WO1990002140A1 - Method for purifying teneicine - Google Patents

Method for purifying teneicine

Info

Publication number
WO1990002140A1
WO1990002140A1 PCT/JP1989/000839 JP8900839W WO9002140A1 WO 1990002140 A1 WO1990002140 A1 WO 1990002140A1 JP 8900839 W JP8900839 W JP 8900839W WO 9002140 A1 WO9002140 A1 WO 9002140A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tenascin
human
cell
urea
basic anion
Prior art date
Application number
PCT/JP1989/000839
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Teruyo Sakakura
Yasuteru Oike
Hideki Hiraiwa
Hisaaki Kawakatsu
Original Assignee
Rikagaku Kenkyusho
Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd.
Amano Pharmaceutical Co., Ltd.
Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rikagaku Kenkyusho, Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd., Amano Pharmaceutical Co., Ltd., Nippon Shinyaku Co., Ltd. filed Critical Rikagaku Kenkyusho
Priority to DE68924650T priority Critical patent/DE68924650T2/de
Priority to EP89909433A priority patent/EP0434836B1/en
Publication of WO1990002140A1 publication Critical patent/WO1990002140A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying an extracellular matrix component, and more particularly, to a method for purifying tenesin, which is an extracellular matrix component.
  • Tenascin is a glycoprotein that was accidentally discovered as an antigen of an antibody that shows a different staining property from type V collagen when trying to obtain a monoclonal antibody against type V collagen, It is a substance expressed on the stromal side of cells. Tenascin has been revealed to have various physiological actions as one of the extracellular matrix components. In other words, tenascin has a stronger hemagglutinating ability than fibronectin, and has been shown to act in a tissue-regulating manner in a tissue-forming manner! ⁇ (Oike et al., Bioscience, 39 (August issue, 1988).
  • This method for purifying human tenascin is based on the fact that a large amount of monoclonal antibody produced by a hybridoma against Gliomas U251 is produced.
  • This is a special method of preparing an affinity gel after obtaining the ascites of the mouse contained in the above and purifying the antibody, and has the disadvantage that it is costly to apply it industrially.
  • an object of the present invention is to provide a method for obtaining high-purity tenascin in a high yield by using ordinary biochemical techniques.
  • the present inventor extracted the tenascin from human fibroblasts5, removed fibronectin, and further purified by using anion-type ion-exchange resin for biopolymer separation. They found that the problem could be solved, and completed the present invention.
  • the present invention allows the extracellular matrix extract containing tenascin to pass through affinity chromatography to which gelatin is covalently bonded at an angle of '° to reduce fibronectin to 1% by weight or less based on the solute.
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying tenesin, comprising purifying tenesin using a basic anion exchange resin after removing the resin as much as possible.
  • Sources of tenascin used in the method for purifying tenascin of the present invention include human fibroblast cells, human melanoma cells, human gloma cells, and human Chondrosarcoma cells and the like can be used. Further, as a source of tenascin derived from a species other than a human, a mouse fetus, a mouse U fetus and the like can also be used.
  • a protein mixture containing tenascin may be extracted after the cells reach confluence using bovine fetal serum or the like as a culture solution.
  • a cell surface extract can be extracted by an ordinary method 5.
  • urea guanidine hydrochloride, guanidine isothiosinate and the like can be used.
  • urea can be used at a concentration of iM to 8 M, preferably 2 M, and guanidine is used.
  • Gin hydrochloride and guanidine dithiothionate can be used at a concentration of 3 M or more.
  • other additives for example, phenylmethylsulfonium fluoride (PMSF) and the like can be added and used.
  • PMSF phenylmethylsulfonium fluoride
  • extraction may be performed from the cell wall of the cells using an extract such as 2 M urea Z phosphate buffered saline (PBS) / 2 mM-PMSF.
  • PBS urea Z phosphate buffered saline
  • a protein mixture containing tenesin can be precipitated from the extract using ammonium sulfate or the like. Normally, ammonium sulfate can be used at 60-80%. By treating at 4 ° C for about 2 hours, tenascin, collagen, proteoglycin, fibronectin, and the like can be used as the first tanker. A mixture of tanks containing the catalyst can be precipitated.
  • this protein mixture contains about 300 ⁇ g Zmi, about 50 times fibronectin relative to tenascin, so it is necessary to remove the fib mouth-neckin.
  • the precipitated protein mixture was added to a solution containing -2 M urea, preferably 4 M, 2 M urea Z0.15 M sodium chloride / 50 Tris-HCl buffer (PH 8.0). After dissolution, it is preferable to carry out crude purification by a gel filtration method.
  • Sepharose CL2B, CL4B, CL6B (manufactured by Pharmacia), which is a resin for gel filtration, can be used.
  • Sepharose Sue CL 4 B is preferred.
  • biogel Biogel 5 m, 15 ⁇ (manufactured by Biorad) or Sephacryl S500, S100 (manufactured by Pharmacia) You can also.
  • Tenascin eluted from the column can be detected by tenascin-dependent cell adhesion activity (Methods Enzymo). Logistics, Vol. 82: 803-83 pp. 1982).
  • Examples of cells that can be used for the cell adhesion test include human melanoma, human fibroblasts, and human epithelial cancer cells.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • fibronectin can be detected by measuring the antigenicity against fibronectin (archives, biochemistry, and strands of physics: 399-406, p. 1 9 8 1 year) 0
  • crudely purified tenascin By collecting fractions containing 20%, preferably 10% or more of tenascin, crudely purified tenascin can be obtained. Since the crudely purified tenascin thus obtained usually contains 50% of fibronectin, it is concentrated and dialyzed by ordinary procedures, and then fibronectin by gelatin gel. Must be removed.
  • concentration operation for example, it is preferable to perform centrifugal concentration at 250 ° C. and 250 ° C. at 4 ° C. using a centflow membrane (manufactured by Amicon), and the concentration is 0.5%.
  • Buffer containing M urea preferably 0.5 M urea 0.15 M sodium chloride Z 50 mM Tris-HCl (PII7.4), 4 ⁇ 2 It's time to go.
  • Zerachingele includes Zerachinsepharose (Pharmacia), Immobilization dozelatin (Pierce), and Zerachinagarose (Sigma). ), Etc., which are affinity chromatographs in which gelatin is covalently bonded.
  • Etc. affinity chromatographs in which gelatin is covalently bonded.
  • Huy Blonnet Cutin can be identified by the ⁇ LIS ⁇ method using an anti-human fibronectin polypeptide antibody, and tenascin can also be identified by the ELISA method.
  • the fractions obtained in this way are concentrated according to the usual procedures and dialyzed against a solution containing 2 M urea, preferably 2 M urea Z 50 mM Tris-HCl (PH 8.0). As a result, a solution containing tenascin at a high concentration can be obtained.
  • the solution usually contains 100 g of Zinc, but further purification by using anion-type ion-exchange resin for biopolymer separation makes it possible to obtain extremely high-purity Tenesin.
  • the solution is prepared, for example, by ion exchange high-performance liquid chromatography using a DEAE-5 PW column (manufactured by Isezo Ichi) having a DEAB (getylaminoethyl) group as an exchange group.
  • a purification method may be mentioned.
