WO1988006621A1 - Serine protease and serine protease gene - Google Patents

Serine protease and serine protease gene Download PDF

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WO1988006621A1
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serine protease
dna
gene
sequence
amino acid
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PCT/JP1988/000205
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Inventor
Yosuke Aoki
Kiyoshi Okano
Masanobu Naruto
Hirohiko Shimizu
Haruji Nakamura
Original Assignee
Toray Industries, Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to serine protease, which is involved in the development of inflammation and has a function of changing the functions of lymphocytes, monocytes, NK cells, and granulocytes, its precursors, and genes encoding them. .
  • the present invention relates to a DNA sequence of a transcription control region required for cell-specific gene expression.
  • Yosuke Aoki et al. Found a novel serine proteinase in erythroblasts and granulocytes in bone marrow cells, and named it niedul lasin. It has been shown that it has a flame effect (J. Biol. Cheui. 253. 2026-2032 (1978); J. Clin. Invest. 69, 1223-1230 (1982)).
  • Yosuke Aoki et al. Have clarified and reported the following biological activities of medaracin.
  • the first object of the present invention is to clone a gene corresponding to medullasin by a genetic recombination method and clarify its sequence. This makes it possible to clarify the gene encoding medullasin or its precursor, and at the same time to elucidate the amino acid sequence of medullasin.
  • an object of the present invention is to make it possible to synthesize medaracin by a chemical synthesis method or a gene recombination method, and to obtain a large amount of high-purity medaracin.
  • Medaracin is abundant in human bone marrow cells or peripheral blood cells. For example, about 1 ⁇ ⁇ g of medalacin has been identified in 1 ml of human peripheral blood. However, it is hardly found in other tissues and cells, and is specifically expressed only in human blood cells, especially leukocytes and erythroblasts.
  • elucidating the expression mechanism of the medullasin gene is expected to elucidate gene expression specific to human leukocytes or erythroid cells, which has not been clarified so far. .
  • the expression of a cell-specific gene is controlled by gene sequences present around and inside the chromosomal gene, together with proteins and other factors (transduction factors) specific to the cell. Have been. Therefore, the above-mentioned human bone marrow cell-derived serine protease and medaracin chromosomal gene may be expressed around or inside the leukocyte or erythroblast-specific gene expression of human blood cells.
  • the necessary transcription control region DNA sequence may exist.
  • the third object of the present invention is to provide a DNA sequence of a transcription control region necessary for cell-specific gene expression.
  • the present invention relates to a serine protease having a biological activity exhibited by a polypeptide having an amino acid sequence shown in FIG. 1, and a serine protease gene encoding the same.
  • the present invention also shows the biological activity exhibited by the polypeptide having all or part of the amino acid sequence shown in FIG.
  • these are a seric proteinase precursor in which a cleavable peptide or signal peptide is bound to the N-terminus of serine proteinase, and a serine proteinase precursor gene encoding the same.
  • the present invention relates to a DNA sequence encoding a transcription control region contained in a chromosome gene of serine protease in human bone marrow cells.
  • FIGS. 1, 3 and 5 show the amino acid sequences of all or a part of the serine protease of the present invention
  • FIGS. 2 and 4 show the serine protease gene of the present invention.
  • An example of the DNA base sequence is shown below.
  • FIG. 6 shows an example of the amino acid sequence of the serine protease precursor of the present invention
  • FIG. 7 shows an example of the DNA sequence containing the serine protease precursor gene of the present invention.
  • FIG. 8 to FIG. 14 show a method for producing a vector for expressing the serine protease of the present invention.
  • FIG. 15 shows an example of a DNA sequence encoding a transcription control region contained in the chromosomal gene of human bone marrow cells or granulocyte-derived serine proteinase of the present invention. Shows a chromosomal gene sequence containing the serine protease structural gene of the present invention and its expression control region.
  • the serine protease of the present invention is a polypeptide consisting of 238 amino acid sequences shown in FIG. Provided that a biological activity substantially equivalent thereto is retained, a polypeptide constituted by partial substitution, deletion, insertion, or the like in the amino acid sequence described above is also a cell of the present invention. Included in the protease.
  • proteases produce messenger from their genes.
  • the serine protease of the present invention has a form in which, for example, a C-terminal 19 amino acid sequence of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 1 is removed by processing. Also included.
  • the serine protease gene of the present invention is a gene that encodes the serine protease of the present invention described above and includes a DNA base sequence shown in FIG. 2 as a representative example.
  • the serine protease precursor of the present invention has a cleavable peptide or signal peptide bound to the N-terminus of the serine protease described above.
  • An example is shown.
  • the serine protease precursor in FIG. 6 is a polypeptide consisting of 267 amino acid sequences and contains a signal peptide upstream of the serine protease in FIG. It is a combination of two amino acids.
  • the serine protease precursor gene of the present invention comprises A typical example is a gene encoding a protease precursor that contains the DNA base sequence shown in FIG.
  • the entire amino acid sequence of the serine protease and its precursor of the present invention has been clarified by the present invention, it can be produced by a known chemical synthesis method. It can be manufactured easily and in large quantities.
  • cDNA containing the gene for serine protease or its precursor is preferably obtained according to the following steps.
  • a DNA probe that hybridizes with DNA is chemically synthesized, and is used to pick up a target DNA from a cDNA library.
  • the serine protease producing cells in step (2) include human acute promyelocytic leukemia (APL) cells, ML3 [A. Leukemia, edited by E. Henderson and F. Gunz, P. 119-139, Grune & S Fluidon. New York (1982)] It is preferably used because it produces protease.
  • APL human acute promyelocytic leukemia
  • ML3 A. Leukemia, edited by E. Henderson and F. Gunz, P. 119-139, Grune & S Fluid On. New York (1982)] It is preferably used because it produces protease.
  • the amino acid sequence of the N-terminal part of serine protease is determined by the Edman degradation method, and the corresponding DNA fragment, a DNA fragment, is chemically synthesized and labeled. It can be obtained by
  • the vector containing the serine protease gene is integrated into an appropriate expression vector, and recombinant DNA is obtained. This can be introduced into a host such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast or cultured animal cells, and the resulting transformant can be cultured to produce the desired serine protease.
  • a serine protease with a sugar chain can be obtained.
  • the above genetic manipulation can be performed according to a known method (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning A Laboratory Mannua Id. Spring Harbor Lab. (1982)).
  • TrpE T7 phage-derived peptides or anthranilate synthase
  • tannin such as 3-galactosidase
  • the expression efficiency can be increased by using an expression vector containing a gene encoding a chimeric protein in which a protein is cleavably linked upstream of the serine protease of the present invention.
  • Serine protease can be easily isolated by digesting the produced chimeric protein with an enzyme or the like.
  • the present invention provides a serine protein derived from human bone marrow cells.
  • the present invention relates to a DNA sequence that encodes a transcription control region contained in a chromosome gene of a case.
  • the transcription control region of the present invention includes a promoter region and an enhancer, and the DNA sequence encoding the same includes, for example, those containing the sequence shown in FIG. 15 or a sequence equivalent thereto. However, it is not limited to this. Equivalence here means that the DNA base is partially replaced by another DNA base, partially deleted, or other DNA base is added, and It has the same function as the original DNA sequence.
  • the sequence shown in FIG. 15 corresponds to the DNA sequence at the 1-125th position of the sequence shown in FIG. Fig. 16 shows the chromosomal gene sequence containing the structural gene of medullasin and its expression control region. The nucleotide sequence of the cloned DNA fragment of about 6 kilobases was determined.
  • medalasin gene This contains the full length of the human medullasin gene, and the TATA sequence and CAAT sequence, which are characteristic promoter structures, can be confirmed. Comparison with the base sequence of medalasin cDNA revealed that the medalasin gene consisted of five exons separated by four introns.
  • Characteristic structures include four repeats of 53 base pairs upstream of the promoter structure and 10 directs of 42 base pairs at the third int. A repeat sequence is observed.
  • the third intron has a complex secondary structure There are also AT-rich sequences that can take the form.
  • the base sequence of the protein synthesis initiation region of the medalacin gene matches well with the nucleotide sequence proposed by Kozak for the efficient initiation of protein synthesis. Shintano ,. This is presumed to be one of the reasons why the protein is present in a relatively large amount of about 10 Ug in 1 ml of human peripheral blood.
  • the present inventors investigated the amount of poly (A) + RNA in cells by Northern blotting as shown in the Examples to obtain the poly (A) of medaracin.
  • RNA + RNA is abundantly expressed in human acute promyelocytic leukemia cells, ML3 cells (described above), but other cells, for example, normal diploid fibroblasts derived from human fetal lung tissue Moreover, it was found that it was hardly expressed in the cell line derived from human pancreatic malignant epithelial tumor MIAPaCa-2 cells.
  • the transcription control region of the present invention is a sequence for gene expression specific to human blood cells, particularly erythroblasts and granulocytes.
  • serine protease is used because the serine protease of the present invention is not mixed with the serine protease precursor.
