WO1988006437A1 - Process for preparing liposome - Google Patents

Description

明 細 書 リ ポ ソ ー ム の 製 造 法 技 術 分 野

本発明はリポソームの新規な製造法に関するものである さらに詳しく は、 本発明は水溶液を内部に取り込んでなる リボソームの製造法に関する。

さらに本発明は高濃度のヘモグロビン水溶液を内部に含 有する新規なヘモグロ ビン含有リボソーム （以下へモソ一 ムという） に関する。

リポソ一ム （l i posome) は脂質 2分子膜からなり、 内部 に水層を含んだ閉鎖小胞体である。 生体膜は脂質の 2分子 構造をとつているといわれており、 従ってリボソームは生 体膜のモデル膜と してその物理化学的性質の研究に広く 用いられている。 また、 リボソームは内部の水層や膜内に 種々の物質を取り込むことができ、 細胞と融合したり、 細 胞に取り込まれたりするので生体内へ物質を送り込むキヤ リヤーとして利用される。 リポソームを利用した研究は生 物学、 医学、 薬学など広範な分野にわたっており、 酸素や 制ガン剤を運ぶキヤ リヤーと しての利用、 免疫学分野での 利用、 細胞との相互作用、 ドラ ッグデリバリー システム と しての利用等が研究されている。

さらにへモソームは酸素運搬能および安全性が高く 、 酸 化に対して安定な人工赤血球と して利用が期待される。 背 景 技 術

リボソームは上述したように極めて広範な利用分野を有 するが、 従来のリボソームの製法では、 高粘度の水溶液を 内部に取り込んだリボソームを得ることは不可能であつた。 従来のリボソームの製法としてはいわゆる薄膜法、 界面活 性剤除去法および逆相法等が知られている。 薄膜法は容器 の内面にリポソーム形成脂質の薄膜をつく り、 そ こへ取り 込ませたい物質を溶解させた水溶液を加え、 振盪処理する かまたは超音波処理してリボソームをつく る方法である。 界面活性剤除去法は取り込ませたい物質を溶解させた水溶 液にリポソ一ム形成脂質と界面活性剤を溶解させて混合ミ セルをつく り、 次いで透析により界面活性剤を除去しリポ ソームをつく る方法である。 逆相法は、 リボソーム形成脂 質を溶かした有機溶媒溶液に取り込ませたい物質を溶解さ せた水溶液を加えて W Z O型ェマルジヨンを作成し、 次い で有機溶媒をエバポレーショ ンで除去してリボソームをつ く る方法である。 これらの従来法によれば、 内部に取り込 ませる水溶液が低粘度である場合にはリポソームが生成す るが lOeP ( 20 °C ) 以上の高粘度になると極端に収率が悪く なるとともに所望のリボソームが得られないことがあり、 リボソーム利用上大きな制約となっていた。 例えば、 人工 赤血球としてへモグロビン水溶液を含有する リポソーム力 知られているが粘度の制約のため、 へモグロビン濃度を天 然のそれである 35% ( v/v)にまで高めることができず、 せ ぃぜぃ 15 %程度であり、 酸素運搬能の低いものしか得られ ていない。

他方、 へモグロビンを含有する リ ボソームと して従来い わゆる薄膜法により製造されたものがミ ラー （Mi l l er) ら により報告されている （米国特許第 4 , 133 , 874 号） 。 この 方法によればヘモグロ ビン含有リ ボソームは、 リ ポソ一ム - 形成脂質をクロロホルム等の適当な有機.溶媒に溶解し、 得 られた溶液から溶媒を留去して脂質の薄膜をつく り、 この 薄膜に溶血ヘモグロビン水溶液を加え、 激しく撹拌して多 重層リボソームを形成し、 次にこれを超音波処理すること によって得られる。 この方法によれば、 ヘモグロビンが酸 素に触れる時間が少ないのでヘモグロ ビンの変性が比較的 少ない利点がある。 しかしながら保存中にリポソーム中の へモグロ ビンのヘム鉄が徐々に酸化されてメ トへモグロ ビンに変質して酸素の運搬機能を失うおそれがある。 血球 内においてはヘモグロ ビンはメ ト型に酸化されても酵素の 作用により もとへ還元される機構をそなえているが、 溶血 して血球外へとり出されるとこのような機構がないため、 一旦メ ト型に変質すると酸素運搬能を失ってしまう。

