JPH0372874A - レトロウィルス・コア構造物の製造方法及びそれによって製造された粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はレトロウィルス科に属するウィルスの開裂型ｇ
ａｇタンパク質から戒る粒子のｗ４造法、及びその製造
法により製造される粒子、その粒子を有効成分とするワ
クチンに関し、さらに詳しくは、レトロウィルス科に属
するウィルスのｅｎｖ遺伝子を含まず少なくともｇａｇ
遺伝子及びｐｏｌ遺伝子を組み込みんだウィルスベクタ
ーを感染させた、またはレトロウィルス科に属するウィ
ルスのｅｎｖ遺伝子を含まず少なくともｇａｇ遺伝子を
組み込んだウィルス・ベクターとレトロウィルス科に属
するウィルスのｅｎｖ遺伝子を含まず少なくともｐｏｌ
遺伝子を組み込みんだウィルスベクターを感染させた動
物培養細胞を培養し、発現させ、　ｇａｇタンパク質前
駆体を開裂させることにより得られる開裂したｇａｇタ
ンパク質によって構成される粒子を製造する方法、その
ようにして製造される粒子、及びその粒子を有効成分と
するワクチンに関する。

（従来の技術） 最近、後天性免疫不全症候＃（エイズ）の発症、蔓延が
世界的に憂慮されており、その予防、治療対策が緊急課
題となっている。

数年前より、エイズや成人Ｔ、１８１胞白血病などの原
因ウィルスと考えられる種々のレトロウィルスが単離、
同定され、その遺伝子の塩基配列が決定された。その結
果、これらは同類または同一であると報告されるように
なった。特にエイズの病原ウィルスとされたＨＴＬＶ−
ｍ、ＬＡＶ、ＡＲＶは同じウィルスであり、ＨＩ　Ｖ　
（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉ
ｒｕｓ）と統一して命名された。

レトロウィルス粒子は、多くのタンパク質で構成されて
おり、外皮糖タンパク質（ｅｎｖタンパク質と称し、Ｈ
ＨＶ−１の場合、前駆体であるｅｎｖ−ｇｐ１６０が開
裂してｇｐ１２０、及びｇＰ４１の２種のｅｎｖタンパ
ク質となる）、逆転写酵素（ＨＩＶＩの場合、　Ｐ６５
、及びｐｓｔがある）、核タンパク質（ｇａｇタンパク
質と称し、ＨＩＶ−Ｉの場合、前駆体であるｇａｇ−ｐ
５５が開裂してＰＩ３、　Ｐ２４、及びＰＩ３の３種の
ｇａｇタンパク質となる。なお、ｇａｇ−ｐ５５のアミ
ノ酸配列では、　ｐ１７相当のアミノ酸配列、ｐ２４相
当のアミノ酸配列、　ｐ１５相当のアミノ酸配列がこの
順番で連続している）などと命名されている。また−　
ＨＩＶに独特なものと言われるｔａｔ−ｖｉｆ、ｒｅｖ
、　　ｎｅｆなどの調節遺伝子産物が知られているが、
　ｖｉｆ産物以外はＨＩＶ粒子中には存在しない。

ｅｎｖタンパク質であるｇＰ１２０は感染の際にウィル
ス粒子を細胞膜に固定化する機能を有し、ｇｐ４１はウ
ィルス遺伝子の細胞内への侵入させる機能を有する。　
ｇａｇタンパク質であるＰ２４はコアタンパク質の主成
分であり、　ＰＩ７はマトリックスタンパク質であると
考えられている。逆転写酵素はｐｏｌ遺伝子にコードさ
れている。　ｐｏｌ遺伝子は他にもｐｌｏ（プロテアー
ゼタンパク質）、　ｐ３１　（エンドヌクレアーゼであ
り、インテグラーゼ活性を有するとも言われる）をコー
ドし、これらｐａｌにコードされているウィルス酵素群
をｐｏｌタンパク質と呼ぶ、　　ｖｉｆはＰ２３（ウィ
ルス粒子の構築に関与していると考えられている）をコ
ードしている。