  • DBAE Toyopearl 650 (manufactured by Tohoku Soup), Mono-Q (manufactured by Pharmacia), DEAB-CL6B, DEAE-Sephacel (manufactured by Pharmacia), DEAB—cell mouth
  • GAIN manufactured by Seikagaku Corporation
  • the solvent used for elution 0 to 1 M, preferably 0 to 0.4 M sodium chloride in 1 to 8 M urea, preferably 2 M urea may be used.
  • elution of 0-0.4 M sodium chloride in 2 M urea as a linear concentration gradient
  • the tenascin is usually eluted with 2-0.3 M, preferably about 0.25 M sodium chloride.
  • the eluted tenascin can be identified by ultraviolet absorption or cell adhesion specific to tenascin.
  • tenascin can be obtained by such a purification method.
  • the human tenisin obtained by the present invention clearly gave a characteristic band to human tenisin at 250 K and at 200 K by SDS-PAGE analysis. .
  • the yield of tenascin by the purification method of the present invention is usually 80% or more.
  • a crude tenosine fraction can be obtained, and the same operation as described above can be performed.
  • Purified tenacin can be obtained by the method.
  • Fig. 1 shows the pattern of human tenisin extracted from human fibroblast cells separated and eluted with a Sepharose CL_4B column.
  • Figs. 2 and 3 show the results. These are the UV absorption pattern and the cell adhesive pattern of high performance liquid chromatography when the fractions passing through the gelatin column are separated using DGAE-5 PW.
  • Fig. 4 shows a pattern of human tenascin, obtained from a culture of human fibroblasts, separated and eluted with a Sepharose CL-4B column.
  • Figs. 5 and 6 show the results. These are the UV absorption pattern and cell adhesion pattern of high-performance liquid chromatography when the fractions passing through gelatin columns were separated using DEAE-5 PW.
  • Example 1 the best mode for carrying out the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 the best mode for carrying out the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the human blast mouth blast cells were transformed into Dulbecco's modified single medium Z.
  • the culture was continued at 37 ° C using 100 bottles of roller F. medium and 10% fetal bovine serum as a culture solution, and the cells reached confluence.
  • 2 M urea / ham F 122 Add 2 mM phenylmethylsulfonium fluoride (PMSF) to the cell layer at 10 r / bottle and add the protein mixture containing human tenacin. Extraction was performed for 2 hours at 7 ° C. while rotating the roller bottle (1 rpm). The extract was cooled to 4 ° C, ammonium sulfate was added to 70% saturation, and the mixture was gently stirred. After allowing the mixture to stand for 2 hours, collagen, proteoglycan, and collagen were added in addition to hytothenicin. A protein mixture containing ibronectin and other unknown proteins was precipitated.
  • PMSF phenylmethylsulfonium fluoride
  • the protein mixture was separated by centrifugation at 4 ° C for 1 hour (20,000 rpm), the supernatant was decanted off, and the precipitate was removed at 4 ° C, 20 Qm was dissolved in 2 M urea Z0.15 M sodium chloride Z50 mM tris-hydrochloric acid (pli 8.0).
  • the protein content of the obtained protein was 100 mg when analyzed using BCA Protein Atssey (Pierce).
  • the protein mixture solution 10 ⁇ ⁇ was applied to Sepharose CL 4 B column (Pharmacia Co., Ltd., 500) to give 2 urea 0.15 ⁇ sodium chloride ⁇ 5
  • Tenascin and fibronectin were separated and eluted at 15 ° C using 0 mM Tris-HCl (plI8.0) (Fig. 1).
  • Tenascin-dependent cell adhesion activity was determined according to the method described below. Place 200 samples from each fraction into the EL1SA plate (Libro, 76-203-3-0 5. TiLertek), and add 20% 50 mM sodium carbonate to each well. Lithium buffer (P119.6) was added and coated at 4 ° C for 12 hours. Thereafter, the gel was washed three times with 0.5% PB SZ—BSA, and then an anti-fibronectin antibody (Cappel, PB SZO. 5% —5% in BSA) Add 200 lb and incubate at 37 ° C for 2 hours, then wash each well with PB SZO. 5% —BSA.
  • the plate was then washed once with PBS / 0.5% —BSA, the cells adhered to the plate were fixed with 3% paraformaldehyde, and 1% —Truy Jimble (Merck) / 3% The cells were stained with paraformaldehyde and the number of adhered cells was observed under a microscope.
  • Fibronectin was detected by measuring antigenicity to fibronectin using the following method. Take a 20 / i sample from each fraction, transfer to a plate (3912 Falcon), and add 5 () mM sodium carbonate buffer (PII 9.6) 18 ⁇ ⁇ ⁇ was added to each gel and incubated at 4 ° C for 12 hours. Each gel was washed three times with PBSZ ⁇ . 5% (W / W) —tween 20 / 0.5% (W / W) —BS ⁇ , and then the rabbit's anti-fibronectin antibody (0.4%, manufactured by Cappel) was added, and the mixture was kept at 20 ° C for 1 hour.
  • the solution was centrifuged at 250 ⁇ at 4 ⁇ with a centrifugal membrane (manufactured by Amicon) at 20 ⁇ 50 mi and concentrated to 20 mi. Dialyze for 12 hours at 4 ° C against squirrel hydrochloric acid (PH 8.0)
  • the solution was purified by high-performance liquid chromatography using a column of DEAE-5PW (manufactured by Tohso Corporation, column diameter 7.5 hidden, power column length 50 discussions). After injecting lm of the solution into a force ram, a linear gradient gradient of 0-0.4 M sodium chloride in 2 M urea was used at a flow rate of 0.5 m £ Z min. Column pressure 15 kg cnf. Power column temperature 15. When separated by C, the desired tenascin was eluted with 2 M urine Z 0.25 M sodium chloride in 42-45 minutes. Tenascin is 2 8 0 It was detected by nm absorption and cell adhesion activity specific to tenascin as described above. The results are shown in FIGS. 2 and 3. As can be seen, tenascin was separated as a sharp single peak. A total yield of 200 ug of human tenascin was obtained from 100 roller bottles (approximately 2.0 billion cells).
  • the human blast cells were cultured on a roller bottle (850 cnf) using Dulbecco's modified single-grain medium, Ham F12 medium, and 10% fetal bovine serum as the culture medium. ) Using 100 pieces, 37. C. Culture was continued at 110 rpm and 1.1 rpm, and the medium was replaced every 5 days after the cells reached confluence. The medium was cooled to 4 ° C, ammonium sulfate was added to a saturation of 33%, and the mixture was stirred gently. In addition, a protein mixture containing collagen, proteoglycan, fibronectin, and other proteins was precipitated.
  • the protein mixture was separated by centrifugation at 200,000 X g at 4 ° C for 60 minutes, and the supernatant was decanted off. m 2 M urea Z0.15 sodium chloride ⁇ 5 ⁇ tris hydrochloric acid (pll 8. ⁇ ). The amount of protein was 3.9 for BC II Protein Assay (Pierce).
  • the protein mixture solution 25 mi was applied to a Sepharose CL 6B column (manufactured by Pharmacia, about 500 mL), and 2 M urea Z 0.15 M sodium chloride Z was added. 5 with 0 mM Application Benefits scan hydrochloride (P H 8. 0), and the Tenei thin and fibronectin were separated eluted with 1 5 ° C.