さらに、 へモグロビンは分子量 65，000程度の高分子化合 物であり、 その水溶液は粘度が高い。 ところが従来の方法 ではこのような高分子量、 高粘度の水溶液を含有する リポ ソームを調製することはできず、 ヘモグロ ビン濃度がせい ぜぃ 15 %程度のリポソームしか得られない。 天然赤血球中 のヘモグロビン濃度が 35 %前後であることを考慮すると上 記濃度では酸素運搬能が低すぎる。 そのため血液と同等の 酸素運搬能をもたせるためには該へモソーム自体の濃度を 高めざるをえなくなり、 そうすると膜材の構成成分である 脂質濃度が高くなつて、 安全性の面から問題を生じ、 さら にはその懸濁液の粘性が高く なり血流循環動態にとつて不 利となる。 従ってリボソーム内部に高濃度のヘモグロ ビン を含有するへモソームが望まれる。

上記の目的は下記の本発明によって達成される。

1 ) リポソ一ム腠形成脂質を有機溶媒に溶解し、 該溶液 から溶媒を留去し、 残留物に水溶液を加え、 振盪処理ま たは超音波処理することにより均一な懸蜀液とし、 該懸 濁液をガスで加圧し、 該ガスを該懸濁液に十分浸透させ た後、 該懸濁液を細隙から高圧吐出処理することを特徵 とするリボソームの製造法。

2 ) 水溶液の粘度が 10〜 3 , 000cP ( 20^eC ) である第 1項 記載のリボソームの製造法。

3 ) 該ガスは不活性ガスである第 1項記載のリボソーム の製造法。

4 ) 不活性ガスによる加圧が 80〜130 kg / c である第 1 項記載のリポソームの製造法。

5 ) ガス加圧式高圧吐出型乳化機を使用して懸濁液を高 圧吐出処理する第 3項記載のリポソームの製造法。

6 ) リボソーム内にヘモグロ ビン水溶液を取り込んでな るヘモグロビン含有リボソームであって、 リ ボソーム膜 が水素添加率 50%以上の水素添加リ ン脂質を主成分とし、 ヘモグロ ビン水溶液が 30〜60 % ( v/v)のヘモグロ ビン濃 度を有すること'を特徵とするヘモグロ ビン含有リポソ一 ム₀

7 ) 水素添加リ ン脂質が水素添加天然リ ン脂質である第 6項に記載のヘモグロ ビン含有リポソ一厶。

8 ) 水素添加天然リ ン脂質が水素'^加レシチンである第

7項記載のへモグロビン含有リポソーム。

9 ) 水素添加率 80%以上の水素添加レシチンである第 8 項記載のへモグロビン含有リ ボソーム。

10) 水素添加率 80 %以上の水素添加ホスファチジルコ リ ンである第 9項記載のヘモグロ ビン含有リボソーム。

11 ) ヘモグロビン濃度が 50 % ( w/v)である第 6項記載の へモグロ ビン含有リ ポソ一ム。

12) リボソーム膜が負電荷を与える物質を含む第ら項乃 至第 10項のいずれかの項に記載のへモグロビン含有リポ ソーム。

13) 負電荷を与える物質がホスファチジン酸、 ジセチル ホスフユ一 トまたは高級脂肪酸である第 11項記載のへモ グロビン含有リ ボソーム。

本発明における リポソーム膜形成脂質には特に制限はな く、 リボソームを形成するものであれば天然または合成の 脂質が使用可能である。 特にリ ン脂質が好適に使用され、 その例と して、 レシチン、 ホスファチジルエタノールァ ミ ン、 ホスフ ァチジン酸、 ホスファチジルセ リ ン、 ホス ファチジルイ ノ シ トール、 ホスファチジルグリセロール、 スフイ ンゴミ エリ ン、 カルジォリ ピンおよびこれらを常法 に従って水素添加したものがあげられ、 これらを組合せて 用いる こ と もできる。 さ らにリ ボソーム膜の構成成分に 一 は所望により ステロール等の膜構造強化剤や電荷付与物 質 （例えばステアリ ン酸、 ォレイ ン酸、 リ ノール酸、 リ ノ レン酸、 ホスファチジン酸、 ホスファチジルグリセロール 等） の崩壊時間調節剤を添加することができる。 リボソ一 ムの内部に取り込まれる高粘度水溶液には特に制限はなく、 任意の種類の化学物質の水溶液が使用されうる。 化学物質 の例と しては、 前述したヘモグロ ビンの他、 9 - ダルク 口 ニダーゼ、 へパリナーゼ、 な - グルコ シダーゼ等の高分子 化合物があげられる。