効果的なエイズワクチンを得ようとする場合には、ウィ
ルスを中和し得る抗体を誘導するのに適当な抗原を含ん
でいることが必要である。そのような抗原としてｅｒｉ
ｖタンパク質、特にｓｔｈ能力に関係するとされるｇＰ
１２０　（セル（Ｃｅｌｌ）、邸、４８３、（１９８８
））がその最有力候補として選ばれ、この抗原タンパク
質をコードする遺伝子を大腸菌に組み換える遺伝子操作
゛技術により産生ずる研究（例えば、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、　趨、　９３−９６、＜１９８５））な
どが既に行われている。

しかし、種々の患者や感染者から分離されたＨＩＶのゲ
ノム塩基配列の解析結果より、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子は
極めて変異が激しいことが明かとなり（サイエンティフ
ィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ）、艶、　８４−９３、（１９８５））、この
部位を利用する手法では全てのＨＩＶに対応できない可
能性がある。

これに対し、ウィルス粒子の骨組みとなるｇａｇタンパ
ク質をコードする遺伝子や逆転写酵素等をコードしてい
るｐｏｌ遺伝子は変異の起こる確率が低い可能性があり
、それらの遺伝子産物を抗原とするワクチンは有利であ
ると考えられ、逆転写酵素を大腸菌に組み換える遺伝子
操作によって産生ずる研究（例えば、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、　勉、３０５−３０８、（１９８７））
、ｇａｇ−Ｐ５５やｐ２４などを組み換え多核体ウィル
スの系で産生ずる研究（例えば。

ヴイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　　喝、　２４８
−２５０、（１９８７））、　ｐ１７の抗原決定部位に
特異的に結合する抗体と結合するポリペプチドを合成す
る研究（特開昭８３−２７４９８号）、　ｐ１７の単ク
ローン抗体がエイズの中和活性を有するという報告（ジ
ャーナル・オブ・ヴイロロジー（Ｊ、　ＶｉｒｏＬ）、
鎚、　２６７−２７２．　　（１９８９））なども行わ
れている。また、発明者らも、　　１９８７年１２月、
エイズ研究会学術集会でｔａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子
を組み込んだワクチニアウィルスについて発表した。

しかし、レトロウィルスのｇａｇ遺伝子全体の組み換え
によって、　ｇａｇ−ｐ５５等の非開裂型ｇａｇタンパ
ク質の発現は確認されていたが、その場合、ｐｏｌ遺伝
子の組み換えの有無によらず、開裂型ｇａｇタンパク質
の発現は確認されていなかった。

また、　ｇｐ１８０及びｇＰ１２０を含まないＨＩＶを
含まない非感染性レトロウィルス粒子が知られていた（
　１０８ｇ１０９８７０）が、それはレトロウィルスを
処理して得るものであって、遺伝子組み換えを利用して
レトロウィルスを形成させず、　ｅｎｖタンパク質を含
まないレトロウィルス・コア構造物が製造できることは
知られていなかった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、鋭意研究の結果、ウィルス・ベクターを
Ｓ染させた細胞中で、レトロウィルスのｅｎｖタンパク
質を発現させずに、　ｇａｇタンパク質、及びｐｏｌタ
ンパク質を発現させることによって、開裂型のｇａｇタ
ンパク質が発現し、その間判型ｇａｇタンパク質により
構成される、感染性を持たない、レトロウィルス粒子の
構造の一部と同一の抗原性を有するレトロウィルスのコ
ア構造物粒子が得られることを見いだし、本発明を完成
するに到った。

（課題を解決するための手段） 本発明においてウィルス・ベクターに組み込まれる遺伝
子はレトロウィルス属に属するウィルス由来のものであ
る。レトロウィルス属に属するウィルスは特に限定され
ないが、具体的にはオンコウィルス亜科に属するウィル
ス、レンチウィルス亜科に属するウィルスなどが挙げら
れ、さらに具体的にはオンコウィルス亜科に属するＨＴ
ＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩなと、レンチウィルス亜科に
属するＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩなどが挙げられる。

本発明においてｅｎｖタンパク質とは、レトロウィルス
の感染、病原性を司るｅｎｖタンパク質及びその変異物
や改変物をいい、感染への影響力、病原性を失ったｅｎ
ｖタンパク質の改変物等を意味しない。本発明において
ｅｎｖ遺伝子を含まないとは。

