropriate. It can be obtained by digesting with various restriction enzymes and preparing a DNA fragment containing the coding region of both the gag protein and the pol gene.
  • the virus / vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can infect animal cells, and can express the gag gene and the poI gene.
  • Vaccinia ⁇ Virus, Avibox ⁇ Innores, Bacchus, Virgin etc. are created.
  • the method for constructing a virus vector incorporating the gag gene and / or the pol gene used in the present invention is not particularly limited.
  • the gene to be incorporated is a gene that encodes the surface antigen protein of encephalitis virus. Therefore, it is necessary to substitute the gag gene and z or pol gene of the retrovirus, and to use the vaccine. ⁇ It is necessary to ensure that the virus always has favorable conditions. Except for the absence It can be constructed by the method described in 498-2.
  • the virus vector incorporating the constructed cDNA fragment encoding the gag gene and the pol gene, or the cDNA fragment encoding the gag gene is used. Infect virus-infected cells with the virus ⁇ vector containing the integrated virus' vector and the cDNA fragment encoding the poI gene. Then, the cleaved gag protein and pol protein are expressed in the culture supernatant.
  • the animal culture cell used in the present invention may be any type of virus vector that can be proliferated, and as a specific example, the virus vector is a vaccine.
  • viruses for example, TK-43 (from human osteosarcoma), FL (from human amniotic membrane), Hela (from human cervical cancer), KB ' (Human ⁇ throat cancer origin), RK 13 (Esthetic kidney origin), CV-1 (Monkey kidney origin), BSC-1 (Monkey kidney origin), L9 29 (Mas origin) Connective tissue), C: (Nitro embryo) cells, DEF (Nitro fetal fibroblast), SW480 (derived from human colon cancer), and the like.
  • the work culture cell used in the present invention may be a chicken germ cell such as a fibroblast for a chicken embryo.
  • examples of such cells include, but not limited to, cells from developing chicken eggs.
  • the virus vector is a baculovirus • a virus, for example, Spodoptera furugierda (Spodoptera furugierda), for example, the Sf9 strain derived from Be done.
  • the expression level of the cleaved gag protein is low depending on the cells used, and for example, the HIV-I gene is transferred to CV-1.
  • Viruses that express high levels of the cleaved gag protein ⁇ Combinations of vectors and animal cell cultures are preferred, such as those that incorporate the HIV-I gene.
  • the cleavage of the gag protein expressed here is considered to be due to the pol protein having protease activity such as p10.
  • cleaved gag protein Purification of the cleaved gag protein from the culture supernatant is not particularly limited. For example, according to the conventional method (Science, 224, 497-500, (1984)), the supernatant is replaced with sucrose or tartaric acid. Cleavage-density gag protein may be recovered by forming a particle by centrifugation using a calcium density gradient, followed by equilibrium centrifugation with cesium chloride sedimentation.
  • Particles composed of the cleaved gag protein of the present invention include, for example, HIV-I when the retrovirus is HIV-I and when fractionated by specific gravity, the specific gravity is HIV-I particles. And around
  • Particles composed of the cleaved gag protein of the present invention may or may not contain reverse transcriptase, but usually at least a part thereof. Includes reverse transcriptase. Therefore, by measuring the reverse transcriptase activity, the fraction containing the particles of the present invention can be discriminated.
  • the reverse transcriptase activity can be measured according to a conventional method.
  • the recombinant virus-infected cell supernatant was PolyA type II and ol igo-dT was primed according to the description in the Proposal for Practical Microbiology (The University of Tokyo Institute of Medical Science, Alumni Association). and to, "2 P - not good by measuring the intake included Ri of d TTP into acid-insoluble fraction.
  • the particles of the present invention are associated with an envelope-like substance which is considered to be a lipid bilayer derived from a biological membrane of a cultured animal cell infected with a virus' vector. ing . These particles function as antigens even if they have a lipid bilayer, but if the presence of the lipid bilayer is not preferred, the protein will not be inactivated. It can be crushed and removed by treatment with an organic solvent such as ether under conditions or freeze-thaw treatment.
  • These particles do not contain the env protein and its gene responsible for infecting cells, and therefore do not show pathogenicity. Other genes may or may not be included. As long as the structure is formed by the cleaved gag protein, it may or may not contain proteins other than the env protein. . Also, it does not matter whether or not an envelope-like lipid bilayer is present. These particles are antigenic Furthermore, the antigenicity of the gag protein is considered to be less mutated than that of the env protein, or the poI protein and gag protein if included. It comes from the quality of the protein. In addition, it has a similar or similar structure to some of the natural virus particles, which means that gag protein, poI protein, or Antigenicity of more than a simple mixture can be expected.
  • viruses are the pathogens of many incurable diseases such as AIDS, adult T-cell leukemia, cancer, and rheumatism. Although no effective vaccine has been known for many diseases caused by retroviruses, the retrovirus of the present invention was not known. Particles having the same or similar structure as the core can be expected to have excellent effects.
  • cDNA encoding the gag protein derived from retroviruses and cDNA encoding the poI protein are obtained.
  • a cell infected with a virus vector that has been integrated into a genomic region that is not essential for virus growth is cultured, and is composed of a cleaved gag protein.
  • a retroviral core structure that does not contain the protein and the env gene is obtained. This structure has the same structure as a part of the structure of the retrovirus particle, but it is not infectious. Therefore, it depends on using this as an active ingredient. It is hoped that a valid retrovirus vaccine will be obtained.
  • Example 1 Example Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
  • Example 1 Example 1
  • pUC9 (Pharmacia) was digested with EcoRI and PstI, and then treated with polymerase. The incised end was blunt-ended, ligated, and the EcoRI site was deleted.
  • PUC 9 was prepared. After cutting the Eco RI site-deficient PUC9 with Hind IE, ligate it to the Hind DIJ fragment of Vaccinia virus WR containing the Vaccinia virus TK gene and recombining it. We obtained p U ⁇ K.
