WO1988005439A1 - Nouveaux types de biosondes froides comportant un cluster alcyne-metal carbonyle - Google Patents
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Classifications
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- C07J51/00—Normal steroids with unmodified cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not provided for in groups C07J1/00 - C07J43/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07F11/00—Compounds containing elements of Groups 6 or 16 of the Periodic Table
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
- C07F15/06—Cobalt compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
Definitions
- the field of the present invention is, in general, that of the use of carbonyl coordination complexes as cold bioprobes using the unique complex property of carbonyl metals, namely: the existence of bands Extremely intense CO in the region 2 100-1 850 cm -1 , in fact in the "window" left free in the proteins.
- This feature therefore makes the derivatives thus labeled usable for any analysis of mixtures of natural compounds.
- Fourier transform infrared spectroscopy (IR-FT) suitably adapted, ideally finds application in this type of problem.
- the development of the spectral method by IR-FT requires the specific synthesis of organometallic bioreagents presenting the best possible specifications of bioreagents.
- French patent application No. 82 16024 proposed estrogen complexes of carbonyl metals as cold bioprobes or tracers for the assay of hormone receptors by IR-FT.
- the present invention offers new types of cold bioprobes based on carbonyl coordination complexes exhibiting intense CO vibrators by the introduction of small alkynes-carbonyl metal clusters on the reagent to be assayed.
- Organometallic derivatives are thus obtained by regioselective alkylation using carbocations derived from alkynes complexed by a metal carbonyl complex (or carbonyl metals).
- the complexes obtained with these carbonyl alkynesmetal clusters are more stable than those obtained by direct compression without alkylation and above all now apply to substances other than estrogen complexes, in fact any substance having structures compatible with this organometallic chemistry.
- the new types of cold bioprobes according to the invention apply to estrogen compounds, as in patent application No. 82 16024 with the assay of hormone receptors, but also to the detection and assay immunological including toxins and anabolic substances.
- the synthesized estrogens can also serve as antigens in the context of immunoassays.
- Zeranol is an anabolic used for the growth of animals for which the EEC plans the next ban.
- the effectiveness of such a measure depends on the means of control available to verify that these prohibition measures are actually applied.
- the use of IR-FT can constitute an original, simple and effective method if we know how to make organometallic antigens capable of being "recognized” by anti-anabolic antibodies. These assays require judicious labeling of these substrates by selective alkylation using organometallic cations.
- the case of zearalenone and its derivatives also perfectly illustrates the above considerations. This product has low acute toxicity. It is used with its derivatives in the breeding of animals because of its estrogenic and anabolic effects.
- Zearalenone (a) and zearalenol (b) have the following structures, respectively:
- zearalenone (a) naturally pollutes moist cereals
- authorized estrogen anabolic zearalenol (b) is obtained by catalytic reduction of this mycotoxin (a).
- the use of zearalenol in the breeding of calves, lambs and chickens must be regulated in France and in the EEC where commissions aim to determine the thresholds of toxic and hormonal action of this product and to propose methods control analytics; the end being the health of the consumer.
- a radioimmunoassay is possible to measure the levels of serum zearalenol in children with early sexual maturity following a diet thus contaminated.
- the current detection threshold being 0.5 mg / ml, it is desirable to reach 25 pg / ml, but the radioimmunological method requires for the detection of traces the use of antibodies and radioactive tracers with high activity. specific difficult to access. This is why the present invention therefore proposes a new dosage of very small quantities of substances of biological interest such as, for example, zearalanol, achieving this sensitivity and avoiding the call to radioactivity, the drawbacks of which have been listed above.
- the chemistry of carbonyl metals provides an unprecedented answer to this problem.
- the goal is to achieve a lower cost, with better sensitivity and repeatability, a simple dosage for example of zearalanol in serum, animal tissues and food. This approach is directly transposable to other antigens and in particular to other food mycotoxins.
- alkynes-carbonyl metal clusters make it possible to synthesize organometallic bioreagents having, in addition to very good stability, a specific recognition power with respect to antibodies in the case of infrared "immuno-assay” (IR-IA) or to receptors in the case of hormonal assays, as well as intense CO vibrators by selective alkylation.