ｅｎｖタンパク質をコードしている遺伝子を発現し得る
形で含まないことを意味し、レトロウィルスの感染、病
原性に関係のないｅｎｖ遺伝子由来の遺伝子（ｅｎｖ遺
伝子の一部やｅｎｖ遺伝子の改変物等）を含んでいても
構わない。ｗ０８δ１０９８７０で開示されたｇｐ１８
０及びｇｐ１２０を含まないレトロウィルス粒子はｇＰ
　１２０がないため内包する遺伝子が細胞内に取り込ま
れる可能性が少ないが、万が一１粒子が内包する遺伝子
が細胞内に取り込まれた場合、レトロウィルスの全遺伝
子を有しているため、レトロウィルスを構築してしまう
危険性があるが、本発明の粒子はｅｎｖ遺伝子を含んで
いないので、そのような危険性はない。しかし、本発明
においても、　ｅｎｖ遺伝子の改変物を含んでいる場合
、変異などにより病原性を回復する可能性があることか
ら、　ｅｎｖ遺伝子の改変物も含んでいないことが好ま
しい。

本発明において、ウィルス・ベクターに組み込まれるレ
トロウィルスのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、ウィルス・ベクター
を感染させる動物培養細胞において、ｇａｇタンパク質
、及び／またはｐｏｌタンパク質が発現でき、　ｅｎｖ
遺伝子を含まないものであれば、特に限定されない。例
えば、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子をコ
ードし、　ｅｎｖ遺伝子を含まないｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、
　ｐＮＬ４３　（ジャーナル・オプ・ヴイロロジー（Ｊ
、　Ｖｉｒｏｌ、）、μｓ、　２．　２８４、（１９８
６））などのように、エイズ患者の染色体にプロウィル
スの形で組み込まれたＨＩＶ−１を一部λファージなど
を用いてクローニングし、それを用いてＨＩＶ−１の全
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含むプラスミドを構築するか、あるい
は、患者より分離したＨＩＶ■のＲＮＡゲノムを逆転写
してｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに変換し、その後プラスミドに移し
てＨＩＶ−１の全ｃ　Ｄ　ＮＡを含むプラスミドを構築
し、得られたプラスミドを適当な＄１限酵素で切断し、
　ｇａｇタンパク質、ｐｏｌ遺伝子の両方のコード領域
を含むＤＮＡ断片を調製することによって得られる。

本発明に用いるウィルス・ベクターも動物細胞にＪｉｓ
染し、　ｇａｇ遺伝子、及びｐｏｌ遺伝子を発現できる
ものであれば、特に限定されない。例えば、ワクチニア
−ウィルス、アビボックス・ウィルス、バキュロ・ウィ
ルスなどがあげられる。

本発明に用いるｇａｇ遺伝子、及び／またはｐｏｌ遺伝
子を組み込んだウィルス・ベクターの構築方法も、特に
限定されない。例えば、ウィルス・ベクターとしてワク
チニア・ウィルスを用いる場合、組み込む遺伝子を日本
脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質をコードする遺伝子から
レトロウィルスのｇａｇ遺伝子、及び／またはｐｏｌ遺
伝子に代えること、用いるワクチニア・ウィルスが必ず
しも好ましい条件を満たす必要の無いこと以外は特開平
１７４９８２号に記載された方法により構築することが
できる。

次いで、構築されたｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子をコ
ードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆＩ？片が組み込まれたウィ
ルス・ベクターを、またはｇａｇ遺伝子をコードするｃ
　Ｄ　Ｎ　Ａ　１１８片が組み込まれたウィルス・ベク
ターとｐｏｌ遺伝子をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片が
組み込まれたウィルス・ベクターを、動物培養細胞に感
染させ、その培養上清中に開裂型のｇａｇタンパク質、
及びｐｏｌタンパク質を発現させる。