  • the 7.5 ⁇ promoter of Vaccinia virus WR strain (Mos et al. (Hoss et. Al.), Cell (Cell), 125, 805—813, ( ⁇ After insertion of 9 8 1)) into the Hinc site of PUC 19 (Pharmacia), the fragment was digested with Hind I and Eco RI, and the 7.5 K promoter was inserted. A DNA fragment (approximately 350 bp) having a polylinker part before and after the protein was obtained.
  • the DNA fragment was treated with nuclease, and the plasmid PUHK Ec0RI digest obtained in (1) was treated with polymerase. After ligation, the resulting recombinant plasmid was designated as 0 NZ68K2.
  • this fragment contains the gag gene and pol gene regions.
  • the 0 NZ68K2 obtained in (2-) was digested with BamHI and Ec0R, and the gag gene prepared above; the DNA fragment containing the pol gene and the ligase
  • the recombinant plasmid W-gag was obtained by taking a shot.
  • TK-negative cultured in a 6 cm Petri dish to confirm the insertion of the recombinant gag gene and pol gene (TK ")" Inoculate 14 3 cells with the above plaque-forming virus, and after 45 minutes, 1% agar ⁇ 12% fetal calf serum ⁇ 25 ⁇ 2 ⁇ BU d R Engle MEM After the medium was laminated and cultured for 3 days, the infected cells were stained with 0.01% neutral ⁇ red. The formed plaques are isolated on pasteur pipets and diluted in Eagle MEM medium. The same procedure was repeated once again on the isolated black to purify the plaque.
  • the virus obtained from the purified plaque is propagated, DNA is prepared from the proliferating virus, and cDNA encoding the gag gene and the pol gene is used as a probe.
  • the obtained recombinant vaccines were used to encode the gag gene and pol gene derived from HIV-I by the dot-plot high predication method. After confirming that it was a recombinant virus having the following DNA in the genome, it was named V-201-11-8.
  • 50 mH Tr is-HC (PH8.0), ⁇ 0 mH dichroic plate, 75 mH K ⁇ ⁇ , 5 mH Mg C ⁇ 2 , 10 ⁇ . ⁇ / Id o I yA, 9 / id o I i go-dT, 0. 0 reaction was 5 raU this, including the 5% NP 4 0 [shed one 32 P] an d TTP the (4 0 0 CiZ mmo to 1 0 fflC i Roh) 5 to 10 ⁇ ⁇ ⁇ was added. This reaction solution is dispensed into a 96-well U-shaped plate in the number of fractions and controls, and each fraction is placed there.
  • Control 10 Tris ⁇ Hydrochloric acid ( ⁇ 7.4) 10.
  • IMNaC ⁇ —ImHE DTA solution was added and reacted at 37 ° C for 1 hour. During the reaction, draw two grids on the two-cell cellulose filter with a pencil on the filter. After the reaction is completed, the reaction solution for each fraction and the control is added.
  • ⁇ _ £ was spotted on each compartment on a two-cell cellulose filter. After the filter is completely dried by drying it, shake it in 5% trichloroacetic acid-5% sodium pyrophosphate solution for 15 minutes. Then, washing was performed to remove unreacted radioactive precursors.