  • Tenascin was detected by the method described in Example 1 based on tenascin-dependent cell adhesion. Fibronectin was detected by the method described in Example 1 by measuring the antigenicity to fibronectin. The above operation was repeated 30 times.
  • Fig. 4 shows the elution patterns of both. As is clear from the figure, tenascin and fibronectin were slightly separated by Sepharose column, and tenascin was eluted at a Kd value of 0. By collecting the fraction Not25- ⁇ 30 (each fraction was 5 ml) in FIG. 3, a solution containing a high concentration of tenascin was obtained at 900 ml. Protein yield 90.0 mg rare o
  • the solution was centrifuged at 250 ° C. and 250 ° C. at 4 ° C. using a centrifugal membrane (manufactured by Amicon) and concentrated to 100 ml. Dialysis was performed at 4 against 12% of sodium M chloride Z 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 2 ⁇ for 12 hours.
  • the solution 12 ⁇ was applied to a gelatin column (Gelatin Sepharose, manufactured by Pharmacia, 30 ⁇ ) to specifically adsorb fibronectin. Tenascin was eluted in the flow-through fraction, and it was possible to obtain 220 mL of a tenascin solution without fibronectin.
  • a gelatin column Gelatin Sepharose, manufactured by Pharmacia, 30 ⁇
  • the solution was centrifuged at 4,500 X g using a centrifugal membrane (manufactured by Amicon) at 40,000 X g, and concentrated to 40 mL. Then, 2 2 M urea Z 50 mM tris was added. It was dialyzed against hydrochloric acid (pll 8.0) at 4 ° C for 12 hours. After dialysis, the solution was treated with D EA E-5 PW (manufactured by Toso Corporation, column diameter 7.5 Purification was performed by high-performance liquid chromatography using a column with a column length of 50 mm).
  • Human melanoma cells (M-14) were injected subcutaneously into nude mice at 2 ⁇ 10 6 cells and about 1 month later, the cancerous tissue was removed.
  • the void fraction (300 ⁇ g) was purified using DEAE-5PW to give tenascin (600 ⁇ g). g was obtained. The elution pattern was almost the same as in Example 1. When analyzed by SDS-PAGE according to the method of Example 1, the purity of the obtained tenascin was approximately 100%.
  • extremely high-purity tenesin can be obtained in high yield by using pure biochemical means that can be industrially used.
  • a bioactive substance such as a monoclonal ⁇ -nal antibody specific to tenascin useful for therapy can be produced.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

明 細 書
テネ ィ シ ンの精製方法
技術分野
本発明は細胞外基質成分の精製法に関し、 さ らに詳しく は、 細 胞外基質成分であるテネィ シンの精製方法に関する。
背景技術
テネイ シンは、 タイプ Vコ ラーゲンに対するモノ クローナル抗 体を得ようとした際に偶然にもタイプ Vコ ラーゲンとは異なる特 異な染色性を示す抗体の抗原と して発見された糖蛋白質であり、 細胞の間質側に発現される物質である。 テネイ シンは、 細胞外基 質成分の一つとして、 様々な生理作用を有することが明らかにさ れつつある。 すなわち、 テネイ シ ンはフイ ブロネクチンより も強 い赤血球凝集能を有することから、 組織形成の場において、 制御 的に作用することが示!^されている （大池ら、 生体の科学、 3 9 巻一 8月号、 1 9 8 8年） 。 また、 他の分子との非共有結合的相 互作用と しては、 フィ ブロネクチンとの相互作用が明らかにされ ており （チケッ ト ら、 セル、 5 3巻 ： 3 8 3— 3 9 0頁、 1 9 8 8 年） 、 プロテオグリカ ンとの相互作用も示唆されている （チケッ ト ら、 ジャーナル ォブ セル ノ、'ィ ォロ ジ一、 9 8巻 ： 1 9 2 6 — 丄 9 3 6頁、 1 9 8 4年） 。 さらには、 カルシウムに依存的 な細胞接着活性を有しており （ボー ドンら、 ジャーナル 才ブ セル バイ オロ ジー、 1 0 5巻 ： 1 3 8 a ) 、 また上皮性の癌の 発生に伴ぃ間充織側に誘導され、 細胞に対して増殖促進効果を持 つことが明らかにされる （チケッ ト ら、 セル、 4 7巻 ： 1 3 1 — 1 3 9頁、 1 9 8 6年） など、 多岐にわたる生理作用を有し、 細 胞 殖や形態形成に重要な役割を担っている。