  • Example 1 the term serine protease is used because the serine protease of the present invention is not mixed with the serine protease precursor.
  • purified medaracin (serine proteinase) 2 25 ⁇ g was used as a gas phase automatic peptide sequencer 47 O type A
  • amino acid sequence portion in which the coding DNA sequence is less degenerate is less degenerate:
  • the cell line ML3 was cultured in RPMI 164 medium containing 10% fetal calf serum. The culture was performed at 37 C under a 5% carbon dioxide concentration. When the cells grew to a density of about 1 ⁇ 10 ° cellsZml, cycloheximide was added to a concentration of 30 g / ml, and the cells were further cultured for 5 hours. Cells obtained by it this (about 1. 4 X 1 0 9 cells) in 6 M guanidine thio Shiane preparative 2% Zaruko sills, 5 0 ⁇ Application Benefits scan hydrochloride ( ⁇ 7. 6) 1 0 ⁇ DTA, 1 % / 3—Melcap Toeta 30 ml of a solution of phenol was added, and the resulting viscous solution was passed through an 18 G injection needle five times.
  • This cell homogenate was layered on 13 volumes of a 5.7 M cesium chloride (containing lOOOMMEDTA) solution, and the resulting mixture was dried at 350,000 rpffl. Centrifuged at C. The RNA precipitated at the bottom of the centrifuge tube was dissolved in a small amount of water, phenol-treated, and then subjected to ethanol precipitation to obtain 640 ⁇ g of total RNA.
  • cesium chloride containing lOOOMMEDTA
  • RNA was subjected to oligo dT cell-mouth column chromatography by a conventional method, and 86 ⁇ g of poly (A) + RNA was selectively collected.
  • the upstream including and including the 7th C and the downstream including and including the 807th G are used for the Ec ⁇ used for cloning into the ⁇ gt10 vector.
  • RI Linker Derived from GGAATTCC Therefore, the DNA base sequences from the 8th to the 806th DNA in the figure are
  • the 8th to 718th nucleotides constitute cDNA encoding the serine protease of the present invention.
  • this cDNA portion is shown in FIG.
  • This cDNA lacks the portion encoding isoleucine (lie), an amino acid at the N-terminus of purified medullasin shown in Fig. 3, but lie is the N-terminus of medullasin. This is evident from the results of the analysis of the amino acid sequence of the purified medullasin described above. Therefore, all cDNAs encoding the serine protease of the present invention were obtained at the 5 terminal It can be concluded that ATT, ATC or ATA which codes He on the side is added.
  • the amino acid sequence corresponding to the entire cDNA that is, the amino acid sequence of the serine protease of the present invention is shown in FIG.
  • Example 1 Using the serine protease partial cDNA obtained in Example 1 as a probe, 5 g of the poly (A) + RNA of ML3 cells prepared in the same manner as in Example 1, section (B) was used.
  • Example 1 Approximately 100,000 newly synthesized clones in the same manner as in section (C); gt clones obtained in Example 1 from the gt10 cDNA library. Five clones with a serine protease cDNA longer than 800 base pairs of a were isolated. Of these, the nucleotide sequence of the region coding for the N-terminus of the cloned MEDIO and MED13 serine proteases was determined by the same method as in Example 1, section (E). MED 13 is 89 base pairs, ta
  • MED 10 contained up to 128 base pairs upstream. Therefore, the sequence of serine protease precursor cDNA is as shown in FIG. As estimated from these DNA sequences, the serine protease precursor consists of 267 amino acids, an additional 29 amino acids upstream of isoleucine at the N-terminus of mature serine proteinase. Acid is bound ( Figure 6). Among the leader peptides composed of 29 amino acids, the 27 amino acids at the N-terminal end are composed of 17 hydrophobic amino acids (9 oral amino acids and 5 alanine amino acids).
  • a peptide consisting of two amino acids, serine-glutamate, present downstream of this signal peptide is presumed to be an activated peptide.
  • the EcoRI fragment of the DNA shown in FIG. 4 obtained in Example 1 was first inserted into the EcoRI site of pUC19, and the downstream site of the DNA in FIG. Clone close to the BamH ⁇ site of pUC19 MED 1 — 4a was selected to obtain plasmid DNA.
  • the vector PUC19MED1-4a was completely digested with HindIE and then partially digested with NaeI to isolate a serine protease portion cDNA consisting of about 800 base pairs.
  • This DNA fragment and a synthetic oligonucleotide encoding the N-terminus of mature serine protease were inserted between the EcoRI and Hindm sites of pUC19 using T4 DNA ligase.
  • a vector PUC19YMED having a mature serine protease cDNA was prepared (FIG. 8).
  • Mature serine protease can be isolated by partially digesting this chimeric protein with trypsin.
  • TrpE Serine protease expression vector pA
  • the pUC19MED1-4a of Example 1 was completely digested with Hind ⁇ and then partially digested with NaeI to isolate a DNA fragment of about 800 base pairs containing a serine protease partial gene. Using T4 DNA ligase, this fragment and a synthetic oligomer encoding the N-terminal side of serine protease were used to express TrpE chimeric protein expression vector pATH2 (CLDieckin an and A. Tzagoloff, J. Biol. Chein. 260.1513-1520 (1985)), inserted between the Sa1I site and the HindE site to obtain the chimeric TrpE-serine protease. A vector expressing the protein, pATH2MED, was constructed (Fig. 10).
  • a peptide consisting of 311 amino acids derived from TrpE and a mature serine protease consisting of 238 amino acids were bound via a lysine.
  • Chimeric proteins consisting of amino acids are produced. Mature serine protease can be isolated by partially digesting this chimeric protein with the endoprotease 1ysC.
  • TrpE When the protein of all cells was confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, TrpE with a molecular weight of about 61,000, which was not found in HB101 into which pATH2 was introduced at the control port, was not found —Chimeric protein of serine protease was confirmed. It was confirmed by Western blotting using an anti-serine protease antibody that this protein was a chimera protein of serine protease.
  • a vector PAT405 carrying the yeast PH05 (inhibitory acid phosphatase) promoter provided by Dr. Higashie of Hiroshima University was completely digested with XhoI, and then T4 DNA polymerase was obtained. After blunt-ending by the enzyme treatment, the terminal rin was removed by E. coli alkaline phosphatase treatment.
  • KC 1 was suspended in a medium (without phosphoric acid), and cultured at 30 for 2 hours.
  • 1 ml of the culture supernatant was concentrated by freeze-drying and analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, a molecular weight of about 32, which was not found in the culture supernatant of DC5 into which the control pAT405 was introduced, was not found. , 000 proteins were detected. The fact that this protein was serine protease was confirmed by western blotting using an anti-serine protease antibody.
  • Example 4 pUC19YMED in section (A) was completely digested with EcoRI and HindIII to isolate a DNA fragment of about 800 base pairs consisting of mature serine protease cDNIII.
  • the vector p MF ⁇ 8 (A. Miyajima et al., Gene, 37.155 (1985)), which has an a-factor mouth motor and a leader sequence, which is a yeast hybrid monkey, is Complete After digestion, it was dephosphorylated by E. coli alkaline phosphatase treatment.
  • T4 DNA ligase to prepare PSRMED, a vector for expression of serine protease, yeast (Fig. 13).
  • the culture supernatant (1 11) was concentrated by freeze-drying, and analyzed by Western blotting using an anti-serine protease antibody, and the control, pMFa8, was introduced.
  • Example 6 pUC19PMED of section (A) was completely digested with EcoRI to contain the serine proteinase precursor cDNA. A DNA fragment of about 95 ° base pairs was separated. After digesting pc DLSR a296 (available from Dr. Takebe of DNAX) with EcoRI, the vector was dephosphorylated by Escherichia coli alkaline phosphatase treatment. By binding using ligase, a serine proteinase animal cell expression vector pSRa MED was prepared (FIG. 14).
  • the soluble fraction obtained by centrifuging the cells at 1200 g for 30 minutes after freezing and thawing the cells was analyzed for -nitrophenyl N-tert-buty loxycarbon l-L-alaninate, a substrate for elastase. with method was used as a substrate (and sser et al, Bioche e.Biophys.Acta., 268, 257 (1972)), about 1 compared to the emissions trawl where the activity of the enzyme was measured x 1 0 s cells Ah or 347. An activity to increase the absorbance of 511111 by 0.1 was detected.
  • a MED—EcoRI fragment of 2 is inserted into the sequence vector pUC18DNA or pUC19DNA.
  • the nucleotide sequence was determined by the xy-sequence method. The results are shown in FIG. That is, among the inserted fragments of clone ⁇ MED-2, 5292 bases whose nucleotide sequence was determined were It was shown to.
  • the CAAT box, the TATA box, and the polyA addition signal are boxed in small boxes, and the protein-coding region of serine protein-A (+) RNA is boxed.
  • the repetitive sequences present in the upstream portion of the promoter and in the third inlet are indicated by underlined arrows. However, the 5 / terminal position of poly (A) + RNA may have an error of about several bases.