  • the plate was washed in 5% trichloroacetic acid for 5 minutes and then in 50% ethanol for 5 minutes. After drying, release each section along the grid and place it in a scintillation vial, and place a liquid break in the trench scintillator. The uptake was measured by a counter. Uptake more than three times that of the control was regarded as positive, and it was judged that reverse transcriptase activity was present.
  • the present invention is composed of a cleaved gag protein. Since the core structure of the retrovirus to be produced is produced without the env protein or the env gene that is infectious or expresses infectivity, it is safe to use. Retrovirus with fewer problems in terms of nature ⁇ Vaccines are likely to be provided and have high industrial applicability.

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Description

明 細 書 レ ト ロ ウ イ ルス · コ ア構造物 の製造方法及び そ れに よ つ て 製造さ れた粒子
< 技術分野 >
本発明 は レ -卜 ロ ウ ィ ルス科に 属す る ウ ィ ルス の 開裂型 gagタ ンパク 質か ら成る粒子 の製造法 、 及びその製造法 に よ り 製造さ れる粒子 、 そ の粒子を有効成分 と す る ワ ク チン に 関 し 、 さ ら に 詳 し く は 、 レ ト ロ ウ イ ルス科 に属す る ウ ィ ルスの et 逍伝子を含 ま ず少な く と も gag遺伝子 及び pol遺伝子を組み込ん だ ウ ィ ルスベ ク タ 一 を感染さ せた 、 ま た は レ ト ロ ウ イ ルス科 に 属す る ウ ィ ルス の env 遺伝子を含 ま ず少な く と も gag逍伝子を組み込ん だ ウ イ ルス ♦ ベ ク タ ー と レ ト ロ ウ イ ルス科 に 属す る ウ ィ ルス の env遺伝子を含 ま ず少な く と も ί>οに遺伝子を組み込ん だ ウ ィ ルスベ ク タ ー を感染さ せ た動物培養細胞を培養 し 、 発現さ せ 、 gagタ ンパク 質前駆休を開裂さ せ る こ と に よ り 得 ら れる開裂 し た gagタ ンパ ク 質に よ っ て構成さ れる 粒子を製造す る方法、 そ の よ う に し て 製造さ れる粒子、 及びそ の粒子を有効成分 と す る ワ ク チ ン に 関 す る 。
ぐ 背摄技術 >
最近 、 後天性免疫不全症候群 （ エイ ズ ） の発症、 蔓延 が世界的 に玆慮さ れて お り 、 そ の予防 、 治療対策が緊急 課题 と な っ て い る 。 数年前 よ り 、 エ イ ズや 成人 T細 胞 白 血病 な ど の 原 因 ウ ィ ルス と 考え ら れる種々 の レ ト ロ ウ イ ルス が単離、 周 定され、 その逍伝子の塩基配列が決定さ れた 。 そ の結果 こ れ ら は周類ま た は周一 で あ る と報告さ れる よ う に な つ た 。 特に エイ ズの病原ウ ィ ルス と さ れた H T L V— 1Π、 L A V、 A R Vは同 じ ウ ィ ルスであ り 、 H I V ( human immunodeficiency virus) と統一 し て 命名さ れた 。
レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子 は 、 多 く の タ ンパク質で構成さ れ て お り 、 外皮糖 タ ンパ ク 質 （ envタ ンパ ク 質 と称 し 、 Ή I V— ェ の場合、 前駆体で あ る env-gp 1 6 0が 開裂 して gpl 2 0、 及ぴ gp4 1 の 2種の envタ ンパ ク 質 と な る ） 、 逆耘写酵素 （ H I V— Iの場合、 t) 6 5 、 及び p 5 1 がある ） 、 核タ ンパ ク 質 （ gagタ ンパ ク 質 と 称 し H I V— Iの場合、 前駆体で ある gag-p5 5が 開裂 し て p 1 7 、 p 2 4 、 及び P 1 5の 3種の gagタ ンパ ク 質 と なる 。 なお 、 gag-p5 5の ア ミ ノ 酸配列で は 、 P "1 7相 当 の ア ミ ノ 酸配列 、 P 2 4相当 の ア ミ ノ 酸配列 、 P 1 5 相当の ア ミ ノ 酸配列 が こ の順番で連続 し て い る ） な ど と 命名さ れて いる 。 ま た 、 H I Vに独特なもの と言われる tat, vif、 rev, ne な ど の調節逍伝子産物 が知 ら れ て いるが 、 Vけ産物以外 は H I V粒子中 に は存在 し な い envタ ンパク 質であ る gp 1 2 0は感染の際 に ウ ィ ルス 粒子を細胞膜に 固定化す る機能を有 し 、 gp4 1 は ウ ィ ル ス遺伝子を細胞内 へ侵入さ せ る機能を有す る 。 gagタ ン ノ ク 質で ある p 2 4 はコ ア タ ンパ ク 質の主成分で あ り 、 p 1 7 はマ 卜 リ ッ ク ス タ ンパク 質で あ る と 考え ら れて い る 。 逆転写酵素 は pol逭伝子 に コ ー ド さ れて いる 。 pol 遺伝子 は他 に も P 1 0 ( プ ロ テ ア ー ゼ タ ンパ ク質 ） 、 P 3 1 ( エ ン ド ヌ ク レ ア ーゼで あ り 、 イ ンテ グラ ーゼ活 性を有す る と も言わ れる ） を コ ー ド し 、 こ れ ら polに コ ー ドさ れて いる ウ ィ ルス酵素群を polタ ンパ ク質 と 呼 ぷ。 V i f は p 2 3 ( ウ ィ ルス粒子の構築 に 関与 し て い る と考え ら れて い る ） を コ ー ド して い る 。
効 果的 な エ イ ズ ワ ク チ ン を 得 よ う と す る 場合 に は 、 ウ ィ ルスを中和 し 得る抗体を誘導する の に適当な抗原を 含 ん で い る こ と が必要で あ る 。 そ の よ う な 抗 原 と し て envタ ンパ ク 質 、 特に感染能力 に 関係す る と さ れる gpl 2 0 ( セ ル （ Cel I ) 、 5_3 、 4 8 3 、 （ 1 9 8 8 ) ) が そ の最有力 候補 と し て 選 ば れ 、 こ の 抗 原 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る遺伝子を大腸菌 に組み換える逍伝子操作技術 に よ り 産生 す る研究 （ 例 え ば、 サイ エ ン ス （ Science ) 2 2 8 、 9 3 — 9 6 、 （ 1 9 8 5 ) ) な ど が既 に行われ て いる 。