水溶液の粘度ま、 リボソームの用途に応じて溶質の種類 および粘度が決定され、 それに従って決定される。 本発明 においては 10cP〜 3 , 000cP (20 °C ) の範囲の粘度を有する水 溶液が通常使用される。 l OcP ( 20て） 以下の粘度の水溶液 も本発明の方法において使用可能であるが、 これらは従来 の製法においても使用することができる。 人工赤血球を作 製する場合には、 ヘモグロ ビン濃度 30〜60% ( w/v)の水溶 液を使用するのが好ましく 、 この場合の粘度は 10〜3 , 000 cP ( 20で） である。

本発明のリボソームは、 リボソーム膜形成脂質を有機溶 媒に溶解し、 該溶液から溶媒を留去し、 残留物に水溶液を 加え、 振盪処理するかまたは超音波処理することにより均 一な懸濁液と し、 該懸濁液をガスで加圧し、 ガスを該懸蜀 液に十分浸透させた後、 該懸濁液を钿隙から高圧吐出処理 することによつて製造される。

上記方法において、 均一な懸濁液を調製するまでの工程 は前述した薄膜法として知られる リポソームの製造方法と 同じであり、 それ自体公知の方法に従って実施される。 有 機溶媒はリボソームの用途によって適宜選択されるが、 通 常クロ口ホルム、 エタノール等が用いられる。

また、 加圧に用いられるガスは水溶液が変質しやすい物 質を含む場合やリ ン脂質の水添率が低い場合には窒素 · ァ ルゴン等の不活性ガスであることが好ま しい。

かく して得られた懸濁液は钿隙ノズル付きの加圧容器内 で不活性ガス （例えば窒素もしく はアルゴンガス） で加圧 される。 加圧は 80〜； 130 k Z ciiが適当である。 不活性ガス が懸濁液に十分浸透したのち、 懸濁液をノズルから吐出処 理する。

懸濁液を高圧吐出処理する工程は、 高圧吐出型乳化機、 好ま しく はガス加圧式高圧吐出型乳化機を用いて懸濁液を 上記の圧力を保持しつつ細隙から 1〜数回吐出させること によって実施される。 この時、 不活性ガスの浸透した懸濁 液は、 ガスの急激な圧力膨張によって激しく乳化され、 リ ポソームを形成する。 高圧で吐出されるほどリボソームの 粒径は小さく なる。 かく して得られるリボソーム液から常 法に従って未保持の物質を洗浄し、 超遠心処理等によって 採取される。

なお、 本発明に使用するガス加圧式高圧吐出乳化機は、 一般に使用されるガスボンベあるいは高圧ガス供給機と該 ガスボンベあるいは高圧ガス供耠機と連通可能に設けられ た細隙ノズル付き加圧容器からなる。 原理的には単純であ - るので、 処理量に応じた耐圧容器を作成するだけで微量処 理から工業的生産まで応用可能である。 また機械部分がな いので、 故障が少ないという利点がある。

他方、 本発明のへモソームは膜材が水素添加率 50 %以上 の水素添加リ ン脂質を主成分とする。

大豆、 卵黄等から得られる天然のリ ン脂質は分子中の脂 肪酸基に不飽和脂肪酸組成をもつものを多く含んでいる。 本発明においては上記天然リ ン脂質の不飽和脂肪酸基の 50

%以上を水素で飽和した水素添加リ ン脂質が好適使用され る。

合成ジステアロイルレシチンは分子中に不飽和脂肪酸を 含んでいないので酸化に対して安定であるが、 へモグロ ビンの捕捉率が水素添加天然レシチンにく らベて劣ってい る。 これは水素添加天然リ ン脂質が異なった種類の脂肪酸 を分子中に—含んだリ ン脂質の混合物であるのに対して、 合 成ジステアロイルレシチンは分子中に脂肪酸としてステア リ ン酸のみを含む単一化合物であることによると思われる。 本発明において用いる水素添加リ ン脂質の水素添加率は