しかし、 このように重要な生理物質であるにもかかわらず、 今 まで研究の対象にされたテネィ シンの多く はヒ ト由来のテネィ シ ンではなく、 ヒ トにおけるテネィ シンの生理作用が充分に解明さ れたとは言い難かった。 また、 現在までテネイ シンの精製に用い られてきた方法は、 ニヮ ト リのモノ ク ロ一ナル.抗体あるいはポ リ クローン抗体をゲルビーズに共有結合させたァフィニティーク口 マ トダラフィ一を用いて行われるものであり、 特殊な操作を必要 と しているので広汎に用いられず、 また、 他の種、 特にヒ ト由来 のテネィ シンの精製に使用することもできなかった。 さらに、 培 養条件下でヒ トのフイブロブラス トにより産生されるヒ トーテネ ィ シンの産生量は、 フイ ブロネクチンの約 2 %であり、 高度に精 製されたテネィ シンを得ることは困難であった。 一方、 最近にな つて M, A.ボー ドン （Bourdon)らにより発見されたヒューマングリ ォーマ ーメ ゼンキマ jレ ェクス ト ラセ レラー マ ト リ クス アン ナケン (Human G 1 loma- esench raa 1 Extracellular Matrix Antigen' GMEM antigen、キヤ ンサー リサーチ 4 3巻 ： 2 7 9 6— 2 8 0 5 頁、 1 9 8 3年） がヒ トーテネィ シンであることが明らかにされ たが （ポー ドンら、 ジャーナル ォブセル ノ ィ ォロ ジ一、 10 5 巻 ： 1 3 8 a 1 9 8 7年） 、 このヒ トーテネイ シンの精製方法は、 'グリオ一マ U 2 5 1 に対するハイブリ ドーマが産生するモノ ク口 ーナル抗体を大量に含むマウスの腹水を得、 抗体を精製した後に、 ァフィ二ティ一ゲルを作成するという特殊なものであり、 工業的 に応用するのにはコス トがかかるという欠点があつた。
高度に精製されたヒ トーテネィ シンを用いてヒ トーテネイ シン に対するモノ ク ロ ーナル抗体を得ることができれば、 上皮癌等の 診断、 治療に応用することも可能である。 そのため、 通常の生化 学的手法のみを用いて工業的に応用可能なテネィ シンの精製方法 の開発が望まれ、 また、 高度に精製されたヒ トーテネイ シンを取 ― q ―
o
得することが切望されていた。
従って、 本発明の目的は、 通常の生化学的手法を用い、 高純度 のテネィ シンを高収量で得る方法を提供することにある。
本発明者は、 ヒ トのフイ ブロブラ ス ト等からテネィ シンを抽出 5 した後、 フイ ブロネクチンを除去し、 さらに生体高分子分離用ァ 二オ ン型ィォン交換樹脂を用いて精製することにより上記課題を 解決できることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明はテネイ シンを含む細胞外基質抽出物を、 ゼ ラチンを共有結合させたァフィ二ティ ーク ロマ トグラフィー内を ' ° 通過させてフイ ブロネクチンを溶質に対して 1重量％以下となる 様に除いた後、 塩基性陰ィォン交換樹脂を用いてテネィ シ ンを精 製することを特徴とする、 テネィ シ ンの精製方法を提供するもの である。
発明の開示
5 以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明のテネィ シ ン精製方法 に用いられるテネィ シンの供給源と しては、 ヒ ト のフ ィ プロブラ ス ト細胞の他、 ヒ ト メ ラ ノ 一マ細胞、 ヒ トグリォ一マ細胞、 ヒ ト コ ン ドロザルコ ーマ細胞等を用いることができる。 また、 ヒ ト以 外の種由来のテネイ シ ンの供給源と しては、 マウス胎児、 ニヮ 卜 U リ胎児等を用いることもできる。
ヒ トのフイ ブロブラ ス ト細胞等を用いる場合には、 牛胎児血清 等を培養液として、 細胞がコ ンフルェ ン トに達した後に、 テネィ シ ンを含むタ ンパク混合物を抽出すればよい。
これらの細胞から、 常法により細胞表面抽出物を抽出すること 5 ができる。 抽出には、 尿素、 グァニジン塩酸塩、 グァニジンイ ソ チオシァネー ト等を用いることができるが、 一般的には、 尿素は、 i M〜 8 M、 好ま しく は 2 Mの濃度で用いることができ、 グァニ ジン塩酸塩、 グァニジンィ ソチオシァネー トは 3 M以上の濃度で 用いることができる。 さらに、 その他の添加剤、 例えばフヱニル メ チルスルホニゥ厶フルオラ ィ ド （P M S F) 等を添加して用い ることもできる。
ヒ ト フイ ブロブラ ス ト細胞を用いる場合には、 該細胞の細胞壁 から 2 M 尿素 Z燐酸バッファーセーラ イ ン （P B S ) / 2 mM- P M S F等の抽出液を用いて抽出すればよい。
その後に、 該抽出液から、 硫酸アンモニゥム等を用いて、 テネ ィ シンを含むタ ンパク混合物を沈澱させることができる。 硫酸ァ' ンモニゥムは、 通常 6 0 — 8 0 %として用いればよく、 4 °Cで約 2時間処理することにより、 テネイ シン、 コ ラーゲン、 プロテオ グリ力 ン、 フィブロネクチンその j也の未 ¾1タ ンハ °クを含むタンノヽ ° ク混合物を沈澱させることができる。
- 通常、 このタ ンパク混合物には約 3 0 0 〃 g Zmi、 テネィ シン に対して約 5 0倍のフイブロネクチンを舍むので、 フィブ口-ネク チ ンを除去することが必要である。 沈澱させたタ ンパク混合物を- 2 M尿素を含む溶液、 好ましく は 4での、 2 M尿素 Z0. 1 5 M塩 化ナ ト リ ウ ム/ 5 0 ト リス塩酸緩衝液 （PH8. 0 ) に溶解した後- ゲル濾過法により粗精製することが好ましい。
ゲル濾過に用いる充塡剤としては、 ゲル濾過用榭脂であるセフ ァ ロ ース （Sepharose) C L 2 B、 C L 4 B、 C L 6 B (フ アルマ シァ社製） 等を用いることができ、 特にセファロースー C L 4 B が好ま しい。 その他にバイ オゲル（Bio- gel) 5 m、 1 5 τη (バ ィ ォ一ラ ッ ド社製） や、 セフアク リル（Sephacryl) S 5 0 0、 S 1 0 0 0 (フアルマシア社製） を用いることもできる。
カ ラ ムより溶出するテネィ シンは、 テネイ シン依存の細胞接着 活性により検出することができる （メ ソーズ イ ン ェ ンザィモ ロジ一、 8 2巻 ： 8 0 3— 8 3 1頁 1 9 8 2年） 。 細胞接着性 試験に用いることができる細胞と しては、 ヒ トメ ラノ ーマの他、 ヒ ト フイ ブロブラ ス ト、 ヒ ト上皮性ガン細胞等を挙げることがで きる。 他の同定法と しては、 ニヮ ト リテネィ シンに対するポ リ ク ロ ー ン抗体を用いた、 ェ ンザィ ムー リ ンク ト 一 ィ 厶ノ ア ツ セ ィ (EL I SA) 法等を用いることもできる。 またフイ ブロネクチンは、 フイブロネクチンに対する抗原性を測定することにより検出でき る （アーカ イ ブス ォブ バイ オケ ミ ス ト リ ー ア ン ド ノ<ィ ォ フイ ジク ス ： 3 9 9 — 4 0 6頁、 1 9 8 1年）0
テネイ シ ンを 2 0 %、 好ま しく は 1 0 %以上含有する分画を集 めることにより、 粗精製テネイ シンを得ることができる。 このよ うにして得られた粗精製テネィ シ ンには、 通常 5 0 %のフイ ブ n ネクチンが含まれるので、 通常の操作により濃縮、 透析を行った 後に、 さ らにゼラチンゲルによりフィ ブロネクチンを除去する必 要がある。
濃縮操作は、 例えばセ ン ト フ ロ ー膜 （ア ミ コ ン社製） を用い て 4 °C、 2 5 0 0 X gで遠心濃縮することが好ま しく、 また、 透 析は 0. 5 M尿素を舎む緩衝液、 好ま しく は 0. 5 M尿素ノ 0. 1 5 M 塩化ナ ト リ ウ ム Z 5 0 mMト リス塩酸 （P II 7. 4 ) を用いて、 4 で 丄 2時間行えばよい。
ゼ'ラ チ ンゲ レと しては、 ゼラ チ ンセフ ァ ロ ース （フ ァ レマ シア 社製）、 ィ モビラ ィ ズ ドゼラ チ ン （ ピア一ス社製） 、 ゼラ チ ンァ ガロース （シグマ社製） 等を挙げることができ、 これらはゼラチ ンが共有結合されたァフィニティ ーク ロマ トグラフィ 一である。 フイ ブロネクチンに対する親和性の高い該ゼラチ ンカ ラムを用い ることにより、 テネイ シンは通過画分に溶出され、 溶質に対しフ イ ブロネクチンを 1重量％以下に除く ことができる。 フイ ブロネ ク チ ンは、 抗ヒ ト フ イ ブロネクチ ンポ リ ク 一ン抗体を用いた Ε L I S Α法で同定することができ、 またテネィ シンも同様に E L I S A法により同定可能である。