しか し 、 種々 の患者や感染者か ら 分離さ れた H I Vの ゲ ノ ム塩基配列 の解析結果よ り 、 H ί Vの env遺伝子は 極 め て 変異 が 激 し い こ と が 明 か と な り （ サ イ ェ ン テ ィ フ ィ ッ ク ♦ ア メ リ カ ン （ Scientif ic American ) 、 2 5. 3 、 8 4 — 9 3 、 （ 1 9 8 5 ) ) 、 こ の部位を利用 す る 手法で は全て の H 1 V に対応できな い可 能性が あ る 。
こ れ に対 し 、 ウ ィ ルス粒子の ^組み と な る gagタ ンパ ク質を コ ー ドす る逭伝子や逆転写酵素等を コ ー ド し て い る pol遺伝子 は変異の起こ る確率が低い 可能性が あ り 、 それ ら の逍伝子産物を抗原 と す る ワ ク チン は有利であ る と考え ら れ、 逆転写酵素を大腸菌 に耝み換える遺伝子操 作に よ っ て産生する研究 （ 例えば、 サイ ェ ンス
( Science ) 、 2 3 6. 3 0 5 - 3 0 8 . ( 1 9 8 7 ))、 gag - p 5 5 や P 2 4 な どを組み換え多核体ウ ィ ルス の系 で産生す る研究 （ 例 えば、 ヴ イ ロ ロ ジ 一 ( Virology) 、 5 8 、 2 4 8 - 2 5 0 、 ( 1 9 8 7 ) ) 、 P Ί 7 の抗 原決定部位に特異的に結合す る抗体 と結合す るボ リ ぺプ チ ド を合成する研究 ( 特開昭 6 3 — 2 7 4 9 8号 ） 、
1 7 の単ク ロ ー ン抗体がエ イ ズの 中和活性を有す る と い う 報告 （ ジ ャ ー ナル ♦ 才ブ ♦ ヴ イ ロ ロ ジ
( J. Vi rol . ) 6_ 3. 2 6 7 - 2 7 2 、 ( 1 9 8 9 ) ) な ども行われて いる 。 ま た 、 本発明者 ら も、 Ί 9 8 7年 1 2 月 、 エ イ ズ研究会学術集会で gag遣伝子及び pol遺 伝子を組 み込んだヮ ク チニ ァ ウ ィ ルス につ いて発表 し た 。
し か し 、 レ 卜ロ ウ ィ ルスの gag遣伝子全体の組み換え に よ っ て 、 gag-p5 5 等の非開裂型 gagタ ンパ ク 質の発 現 は確認さ れて いた が 、 そ の場合、 pol逍伝子の組み換 えの有無に よ らず 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現 は確認 さ れて いなか っ た 。
ま た 、 g P 1 6 0及び Ί 2 0を有す る非感染性 レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子が知 ら れて い た （ W 0 8 8 / 0 9 6 7 0 ) が 、 そ れは レ 卜 ロ ウ ィ ルスを処理 し て 得 ら れるも のであ つ て 、 遺伝子組み換え を利用 し て 、 レ十 ロ ウ ィ ルス を形 成す る こ と な く envタ ンパ ク 質を含 ま な い レ ト ロ ウ ィ ル ス ♦ コ ア構造物 が製造で き る こ と は知 ら れて いなか っ た ぐ 発明 の開示 >
本発明者 ら は 、 鋭意研究の結果 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー を感染さ せ た細胞中で 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルスの envタ ンパ ク 質を発現さ せず に 、 gagタ ンパ ク 質 、 及び polタ ンパ ク 質を発現さ せ る こ と に よ っ て 、 開裂型の gagタ ンパ ク 質 が発現 し 、 そ の開裂型 gagタ ンパ ク 質 に よ り 構成さ れる 感染性を持た ない 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子の構造の一部 と 同一 の抗原性を有す る レ ト ロ ウ イ ルスの コ ア構造物粒子 が得 ら れる こ と を見い だ し 、 本発明 を完成す る に 到 っ た ぐ 図面の簡単な説明 >
第 1 図 はプ ラ ス ミ ド P U H K , 第 2 図 はプ ラ ス ミ ド P N Z 6 8 K 2 , 第 3 図 はプラ ス ミ ド W — gag の構築手 頫を示す 。
< 発明を実施するた め の最良の形態 >
本発明 に おいて 「 e n Vタ ンノ ク 質 」 と は 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス の感染、 病原性を司 る envタ ンパ ク 質及びそ の変異 物や改変物 をいい 、 感染へ の影饔力 、 病原性を失 っ た envタ ンパク 質の改変物等を意味 し な い 。 本発明 に おい て 「 env遣伝子を含 ま な い 」 と は 、 envタ ン ノ ク 質 を コ ー ド し て い る遺伝子を発現 し得る形で含 ま な い こ と を 意味 し 、 レ 卜 ロ ウ ィ ル ス の感染、 病原性に 関係の な い env遺伝子由 来の遗伝子 （ env遺伝子の一部や env遺伝 子の改変物等 ） を含んでい て も構わ ない 。 W 08 8 Z 0 9 6 7 0で開示さ れた gp1 6 0及び 9ΡΊ 2 0を含 ま ない レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子は 9P1 2 0がないた め 内包 す る遺伝 子が細胞内 に取 り 込 ま れる可能性が少ない が 、 万が一、 内 包 す る遺伝子が細胞 内 に 取 り 込 ま れ た 場 合 、 レ ト ロ ウ ィ ルス の全遺伝子を有 し ている た め； レ 卜 ロ ウ ィ ルス を構築 し て し ま う 危険性が あ るが、 本発明 の粒子 は env 遺伝子を含んでいない ので 、 そ の よ う な危険性 は な い 。 し か し 、 本発明 に おい て も 、 env遣伝子の改変物 を含ん でいる場合、 変異な ど に よ り 病原性を回復する可 能性が あ る こ と か ら 、 env遛伝子の改変物 も含ん で い ない こ と が好 ま し い 。