  • ML3 cells normal diploid fibroblasts derived from human fetal lung, and MIAPaCa-2 cells were converted to RPMI 164 medium (ML3) containing 10% fetal bovine serum, Eagle's MEM medium containing 0% fetal bovine serum (human fetal lung normal diploid fibroblasts) or Dulbecco's MEM containing 10% fetal bovine serum and 2.5% horse serum
  • ML3 cells normal diploid fibroblasts derived from human fetal lung, and MIAPaCa-2 cells were converted to RPMI 164 medium (ML3) containing 10% fetal bovine serum, Eagle's MEM medium containing 0% fetal bovine serum (human fetal lung normal diploid fibroblasts) or Dulbecco's MEM containing 10% fetal bovine serum and 2.5% horse serum
  • the cells were cultured in a medium (MIAPaCa-2 cells) at 32 ° C with 5% carbon dioxide gas. 2 to 5 X 1 0 8 cells in 6
  • RNAs were applied to an oligo dT column according to the method described in the same book, pages 192 to 198, to obtain poly (A) ⁇ RNA.
  • poly (A) + RNAs was subjected to formaldehyde agarose gel electrophoresis with lOig and transferred to a filter of nitrocellulose. These procedures were described in the same book, page 202 to page 203. Said
  • the two-cell mouth filter obtained in this way was analyzed using a Nozzan hybridizer.
  • the method was performed according to the Southern hybridization described in the same book, pp. 377-389. Serine proteinase described in Okano K, et al., J. Biochem. 102, 13-; L6 (1987), as a probe.
  • the serine protease of the present invention is important for the development of an inflammation inhibitor because it is involved in the development of inflammation, and further has an effect of changing the functions of lymphocytes, monocytes, NK cells, and granulocytes. is there. Therefore, it is very useful in the medical field.
  • the serine protease of the present invention can be a useful pharmaceutical.
  • the serine protease of the present invention since it has a thrombolytic effect, it can be used as a thrombolytic agent for disseminated intravascular coagulation (DIC).
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • plant-derived protease, papine may be used for the treatment of DIC.
  • the serine protease of the present invention has an advantage that it can be used safely because it is a human-derived enzyme.
  • the serine protease of the present invention is safe because it is derived from human.
  • the D ⁇ sequence of the transcription control region required for the cell-specific gene expression of the present invention is capable of expressing foreign genes in leukocytes or erythroid cells, especially, in cultured cells derived therefrom. It is useful for making it specific.

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Description

明 細 書
セリ ンプロテア一ゼおよびセリ ンプロテアーゼ遺伝子 技 術 分 野
本発明は炎症の発現に関与し、 さ らにリ ンパ球、 単球、 N K細胞および顆粒球の機能を変化させる働きを有する セリ ンプロテア一ゼ、 その前駆体、 およびそれらをコー ドする遺伝子に関する。
さ らに、 本発明は、 細胞特異的な遺伝子発現に必要な 転写制御領域の D N A配列に関する。
背 景 技 術
青木洋祐らは、 骨髄細胞のうち赤芽球と顆粒球に新規 なセリ ンプロテア一ゼを見い出し、 これをメ ダラ シ ン (niedul lasin) と命名し、 メダラ シ ンに N K細胞活性化 作用および起炎作用のあることを明らかにした（J.Biol . Cheui. 253. 2026-2032 (1978) ； J.Clin. Invest. 69, 1 223-1230 (1982) ) 。
そ して同じく青木洋祐らによってメダラ シンの有する 下記のような生物活性が明らかにされ、 報告されている。
① 赤芽球において、 ヘム合成の調節に関与しピリ ドキ シン反応性貧血の発現.に関与する。
② 慢性炎症に随伴する貧血の発現に関与する。
③ 顆粒球のメダラ シン活性は慢性炎症性疾患増悪期に 増大する。
④ 生理的濃度のメ ダラ シ ンを動物皮内に注射すると単 球浸潤を特徵と した炎症が惹起され、 細静脈内皮細胞 が特徵的に変性する。
⑤ ヒ ト リ ンパ球をメ ダラシン処理すると、 その D N A - および R N A合成能が増大し、 各種マイ トージヱンに 対する反応性が著増する。
⑥ 単球をメダラシン処理すると、 その遊走能が阻止さ れてスーパ一ォキサイ ド産生能が増大する。
⑦ 顆粒球をメダラシン処理すると遊走能が増大する。
⑧ ヒ ト リ ンパ球をメダラシン処理すると、 その N K活 性が著増し、 これはイ ンタ一フエロン産生を介さない。 メダラ シンの全ァ ミ ノ酸配列は未だ解明されておらず、 メ ダラ シンの取得にはヒ ト骨髄細胞も しく は顆粒球が供 耠源として用いられている。 従って、 その供耠量には限 りがある。
本発明は、 遺伝子組換え法によつてメ ダラ シンに対応 する遺伝子をク ロー ン化して、 その配列を明らかにする ことを第一の目的とする。 これによつて、 メ ダラシンも しく はその前駆体をコー ドする遺伝子を明らかにするこ とができると同時に、 それによつてメ ダラ シンのァ ミ ノ 酸配列を解明することができる。 第二に、 本発明はメダ ラシンの化学合成法も しく は遺伝子組換え法による合成 を可能なら しめ、 純度の高いメダラシンを大量に得るこ とを目的とする。
メダラシンは、 ヒ ト骨髄細胞中あるいは末梢血細胞中 においてかなり多く含まれている。 例えば、 ヒ ト末梢血 1 mlの中に約 1 ◦ ^ gのメ ダラ シンが確認されている。 しかしながら他の組織や細胞中には殆んど見い出されて おらず、 ヒ ト血球系細胞、 特に白血球や赤芽球等にのみ 特異的に発現されている。
従って、 メ ダラ シン遺伝子の発現機構を明らかにする ことは、 これまでに明ら力、になっていないヒ トの白血球 あるいは赤芽球系に特異的な遺伝子発現を解明する もの と期待される。