本発明で用いる動物培養細胞はウィルス・ベクターが増
殖可能なものであればよく、その具体例として、ウィル
ス・ベクターがワクチニア・ウィルスである場合は、例
えばＴＫ−１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＰＬ　（ヒト羊
膜由来）、）ｌｅｌａ　（ヒト子宮頚部癌由来）、ＫＢ
　（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＲＫ１３　（ウサギ腎由来）
、ＣＶ−１（サル腎由来）　、　　Ｂ５Ｃ−１（サル腎
由来）、Ｌ９２９　（マウス結合組織由来）、ＣＥ　に
ワトリ胚）細胞、　ＤＥＦ　にワトリ胎児繊維芽細胞）
ＳＷ４８０　（ヒト結腸ガン由来）などが例示される。

ウィルス・ベクターがアビボックス・ウィルスである場
合は、本発明で用いる動物培養細胞としては鶏胚用繊維
芽細胞などの鶏由来細胞などが例示されるが、発育鶏卵
漿尿膜なとも含む。ウィルス・ベクターがバキュロ・ウ
ィルスの場合は、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（
汀餞坐燵Ｄｆｕｒｕ（転）ｍ）由来のＳｆＱ株などが例
示される。

しかし、一般的な培養条件においては、用いる細胞によ
っては開裂型ｇａｇタンパク質の発現量が低く、例えば
ＣＶ−１にＨＩＶ−１の遺伝子を組み込んだワクチニア
・ウィルスを感染させた場合には、開裂型ｇａｇタンパ
ク質はほとんど発現が認められない。開裂型ｒａｇタン
パク質の発現量が多いウィルス・ベクターと動物培養細
胞の組み合せが好ましく、そのような例としてはＨＴＶ
−１の遺伝子を組み込んだワクチニアウィルスを５％１
４８０に感染させる場合がある。

ここで発現されるｇａｇタンパク質の開裂はＰｌｏなど
プロテアーゼ活性を有するｐｏｌタンパク質によるもの
と考えられる。

培養上清からの開裂型ｇａｇタンパク質の精製は特に限
定されない。例えば、常法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、　甜、　４９７−５００、（１９８４））に従っ
て、上滑をショ糖、あるいは酒石酸カリウム密度勾配遠
心を行い、さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心を行
えばよい。開裂型ｇａｇタンパク質は粒子を形成して、
回収される。

本発明の開裂型ｇａｇタンパク質により構成される粒子
は、例えば、レトロウィルスがＨＩＶ−Ｉで、比重によ
り分画した場合、比重がＨＩＶ−Ｉ粒子と同じ約１．１
５のプラクジョンに認められる。

精製の各段階においてどのフラクション中に粒子が存在
するかの確認の方法は特に限定されない。

例えば、　ｇａｇタンパク質に対する抗体を使う方法や
逆転写酵素活性を測定する方法がある。本発明の開裂型
ｇａｇタンパク質により構成される粒子は逆転写酵素を
内包していても内包していなくてもかまわないが、通常
、少なくとも一部は逆転写酵素を内包する。従って、逆
転写酵素活性を測定すれば１本発明の粒子を含むフラク
ションは判別できる。

逆転写酵素活性の測定は常法に従えばよい。例えば、微
生物学実習提要（東京大学医科学研究所学友余幅）の記
述に準じて組み換えウィルスａ染細胞上清をｐｏｌｙ−
Ａを鋳型、ｏｌｉｇｏ−ｄＴをプライマーとして、　　
３２Ｐ−ｄＴＴＰの酸不溶性百分への取り込みを測定す
ればよい。

本発明の粒子は、ウィルス・ベクターをＦ６染させた動
物培養細胞の生体膜由来の脂質二重膜と考えられるエン
ベロープ様のものを伴っている。この粒子は、脂質二重
膜を有したままでも抗原として機能するが、脂質二重膜
があることが好ましくない場合は、タンパク質が失活し
ない条件下でのエーテル等の有機溶媒処理や、凍結融解
処理により破砕し、除去することができる。