本発 明 に 用 い る レ ト ロ ウ イ ル ス は 、 ウ ィ ル ス ♦ べ ク タ ー を感染さ せ る動物培養細胞 に おい て 、 gagタ ンパク 質 、 及び 又 は polタ ンパク質が発現で き 、 env遗伝子 を含 ま な いもので あれば特に 限定 さ れない 。 例 え ば、 才 ン コ ウ ィ ルス亜科ま た は 、 レ ンチウ ィ ルス亜科 に 属す る もの ウ ィ ルス、 特に 、 H I V— I 、 H I V— I、
H T L V— I 、 H T L V— Iが挙げ ら れる 。
本発明 に おい て 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー に 組み込 ま れる レ ト ロ ウ イ ルス の c D N Aは 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー を感 染さ せ る動物培養細胞 に おいて 、 gagタ ンパ ク 質、 及び ま た は polタ ンパ ク 質が発現でき 、 env遺伝子を含 ま な い も の で あ れ ば 、 特 に 限定 さ れ な い 。 例 え ば 、 ト1 1 ー 1 の gag遺伝子及び pol遺伝子を コ ー ド し 、 env遺伝子を 含 ま ない c D N Aは 、 P N し 4 3 ( ジ ャ ー ナル ♦ 才ブ ♦ ヴ ィ □ □ ジ — （ Vi rol . ) 、 5_ £、 2、 2 8 4、 （ 1 9 8 6 ) 〉 な ど の よ う に 、 エ イ ズ患者の染 色体 に プ ロ ウ イ ルスの形で組み込 ま れた H I V一 Iを一 旦 ；（ フ ァ ー ジな ど を用 い て ク ロ 一 二 ング し 、 そ れを用 い て H I V— Iの全 c D N Aを含むプラ ス ミ ド を構築する か 、 あ るい は-、 患者 よ り 分離 し た H I V一 I の R N Aゲ ノ ムを逆転写 し て c D N Aに変換 し 、 そ の 後プラ ス ミ ド に 移 し て H I V - I の全 c D N Αを含むプ ラ ス ミ ド を構 築 し 、 得 ら れたプラ ス ミ ド を適当 な制 限酵素で切断 し 、 gagタ ンパ ク賀、 pol遺伝子の両方の コ一 ド頜域を含む D N A断片を調製する こ と に よ つ て 得 ら れ る 。
本発明 に 用 い る ウ イ ルス · ベ ク タ 一 ち動物細胞に 感染 し 、 gag遗伝子 、 及び po I遺伝子 を発現で き る ち のであ れば、 特 に 限定 さ れない 。 例 え ぱ、 ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ル ス 、 ア ビボ ッ ク ス ♦ ゥ イ ノレス 、 バキ ュ 口 ， ゥ ィ ルス な ど が あ げ ら れる 。
本発明 に用 いる gag遗伝子、 及び ま た は pol遺伝子 を組み込ん だゥ ィ ルス ♦ ベ ク タ 一 の構築方 法も 、 特に 限 定さ れない 。 例 えば 、 ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー と し て ワ ク チ 二 ァ · ウ ィ ルス を用 い る場合、 組み込む遺伝子を ョ 本脳 炎ウ ィ ルス の表面抗原蛋 白質を コ ー ド する 遺伝子か ら レ 卜 ロ ウ ィ ルス の gag遺伝子、 及び zま た は pol遺伝子 に 代え る こ と 、 用 いる ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ルス が必ず し も好 ま し い条件を 篛た す必要の無い こ と 以外 は特開平 1 一 7 4 9 8 2 号 に 記載さ れた 方法 に よ り 構築する こ と がで き る 。
次いで 、 構築さ れた gag遺伝子及び pol遺伝子を コ ー ドす る c D N A断片が組み込 ま れた ウ ィ ルス · ベ ク タ ー を 、 ま た は gag遺伝子を コ ー ド する c D N A 断片が組 み 込 ま れ た ウ ィ ルス ' ベ ク タ ー と po I遺伝子を コ ー ド する c D N A 断片が耝み込 ま れた ゥ ィ ルス ♦ ベク タ ー を 、 動 物培養細胞 に 感染さ せ 、 そ の培養上清中 に 開裂型の gag タ ンパ ク 質 、 及び polタ ンノ ク 質を発現させる 。
本発明で用 い る動物培養細胞 は ウ ィ ルス · ベ ク タ ー が 増殖可能なも ので あれば よ く 、 そ の具体例 と し て 、 ウ イ ルス · ベ ク タ ー が ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ルスで あ る場合は 、 例 え ば T K - 4 3 ( ヒ 卜 骨肉腫由 来 ） 、 F L ( ヒ 卜 羊 膜由 来 ) 、 Hela ( ヒ 卜 子宮頸部癌由 来 ） 、 K B ' ( ヒ 卜 ^ 咽喉癌由 来 ） 、 R K 1 3 ( ゥサ ギ腎由 来 ） 、 C V — 1 ( サル腎由 来 ） 、 B S C — 1 ( サル腎由 来 ） 、 L 9 2 9 ( マ ゥ ス 結合組織由 来 ） 、 C ： ( ニ ヮ 卜 リ 胚 ） 細 胞 、 D E F ( 二 ヮ 卜 リ 胎児繊維芽細胞 ） 、 S W 4 8 0 ( ヒ 卜 結腸ガ ン由来 ） な どが例示さ れる 。 ウ ィ ルス ， ベ ク タ ー が ア ビボ ッ ク ス · ウ ィ ルス で あ る場合 は、 本発明で用 い る勤物培養細胞 と し て は鶏胚用 繊雜芽細胞な ど の鶏由 来 細胞な ど が例示さ れる が 、 発育鶏卵漿屎膜な ど も含む。 ウ ィ ルス · ベ ク タ 一 がバキ ュ 口 • ウ ィ ルス の場合 は 、 例 え ばス ポ ドプテ ラ ♦ フ ルギぺルダ ( Spodoptera f u rug i erda ) 由 来の S f 9 株な ど が例示さ れる 。 し か し 、 一般的な培養条件 に お い て は 、 用 い る細胞 に よ っ て は 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現量が低く 、 例 えば C V - 1 に H I V— Iの遣伝子を組み込ん だ ワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ルス を感染さ せ た 場合 に は 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質 は ほ と ん ど発現が認め ら れな い 。 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現量が多い ウ ィ ルス ♦ ベ ク タ ー と動物培養細胞の 組み合せが好 ま し く 、 その よ う な例 と し て は H I V - I の遺伝子を組み込ん だ ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス を S W 4 8 0 に感染 さ せ も の が あ る 。