この様にして得られた分画を、 通常の操作により濃縮し、 2 M 尿素を含む溶液、 好ま しく は 2 M尿素 Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （P H 8. 0 ) に対して透析して、 テネイ シンを高濃度で含む溶液を得る ことができる。
該溶液は通常テネィ シン 1 0 0 g Z m£を含むが、 さらに生体 高分子分離用ァニォン型ィォン交換榭脂を用いた精製をすること により、 極めて高純度のテネィ シンを得ることができる。
その方法として、 該溶液を、 例えば DEAB (ジェチルアミ ノエチ ル) 基を交換基として有する D EAE- 5 P Wカ ラ ム （柬ソ一㈱製） を用 いたィォン交換高速液体ク口マ トグラ フィ一により精製する方法 を挙げることができる。 さらに、 D BAE— ト ヨパール 650 (東ソ一㈱ 製） 、 Mo n o - Q (フ アルマシア社製） 、 D EAB- CL6B 、 DEAE-セフ ァ セル （フ ア ルマシァ社製） 、 DEAB—セル口 フ ァ イ ン （生化学工業 社製） などのカラムを用いることもできる。 これらのうち、 D EAE --5PWを用いることが好ましい。 溶出に用いる溶媒としては、 1 - 8 Mの尿素、 好ま しく は 2 Mの尿素中で 0 — 1 M、 好ま しく は 0 — 0. 4 Mの塩化ナ ト リ ウムを用いればよい。
DEA E-5 P W力 ラ 厶を用いたィォン交換高速液体ク口マ トグラ フィ —において、 2 M尿素中で 0 — 0. 4 Mの塩化ナ ト リ ゥ厶を直線濃 度勾配として溶出する場合には、 通常 2 — 0. 3 M、 好ま しくは 約 0. 2 5 Mの塩化ナ ト リ ウムでテネィ シンが溶出される。 溶出さ れるテネイ シンは、 紫外吸収や、 テネイ シンに特異的な細胞接着 性により同定することができる。
この様な精製法により、 ほぼ 1 0 0 %のテネィ シンを得ること ができる。 本発明により得られたヒ ト一テネィ シンは、 S DS- PAG E による分析で、 2 5 0 K及び、 2 0 0 Kにヒ ト一テネイ シンに特 徴的なバン ドを明瞭に与えた。 本発明の精製方法によるテネィ シ ンの収率は、 通常 8 0 %以上である。
さらに、 培養液中からも 3 0 — 3 5 %、 好ま しく は 3 3. 3 %の 硫酸ア ンモニゥムを用いることにより、 粗テネィ シ ン分画を得る ことができ、 前記の操作と全く同一の方法により精製テネィ シ ン を得ることができる。
図面の簡単な説明
第 1図はヒ トフイ ブロブラス ト細胞より抽出したヒ トーテネィ シ ンをセ フ ァ ロ ース C L _ 4 Bカ ラ ムで分離溶出させたパタ ー ン であり、 第 2図、 第 3図は、 それぞれゼラチンカ ラム通過画分を D GAE- 5 PWを用いて分離した場合の高速液体ク 口マ トグラフィ 一の U V吸収パター ン、 細胞接着性パタ一ンである。 第 4図は、 ヒ ト フイ ブ ブラ ス ト細胞の培養液より得たヒ トーテネイ シンをセフ ァロース C L— 4 Bカ ラムで分離溶出させたパター ンであり、 第 5図、 第 6図は、 それぞれゼラチ ンカ ラ ム通過画分を D EAE-5 PWを 用いて分離した場合の、 高速液体ク 口マ トグラフィ 一の U V吸収 パター ン、 細胞接着性パターンである。 第 7図、 第 8図は、 それ ぞれヒ トーメ ラノ ーマ細胞、 ヒ トーコ ン ドザルコ ーマ細胞より得- たゼラチ ンカ ラム通過画分を D EA E-5 PWを用いて分離した場合の高 速液体ク 口マ トグラフィ 一の U V吸収パタ一ンを示す。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施するための最良の形態を実施例によりさら に詳細に説明するが、 本発明は本実施例に限定されることはない。 実施例 1
ヒ ト フイ ブ口ブラ ス ト細胞をダルベッコ変法ィ一グル培地 Zハ ム F 1 2培地、 1 0 %牛胎児血清清を培養液として、 ローラーボ トル 1 0 0本を用いて、 3 7 °Cで培養を継続し、 細胞がコ ンフル ェ ン トに達した後に、 2 M尿素/ハム F 1 2 2 mMフ ヱニルメチ ルスルホニゥムフルオラィ ド（PMSF)を 1 0 r /ボ トルとなるよう に細胞層に加え、 ヒ ト ーテネィ シンを舍むタ ンパク混合物を 3 7 °Cでローラーボトルを回転させながら ( 1 rpm) 2時間抽出した。 抽出液を 4 °Cに冷却し、 硫酸アンモニゥムを 7 0 %飽和となるよ うに加えて静かに攬拌した後に、 2時間放置して、 ヒ トーテネィ シンの他、 コ ラーゲン、 プロテオグリ カ ン、 フ イ ブロネクチン、 その他の未知タ ンパク質を含むタ ンパク混合物を沈澱させた。
該タ ンパク混合物を、 4 °Cで 1時間遠心 （ 20, 0 0 0 rpm)して 分離し、 上清をデカ ン ト して除いた後、 沈澱物を 4 °C、 2 0 Q m£ の 2 M尿素 Z0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （pli 8. 0 ) に溶解した。 得られたタ ンパクのタ ンパク量は、 B C A プロテイ ン アツセィ （ピアス社製） を用いた分析で 1 0 0 mgで あったり
該タ ンパク混合物溶液 1 0 τ ^を、 セフ ァ ロース C L 4 Bカ ラム (フ アルマ シア社製、 5 0 0 にアプライ して、 2 Μ尿素 Ζ 0. 1 5 Μ塩化ナ ト リ ウム Ζ 5 0 mMト リス塩酸 （plI8. 0 ) を用いて 1 5 °Cでテネイ シンとフイブロネクチンを分離溶出させた （第 1 図） 。
テネイ シン依存性の細胞接着活性は、 以下に述べる方法にした がった。 各画分から 2 0 0 の試料を、 EL1SA プレー ト （Libro, 7 6 - 2 0 3 - 0 5. TiLertek社製） のゥヱルに入れ、 さらに各 ゥ ェルに 2 0 の 5 0 mM炭酸ナ ト リ ウム緩衝液 （P119. 6 ) を入 れ、 4 °Cで 1 2時間コー ト した。 その後ゥ ヱルを P B SZ0. 5 % — B S Aで 3回洗った後、 抗フイブロネクチン抗体 （Cappel社製, P B SZO.5 %— B S A中 5 %) 2 0 0 £を加え、 3 7 °Cで 2 時間保温し、 その後各ゥエルを P B SZO. 5 %— B S Aで洗った c —方、 ヒ ト フ イ ブ πブラス ト細胞をコ ンフルェン ト になるまで、 ダルベッ コ変法イーグル培地 Zハム F 1 2培地、 1 0 %牛胎児血 清中で維持し、 EDTAを含まない ト リプシン （タイプ]!、 シグマ社 製、 ϋ. l mgZm£) 溶液で 3 7 ：、 1時間保温して細胞をはがし、 1 X 1 0 6 セル Zmjg ( P B S /ソィ ビーン ト リ プシン イ ンヒ ビター 0.5 mg、 シグマ社） に細胞溶液を調製した。 この細胞溶液 をミ ク ロタイ タ一 プレー トのゥヱルに 丄 0 0 ずつ加えて、 3 7。Cで 1 時間保温した。 ついで、 プレー トを P B S / 0. 5 %— B S Aで 1 回洗い、 プレー ト に接着した細胞を 3 %のパラホルム アルデヒ ドで固定し、 1 %— トルイ ジンブル一 （メ ルク社製） / 3 %パーラホルムアルデヒ ドで染色して、 接着した細胞数を顕微 鏡下で観測した。
フイ ブロネクチンはフイブロネクチンに対する抗原性を測定す ることにより、 以下の方法を用いて検出した。 各画分から 2 0 / iの試料を取り、 プレー ト （ 3 9 1 2 フ ァルコ ン社製）の ゥ エルに移し、 5 () mMの炭酸ナ ト リ ウム緩衝液 （PII9. 6 ) 1 8 ϋ 〃 ^を各ゥヱルに加えて 4 °Cで 1 2時間保温した。 各ゥ ヱルを P B S Z ϋ. 5 % (W/W)—ッウ ィ ーン 2 0 / 0. 5 % (W/W)— B S Αを 用いて 3回洗った後に、 ゥサギの抗フイ ブロネクチン抗体 （ 0.4 %、 Cappel社製） 2 0 0 〃 ^を加え、 2 0 °Cで 1時間保温した。 さ らに、 抗体溶液をすて、 P B S Z 0. 5 % (W/W)—ッウ ィ ーン 2 ϋ / 0. 5 % (W/W) - B S Aで各ゥヱルを洗い、 パ一ォキシダ一 ゼ標識されたャギの抗ゥサギ抗体 （ 0.4 %、 Cappel社製） を加え て更に 1 峙間反応させた。 P B S Z O. 5 % (W/W)—ッウ ィ ー ン 2 0 X 0. 5 % (W/W)一 B S Aで各ゥ ヱルを洗い、 オル ト ーフ ヱ 二レンジア ミ ン塩酸塩を基質として、 パーォキシダーゼ活性を