この粒子は細胞への感染を司るｅｎｖタンパク質及びそ
の遺伝子も含まないので、病原性を示さない。その他の
遺伝子は含んでいても含んでいなくても構わない６　同
様に、開裂型ｇａｇタンパク質によりその構造が形成さ
れていれば、　ｅｎｖタンパク質以外のタンパク質を含
んでいても含んでいなくても構わない、また、エンベロ
ープ様の脂質二重膜の有無を問わない。この粒子は抗原
性を有し、さらにその抗原性はｅｎＶタンパク質に比べ
て変異が少ないと考えられるｇａｇタンパク質、または
内包されている場合にはｐｏｌタンパク質およびｇａｇ
タンパク質に由来するものである。さらに、自然界のウ
ィルス粒子の一部と同一または類似の構造を有している
ことから、　ｇａｇタンパク質、　　ｐｏｌタンパク質
、あるいはその単なる混合物以上の抗原性も期待できる
。

レトロウィルスはエイズ、成人Ｔ細胞白血病、癌、リュ
ーマチ等の多くの難病の病原ウィルスであると確認、ま
たは推定されており、レトロウィルスが原因で起こる病
気の多くは効果のあるワクチンは知られていなかったが
、本発明のレトロウィルスのコアと同一または類似の構
造を有している粒子は優れた効果が期待できる。

（発明の効果） かくして本発明によれば、レトロウィルス由来のｇａｇ
タンパク質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ及びｐｏｌタン
パク質をコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをウィルスの増殖に
非必須なゲノム領域に組み込んだウィルス・ベクターを
感染させた細胞を培養し、開裂型のｇａｇタンパク質に
より構成され、　ｅｎｖタンパク質及びｅｎｖ遺伝子を
含まないレトロウィルスのコア構造物が得られる。この
構造物は、レトロウィルス粒子の構造の一部と同一の構
造を持つがＳ染性を持たないことから、これを有効成分
とすることにより、有効なレトロウィルス・ワクチンが
得られることが期待できる。

（実施例） 以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
６ 実施例１ （１）組み換えベクターｐＵＨＫの作ＩＩ（第１図参照
）ＰＵＣ９（ファルマシア社製）をＥｃｏＲｌ、　　及
びＰｓｔ　Ｉで消化後、ポリメラーゼで処理し、切断端
を平滑末端とし、連結し、ＥｃｏＲ１部位の欠損したｐ
ｌＪｃ９を作製した。ＥｃｏＲ１部位欠損ｐＬＩｃ９を
旧ｎｄＩＩＩで切断後、ワクチニアウィルスＴＫ遺伝子
を含むワクチニアウィルスＷＲ株のＨｉｎｄｌＩＩＪ断
片に連結し、組み換えベクターρυ）ＩＫを得た。

（２）組み換えベクターｐＮ２８８に２の作製（第２図
参照） ワクチニアウィルスＷＲ株の７．５にプロモーター（モ
スら（Ｍｏｓｓ　ｅｔ、ａｌ）、　　セル（Ｃｅｌｌ）
、　頂、　８０５−８１３、（１９８／Ｌ））をｐＵｃ
１９　（ファルマシア社製）のＨｉｎｃＩ［部位に挿入
した後、ＨｉｎｄＩ［ＩとＥｃｏＲＩで順次切断して、
７．５にプロモーターの前後にポリリンカ一部位を有す
るＤＮＡ断片（約３５０ｂｐ）を得た。

このＤＮＡ断片の８１ヌクレアーゼ処理したもの、及び
（１）で得たプラス主ドＰＵＨＫのＥｃｏＲＩ消化物を
ポリメラーゼ処理したものを連結し、得られた組み換え
プラスミドをＰＮＺｅ８に２と命名した。

（３）組み換えプラスミドトｇａｇの作製（第３図参照
） ＨＩＶ−１の全ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含むＰＮＬ４３をＢｇ
！ＱＩＩとＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロース電気
泳動で約５−１ｋｂｐの断片を分離し、フェノール抽出
によりその断片を回収した。

この断片中には、第３図に示すように、　ｇａｇ遺伝子
、及びｐｏｌ遺伝子領域が含まれている。

次に、　（２）で得たｐＮ２６８に２をＢａｍＨＩとＥ
ｃｏＲＩで消化し、先に調製したｇａｇ遺伝子、及びｐ
ｏｌ遺伝子を含むＤＮＡ断片とライゲーションして組み
換えプラスミドＷ−ｇａｇを得た。