こ こ で発現さ れる g a gタ ンパ ク 質の 開裂 は p 1 0な ど プ ロ テ ア ーゼ活性を有する polタ ンパ ク 質 に よ る も の と 考え ら れる 。
培養上清か ら の開裂型 gagタ ンパ ク 質の精製 は特 に 限 定 さ れない 。 例 えば、 常法 （ サイ エ ン ス （ Science ) 、 2 2 4 、 4 9 7 — 5 0 0、 （ 1 9 8 4 ) ) に従 っ て 、 上 清を シ ョ 糖 、 あ る い は酒石酸 カ リ ウ ム密度勾配遠心を行 い 、 更 に セ シ ウ ム ク ロ ラ イ ド沈降平衡遠心を行え ば よ い 開裂型 gagタ ンパ ク 質 は粒子を形成 し て 、 回収さ れる 。
本発明 の 開裂型 gagタ ンパ ク 質に よ り 構成さ れる粒子 は 、 例 え ば、 レ ト ロ ウ イ ルス が H I V— Iで 、 比重 よ り 分画 し た 場合 、 比重が H I V— I粒子 と 周 じ 約
1 . 1 5の フ ラ ク シ ョ ン に 認 め ら れる 。
精製の各段階 に おい て ど の フ ラ ク シ ョ ン 中 に 粒 " f が存 在 す る か の確認の方法 は特 に 限定 さ れな い 。 例 え ば 、 gagタ ンパ ク 質に対す る 抗体を使 う 方法や逆転写 酵素活 性を測定 す る方法がある 。 本発明 の 開裂型 gagタ ンパ ク 質に よ り 構成さ れる粒子 は逆転写酵素を 内包 し て い て も 内包 し て いな く て も か ま わないが 、 通常、 少な く と も一 部 は逆転写酵素を内包する 。 従 っ て 、 逆転写酵素活性を 測定すれば、 本発明 の粒子を含む フ ラ ク シ ョ ン は判別で ぎる。
逆転写酵素活性の測定 は常法 に従え ば よ い 。 例 え ば 、 微生物学実習提要 （ 東京大学医科学研究所学友会編 ） の 記述 に準 じ て組み換え ウ ィ ルス感染細胞上清を Po l y-Aを 鍩型、 ol igo-dTをプラ イ マ 一 と し て 、 "2 P — d T T P の 酸不溶性画分への取 り 込みを測定すれば よ い 。
本発 明 の粒子は 、 ウ ィ ルス ' ベ ク タ ー を感染さ せ た 動 物培養細胞の生体膜由 来の脂質二重膜 と考 え ら れる ェ ン ベ ロ ープ様のもの を伴 っ て いる 。 こ の粒子 は 、 脂質二重 膜を有 し た ま ま でも抗原 と し て 機能するが 、 脂質二重膜 がある こ と が好 ま し く な い場合は 、 タ ンパク 質が失活 し ない条件下でのエ ー テル等の有機溶媒処理や 、 凍結融解 処理に よ り 破碎 し 、 除去す る こ と がで きる 。
こ の粒子 は細胞への感染を司 る envタ ンパク 質及びそ の遣伝子も含 ま ないので、 病原性を示さ ない 。 そ の他の 遺伝子 は含んで い て も含んで いな く て も構わな い 。 周様 に 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質に よ り そ の構造が形成さ れて いれば、 envタ ンパ ク 質以外の タ ンパ ク 質 を含んで い て も 含んで いな く て も構わ ない 。 ま た 、 エ ンベ ロ ー プ様の 脂質二重膜の有無を 問わ な い 。 こ の粒子 は抗原性を有 し さ ら に そ の抗原性 は envタ ンパク 質 に 比べ て 変異が少な い と 考え ら れる gagタ ンパ ク 質 、 ま た は内包さ れて いる 場合 に は po Iタ ンパク質お よ び gagタ ンパ ク 質に 由 来す るも のであ る 。 さ ら に 、 自然界の ウ ィ ルス粒子の一部 と 周一ま た は類似の構造を有 し て い る こ と か ら 、 gagタ ン パク 質、 po Iタ ンパ ク 質 、 あ る い はそ の単な る混合物以 上の抗原性も期待で き る 。
レ 卜 □ ウ ィ ル ス は エ イ ズ 、 成 人 T 細 胞 白 血病 、 癌 、 リ ュ ー マ チ等の 多 く の難病の病原 ウ ィ ルス で あ る と 確認 ま た は推定 さ れて お り 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス が原因で起 こ る 病気の多 く は効 果の あ る ワ ク チン は知 ら れて い な か っ た が 、 本発明 の レ ト ロ ウ イ ルス の コ ア と 同一 ま た は類似の 構造を有 し て い る粒子 は優れ た 効 果が期待で き る 。
か く し て 本発明 に よ れば 、 レ ト ロ ウ イ ルス 由 来の gag タ ンパ ク 質を コ ー ド す る c D N A 及び po Iタ ンパ ク 質を コ ー ドす る c D N A を ウ ィ ルスの増殖 に非必須なゲノ ム 領域に 組み込ん だウ ィ ルス · ベ ク タ 一 を感染さ せ た 細胞 を培養 し 、 開裂型の gagタ ンパ ク 質 に よ り 構成さ れ 、 envタ ンパ ク 質及び env遺伝子を含 ま ない レ ト ロ ウ ィ ル スの コ ア構造物 が得 ら れる 。 こ の構造物 は 、 レ 卜 ロ ウ ィ ルス粒子の構造の一部 と 同一 の構造を持つ が感染性を持 た な い こ と か ら 、 こ れを有効成分 と す る こ と に よ り 、 有 効な レ 卜 ロ ウ ィ ルス · ワ ク チ ン が得 ら れる こ と が期待で ぎる 。
( 実施例 以下実施例を挙げて本発明 を更 に 具体的 に説明 する 。 実施例 1
(1) 組み換えベ ク タ ー P U H Kの作製 （ 第 1 図参照 ） p U C 9 ( フ ア ルマ シ ア社製 〉 を E c o R I 、 及び P s t Iで消化後 、 ポ リ メ ラ ーゼで処理 し 、 切 断端を平 滑末端 と し 、 連結 し 、 E c o R I部位-の欠損 し た
P U C 9を作製 し た 。 E c o R I部位欠損 P U C 9を H i n d IEで 切 断後、 ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス T K遺伝子を 含むワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株 の H i n d DI J 断片 に連 結 し 、 組み換え べ ク タ一 p U Η Kを得 た 。