50 %以上、 好ま しく は 80 %以上であり、 ヨウ素価で表わし て 30以下、 好ましぐは 10以下である。 水素添加率が 50 %よ り少ないとヘモグロ ビンの酸化の防止が不十分である。 水素添加リ ン脂質の例と しては、 レシチン、 ホスフ ァチ ジノレエタ ノ ールァ ミ ン、 ホスフ ァチジルイ ノ シ トール、 ホスファチジルセ リ ン、 ホスフ ァチジルグリセロール、 ス フィ ンゴミ エリ ン、 カルジオリ ピン等を常法に従って水素 添加したものがあげられる。 特に大豆レシチン、 卵黄レシ チン、 コーンレシチン、 綿実油レシチン、 ナタネレシチン 等を水素添加した水素添加天然レシチンが好適に使用され る 0 - 水素添加率は次の如く して測定される。 すなわち、 水素 添加リ ン脂質の脂肪酸部分を J hum らの方法 〔J . Am. Oil Chem. Soc. 53, 132 (1982 ) 〕 により メ チルエステルと した後 G L C分析し、 構成脂肪酸からヨウ素価を算出する。 同様にして未水素添加リ ン脂質のヨウ素価を求め、 上記水 素添加リ ン脂質のヨウ素価との比率から水素添加率を算出 した。

本発明のへモソ一ムの膜材には膜の強度を高めるために、 コ レステロール、 コ レスタ ン等のステロールを添加するこ とができ、 またリボソームの凝集を防止するために、 負の 電荷を与える物質、 例えばホスファチジン酸、 高級脂肪酸、 ジセチルホスフエ一トを添加することができる。 さ らに、 膜材に トコフユロール （ビタ ミ ン E ) 等の酸化剤を加える と リポソーム膜の酸化が抑制される。

例えば、 ト コフヱロールではリ ン脂質 1 mo 1 に対して 0.01〜0.1mol、 好ま しく は 0.04mol 添加するのが良い。

リ ポソーム内部に取り込まれるへモグロ ビンは赤血球を 常法に従って溶血し分画分子量 5万以下の膜を使用 した 限外^過により 30% (w/v)以上に濃縮したものが使用され る。 ヘモグロ ビンは水溶液の形態でリボソームに取り込ま れ、 その濃度は 30〜60 % ( w/v)であり、 その粘度はおよそ 10cP〜 3 , 000cP ( 20で） である。

本発明のへモソームは、 上記水素添加天然リ ン脂質を主 成分とするリボソーム膜材を有機溶媒に溶解し、 該溶液か ら溶媒を留去し、 残留物に S0〜60w/v ( % ) 濃度のへモグ ロ ビン水溶液を加え、 振盪処理するかまたは超音波処理す ることにより均一な懸濁液とし、 該懸濁液を不活性ガスで 加圧し、 不活性ガスを該懸濁液に十分浸透させた後該懸濁 液を钿隙から高圧吐出処理することによつて製造される。 上記製法において、 均一な懸蜀液を調製するまでの工程 は、 水素添加天然リ ン脂質を主成分とする膜材^使用する 以外は、 前述した薄膜法として知られる リボソームの製造 方法と同じであり、 それ自体公知の方法に従って実施され る。 有機溶媒としては通常クロ口ホルム、 エタノール等が 用いられる。

かく して得られた懸蜀液を前記の高圧吐出法によつて処 理し、 へモソーム液を得て、 これを常法に従って洗浄し、 超遠心処理して所望のへモソームを得る。

次に実施例および試験例を示して本発明をさらに具体的 に説明する。

実 施 例

1 ) 赤血球膜除去へモグロビン （ S F H ) 溶液の調製 抗凝固剤入りの採血バックを用いて、 牛の静脈より牛全 血 15 を採取する。 採取全血は無菌的に密閉容器内、 4 にて運搬保管する。 以下工程はすべて無菌的に、 4 C低温 下にて行なう。

連続遠心機により生理食塩水を用いて遠心洗浄を行ない 血小板、 白血球、 血漿を取り除いた粗洗浄赤血球 5ί? を得 る 0

孔径 0.45 の血漿分離器により、 生理食塩水を用いてさ らに洗浄を行なう。 洗浄赤血球 5J? に対してパイロジェン フ リ ーの蒸留水 105 を加え溶血させる。 孔径 0.45 の血漿 分離器および孔径 G.1 の血漿成分分離器を用いて、 赤血 球膜の除去および戶過無菌化を行なう。 ヘモグロ ビン濃度