一般に細胞特異的な遺伝子の発現は、 その細胞に特異 的なタ ンパク質をはじめとする因子類 （ トラ ンス因子） とと もに、 当該染色体遺伝子の周辺および内部に存在す る遺伝子配列によって制御されている。 従って、 前述の ヒ ト骨髄細胞由来セリ ンプロテアーゼ、 メ ダラ シ ンの染 色体遺伝子の周辺も し く は内部には、 ヒ ト血球細胞のう ち白血球や赤芽球特異的な遺伝子発現に必要な転写制御 領域の D N A配列が存在することが考えられる。
従って、 本発明は第三に、 細胞特異的な遺伝子発現に 必要な転写制御領域の D N A配列を提供すること も目的 とする。
発 明 の 開 示
本発明は、 第 1図に示されるア ミ ノ酸配列を有するポ リベプチ ドが呈する生物活性を示すセ リ ンプロテア一ゼ、 およびそれをコ一 ドするセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子であ る 0
また、 本発明は、 第 1図に示すア ミ ノ酸配列の全部ま たは一部を有するポ リべプチ ドが呈する生物活性を示す セ リ ンプロテア一ゼの N—末端に、 開裂可能なぺプチ ド またはシグナルぺプチ ドが結合してなるセリ シプロテア ーゼ前駆体、 およびそれをコー ドするセリ ンプロテア一 ゼ前駆体遺伝子である。
さ らに本発明はヒ ト骨髄細胞のセリ ンプロテア一ゼの 染色体遺伝子に含まれる転写制御領域をコー ドする D N A配列である。
図面の簡単な説明
第 1図、 笫 3図および第 5図は本発明のセリ ンプロテ ァ一ゼの全部または一部のァ ミ ノ酸配列であり、 第 2図 および第 4図は本発明のセリ ンプロテアーゼ遺伝子を含 む D N A塩基配列の一例を示す。
第 6図は本発明のセリ ンプロテアーゼ前駆体のァ ミ ノ 酸配列の一例であり、 第 7図は本発明のセリ ンプロテア —ゼ前駆体遺伝子を含む D N A配列の一例を示す。
第 8図〜第 1 4図は本発明のセリ ンプロテア一ゼを発 現するためのべクターの作製方法を示す。
第 1 5図は、 本発明のヒ ト骨髄細胞も しく は顆粒球由 来のセリ ンプロテア一ゼの染色体遺伝子に含まれる転写 制御領域をコ一 ドする D N A配列の一例であり、 第 1 6 図は本発明のセリ ンプロテア一ゼ構造遺伝子およびその 発現制御領域を含む染色体遺伝子配列を示す。
発明を実施するための最良の形態 本発明のセ リ ンプロテア一ゼは、 第 1図に示される 2 3 8個のァミ ノ酸配列から成るポリべプチ ドであるが、 それと実質的に同等の生物活性が保持されているならば、 上記ァ ミ ノ酸配列に部分的な置換 ·欠失 · 挿入などがな されて構成されるポ リべプチ ドも本発明のセリ ンプロテ ァーゼに含まれる。
一般にプロテアーゼは、 その遺伝子からメ ッセンジャ
— R N Aを経由して合成された前駆体タ ンパク質がプロ セッ シングを受けることによって N末端の一部を失い、 さ らにまた、 ある場合には C末端の一部を失う ことによ つて成熟プロテア一ゼになることが知られている。
本発明のセリ ンプロテア一ゼには、 第 1図に示したァ ミ ノ酸配列から成るポ リペプチ ドの、 例えば C末端 1 9 個のァ ミ ノ酸配列がプロセッ シングを受けて除去された 形態のものも含まれる。
本発明のセリ ンプロテアーゼ遺伝子は、 上記の本発明 にい う セ リ ンプロテア一ゼをコ一 ドする遺伝子であって、 第 2図に示す D N A塩基配列を含むものがその代表例で める 0
また本発明のセリ ンプロテアーゼ前駆体は、 上記のセ リ ンプロテア一ゼの N —末端に、 開裂可能なぺプチ ドま たはシグナルペプチ ドが結合している ものであり、 第 6 図にその一例を示す。 第 6図のセリ ンプロテアーゼ前駆 体は、 2 6 7個のァ ミ ノ酸配列から成るポ リぺプチ ドで あり、 第 1図のセリ ンプロテア一ゼの上流にシグナルぺ プチ ドを含む 2 9個のァ ミ ノ酸が結合 たものである。
本発明のセ リ ンプロテア一ゼ前駆体遺伝子は、 セ リ ン プロテア—ゼ前駆体をコー ドする遺伝子であって、 第 7 図に示す D N A塩基配列を含むものがその代表例である。
本発明のセリ ンプロテアーゼおよびその前駆体は、 本 発明によってその全ァ ミ ノ酸配列が明らかになつたので、 公知の化学合成法によって製造することもできるが、 遺 伝子組換え法によつて容易にかつ大量に製造することが できる。
遺伝子組換え法によって本発明のセリ ンプロテアーゼ またはその前駆体を製造するには、 まずセリ ンプロテア ーゼまたはその前駆体の遺伝子を含む c D NAを取得す る必要がある。 c D NAは次の工程に従って好ま しく取 得される。
① セリ ンプロテア一ゼ産生細胞からポリ （A) + RN Aを抽出する。
② 抽出したポリ （A) + R N Aを铸型と して逆転写酵 素を用い、 c D N Aを調製し、 種々の c D N Aを含む c D N Aライブラ リ一を得る。
③ 目的の 。 D N Aとハイブリダィズする D N Aプロ一 ブを化学合成し、 これを用いて c D N Aライブラ リー から目的の c D N Aを拾い出す。
ここで①の工程におけるセリ ンプロテア一ゼ産生細胞 としては、 ヒ ト急性前骨髄球性白血病 （APL ： Acute Pr omyelocytic Leukemia) 細胞である M L 3 [E.Henderso n および F.Gunz編 " Leukemia" 、 P 119—139 、 Grune & Strakton. New York (1982) を参照〕 が継続的にセリ ンプロテア一ゼを産生するので好ま し く用いられる。
③の工程で用いる D N Aプローブは、 セリ ンプロテア ーゼの N末端側部分のァ ミ ノ酸配列をェ ドマン分解法に より決定し、 それに対応する遺伝子断片である D N Aォ リ ゴマーを化学合成し標識化することによって得られる。 セ リ ンプロテアーゼ遺伝子を含むベクターは適正な発 現べクタ一に組み込まれ、 組換え D N Aが得られる。 こ れを大腸菌、 枯草菌、 酵母あるいは培養動物細胞などの 宿主に導入し、 得られる形質転換体を培養するこ とによ つて目的のセ リ ンプロテア一ゼを産生させる ことができ る。 こ こで宿主と して動物細胞などの真核細胞を用いる と、 糖鎖を伴なつたセ リ ンプロテアーゼが得られる。
以上の遺伝子操作は、 公知の方法 （T.Maniatisら、 "Molecular Cloning A Laboratory Mannua I Col d Spring Harbor Lab. (1982) ) に従って実施するこ とが できる。
なお、 宿主と して大腸菌を用いる場合は、 T 7フ ァー ジ由来のペプチ ド、 またはアン トラニル酸合成酵素 （以 下、 T r p Eと略す） 、 ；3—ガラク ト シダーゼ等のタ ン パク質を本発明のセリ ンプロテア一ゼの上流に切断可能 に連結してなるキメ ラ蛋白をコー ドする遺伝子を含む発 現ベクターを用いることにより、 発現効率を上げる こと ができる。 製造されたキメ ラ蛋白を酵素等で消化するこ とにより、 容易にセリ ンプロテア一ゼを単離できる。
さ らに、 本発明は、 ヒ ト骨髄細胞由来のセ リ ンプロテ ァーゼの染色体遺伝子に含まれる転写制御領域をコ一 ド する D N A配列に関する。
本発明の転写制御領域とは、 プロモーター領域および ェンハンサ一を含むものであり、 それをコ一 ドする D N A配列は、 例えば 1 5図に示す配列またはこれと等価 な配列を含むものが挙げられるが、 これに限定されない。 ここに言う等価とは、 D N A塩基が部分的に他の D N A 塩基に置換されているもの、 部分的に削除されているも の、 他の D N A塩基が付加されているものなどであって、 しかも元の D N A配列と同等の機能を有する ものを言う。 第 1 5図の配列は、 第 1 6図に示される配列の 1〜 1 2 5 ◦番目の D N A配列に相当する。 第 1 6図は、 メ ダ ラシンの構造遺伝子およびその発現制御領域を含んだ染 色体遺伝子配列であって、 これはクローン化された約 6 キロ塩基の D N A断片のうち塩基配列が決定されたもの であり、 この中にはヒ トメダラシン遺伝子の完全長が含 まれており、 特徴的なプロモータ一構造である T A T A 配列、 C A A T配列も確認できる。 メダラシン c D N A の塩基配列との比較により、 メ ダラシン遺伝子は 4つの イ ン トロンにより分断された 5つのェキソ ンより成るこ とが明らかとなつた。
特徴的な構造と しては、 プロモータ一構造の上流に 5 3塩基対よりなる 4つのリ ピー ト配列、 また第 3イ ン ト 口ンには 4 2塩基対よりなる 1 0のダイ レク ト リ ピー ト 配列が観察される。 第 3イ ン ト ロ ンには複雑な 2次構造 をとり得る A T リ ツチな配列も存在している。
プロモーター領域の近傍には、 転写調節因子の S Ρ 1 タ ンパクが結合する コ ンセ ンサス配列 （G G C G G G、 C C C G C C ) に似た配列も存在する。
また、 メダラ シン遺伝子のタ ンパク合成開始領域の塩 基配列は、 コザッ クが効率的なタ ンパク合成開始に必要 と して提唱した塩基配列とよく 一致しているが、 このこ とはメ ダラ シンタ ンノ、。ク質がヒ ト末梢血 1 mlの中に約 1 0 U g と比較的多量に存在している理由の一つであると 推察される。
また本発明者らは、 実施例に示したように細胞中のポ リ （ A ) + R N Aの量をノ一ザンブロ ッテイ ング法によ ' り調べるこ とによって、 メ ダラシ ンのポ リ （A) + R N Aがヒ ト急性前骨髄球性白血病細胞である M L 3細胞 (前述） 内に多量に発現されているが、 他の細胞、 例え ばヒ ト胎児肺組織由来正常 2倍体繊維芽細胞や、 ヒ トす い臓悪性上皮性腫瘍由来細胞株 M I A P a C a - 2細胞 には殆んど発現されていないことを見い出した。