(2) 組み換え ベ ク タ ー Ρ Ν Ζ 6 8 Κ 2の作製 （ 第 2 図参照 ）
ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株の 7 . 5 Κプ ロ モ ー タ ー ( モス ら （ Hoss et. al ) 、 セル （ Cel l ) 、 1 2 5、 8 0 5 — 8 1 3、 （ Ί 9 8 1 ) ) を P U C 1 9 ( フ ア ルマ シ ァ社製 ） の H i n c 部位に挿入 し た 後 、 H i n d I と E c o R I で頫次 ¾ 断 し て 、 7 . 5 Kプ ロ モ ー タ 一 の 前後 に ポ リ リ ン カ 一部位を有す る D N A断片 （ 約 3 5 0 bp) を得た 。
こ の D N A断片の ヌ ク レ ア ーゼ処理 し た も の 、 及 び （ 1 )で得たプラ ス ミ ド P U H Kの E c 0 R I消化物 を ポ リ メ ラ 一ゼ処理 し た も の を連結 し 、 得 ら れた組み換え プラ ス ミ ド を 0 N Z 6 8 K 2 と 命名 し た 。
(3) 組 み換えプラ ス ミ ド gag の作製 （ 第 3図参 照 ） H I V - I の全 c D N Aを含 む P N L 4 3 を B g ^ I と E c o R ェ で 消化後、 低融点 ァ ガ ロ ー ス電気泳動で約 5 . Ί kbp の断片を分離 し 、 フ エ ノ ール抽 出 に よ り そ の 断片を 回収 し た
こ の 断片中 に は 、 第 3 図 に 示す よ う に 、 gag遺伝子 、 及び pol遺伝子領域が含 ま れて い る 。
次 に 、 （2-)で得た 0 N Z 6 8 K 2を B a m H I と E c 0 R ェ で 消化 し 、 先 に 調製 し た gag遺伝 子； 及び pol遺伝子を含む D N A断片 と ラ イ ゲー シ ヨ ン し て 組み 換えプラ ス ミ ド W- gag を得た 。
(4) 組み換え ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス の作出 （ 第 3 図参 照 〉
2 5 cfli 2 の 力 ルチ ヤ 一 ポ ト ル に培養さ れた C V— Ί 細 胞 に ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス W R株を 0. 1 p . f . u . Z細胞接 種 し 、 4 5分後 m pd耝み換えプラ ス ミ ド W- gag を 2 . 2 の 滅菌水で溶か し 、 樋髙 ら （ 蛋 白 質 ♦ 核酸 · 酵 素 、 2 L、 3 4 0、 ( 1 9 8 5 ) ) の方法 に よ っ て 、 D N A — リ ン酸カ ルシ ゥ ム共沈物 をつ く り 、 そ の 0 . 5 /^を感染 C V— 1 細胞上 に 滴下 し た 。 3 0分 II3、 3 7で 5 % C 02 イ ンキ ュ べ 一 タ ー に静置 し 、 5 %牛胎児血清 を含 む Eag I e M E M培地 4 . 5 idを加 え た 。 そ の 3 時間 後培養液を交換 し 、 4 8 時 間後 、 培養細胞 ご と 3 度凍結 融解 し 、 3 0秒間超音波処理 し た
組み換え休の gag遺伝子 、 及び pol遺伝子の揷入を確 認す る た め 、 6 cmの ぺ 卜 リ 皿 に 培養さ れた T K陰性 ( T K " ) "1 4 3細胞 に上記プラ ー ク 形成 ウ ィ ルス を接 種 し 、 4 5分後、 1 %寒天 · 1 2 %牛胎児血清 ♦ 2 5 ^ 2 ^ B U d R加 Engle M E M培地を積層 し 、 3 日 間 培養後、 感染細胞を 0 . 0 1 %ニ ュ ー 卜 ラル ♦ レ ッ ドで 染色 し た 。 形成さ れた プラ ー ク をパスツ ール ピぺ ッ 卜 で 単離 し 、 Eagle M E M培地 中 に希釈す る 。 単離 し た ブラ ー ク にっ き 、 再度同様の操作を緩 り 返 し 、 プラ ー ク を純 化 し た 。 純化 し た プラ ー ク よ り 得 ら れた ウ ィ ルス を増殖 させ 、 増殖 ウ ィ ルス よ り D N Aを調製 し 、 gag遺伝子 、 及び pol遺伝子を コ ー ド す る c D N Aをプ ロ ブ と す る ド ッ 卜 プ ロ ッ ト ハイ プ リ ダイ ゼ ー シ ヨ ン に よ り 、 得 ら れ た組み換え ワ ク チニ ァ ウ ィ ルスが H I V— I 由 来の gag 遺伝子 、 及び pol遺伝子を コ ー ドす る D N Aをゲノ ム内 に持つ組み換え ウ ィ ルスで あ る こ と を確認 し 、 V — 2 0 一 1 — 8 と命名 し た 。
(6) 組み換え体の細胞上清で の発現
耝耩培養用 9 cnデ ィ ッ シ ュ に培養 し た S W 4 8 0細胞 に Bi.o. i. 1 0〜 2 0の V— 2 0 — 1 — 8 を接種 し 、 3 7 で 、 1 時簡感染させた後 、 ウ ィ ルス液を抜取 り 、 細胞を Eagle M E Mで洗净 し 、 5 %牛胎児血清加 Eag I e M E M を加えた 。 1 6時間後 、 細胞上清を回収 し 、 1 0 IDH卜 リ ス ♦ 塩歷 （ PH7 . 4 ) - 0 . 1 M N a C - 1 ηιΗ
E D T A溶液で作製 し た 2 0〜 6 0 % の酒石酸 カ リ ウ ム の密度勾 配上 に 重層 し 、 ロ ー タ ー S W 4 7 ( ベ ッ クマ ン 製 ） で 3 5 , 0 0 0 rpm 、 1 6時間遠心 し た 。 遠心後 、 各 フ ラ ク シ ョ ン に 分け た 。