4 9 2 nmの吸収で測定した。
以上の操作を 1 0回繰り返した。 第 1図から明らかな様に、 テ ネイ シンとフイ ブロネクチンはセフ ァロースカ ラムによりやや分 離され、 テネイ シンは K d値 0. 1 1の所に溶出された。 第 1図中 のフラク ショ ン No. 3 0 - No. 4 0 (各フラ ク シヨ ンは 5 ηώ ) を集め て、 テネィ シンを高濃度で含む溶液 5 0 0 を得た。 タンパクの 収量は 2. 6 mgであった。 該溶液をセント リ フロー膜 （ァミ コ ン社 製） を用いて 4 、 2 5 0 0 x gで遠心して 5 0 m£に濃縮した後、 0. 5 M尿素 / 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム / 5 0 mMト リス塩酸 （ρΙ1 7. 4 ) に対して、 4 1 2時間透析した。
透折後、 該溶液 6 0 m£をゼラチンカ ラム （ゼラチンセフ ァ ロー ス、 フ アルマシア社製、 1 0 にアプライ し、 フイ ブロネクチ ンを特異的に吸着せしめた。 テネィ シンは通過画分に溶出され、 フイブロネクチンを舍まないテネィ シン溶液 7 0 を得ることが できた。
該溶液をセン ト リ フロー膜 （ア ミ コ ン社製） を用いて 4 でで 2 5 0 0 X で遠心して 2 0 miに濃縮した後、 1 £の 0. 5 M尿素 Z 5 0 ト リス塩酸 （P H 8. 0 ) を用いて、 4 °Cで 1 2時間透析し O
透析後、 該溶液を DEAE- 5PW (東ソ一㈱製、 カ ラム径 7. 5 隱、 力 ラム長 5 0 議） のカ ラムをもちいて高速液体ク口マ トグラフィ ー により精製した。 該溶液の l m£を力ラムにィ ンジヱク ト した後、 2 Mの尿素中 0 — 0. 4 Mの塩化ナ ト リ ゥム直線濃度勾配溶液を用 い、 流速 0. 5 m£Z分、 カ ラム圧 1 5 kg cnf . 力 ラム温度 1 5 。Cで 分離すると、 目的とするテネイ シンは、 4 2分一 4 5分に 2 M尿 素 Z 0. 2 5 M塩化ナ ト リ ゥムで溶出された。 テネイ シンは 2 8 0 nmの吸収、 及び前述したテネィ シンに特異的な細胞接着活性によ り検出した。 その結果を第 2図及び第 3図に示す。 図から明らか なように、 テネイ シンはシャープな単一ピークと して分離された。 ローラ—ボ ト ル 1 0 0本 （細胞数約 2 0 0億） より総収量 2 0 0 u gのヒ ト 一テネイ シンを得ることができた。
得られたヒ ト一テネィ シン 5 / gを、 1 %— 2 -メ ルカプトエタ ノ ール Z 2 %— S D S Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （ΡΗ8. 0 ) を用いて 7 0 °Cで 3 0分間還元した後、 4 2 0 %の SDS- PAGEで分析し た。 ヒ トーテネィ シンに特徴的な 2 5 0 Kと 2 0 0 Kのバン ドを 検出することができた。 他にバン ドは検出されず、 本発明により 得られたヒ 卜一テネイ シンの純度は、 ほぼ 1 0 0 %であることが 確認できた。
実施例 2
ヒ ト フ.ィ ブ ϋブラス ト細胞を、 ダルべッ コ変法ィ 一グル培地 Ζ ハム F 1 2培地、 1 0 %牛胎児血清を培養液と して、 ローラーボ ト ル （ 8 5 0 cnf) 1 0 0本を用い、 3 7。C、 1 1 0 mgZ本、 1. 1 rpm で培養し続け、 細胞がコ ンフルェン 卜に達した後に 5 日目ご とに培地を交換した。 この培地 1 0 ϋ £を 4 °Cに冷却し、 硫酸ァ ンモニゥムを 3 3 %飽和となるように加えて静かに攪拌した後、 4 °Cで 1 2 0分間放置して、 ヒ トーテネイ シンの他、 コ ラ一ゲン、 プロテオグリカ ン、 フイ ブロネクチン、 その他のタ ンパク質を含 むタ ンパク混合物を沈澱させた。
該タ ンパク混合物を 4 °Cで 6 0分間、 2 0， 0 0 0 X gで遠心し て分離し、 上清をデカ ン ト して除いた後、 沈澱物を 4 °C、 7 5 0 m の 2 M尿素 Z0. 1 5 Μ塩化ナ ト リ ゥム Ζ 5 ϋ ト リ ス塩酸 （pll 8. ϋ ) に溶解せしめた。 タ ンパク量は、 B C Αプロテイ ンアツセ ィ （ ピアス社製） で 3.9 であった。 該タ ンパク混合物溶液 2 5 miを、 セフ ァ ロース C L 6 Bカラム (フ アルマシァ社製、 約 5 0 0 m£ ) にアプライ し、 2 M尿素 Z 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ゥム Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （PH 8. 0 ) を用いて、 1 5 °Cでテネイ シンとフイブロネクチンを分離溶出させた。
テネィ シンは、 テネィ シン依存の細胞接着性により、 実施例 1 に記載の方法で検出した。 フイブロネクチンは、 フイブロネクチ ンに対する抗原性を測定することにより、 実施例 1 に記載の方法 で検出した。 以上の操作を 3 0回繰り返した。 両者の溶出パター ンを第 4図に示す。 図から明らかなように、 テネイ シンとフイブ ロネクチンはセフ ァ ロースカ ラムによりやや分離され、 テネィ シ ンは K d値 0の所に溶出された。 第 3図中のフラク シヨ ン Not 2 5 - Να 3 0 (各フラ ク ショ ンは 5 m£ )を集めることにより、 テネィ シ ンを高濃度で舍む溶液 9 0 0 m£を得た。 タ ンパクの収量は 9 0. 0 mg めった o
該溶液をセント リ フロー膜 （アミ コ ン社製） を用いて、 4 °C、 2 5 0 0 X で遠心して 1 0 0 m£に濃縮した後、 0. 5 M尿素 Z 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム Z 5 0 mMト リス塩酸 （pH 7. 4 ) 2 ^に対 して、 4でで 1 2時間透析した。
該溶液 1 2 Ο πώを、 ゼラチンカ ラム （ゼラチンセフ ァロース、 フ アルマシア社製、 3 0 πώ ) にアプライ し、 フイブロネクチンを 特異的に吸着せしめた。 テネイ シンは通過画分に溶出され、 フィ ブロネクチンを含まないテネィ シン溶液 2 2 0 m£を得ることがで きた。
該溶液をセン ト リ フロー膜 （ア ミ コ ン社製） を用いて 4 、 2 5 0 0 X gで遠心して 4 0 m£に濃縮した後、 2 の 2 M尿素 Z 5 0 mMト リス塩酸 （pll 8. 0 ) を用いて、 4 °Cで 12時間透析した。 透析後、 該溶液を D EA E- 5 PW (東ソ一㈱製、 カ ラム径 7. 5 匪、 力 ラ ム長 5 0 mm) のカ ラ ムをもちいて高速液体ク口マ トグラ フ ィ ー により精製した。 該溶液の 1 miを力 ラ ムにィ ンジエタ ト した後、 2 Mの尿素中 0 — 0. 4 Mの塩化ナ ト リ ゥム直線濃度勾配溶液を用 い、 流速 5 m£Z分、 カ ラ ム圧 1 5 kg/cnf. 力 ラ 厶温度 1 5 °Cで 分離すると、 目的とするテネイ シンは、 4 2分一 4 5分に 2 M尿 素 Z0.2 5 M塩化ナ ト リ ゥムで溶出された。 テネイ シンは 2 8 0 nmの吸収、 及び実施例 1に記載したテネィ シンに特異的な細胞接 着活性により検出した。 その結果を第 5図及び第 6図に示す。 図 から明らかなようにテネィ シ ンはシャープな単一ピークと して分 離された。 ローラ一ボ ト ル 1 0 0本 （細胞数約 2 0 0 X 1 0 8 ) - 培地 1 0 0 ^より総収量 6. 6 mgのヒ トーテネィ シンを得ることが できた。