8 % (w/v) の赤血球膜除去ヘモグロ ビン約 12j? が得られる。 透析用ダイァライザ一 T A F 10W (テルモ社製のセル ロース系中空系ダイァライザ一） を用いて限外^過により 濃縮しへモグロビン濃度 50% (w/v) の赤血球膜除去へモグ ロ ビン約 1.8]? が得られる。

2) リポソーム形成脂質の調製

水素添加率 80%の精製ホスファチジルコ リ ン 27.76 g、 コ レステロール 6.96 g、 水素添加率 80%の精製ホスファチ ジン酸 3.75 gをクロ口ホルムに溶解する。 該脂質溶液をナ スフラスコに入れ、 エバポレ一シ ョ ンを行ないクロ口ホル ムを除去し、 ナスフラスコの底に脂質膜を形成させる。 さ らに真空乾燥を 16時間行ないク口口ホルムを完全に除去す る o

3) S F H ·脂質の懸濁液作成

前記 S F H調製工程で得られた 50% S F Hのうち、 300 mlを該脂質膜に添加して、 振盪または超音波により均一な 懸濁液とし、 これを原料溶液とする。

) 活性ガスを用いた加圧吐出によるへモグロビン含有 リボゾームの作成

該原料溶液を钿隙ノ ズル付きの加圧容器、 パール細胞 破砕器 （米国 P A R R社製） に入れ、 チッ素ガスを導入し 180 kg Z eiに加圧する。 30分間放置し、 チッ素ガスを十分 に原料溶液に浸透させる。 次にノズルのバルブを徐々に開 放し、 I S Okg Z ciiの圧力を維持しながら原料溶液を吐出さ せる。

5) へモグロ ビン含有リ ポソ一ムの精製

加圧吐出後の液を生理食塩水で 10倍に希釈 し遠心 (Π . ΟΟθΓΡΐη, 30ro i n)により、 ヘモグロビン含有リボソーム の沈殿として分離する。 上澄のカプセル化に関与しなかつ たヘモグロビン溶液をデカンテーシヨ ンで除き、 その後生 理食塩水でへモグロビン含有リポソーム沈殿を懸濁させ、 再度遠心を行なう。 以下同様の操作を上澄にヘモグロ ビン が検出されなく なるまで鎳り返す。

6) 粗大粒子の除去

精製後のヘモグロ ビン含有リ ボソームの懸濁液を孔径

0.4 の多孔質ポリカーボネー ト製フィ ルター （ニューク リボアメ ンブレン ： 商品名、 ニュークリポア社） にて^過 して粗大粒子を取り除く。

このときのヘモグロ ビンの収率は 最終へモグロビン濃度 X人工赤血球液体積（ml)

100(¾) S F H濃度 X S F H添加量 （ml)

0.1X 180

X 100 = 12%であつ 7"こ

0.5X 300

7) へモグロ ビン濃度調整

最終的に生理食塩水に懸蜀し、 ヘモグロ ビン濃度 10%に 調整したものが 180ml得られた。 試験例 1

へモグロ ビンの酸化

実施例で作成された水素添加リ ン脂質へモソーム （No. 1 ) 、 未水素添加リ ン脂質へモソー厶 （ビタ ミ ン E添加有） (No.2) および未水素添加リ ン脂質へモソー厶 （ビタ ミ ン E添加無） （ o.3 ) をそれぞれ生理食塩水に懸濁し、 37て で放置したときのメ トヘモグロ ビン比率 （％) を経時的に 測定した。 結果を第 1図に示す。 第 1図から明らかに本発 明の水素添加リ ン脂質へモソーム （No. l ) には酸化 （メ ト 化） 抑制の効果がみられる。

試験例 2

濃厚へモグロビン水溶液をリポソーム化することによる へモソーム懸濁液中のへモグロビン濃度に対する脂質濃度 低減化の効果を調べた。

実施例で作成した 50% S F Hへ乇ソーム （No.l)、 対照と しての 30%(v/v) S F Hから調整したへモソーム （ o.4 ) お よび 15%(v/v) S F Hから調整したへモソーム （ No.5 ) にお けるへモソーム懸濁液中の脂質濃度： L ( nig/ml) とへ乇 グロビン濃度： H (ng/ml) の比 LZHを表 1に示す。