5 0 mH Tr i s - H C ( PH8 . 0 ) 、 Ί 0 mHジ チ 才ス レ イ 卜 一ル、 7 5 mH K 〇 ^ 、 5 mH M g C ^ 2 、 1 0 μ. ^ / id o I y-A 、 9 / id o I i go-dT 、 0 . 0 5 % N P 4 0 を含む反応液 5 raUこ [ ひ 一 32 P 】 一 d T T P ( 4 0 0 CiZ mmoし 1 0 fflC iノ ) を 5 〜 1 0 〃 ·β 加 え た 。 こ の 反応 液 を 、 9 6 穴 U 字型 プ レ ー 卜 に フ ラ ク シ ヨ ン と 対照 の 数 だけ 分 注 し て お き 、 そ こ へ 各 フ ラ ク シ ヨ ンあ る い.は対照用 1 0 ηιΗ卜 リ ス ♦ 塩酸 （ ρΗ 7 . 4 ) 一 0. I M N a C ^ — I mHE D T A溶液 加 え 、 3 7 °Cで 1 時間反応さ せ た 。 反応中 に 、 二 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ル タ ー に鉛筆で 2 間 隔の碁盤の 目 を書い て お き 、 反応終了後、 各 フ ラ ク シ ョ ン及び対照の反応液 1 0 ^ _£ を二 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ル タ ー上の各区画 に スポ ッ 卜 し た 。 こ の フ ィ ル タ ー を l乾に よ り 完全 に 乾燥さ せ た後、 5 % 卜 リ ク ロ ロ 酢酸 一 5 %ピ ロ リ ン酸ナ ト リ ウ ム液 中で 1 5分間振盪 し な が ら 洗净 し 、 未反応の放射性前駆休を 除去 し た 。 続い て 5 % 卜 リ ク ロ ロ 醉酸 中で 5分、 そ し て 5 0 %エ タ ノ ー ル中で 5分洗净 し た 。 乾燥後、 碁盤の 目 にそ っ て各 区画 を切 り 放 し 、 シ ン チ レ ー シ ヨ ンバイ アル に入れて 、 ト ルエ ンシ ン チ レ ー タ ー 中 で 液休シ ンチ レ一 シ ヨ ン カ ウ ン タ 一 に よ り 取 り 込みを測定 し た 。 対照 の 3 倍以上の 取 り 込みを 陽性 と し 、 逆転写 酵素活性が あ る と 判断 し た 。
次いで 、 逆転写酵素活性が認め ら れ た フ ラ ク シ ョ ン を S D S — ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動で分画 し 、 二 卜 ロ セル ロ ー ス フ ィ ルタ ー にブ ロ ッ テ イ ングす る （ アナ リ テ ィ カ ル ' パ イ オケ ミ ス 卜 リ イ （ Anaに B i ochem. ) 、 1 2 、 1 9 5 — 2 0 3 、 （ 1 9 8 1 〉 ） 。 検出法 と し て 1251 ラ ベルプ ロ テ イ ン A 、 抗 p> 2 4 モ ノ ク ロ ー ナル 抗体 ( Japanese Journal of Cancer Reserch、 7 8 、 2 3 5 - 2 4 1 , ( 1 9 8 7 ) 〉 を利用 す るいわ ゆ る ゥ ェ ス タ ンブ ロ ッ テ イ ング法 に よ っ て 、 開裂型 gagタ ンパ ク 質の発現 が確認さ れ、 V — 2 0 — 1 — 8 感染 S W 4 8 0細胞 はそ の上清 に分子量 2 4 , 0 0 0 ダル ト ンの 開裂 型 g agタ ンパク 質 p 2 4 を産生 し て い る こ と が判 明 し た gag-p5 5 の構造か ら判 断する に 、 gag-p5 5 の 中央部 分の ア ミ ノ 酸配 列 に 相 当 す る P 2 4 が 産生 さ れ て い る こ と か ら 、 gag-p5 5 の両端の ア ミ ノ 酸配列 に相当 す る p l 7 、 P 1 5 も産生さ れて い る と 考 え ら れる 。
逆転写酵素活性の検出 さ れる比重約 1 . 1 5 の分画を さ ら に セ シ ウ ム ク ロ ラ イ ド沈降平衡遠心 に よ り 精製 し 、 逆転写酵素活性の検出 さ れる比重約 1 . 1 5 の分画 に P 2 4 が確認さ れた 。
いわ ゆ るネガテ ィ ブ染色法 に よ り 、 上記の p 2 4 が確 認さ れた 分画を電子顕微鏡 に よ り 観察す る と ワ ク チニ ァ ウ ィ ルス と は異 なる直径約 1 1 0〜 Ί 5 0 nmの球形 の粒 子が認め ら れた 。
ぐ 産業上の利用 可能性 >
本発 明 に よ れば、 開 裂型の gagタ ンパク質 よ り 構成さ れる レ ト ロ ウ イ ルスの コ ア構造物 が感染性をもつ 又は感 染性を発現さ せる envタ ンパ ク 質も env遺伝子を も 含 ま ず に 製造 さ れる こ と と な る ので 、 安全性の点で 問題が よ り 少 く な い レ ト ロ ウ イ ルス ♦ ワ ク チン が提供さ れる可 能 性が髙 く 、 産業上の利用 可 能性が高い 。

Claims

請 求 の 範 囲
1. レ ト ロ ウ イ ルス に属 す る ウ ィ ルス の env遣伝子 を含 まず レ ト ロ ウ イ ルス に属する ウ ィ ルス の少な く と も gag遺伝子及び pol遺伝子を組み込ん だ ワ ク チニ ァ * ゥ ィ ルスを細胞 に感染させ、 ま た は レ ド ロ ウ ィ ルス に属す る ウ ィ ルス の env遣伝子を含 ま ず レ ト ロ—ウ ィ ルスに 属す る ウ ィ ルスの少な く と も gag遗伝子を組み込ん だ ヮ ク チ ニ ァ · ウ ィ ルス と レ 卜 ロ ウ ィ ル ス に 属 す る ウ ィ ル ス の envl伝子 を含 まず レ ト ロ ウ イ ルス に属する ウ ィ ルスの 少な く と も po I遺伝子を組み込ん だワ ク チニ ァ ♦ ウ ィ ル スを周一の細胞 に感染させ 、 感染させた 細胞を培養する こ と に よ る 、 envタ ンパク 質を含 ま ない レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ァ構造物粒子の製造方法 。
2. レ ト ロ ウ イ ルス に 属する ウ ィ ルス が オ ン コ ウ イ ルス亜科、 ま た は レ ン チ ウ ィ ルス亜科に属す る ウ ィ ルス で あ る請求項 Ί 記載の レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア構造物粒子 の製造方法 。
3. レ 卜 ロ ウ ィ ルス に 厲する ウ ィ ルス が H I V— I H I V— E、 H T L V— ェ 、 ま た は H T L V— 1で ある 請求項 2記載の レ ト ロ ウ イ ルス * コ ア構造物粒子 の製造 方法。
4. 細胞が ヒ 卜 結腸ガ ン由来で あ る S W 4 8 0細胞 で あ る 請求項 3 記載の レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア構造物粒子 の製造方法。
5 . 請求項 1 、 2 、 3 、 ま た は 4 記載の レ ト ロ ウ イ ルス ♦ コ ア構造物粒子の製造方法 に よ り 製造さ れた レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア構造物粒子 。
6 . 請求項 5 記載の レ 卜 ロ ウ ィ ルス ♦ コ ア 構造物粒 子を有効成分 と する抗 レ 卜 ロ ウ ィ ルス ， ワ ク チ ン 。
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