（４）組み換えワクチニアウィルスの作出（第３図参照
） ２５ｃ１１２のカルチャーボトルに培養されたｃｖ−ｉ
細胞にワクチニアウィルスＷＲ株を０．１　ｐ、ｆ、ｕ
−／細胞接種し、４５分後前記組み換えプラスミドトｇ
ａｇを２．２ｍ９の滅菌水で溶かし、樋高ら（蛋白質・
核酸・酵素、η、　３４０、（１９８５））の方法によ
って。

ＤＮＡ−リン酸カルシウム共沈物をつくり、その０．５
−を感染ＣＶ−１細胞上に滴下した。３０分間、３７℃
、５％ＣＯ２インキュベーターに静置し、５％牛脂児血
清を含むＥａｇｌｅ、　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地４．５＋ｄを加
えた。

その３時間後培養液を交換し、４８時間後、培養細胞ご
と３度凍結融解し、３０秒間超音波処理した。

組み換え体のｇａｇ遺伝子、及びｐｏｌ遺伝子の挿入を
確認するため、　　８ｃｍのペトリ皿に培養されたＴＫ
陰性（ＴＫ−）　１４３細胞に上記プラーク形成ウィル
スを接種し、４５分後、１％寒天・１２％牛脂児血清−
２５μｇ／ｗ＆ＢＵｄ　Ｒ加Ｅａｇｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培
地を積層し、３日間培養後、感染細胞を０．０１％ニュ
ートラル・レッドで染色した。形成されたプラークをパ
スツールピペットで単離し、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地中
に希釈する。単離したプラークにつき、再度同様の操作
を繰り返し、プラークを純化した。純化したプラークよ
り得られたウィルスを増殖させ、増殖ウィルスよりＤＮ
Ａを調製し、　ｇａｇ遺伝子、及びｐｏｌ遺伝子をコー
ドするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをプローブとするドツトプロット
ハイブリダイゼーションにより、得られた組み換えワク
チニアウィルスがＨ工Ｖ−１由来のｇａｇ遺伝子、及び
ｐｏｌ遺伝子をコードするＤＮＡをゲノム内に持つ組み
換えウィルスであることを確認し、Ｖ−２０−１−８と
命名した。

（６）組み換え体の細胞上清での発現 １１Ｉｉ織培養用９ｃｍデイツシュに培養したＳＷ４８
０細胞にｍ、ｏ、ｉ、　１０〜２０のＶ−２０−１−８
を接種し、３７℃、１時間感染後、ウィルス液を抜取り
、細胞をＥａｇ］、ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄し、５％牛脂
児血清加ＥａｇｌｅＭＥＭを加えた。１６時間後、細胞
上清を回収し。

１０＋ｎＭ）リス・塩ＩＩＩ　（ｐＨ７，４）　　−０
，１ＭＮａα−ＪｍＭＥＤＴＡ溶液で作製した２０〜６
０％の酒石酸カリウムの密度勾配上に重層し、ローター
５％１４７（ベックマン製）で３５，０ＯＯｒｐＬ１６
時間遠心した。遠心後。

各フラクションに分けた。

５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＥＩ　（ｐＨ８，０）　、
　　１０−ジチオスレイトール、７５ｍＭ　ＫＣＡ、５
ｍＭ　Ｍｇ（ｌｉ２．１０μｇ／　ｄ　　ｐｏｌｙ−Ａ
、５μｇ／　ｄ　ｏｌｉｇｏ−ｄＴ、０．０５％ＮＰ４
０を含む反応液５−に［ａ−３２Ｐ］−ｄＴＴＰ（４０
０Ｃｉ／ｍｍｏ１．１０ｍＣ１／ｗｄ＋）を５〜１Ｏ１
６１加えた。この反応液を、９６穴Ｕ字型プレートにフ
ラクションと対照の数だけ分注しておき、そこへ各フラ
クションあるいは対照用１０ｍＭ　）リス・塩酸（ｐＨ
７，４）　−０，１ＭＮａα−１ｍＭＥＤＴＡ溶液１０
ｍ１ｇ加え、３７℃で１時間反応させた。反応中に。