これらのことから本発明の転写制御領域は、 ヒ ト血球 系細胞、 特に赤芽球や顆粒球に特異的な遺伝子発現のた めの配列であると言える。
以下実施例を挙げて本発明をさ らに具体的に説明する。 実施例中、 成熟セリ ンプロテア一ゼとあるのは、 本発明 のセリ ンプロテア一ゼをセリ ンプロテアーゼ前駆体を混 同しないため用いた。 実 施 例 1
セリ ンプロテアーゼ c D N Aの調製と塩基配列の決定
( A) D N Aプローブの合成 ：
青木らの方法 CJ.Biol.Cheni. 253, 2026-2032 (1978) 〕 に従って得た精製メ ダラ シン （セリ ンプロテア一ゼ） 2 25^ gを気相式自動べプチ ドシーケンサー 47 O A型
(アプライ ド ♦ バイオシステムズ社製） で分析した。 得 られたフラク ショ ンを高速液体クロマ トグラフィ 一によ り分析し、 第 3図に示した N末端から 4 9ァ ミ ノ酸残基 の配列を決定した。 同図中で括弧が付されたア ミ ノ酸残 基は、 本分析法において若干の不確実性があるものであ o
上記 49ァ ミ ノ酸残基の中、 コ一 ドする D N A配列の 縮重度が少ない下記のァ ミ ノ酸配列部分
12T r p - P r o - P e -M e t -16V a 1
を選び、 このア ミ ノ酸配列部分をコー ドする D N A塩基 配列に相捕な D N A'塩基配列の 5 ' 末端の 1個の塩基
(これは Valをコー ドする第 3塩基である） を除く 14 塩基長の D N Aオリゴマー 8種 （プロ リ ンをコー ドする コ ドンは 4種、 フエ二ルァラニンをコー ドする コ ドンは 2種あることによる） を公知の方法によって化学合成し た。 これら 8種の D N Aオリ ゴマーの塩基配列は下記の とおりである。 得られた 8種の D N Aオリ ゴマーの等量 A C C A T A A A A G G C C A 5 3'
A C C A T A A A C G G C C A
5' 3'
A C C A T A A A G G G C C A 5' , %'
A C C A T A A A T G G C C A
5' 3'
A C C A T G A A A G G C C A
5' 3'
A C C A T G A A C G G C C A
A C C A T G A A G G G C C A
5' 3'
A C C A T G A A T G G C C A 混合物の 5 ' 水酸基を T 4キナーゼと ァ 〔32P〕 A T P を用いてリ ン酸化標識し、 D N Aプローブを得た。
( B ) ポ リ （ A ) + R N Aの調製 ：
株化細胞 M L 3を 1 0 %牛胎児血清を含む R P M I 1 64 0培地で培養した。 培養は 5 %炭酸ガス濃度のもと に 3 7 Cで行なった。 細胞が約 1 X 1 0 ° cellsZmlの 密度に増殖したとき、 シク ロへキシ ミ ドを 3 0 g / ml の濃度になるように加え、 さ らに 5時間培養した。 こ う して得た細胞 （約 1. 4 X 1 0 9 個） に 6 Mグァニジン チオ シァネー ト、 2 %ザルコ シル、 5 0 πιΜト リ ス塩酸塩 (ρΗ7. 6 ) 1 0 πιΜΕ D T A , 1 % /3—メ ルカプ トエタ ノールの溶液 30 mlを加え、 得られた粘稠溶液を 18 G 注射針の中に 5回通した。
この細胞ホモジネー トを 1 3容の 5. 7 M塩化セシ ゥム （ l O OmME D T Aを含む） 溶液の上に重層し、 3 50 0 0 rpffl で一晚 2 5。Cで遠心した。 遠心管の底に沈 澱した R N Aを少量の水に溶かし、 フエノール処理後ェ 夕ノール沈澱を行なう ことによって 640 ^ gの全 R N Aを得た。
この全 R N Aを常法に従って、 オ リ ゴ d Tセル口一 スカラムク ロマ ト グラフィ ーに力、けて 8 6 μ gのポ リ ( A) + R N Aを選別収集した。
( C ) c D N Aの調製 ：
前記 （B) 項で得たポリ （A) + R NA 5 gを用い て c D N A合成キッ ト （Amershain製） を利用し、 そのプ ロ ト コールに準じて Gublerと Hoffmanの方法 （Gene, 25 , 263 (1983)) でニ本鎮 c D N A 640 ngを合成した。 次に c D N Aクローニングシステム一 λ gt 1 0 (Amersh am製 ）を用いて両端に E c o R I リ ンカ一を結合し、 E c o R Iで消化し、 ゲル萨過力ラムによって両端に E c o R I接着末端をもつ二本鎖 c D N A 434 ngを得た。 この二本鎖 c D N A 86 ngと 久 1:1 0ァ一ム 1 〃 とを T 4 D N Aリガ一ゼを用いて結合し、 これを； Iファージ • ノ ッケ—ジング ♦ ェクス トラク 卜に加えて組み換え、 ファージの混合物を得た CAmersham社製 c D N Aクロー ニングシステムの材料を使い、 その処方に従った〕 。 大 腸菌 NM 5 1 4を宿主と して 9 , 6 x 1 0 pfu (ブラ ーク ♦ フ ォ一 ミ ング ♦ ュニッ ト） の組み換えフ ァ ー ジ ( c D N Aライブラ リ 一） が得られた。
(D) セ リ ンプロテア一ゼ c D N Aク ロー ンの単離 ： L B寒天培地の入った直径 14 5 mmのシャー レ当り大 腸菌 N M 5 14を宿主と して、 約 2 5 0 0 0個の前項で 得られた組み換えフ ァ ージをまき、 計 4枚のマスタ一プ レ一 トを作製した。 ニ ト ロセル口一スフイ ノレタ一にフ ァ ージを移したあと、 アルカ リ変成により フ ァージ D N A をフィ ルタ一上に固定した。 これらは Davisらの手法 (D.M. Glover編、 "DMA Cloning " ヽ vol Iヽ p49 〜78ヽ IRL Press 、 (1985)) に準じて行なった。
(A) 項で作成した D N Aプロ一ブを用いて、 上記に より フ ァ一ジ D N Aを固定したフ ィ ノレ夕一をハイブリ ダ ィゼ一シ ヨ ン法でスク リ ーニングした。 ハイブリ ダィゼ —シ ヨ ンは 3 5。Cで行ない、 洗いも： 3 5 °Cで行なつた。 これらの操作は T.Maniatis らの方法 （ "Molecular C1 oni ng 、 A Laboratory MannuaT (1982) ) に準じてィ了な つた。 ハイブリ ダィゼーシヨ ンの結果、 オー トラ ジオグ ラフィ 一で陽性の 7個のクローンを得た。
( E ) セリ ンプロテアーゼ c D N Aの塩基配列の決定 ： 前項で得られた陽性ク ロー ンの中の一つである M E D 1 — 4 aのフ ァ ージ D N Aを抽出したあと、 E c o R I で切断して約 80 0塩基対の D N Aフラグメ ン トを得た。 この断片を - 一ゲンシング用ク ロ一ニングベク ター、 p U C 1 9 (宝酒造製） およびシーゲンシング用ファージ、 M 1 3 m P 1 9 (宝酒造製) 、 R F D N Aの E c o R I 部位に挿入した。 配列解析はデォキシ— 7—デァザグァ ニン ト リホスフエ一 トを用いたジデォキシ法で行なつた。 中央部については配列の確定した周辺部に対応したブラ ィマ一を順次合成してジデォキシ法により決定した。 こ のようにして第 4図に示す D N A塩基配列が決定された。
第 4図に示す D N A塩基配列のうち、 7番目の Cを含 んでその上流と 80 7番目の Gを含んでその下流は、 λ gt 1 0ベクタ一へのクロ一ニングに際して用いた E c ο R I リ ンカ一 G G A A T T C Cに由来する。 従って、 同 図の 8番目から 80 6番目までの D N A塩基配列がポリ
( A) + RN A由来の c D NAである。 この c D NA配 . 列について、 最長のオープンリ一ディ ングフレーム （タ ンパク質をコ一 ドする領域） を捜したところ、 同図の 8 - 番目から 7 1 8番目までの D N A塩基配列を翻訳したも のが最長であり、 7 1 9番目以下に終止コ ドン T G A力 続いていることがわかった。 8番目から 7 1 8番目まで の D N A塩基配列に対応する翻訳ァ ミ ノ酸配列は、 第 5 図に示すとおりである。 同図に示すア ミ ノ酸配列の 1番 目から 48番目は、 第 3図に示された精製メダラシンの ァ ミ ノ酸配列の 2番目から 4 9番目までと完全に一致し ている。 この結果から第 4図に示された D N A塩基配列 の中、 8番目から 7 1 8番目までは本発明のセリ ンプロ テア一ゼをコー ドする c D N Aを構成するものであると 結論でき、 この c D N A部分は第 2図に示されている。 この c D N Aは、 第 3図に示す精製メダラ シンの N末端 のア ミ ノ酸であるイ ソロイ シン （lie)をコー ドする部分 を欠いているが、 lie がメ ダラ シンの N末端であること は上述の精製メ ダラ シンのァ ミ ノ酸配列の解析結果から 明らかであるから、 本発明のセ リ ンプロテア—ゼをコ一 ドする全 c D N Aは、 第 2図の塩基配列の 5 末端側に H e をコー ドする A T T、 A T Cまたは A T Aが付加し たものであると結論できる。 この全 c D N Aに対応する ア ミ ノ酸配列、 すなわち本発明のセ リ ンプロテア一ゼの ァ ミ ノ酸配列が第 1図に示されている。