得られたヒ トーテネイ シン 5 〃 gを、 1 % _ 2 -メ ルカプトエタ ノ ール Z 2 %— S D S Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （ρΙ16. 8〉 を用いて 1 0 0 °Cで 3分間還元した後、 4 %— 2 0 %の SDS- PAGEで分析し た。 ヒ ト 一テネィ シンに特徴的な 2 5 0 Kと 2 0 0 Kのバン ドを 検出.することができた。 他にバン ドは検出されず、 本発明により 得られたヒ トーテネイ シンの純度は、 ほぼ 1 0 0 %であることが 確認できた。
実施例 3
ヒ ト メ ラ ノ ーマ細胞 （M— 1 4 ) をヌ ー ドマウスに 2 X 1 06 セル Z匹となるように皮下に注射し、 約 1 ヶ月後に癌化した組織 を摘出した。
該摘出組織 5 gをミ ンチ し、 2 M尿素 Z 5 0 mMト リス塩酸 （PH 7.4 ) / 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ゥ厶 2 mM - P M S Fを 4 5 /^加え て 4 °Cで 1 2時間攪排した後、 実施例 2 に記載の方法により、 テ ネィ シンを含む画分 3 1 0 mgを得た。 セファ ロース C L一 6 Bの 溶出条件は、 実施例 2 に記載の条件によった。 そのボイ ド画分 ( 9 rag) を、 実施例 1 に記載の方法により、 フイブロネクチンを 除去した後に DEAE-5PWを用いて精製することにより、 テネィ シン 7 0 0 gを得た （第 7図） 。 実施例 1の方法で SDS- PAGEにより 分析すると、 得られたテネィ シンの純度はほぼ 1 0 0 %であった 実施例 4
ヒ ト —コ ン ドザルコ ーマの組織 3 gに、 2 7 /^の 21^尿素 5 0 mMト リス塩酸 （pH7.4 ) Z 0.1 5 M塩化ナ ト リ ウム Z 2 mM- PM S Fをを加えて 4でで 1 2時間攪拌した後、 テネィ シンを含 む画分 3 0 mgをえた。 セファロース C L一 6 Bの溶出条件は実施 例 2に記載の条件によった。 そのボイ ド画分 （ l mg) を実施例 1 に記載の方法により、 フイブロネクチンを除去した後に （ 8 0 0 g ) 、 DEAE- 5PWを用いて精製し、 テネイ シンを 2 0 0 g得た (第 8図） 。 実施例 1記載の方法で SDS- PAGEにより分析すると、 得られたテネィ シンの純度は、 ほぼ 1 0 0 %であった。
実施例 5
9 B目のマウス胎児 4 0 0匹 （ l、 5 g ) に、 1 3. の 2 M 尿素 Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （pH8.0 ) X ϋ. 1 5 Μ塩化ナ ト リ ウム X 2 mM- PM S Fを加えて 4 °Cで 1 2時間攪袢した後、 マウス一 テネィ シンを含む画分 1 5 mgを得た。 セファロース C L一 6 Bの 溶出条件は、 実施例 2 に記載の条件によった。 そのボイ ド画分 ( 5 0 0 g ) を、 実施例 1 に記載の方法によりフイブロネクチ ンを除去した後に （ 4 0 0 、 を用いて精製し、 テ ネイ シン 1 0 0 〃 gを得た。 溶出パターンは、 実施例 1 とほぼ同 じであった。 実施例 1の方法により SDS- PAGEにより分析すると、 得られたテネィ シンの純度は、 ほぼ 1 0 0 %であった。 実施例 6
ニヮ ト リ胎児 （ハンバーガ——ハ ミ ル ト ン ステージ 2 3. 5 ) 3 0 0匹に、 9 ? ^の 2 M尿素 Z 5 0 mMト リ ス塩酸 （PII8. 0 ) / 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム Z 2 mM— P M S Fを加えて 4 °Cで 1 2時 間攪桦してマウス一テネィ シンを含む画分 1 0 mgを得た。 セフ ァ ロース C L— 6 Bの溶出条件は、 実施例 2に記載の条件によつた。 そのボイ ド画分 （ 3 0 0 〃 g ) を、 実施例 1 に記載の方法により フィ ブロネクチンを除去した後 （ 2 5 0 g ) 、 DEAE- 5PWを用い て精製して、 テネイ シン 6 0 〃 gを得た。 溶出パタ一ンは実施例 1 とほぼ同様であった。 実施例 1の方法で SDS- PAGEにより分析す ると、 得られたテネィ シンの純度は、 ほぼ 1 0 0 %であった。
産業上の利用可能性
このように本発明にかかるテネィ シンの精製方法により、 工業 的にも対応しうる純生化学的手段を用いて極めて高純度のテネィ シ ンを高収率で得る事ができ、 例えば癌の診断、 治療に有用なテ ネィ シンに特異的なモノ ク π—ナル抗体等の生理活性物質を産生 することができる。

Claims

請求の範囲
(1) テネィ シンを含む細胞外基質抽出物をゼラチンを共有結合さ せたァフィ二ティークロマ トグラフィー内を通過させてフイブ πネクチンを溶質に対して 1重量％以下となる様に除いた後、 該通過画分から塩基性陰ィォン交換榭脂を用いてテネィ シンを 精製することを特徴とする、 テネイ シンの精製方法。
(2) 該細胞外基質抽出物が、 ヒ トーフイブロブラ ス ト細胞、 ヒ ト 一メ ラノ 一マ細胞、 ヒ ト ーグリォーマ細胞、 及びヒ ト ーコ ン ド ロザルコ ーマ細胞からなる群から選ばれる細胞由来のものであ
I 0
る、 請求の範囲第 1項記載の方法。
(3) 該細胞外基質抽出物を、 尿素、 グァニジン塩酸塩、 及びグァ 二ジンィ ソチォ シァネー トからなる群から選ばれる薬剤で抽出 する、 請求の範囲第 1項記載の方法。
(4) 該細胞外基質抽出物を該細胞培養液から得る、 請求の範囲第 2項記載の方法。
(5) 該塩基性陰ィォン交換樹脂がジェチルァミ ノ ェチル基で修飾 された樹脂である、 請求の範囲第 1項記載の方法。
(β) 該塩基性陰ィォン交換樹脂による精製を 1〜 8 Μの尿素中 .1 Μ以下の塩化ナ ト リ ゥムを用いて行う、 請求の範囲第 1項記載
2 υ
の方法。
(7) 該塩基性陰ィォン交換榭脂による精製を 2 Μの尿素中 0. 4 Μ 以下の塩化ナ ト リ ウムを用いて行う、 請求の範囲第 1項記載の 方法。
(8) 該塩基性陰イ オ ン交換榭脂による精製を 2 Μの尿素中 0 一
2 5 0. 4 Μ塩化ナ ト リ ゥ ム直線濃度勾配を用いて行う、 請求の範囲 第 1項記載の方法。
(9) 該塩基性陰ィォン交換樹脂による精製を高速液体ク πマ トグ ラ フィ —で行う、 請求の範囲第 8項記載の方法。
o) テネイ シンをテネィ シン依存の細胞接着活性により検出する、 請求の範函第 1項記載の方法。
PCT/JP1989/000839 1988-08-19 1989-08-17 Method for purifying teneicine WO1990002140A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE68924650T DE68924650T2 (de) 1988-08-19 1989-08-17 Verfahren zur reinigung von tenascin.
EP89909433A EP0434836B1 (en) 1988-08-19 1989-08-17 Method for purifying tenascin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63205902A JPH0256499A (ja) 1988-08-19 1988-08-19 テネイシンの精製方法
JP63/205902 1988-08-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1990002140A1 true WO1990002140A1 (en) 1990-03-08