試 料 L/H

No.1 50% S F Hのへモソーム 1.29

No.4 30% S F Hへモ ソ 一ム 3.48

No.5 15% S F Hへモソ ーム 6.76 表 1から S F Hの濃度が上昇するにつれ Hb 濃度に対 する脂質濃度低減化の効果が明らかである。

試験例 3

濃厚へモグロビン水溶液をリポソ一ム化することによる へモソーム懸濁液の粘度低減効果を調べた。

へモソーム懸濁液 （生理食塩水) 中のヘモグロ ビン濃度 を一定 ( 7 %) にしたときの 50% S F Hへモソーム懸濁液 (No.1 ) 、 30% S F Hへモソーム懸濁液 （No.4 ) および 15 %S F Hへモソ一ム懸種液 （No.5) のそれぞれの粘度を測 定した。 結果を第 2図に示す。

第 2図から、 へモソーム懸濁液中のへモグロビン濃度を —定にしてその粘度を比較すると、 濃厚な S F Hを含有す る程へモソーム懸濁液の粘度は低減化することが明らかで ある。

比 較 例

実施例で調製した S F H ·脂質の懸濁液 （実施例第 3段 階の液） を使用してフ レンチプレス （大岳製作所） により 処理を行った。 粒子径を参考にして実施例と同等の効果を 求めようとしたところ、 圧力 200kgZciiでの 1回処理した ものでは、 リボソームは形成されるものの、 粒径が不揃い であり、 実施例と同程度の粒径にするためには 5回処理が 必要であった。 また、 実施例第 5段階以-降と同様にして人 ェ赤血球 154.5mlが得られ、 その収率は、

0.1X 154.5 (ml)

100(%) 10.3%でぁり、 収率につい

0.5 X 300 (ml)

ても実施例のものと比較して劣っていた。 また作業時間に おいても実施例の方が短かく て済むことがわかった。

図面の簡単な説明

第 1図はへモソ一ム中のメ トヘモグロビン比率 （％) の 絰時変化を示すグラフである。

第 2図はへモソーム懸濁液の粘度を示すダラフである。

Claims

請 求 の 範 囲

1 ) リボソーム膜形成脂質を有機溶媒に溶解し、 該溶液 から溶媒を留去し、 残留物に水溶液を加え、 振盪処理ま たは超音波処理することにより均一な懸濁液とし、 該懸 濁液をガスで加圧し、 該ガスを該懸濁液に十分浸透させ た後、 該懸濁液を钿隙から高圧吐出処理することを特徴 とする リ ボソームの製造法。

2 ) 水溶液の粘度が 10〜S . 000cP ( 20で） である請求の 範囲第 1項記載のリボソームの製造法。

3 ) 該ガスは不活性ガスである請求の範囲第 1項記載の リ ボソームの製造法。

4 ) 不活性ガスによる加圧が 80〜； 130 kg Z c である請求 の範囲第 1項記載のリボソームの製造法。

5 ) ガス加圧式高圧吐出型乳化機を使用して懸濁液を高 圧吐出処理する請求の範囲第 4項記載のリボソームの製 造法 o

6 ) リ ボソーム内にへモグロビン水溶液を取り込んでな るヘモグロ ビン含有リ ボソームであって、 リ ボソーム膜 が水素添加率 50%以上の水素添加リ ン脂質を主成分とし、 へモグロビン水溶液が 30〜60% ( w/v)のへモグロビン濃 度を有することを特徵とするへモグロビン含有リポソー ム。

7 ) 水素添加リ ン脂質が水素添加天然リ ン脂質である請 求の範囲第 6項に記載のへモグロビン含有リポソ一ム。 8 ) 水素添加天然リ ン脂質が水素添加レシチンである請 求の範囲第 7項記載のへモグロビン含有リポソーム。

9 ) 水素添加率 80%以上の水素添加レシチンである請求 の範囲第 8項記載のへモグロビン含有リボソーム。

5 10) 水素添加率 80 %以上の水素添加ホスフ ァチジルコ

リ ンである請求の範囲第 9項記載のへモグロビン含有リ ポソ一ム。

·' 11 ) ヘモグロ ビン濃度が 50 % ( w/v)である請求の範囲第

6項記載のヘモグロ ビン含有リボソーム。

10 12) リボソーム膜が負電荷を与える物質を含む請求の範 囲第 6項乃至第 10項のいずれかの項に記載のへモグロ ビン含有リ ポソーム。

13) 負電荷を与える物質がホスファチジン酸またはジセ チルホスフュー トである請求の範囲第 11項記載のへモグ 5 ロ ビン含有リ ボソーム。