実 施 例 2
セ リ ンプロテア一ゼ完全鎖長 c D N Aの調製と塩基配列 の決定
実施例 1で得たセリ ンプロテアーゼ部分 c D N Aをプ ローブと して、 実施例 1、 （ B ) 項と同様に調製した M L 3細胞のポ リ （A) + R N Aのうち 5 gを用いて実 施例 1、 ( C ) 項と同様な方法で新たに合成した約 1 0 0万個の； ί g t 1 0 c D N Aライブラ リ ーから実施例 1 で得られたク ロー ン M E D 1 — 4 aの 80 0塩基対より 長いセリ ンプロテアーゼ c D N Aを持つ 5つのクローン を単離した。 このうちク ローン M E D I Oおよび M E D 1 3のセ リ ンプロテアーゼの N末端をコ一 ドする領域の 塩基配列を実施例 1、 （E ) 項と同様な方法で決定した ところ、 M E D 1 — 4 aより M E D 1 3は 8 9塩基対、 t a
ME D 1 0は 1 28塩基対上流まで含んでいた。 したが つて、 セ リ ンプロテアーゼ前駆体 c D N Aの配列は第 7 図の通りである。 これらの D N A配列から推定するとセ リ ンプロテア一ゼ前駆体は 26 7ア ミ ノ酸から成り、 成 熟セリ ンプロテア一ゼの N末端にあるイ ソロイ シンの上 流にさ らに 29個めア ミ ノ酸が結合している （第 6図） 。 この 2 9ア ミ ノ酸から成る リ一ダーぺプチ ドのうち N末 端側の 2 7ア ミ ノ酸は 1 7個の疎水性ァ ミ ノ酸 （口イ シ ン 9ケ、 ァラニン 5ケ、 フエ二ルァラニン 1 ケ、 バリ ン 1 ケ及びプロ リ ン 1ケ） から成ると共に、 そ の C末端側にァラニン一ロイ シンーァラニンという最も シグナルぺプチダーゼで認識され易い配列を持つことか -らシグナルペプチ ドと考えられる。 また、 このシグナル ぺプチ ドの下流に存在するセリ ンーグルタ ミ ン酸という 2ア ミ ノ酸からなるペプチ ドは、 活性化べプチ ドと推定 される。
実 施 例 3
セ リ ンプロテアーゼ大腸菌癸現べク 夕一 p E TME Dの 作製と T 7—セリ ンプロテア一ゼキメ ラ蛋白の発現
( A ) 成熟セリ ンプロテア一ゼ c D N Aベクター p U C 1 9 Y M E Dの作製 ：
実施例 1で得た第 4図に示す D N Aの E c o R I断片 を、 先ずク口一ニングべク夕一 p U C 1 9の E c o R I 部位に揷入し、 第 4図の D N Aの下流部位が p U C 1 9 の B a m H Γ部位に近い揷入方向のクローン p U C 1 9 M E D 1 — 4 aを選び、 プラス ミ ド D N Aを得た。
このべクタ一 P U C 1 9 M E D 1 — 4 aを H i n d IE で完全消化後 N a e Iで部分消化し、 約 80 0塩基対か ら成るセ リ ンプロテアーゼ部分 c D N Aを分離した。 こ の D N A断片と成熟セリ ンプロテア一ゼの N末端をコー ドする合成オリ ゴマ一を T 4 D N Aリ ガーゼを用いて p U C 1 9の E c o R I サイ ト と H i n d mサイ トの間に 揷入することにより、 成熟セリ ンプロテア一ゼ c D N A を持つベク タ一 P U C 1 9 Y M E Dを作製した （第 8 図） 。
( B ) p E T M E Dの作製 ：
F. Vi 1 lai Studier博士 (Biology Departmen , Brookh aven National Laboratory. Upton - New York)よ ^)分与 された p E T— 3 bを T 7プロモー夕の下流にある B a m H I で完全消化して力〕らマングビーンヌ ク レア一ゼ （ Mung bean nuclease) 処理により平滑末端化した。 次に ( A ) 項の p U C 1 9 YM E Dを E c o R Vと H i n c Πで完全消化し、 成熟セリ ンプロテア一ゼ c D N Aから 成る約 0. 8 K bの D N A断片を分離した。 これら 2つ の D N A断片を T 4 D N A リガーゼを用いて結合するこ とによりセリ ンプロテアーゼ大腸菌発現ベクター p E T M E Dを作製した （第 9図） 。 このべクタ一からは T 7 フ ァージ由来の 1 1ア ミ ノ酸（Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly -Gly-Gln-Gln-Met-Gly) から成るペプチ ドと 2 38ア ミ ノ酸から成る成熟セリ ンプロテア一ゼがアルギニンをは ざんで結合した 25ひア ミ ノ酸のキメ ラ蛋白が作られる。 成熟セ リ ンプロテア一ゼは、 このキメ ラ蛋白を ト リ プシ ンで部分消化することにより単離できる。
( C ) p E TM E Dによる T 7—セリ ンプロテアーゼキ メ ラ蛋白の発現 ： ，
まず、 （B) 項で作製した £丁1^£ 0を大腸菌11？^ S 1 74 (J.L, Campbellら、 Proc. Natl . Acad..Sci . , U.S. A.75. 2276-2280 (1978)) に導入した。 この組換え 体をア ンピシリ ンを 1 0 0 g mlの、 またマル ト一ス を 0- 4 % (v / v) の濃度で含む 5 mlの L B培地 （T.Ma niatisら， "Molecular Cloning " p440. (1982)) で 3 7。C、 一晚培養後、 そのうち 0. 1 mlをアンピシリ ン及 びマルトースをそれぞれ 1 0 0 gノ. ml及び 0. 4 % (w /v) の濃度で含む N Z C YM培地 （T.Maniantis ら、
"Molecular Cloning " 、 p440 (1982) ) に移し、 波長 6 0 0 πιπでの吸光度が 0. 3となるまで 3 7 °Cにて培養 後、 大腸菌数の 5倍から 1 0倍のフ ァージ C E 6 (F.W. Studier ら、 J.Mol.Biol.. 189, 113-130 (1986)) を感 染させた後、 3時間 3 7 Cで培養した。 こ う して得られ た菌体の全蛋白質を S D Sポ リアク リルァ ミ ドゲル電気 泳動により解析したところ、 コ ン ト ロールの p E T— 3 b (前述） を導入 た組換え体には見られない分子量約 2 9 , 0 00の蛋白が観察された。 この蛋白が T 7セ リ ンプロテア一ゼキメ ラ蛋白であることは、 抗セリ ンプロ テア一ゼ抗体を用いたウェスタ ンブロ ッティ ングによ り ΐ宦 した。
実 施 例 4
T—r p E—セ リ ンプロテア一ゼ発現べクタ一 p A T H 2 M E Dの作製と T r p Eーセリ ンプロテア一ゼキメ ラ蛋 白の発現
( A) T r p E—セ リ ンプロテアーゼ発現ベクター p A
T H 2 M E Dの作製 ：
実施例 1の p U C 1 9 M E D l — 4 aを H i n d ΠΙで 完全消化後 N a e I で部分消化しセ リ ンプロテア一ゼ部 分遺伝子を含む約 80 0塩基対の D N A断片を分離した。 この断片と、 セ リ ンプロテア一ゼの N末端側をコ一 ドす る合成オリ ゴマーを T 4 D N A リガ一ゼを用いて、 T r p Eキメ ラ蛋白発現用ベク ター p A T H 2 (C.L.Dieckin an and A.Tzagoloff , J . Biol . Chein . 260. 1513〜 1520 ( 1985) ) の S a 1 Iサイ ト と H i n d lEサイ トの間に挿 入し、 T r p E -セリ ンプロテアーゼのキメ ラ蛋白を発 現させるベクター p A T H 2 M E Dを作製した （第 1 0 図） 。
このべクタ一からは、 T r p E由来の 3 3 1ア ミ ノ酸 から成るペプチ ドと 2 38ア ミ ノ酸から成る成熟セ リ ン プロテア一ゼがリ ジンをはさんで結合した 5 7 0ァ ミ ノ 酸から成るキメ ラ蛋白が作られる。 成熟セ リ ンプロテア ーゼはこのキメ ラ蛋白をエン ドプロテアーゼ 1 y s Cで 部分消化することによ り単離できる。
( B) p A T H 2 M E Dによる T r p E—セ リ ンプロテ ァーゼキメ ラ蛋白の発現 ：
p A T H 2 M E Dで形質転換した大腸菌 H B 1 ◦ 1を ァンピシリ ンを 1 0 0 ^ g Zmlの濃度で含む 5 mlの L B 培地 (T.Marliatis らヽ "Molecular Cloning " p440 ( 1982) ) にて 3 0。C 7時間培養後、 そのうちの 4mlを硫 酸マグネシウム、 塩酸チア ミ ン、 グルコース及びアンピ シ リ ンをそれぞれ l mM、 1 H g /ml^ l % (w/v) 及び 1 0 ◦ g Zmlの濃度で含む 4 0 mlの M 9培地 （T.Mani atisら、 "Molecular Cloning " ρ6δ (1982)) に移し、 2 5。Cで一晚培養した後、 4 0 % (v/v) グルコースを 0. 8ml、 14 % (v/v) 水酸化ア ンモニゥムを 0. 1 6 ml、 及び 1 ◦ nigZ mlイ ン ドールアク リル酸を 4 ◦ ^ 1加えて さらに 8時間培養した。