ニトロセルロースフィルターに鉛筆で２ｃｍ間隔の基盤
の目を書いておき、反応終了後、各プラクジョン及び対
照の反応液１０縛をニトロセルロースフィルター上の各
区画にスポットした。このフィルターを風乾により完全
に乾燥させた後、５％トリクロロ＃１ｌ−５％ピロリン
酸ナトリウム液中で１５分間振盪しながら洗浄し、未反
応の放射性前趣体を除去した。続いて５％トリクロロ酢
酸中で５分。

そして５０％エタノール中で５分洗浄した。乾燥後。

基盤の目にそって各区画を切り放し、シンチレーション
バイアルに入れて、トルエンシンチレータ−中で液体シ
ンチレーシゴンカウンターにより取り込みを測定した。

対照の３倍以上の取り込みを陽性とし、逆転写酵素活性
があると判断した。

次いで、逆転写酵素活性が認められたフラクションを５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、ニト
ロセルロースフィルターにブロッティングする（アナリ
ティカル・バイオケ主ストリイ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ−）、１１２．　１９５−２０３、（１９８１）
）。

検出法として１２５エラベルプロテインＡ、抗ｐ２４モ
ノクローナル抗体（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ、　　７８．２３
５−２４１．　　（１９８７））を利用するいわゆるウ
ェスタンブロッティング法によって、開裂型ｇａｇタン
パク質の発現が確認され、Ｖ−２０−１−８感染５１４
８０細胞はその上清に分子量２４，０００ダルトンの開
裂型ｇａｇタンパク質Ｐ２４を産生じていることが判明
した。　ｇａｇ−ｐ５５の構造から考えて、ｇａｇ−ｐ
５５の中央部分のアミノ酸配列に相当するｐ２４が産生
されていることから、　ｇａｇ−ｐ５５の両端のアミノ
酸配列に相当するＰＩ３．　　ｐ１５も産生されている
と考えられる６ 逆転写酵素活性の検出される比重約１．１５の分画を、
さらにセシウムクロライド沈降平衡遠心により精製し、
逆転写酵素活性の検出される比重約１．１５の分画にＰ
２４が確認された。

いわゆるネガティブ染色法により、上記のｐ２４が確認
された分画を電子顕微鏡により観察するとワクチニアウ
ィルスとは異なる直径約１１０〜１５０ｎｍの球形の粒
子が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＵｌｌＫ、　　第２図はプラスミ
ドｐＮＺ６８に２゜ を示す。 第３図はプラスミ ド Ｗ−ｇａＫの構築手順

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともレトロウィルスに属するウィルスのｅｎ
   ｖ遺伝子を含まずレトロウィルスに属するウィルスのｇ
   ａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子を組み込んだワクチニア・
   ウィルスを細胞に感染させ、または少なくともレトロウ
   ィルスに属するウィルスのｅｎｖ遺伝子を含まずレトロ
   ウィルスに属するウィルスのｇａｇ遺伝子を組み込んだ
   ワクチニア・ウィルスと少なくともレトロウィルスに属
   するウィルスのｅｎｖ遺伝子を含まずレトロウィルスに
   属するウィルスのｐｏｌ遺伝子を組み込んだワクチニア
   ・ウィルスを同一の細胞に感染させ、感染させた細胞を
   培養することによる、ｅｎｖタンパク質を含まないレト
   ロウィルス・コア構造物粒子の製造方法。 ２、レトロウィルスに属するウィルスがオンコウィルス
   亜科、またはレンチウィルス亜科に属するウィルスであ
   る請求項１記載のレトロウィルス・コア構造物粒子の製
   造方法。 ３、レトロウィルスに属するウィルスがＨＩＶ− I 、
   ＨＩＶ−II、ＨＴＬＶ− I 、またはＨＴＬＶ−IIであ
   る請求項２記載のレトロウィルス・コア構造物粒子の製
   造方法。 ４、細胞がヒト結腸ガン由来であるＳＷ４８０細胞であ
   る請求項３記載のレトロウィルス・コア構造物粒子の製
   造方法。 ５、請求項１、２、３、または４記載のレトロウィルス
   ・コア構造物粒子の製造方法により製造されたレトロウ
   ィルス・コア構造物粒子。 ６、請求項５記載のレトロウィルス・コア構造物粒子を
   有効成分とする抗レトロウィルス・ワクチン。