Family

ID=16514641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1989/000839 WO1990002140A1 (en) 1988-08-19 1989-08-17 Method for purifying teneicine

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0434836B1 (ja)
JP (1) JPH0256499A (ja)
DE (1) DE68924650T2 (ja)
WO (1) WO1990002140A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
JP4341302B2 (ja) 2003-06-09 2009-10-07 パナソニック株式会社 電子部品実装装置および電子部品実装方法
JP4952692B2 (ja) * 2008-09-19 2012-06-13 パナソニック株式会社 電子部品実装装置および電子部品実装方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61148127A (ja) * 1984-12-21 1986-07-05 Chemo Sero Therapeut Res Inst ＨＢｃ抗原の精製方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61148127A (ja) * 1984-12-21 1986-07-05 Chemo Sero Therapeut Res Inst ＨＢｃ抗原の精製方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0555520B2 (ja) 1993-08-17
EP0434836B1 (en) 1995-10-25
EP0434836A4 (en) 1991-10-16
JPH0256499A (ja) 1990-02-26
DE68924650T2 (de) 1996-04-11
EP0434836A1 (en) 1991-07-03
DE68924650D1 (de) 1995-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fernández-Puentes et al. Viral infection permeabilizes mammalian cells to protein toxins
Saksela et al. Endothelial cell-derived heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic degradation.
Nitkin et al. Identification of agrin, a synaptic organizing protein from Torpedo electric organ.
Alitalo et al. Extracellular matrix components synthesized by human amniotic epithelial cells in culture
US5587297A (en) Method for identification of disease-specific surface components of vascular endothelial cells
Skinner et al. Structural characterization of proteoglycans produced by testicular peritubular cells and Sertoli cells.
JP2004043502A (ja) 新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法
JPS62223197A (ja) アルフア−１−抗プロテア−ゼ精製
Morrison et al. Simian virus 40 tumor antigen: isolation of the origin-specific DNA-binding domain
JP2004113252A (ja) 二本鎖を有する非毒性リボソーム不活性化蛋白、その製法および調製物
Hausser et al. Endocytosis of a small dermatan sulphate proteoglycan. Identification of binding proteins
Zack et al. Identification of fibronectin neoepitopes present in human osteoarthritic cartilage
Chuang et al. Detection and characterization of beta-adrenergic receptors and adenylate cyclase in coated vesicles isolated from bovine brain
Kroll et al. The carboxy-terminus of IκBα determines susceptibility to degradation by the catalytic core of the proteasome
McGLADE et al. Acylation of the 176R (19-kilodalton) early region 1B protein of human adenovirus type 5
WO1990002140A1 (en) Method for purifying teneicine
Tomida et al. A serum factor capable of stimulating hyaluronic acid synthesis in cultured rat fibroblasts
Cammarata et al. Identification of noncollagenous components of calf lens capsule: Evaluation of their adhesion‐promoting activity
Painter et al. Photoaffinity labeling of the N‐formyl peptide receptor of human polymorphonuclear leukocytes
ISEMURA et al. Isolation and characterization of human placenta fibronectin
Kumar Nadimpalli et al. Identification of the putative mannose 6-phosphate receptor (MPR 46) protein in the invertebrate mollusc
Déry et al. Possible role of ADP-ribosylation of adenovirus core proteins in virus infection
TW385313B (en) Method for the production of rDSPA alpha 1
JP3104178B2 (ja) 機能性ポリペプチド
Klein et al. Renal localization of heparan sulfate proteoglycan by immunohistochemistry.

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1989909433

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1989909433

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1989909433

Country of ref document: EP