全菌体の蛋白質を S D Sポリァク リルア ミ ドゲル電気 泳動により確認したところコン ト口一ルの p A T H 2を 導入した H B 1 0 1には見られない分子量約 6 1 , 0 0 0の T r p E—セ リ ンプロテア一ゼのキメ ラ蛋白が確認 された。 この蛋白がセリ ンプロテア一ゼのキメ ラ蛋白で あることは、 抗セリ ンプロテア一ゼ抗体を用いたウェス タンブロッテイ ングにより確認した。
実施例 5
セ リ ンプロテア一ゼ酵母べ タ_— p A TME Dの作製と セ リ ンプロテア一ゼの発現
( A ) セリ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aベクタ一 p U C 1 9 PME Dの作製 ： 実施例 3の P U C 1 9 M E D 1 3を H i n d mで完全 消化後 E c 0 52 Iで部分消化する こ とによ り約 9 5 0 塩基対の D N A'断片を分離した。 この断片と、 セリ ンブ 口テアーゼ前駆体の N末端をコ一 ドする合成オ リ ゴマー を p U C 1 9の E c o R Iサイ ト と H i n d HIサイ トの 間に、 T 4 D N A リガーゼを用いて揷入することにより セリ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aを持つベクター p U C 1 9 P M E Dを作製した （第 1 1図） 。
( B ) p A T M E Dの作製 ：
まず、 広島大学の東江博士より供与された酵母の P H 0 5 (抑制性酸性ホスファ タ一ゼ） プロモータを持つベ クタ一 P A T 4 0 5を X h o Iで完全消化後、 T 4 D N Aポ リ メ ラーゼ処理により平滑末端化してから大腸菌ァ ルカ リ フ ォスファタ一ゼ処理により末端のリ ンを除いた。
次.に ( A) 項の p U C 1 9 P M E Dを E c o R Iで完 全消化後、 T 4' D N Aポ リ メ ラ一ゼ処理により平滑末端 化してからセ リ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aを含む約 9 5 0塩基対の D N A断片を分離した。 これら 2つの D N A断片を T 4 D N A リガ一ゼを用いて結合することに よ りセ リ ンプロテア一ゼ酵母発現ベクター p A TM E D を作製した （第 1 2図） 。
( C ) p A丁 M E Dによるセ リ ンプロテア一ゼの発現 ： p A T M E Dを導入した酵母 D C 5 (広島大学東江博 士より供与された） をヒスチジンとグルコースをそれぞ れ 0. 1 mg/ml及び 2 % (w/v) の濃度で,含む 5 mlの Yeas t Nitrogen Base 培地 （Difco 社製） にて一晚 3 0 で 培養後、 その 2. 5 mlを 5 0 mlの同一培地に移し、 さら に 3 0でで一晚培養した。 集菌後 50 mlの水で一度洗つ てから、 5 Omlの無リ ン酸培地 （Yeast Minimal Medium (R.L.Rodriguez and R.C. Trait "Recombinant DNA Tech niques" pl5i (1983) ) の K H 2 P 04 の代わりに K C 1 を甩ぃリ ン酸を除いた培地） に懸濁し、 3 0でで 2晚 培養した。 培養上清 1 mlを凍結乾燥により濃縮してから S D Sポリアク リルアミ ドゲル電気泳動により解析した ところ、 コ ン トロールの p A T 4 0 5を導入した D C 5 の培養上清には見られない分子量約 32, 0 0 0の蛋白 が検出された。 この蛋白がセリ ンプロテアーゼであるこ とは抗セリ ンプロテア一ゼ抗体を用いたウエスタ ンプロ ッティ ングにより確認した。
実 施 例 ら
セリ ンプロテア一ゼの酵母 _発現べクター T3 MF a M E D の作製と酵母での発現
( A ) セリ ンプロテア一ゼ酵母発現べクタ一 p M F M E Dの作製 ：
実施例 4 ( A ) 項の p U C 1 9 YME Dを E c o R I と H i n c Πで完全消化し、 成熟セリ ンプロテアーゼ c D N Αから成る約 80 0塩基対の D N A断片を分離した。 次に、 酵母の交配フヱ σモンである a—ファクターのプ 口モータと リーダ一配列を持つベクタ一 p M F α 8 (A. Miyajimaら、 Gene, 37. 155 (1985) ) を S t u Iで完全 消化後、 大腸菌アルカ リ フ ォ スフ ァターゼ処理により脱 リ ン酸化した。 これら 2つの D N A断片を T 4 D N A リ ガーゼを用いて結合することによりセリ ンプロテア一ゼ 酵母発現用べクタ一 P S R M E Dを作製した （第 1 3 図） 。
( B ) p S R " M E Dによる酵母 2 0 B 1 2の形質転換 ： ( A ) 項の p S R M E D 1 0 〃 gを約 l x l O 7 個 の酵母 2 0 B 1 2 (広島大学東江博士より供与された） に、 アルカ リ金属処理法 （A.Kimuraら、 J . Bacteriol . , 153, 163 (1983) ) によ り導入した。 得られた形質転換 体をグルコースを 2 % (w/v) の濃度で含む 5 mlの Yeast Nitrogen Base 培地 （ Di f co 社製） にて、 3 0 °C—晩培 養後、 その 1 miを 1 O miの同じ培地に移し、 さ らに 2 4 時間培養した。 培養上清 1 ∞1を凍結乾燥によ り濃縮して から、 抗セリ ンプロテア一ゼ抗体を用いたウェスタ ンブ ロ ッティ ングにより解析したところ、 コ ン ト ロールの p M F a 8を導入した 2 0 B 1 2の培養上清には見られな い分子量約 3 2 , 0 0 0の蛋白が検出された。
実 施 例 7
セ リ ンプロテァーゼの動物細胞発現ベクター p S R a M E Dの作製と動物細胞での発現
( A ) セ リ ンプロテア一ゼ動物細胞発現ベクター p S R Μ Ε Όの作製 ：
実施例 6 ( A ) 項の p U C 1 9 P M E Dを E c o R I で完全消化し、 セ リ ンプロテア一ゼ前駆体 c D N Aを含 む約 9 5 ◦塩基対の D N A断片を分離した。 これを、 p c D L S R a 2 9 6 (DNAX社、 武部博士より供与された） を E c o R Iで完全消化後、 大腸菌アル力 リ フ ォスフ ァ ターゼ処理により脱リ ン酸化したベクターに、 T 4 D N A リガ一ゼを用いて結合させることによりセリ ンプロテ ァーゼ動物細胞発現べクター p S R a M E Dを作製した (第 14図） 。
(B) p S R M E Dによる C o s — 1細胞の形質転換 ： ( A) 項の p S R ME D l O /z gを約 2 x 1 0 6 個 のサル腎臓由来の C o s — 1細胞 （Y.Gluzman, Cell , 3, 175 (1981) ) にリ ン酸カルシウム法 （F.し. Grahamら、 Virology, 54, 536 (1873)) により導入した。 5日後に 細胞を集め全細胞の蛋白質を抗セリ ンプロテア一ゼ抗体 を用いたゥエスタ ンプロッティ ングにより解析したとこ ろ、 べクタ一を導入していない C o s — 1細胞には見ら れない分子量約 : 3 0 , 0 0 0の蛋白が検出された。 また、 細胞を凍結融解により破壊後 1 2 0 0 0 g、 3 0分間の 遠心により得られた可溶性画分について、 エラスタ一ゼ の基質である -nitrophenyl N-tert-buty loxycarbon l- L-alaninate を基質とした方法で（し sser ら、 Bioche e.Biophys.Acta. , 268, 257 (1972)) 、 本酵素の活性を 測定したところ ン トロールに比べ約 1 x 1 0 s 細胞あ たり 347. 511111の吸光を 0. 1上昇させる活性が検出 された。
実 施 河 8 染色体 D N Aのサザンハイブリ ダィゼ一シヨ ン
ヒ トセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子のク ロ一ニングに先立 ち、 まず、 染色体 D N Aのサザンハイブリ ダィゼ一シ ョ ンを行なった。 ヒ ト扁挑由来の染色体 D N A (調製法は、 P.Chanibon ら Eur . J . Biochein , 36. 32-38 (1973 年） に 記載の方法に従った。 ） の各 1 0 gを制限酵素 E c 0 R I、 B a mH I、 P s t Iで切断、 ァガロースゲル電 気泳動 （ 1 %ァガロース） し、 サザンブロ ッティ ング後、 セリ ンプロテアーゼ c D N Aをプローブと してサザンハ イブリ ダィゼ一シ ヨ ンを行なった。 その結果、 E c o R I切断では約 6 kbの断片のみがセ リ ンプロテア一ゼ c D N Aプローブとハイプリ ッ ドを形成し、 ヒ トセリ ンプロ テアーゼ遺伝子は染色体に 1種類のみ存在し、 E c o R I の 6 kbの断片にのみ含まれることが明らかとなった。 こ こで用いたセ リ ンプロテア一ゼ c D N Aプローブは、 Okano K.ら J. Biochem, 102, 13〜16 (1987) に記載さ れた c D N A配列 （ E c o R I挿入断片、 約 80 0 bp) をニッ ク ト ラ ンス レー シ ョ ン法によって" Pで標識した ものである。
実 施 例 9
ヒ トセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子 _のク ローニング
ヒ ト染色体 D N A約 1 0 0 ^ gを E c o R Iで切断し、 ァガ口—スゲル電気泳動後、 約 6 kb近傍の D N Aを回収 した。 ス フ ァージ由来のベク タ ー ； l g t WE S * ;i y3の E c o R I アーム D N A ( B R L社のより購入） をべク ターと して、 回収した D N Aと結合 （リガーゼ反応） さ せ、 in vitroノヽ0ッケージンク in vitroノヽ0ッケ—シ ンク キッ トは宝酒造㈱より購入） により遺伝子ライブラ リ一 を作製した。 0. 5 gの回収 D N Aと 0. l gべク ター D NAから 5 x l 04 pfu の遺伝子ライブラ リ一力 作製できた。 この遺伝子ライブラリ一とセリ ンプロテア —ゼ c D NAをニッ ク ト ラ ンス レー シ ョ ン （ニッ ク トラ ンス レ一シヨ ンキッ トは宝酒造線より購入） した D NA をプローブと して、 通常のプラークハイブリダィゼ一シ ョ ン法 〔T.Maniatisら、 "Molecul ar Cloning ： A Labo ratory Manual " (以下書籍 Aと略す） P.312〜328, C ' old Spring Harbor Laboratory (1982年） 〕 でスク リー -ニングを行なった。 その結果、 3個のポジティ ブクロー ンが得られた。 そのうちの一つが； M E D - 2である。 実施例 1 0
λ M E D - 2の塩基配列の決定
A ME D— 2の E c o R I揷入断片をシーク ェンス用 ベクタ一 p U C 18 D NA、 または p U C 1 9 D NA
(宝酒造㈱より購入） にサブクローニングし、 キロデリ — シ ヨ ンキッ ト （宝酒造㈱より購入） を用い適当な欠失 変異株を得、 それぞれについて 7— D E A Z Aシークェ ンスキッ ト （宝酒造㈱） を用いたジデォキシシークェン ス法により塩基配列の決定を行なった。 その結果を第 1 6図に示す。 すなわち、 クローン λ M E D— 2の揷入断 片のうち、 塩基配列を決定した 52 9 2塩基を第 1 6図 に示した。 C A A Tボッ クス、 T A T Aボッ クス、 poly A付加シグナルを小さな四角で囲み、 セリ ンプロテア一 ゼポ リ （A) + R N Aのうち、 タンパク質をコー ドする 領域を四角で囲った。 プロモータ一上流部分と第 3イ ン ト 口ン内に存在する反復配列を矢印のついた下線で示し た。 ただしポリ （A) + R N Aの 5 / 末端位置は数塩基 程度の誤差のある可能性がある。
実施例 1 1
M L 3細胞、 ヒ ト胎児肺由来正常 2倍体繊維芽細胞お よび M I A P a C a - 2細胞の各々を、 1 0 %牛胎児血 清を含んだ R P M I 1 64 0培地 （M L 3 ) 、 1 0 %牛 胎児血清を含んだイーグル M E M培地 （ヒ ト胎児.肺由来 正常 2倍体繊維芽細胞） 、 または 1 0 %牛胎児血清と 2. 5 %の馬血清を含んだダルべッ コ M E M培地 （M I A P a C a — 2細胞） で、 それぞれ 5 %炭酸ガスのも とで 3 2 °Cで培養した。 2ないし 5 X 1 0 8 個の細胞に 6 Mグ ァニジ ンチオ シァネー ト、 2 %ザルコ シル、 5 0 m M ト リ ス塩酸塩 （PH7. 6 ) 、 1 0 mM E D T A、 1 % β 一メルカプ トエタノールを含んだ溶液 1 6 mlを加え、 得 られた粘稠溶液を 1 9 G注射針の中に 5回通した。 この 細胞ホモジネー トを 1 8 mlの 5. 7 M塩化セシウム （ 1 0 0 mM E D T Aを含む） 溶液の上に重層し、 3 5 0 0 0 rpni で一晚 2 5 で遠心した。 遠心管の底に沈澱し た R N Aをノくッ フ ァー液に溶かしフ ノール処理後、 ェ タノ一ル沈澱を行なう ことによって全 R N Aを得た。 こ れらの操作は、 書籍 Aの 1 9 6頁に記載された方法に準 じて行なつた。 得られた全 R N Aは 20 0〜 6 0 0 ^ g" であった。 これらの全 RN Aを同書 1 9 2〜 1 98頁の 方法によってオリ ゴ d Tカラムにかけポリ （ A ) ÷ R N Aを得た。 これらのポリ （A) + R N Aを各々 l O i g をホルムアルデヒ ド♦ ァガロースゲル電気泳動にかけ、 ニ トロセルロースのフィ ルタ一に移した。 これらの操作 は同書 2 0 2〜 2 0 3頁の方法によつた。
こう して得られた二 トロセル口一スフィ ルターをノザ ンハイブリ ダィゼ一シヨ ンで分析した。 方法は同書 38 7〜 389頁のサザンハイブリダィゼ一ショ ンに準じて 行なった。 プローブと して、 Okano K,ら J. Biochem. 1 02, 13〜； L6 (1987) に記載されたセリ ンプロテア一ゼ
(メダラ シン） の c D N Aをニック ト ラ ンス レーシ ョ ン の方法 （書籍 Aの 1 ◦ 9〜 1 1 2頁） で、 〔a 32P〕 d C T Pでラベルした比活性約 1 X 1 0 8 cpinZ gのも のを用いた。 プローブの濃度は、 2 x 1 0 s cpm/mlで ハイブリ ダィゼーシヨ ンを 5 0 %ホルムア ミ ド 4 2。Cの 条件で行なった。 増感スク リ 一ンの存在下、 一 7 0てで コダッ ク社 X A R— 5フ ィ ルムを一晚感光させたところ、 ML 3細胞の: R N Aを電気泳動したレー ンには約 1 0 0 0塩基の長さのところに明瞭なバン ドが観察された。 し かしながら、 他の細胞から得た： N Aを泳動したレーン には、 認め得るバン： ドは見られなかった。
産業上の利用可能性 本発明のセ リ ンプロテアーゼは、 炎症の発現に関与す るため炎症阻害剤の開発に重要であり、 さ らに リ ンパ球、 単球、 N K細胞、 及び顆粒球の機能を変化させる作用が ある。 従って医療分野において非常に有用である。
また、 本発明のセリ ンプロテアーゼは有用な医薬品と なり得る。 例えば、 本発明のセリ ンプロテアーゼは血栓 溶解作用があるため、 汎発性血管内凝固症候群 （DIC ： disseminated intravascular coagulation) の血栓溶解 剤と して使用可能である。 従来 D I Cの治療に、 植物由 来のプロテアーゼであるパパイ ンを使用する ことがある 力 作用が強すぎることと、 免疫によるアレルギー症状 の誘起等のため危険な副作用が心配されている。 この点、 本発明のセリ ンプロテア一ゼはヒ ト由来の酵素であるた め安全に使用できるという長所がある。 さ らに他の医薬 の応用例と して、 外傷治療段階において、 古い皮膚組 織あるいは肉芽状に盛り上がつた組織の除去修正を目的 と した外用薬と して使用可能である。 この場合も、 本発 明のセリ ンプロテア一ゼはヒ ト由来であるため安全であ 0
さ らに、 本発明の細胞特異的な遺伝子発現に必要な転 写制御領域の D Ν Α配列は、 白血球も しく は赤血球細胞、 なかんずく 、 これらに由来する培養細胞において外来遺 伝子の発現を特異的に行なわせるために有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 第 1図に示すア ミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテアーゼ。
. 第 1図に示すア ミ ノ酸配列を有するポリベプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテア一ゼをコ一 ドす るセ リ ンプロテア一ゼ遺伝子。
3 . 第 2図に示す D N A塩基配列を含む請求の範囲第 2 項記載のセリ ンプロテアーゼ遺伝子。
. 第 1図に示すァ ミ ノ酸配列を有するポ リぺプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテア—ゼの N—末端 に、 開裂可能なぺプチ ド又はシグナルべプチ ドが結合 してなるセリ ンプロテア一ゼ前駆体。
5 . 第 6図に示すア ミ ノ酸配列を有する請求の範囲第 4 項記載のセリ ンプロテアーゼ前駆体。
6 . 第 1図に示すア ミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドが 呈する生物活性を持つセリ ンプロテア一ゼの N—末端 に、 開裂可能なペプチ ド又はシグナルペプチ ドが結合 してなるセリ ンプロテア一ゼ前駆体をコー ドするセリ ンプロテアーゼ前駆体遺伝子。
7 . 第 7図に示す D N A塩基配列を含む請求の範囲第 6 項記載のセリ ンプロテアーゼ前駆体遺伝子。
8 . ヒ ト骨髄由来のセ リ ンプロテアーゼの染色体遺伝子 に含まれる転写制御領域をコ一 ドする D N A配列。
9 . 第 1 5図に示す配列またはこれと等価な配列を含む 請求の範囲第 8項記載の転写制御領域をコー ドする D 1
31
N A配列。
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