- IR-IA infrared immuno-assay
- These clusters offer, for example, the possibility of selective alkylation on ether functions of enols, with respect to an aromatic nucleus activated by donor substituents, in particular by using an organometallic cation complexed in the presence of hexamethyldisilazane and, hence, the possibility of final deprotection of the phenol function.
- these clusters offer the possibility of decoraplexation of alkynes-cobalt carbonyl precursors, which allows access, from the free acetylenic derivative, to other carbonyl metal complexes from groups VI, VII, VIII, IX of the Table. Periodic and therefore to use these cold bioprobes in analysis.
- the invention therefore generally relates to complexes of alkylated bioreagents complexed by an organometallic compound which, according to the essential characteristic of the invention, comprises a carbonyl metal alkyne ciuster.
- the alkyne consists of a propargyl derivative, the latter giving particularly alkylating and stable cations.
- bioreactive means any substance of biological interest.
- bioreactants of biological compounds comprising in particular at least one phenolic aromatic nucleus and / or at least one free ketone or hydroxy function on an aliphatic carbon and / or at least one amino, thiol or carboxy function. Indeed, by way of example, it is indicated that the alkylation-complexation can take place, in particular
- estrogens and estrogen derivatives in particular chosen from estradiols, estrones and their derivatives of formulas:
- bioreagents suitable for the invention of toxins and in particular zeranol, zeralone, zearalenone, zearalanol and their derivatives of formulas I, II, III and IV respectively:
- R and R ' represent hydrogen or a protective radical such as a hydroxalkoxy group.
- an organometallic compound of metals from groups VI, VII, VIII and IX of the periodic table in particular chromium, molybdenum, tungsten, manganese, cobalt, nickel, technetium, rhenium, osmium, ruthenium.
- the ligands of these organometallic compounds can be very varied, in particular CO, CS, CSe, CNR 1 , P (R 2 , R 3 , R 4 ), cyclopentadienyl, R 1 being in particular an alkyl radical or -COR 5 and R 2 , R 3 , R 4 and R 5 being in particular phenyl or phenoxy substituted or unsubstituted, alkyl or C 1 to C 7 substituted or unsubstituted alkoxy or else a halogen atom, R 5 may be -N (CH 2 CH 2 Cl) 2 .
- the metal-carbonyl compounds can contain several metals and up to 12 ligands.
- the invention also relates to a process for the preparation of bioreactive complex, characterized in that the bioreactor is reacted with an alkynic cation complexed with a metal carbonyl compound in the presence of tetrafluoroboric acid.
- the alkylation-complexation takes place selectively at the alpha of a ketone function or of a free hydroxy radical with respect to the aromatic nucleus and in a stereospecific manner.
- the ketone function is transformed into the form of enol ether.
- the enol ether function is reacted with an alkyne-carbonyl metal cation in the presence of hexamethyldisilazane (HMDS).
- HMDS hexamethyldisilazane
- an advantageous solvent is methylene chloride.
- the complexed carbocations according to the invention, it is possible to complex a second time temporarily with solvents comprising heteroatoms, such as pyridine, sulfides, etc., the carbocation already complexed with the metal car bony le.
- solvents comprising heteroatoms, such as pyridine, sulfides, etc.
- Protic solvents can then be used.
- Decomplexation of the triple bond of the complex takes place by the action of ferric salts in ethanol.
- the alkylation-complexation according to the invention can take place on the aliphatic carbon even carrying a hydroxy or ketone function, for example in the case of the zeranol and zearalenol derivatives in position 7.
- the compound is reacted, for example the zeralone or zearalenone on an acetylenic organomagnesium compound in order to obtain in this case in position 7 an ethynyl zeranol or zearalenol, the phenol functions are released, then the CC triple bond is complexed with a metal-carbonyl.
- a triple bond distant from several atoms of the ketone function for example in the case of zeralone or zearalenone of position 7 by transforming the ketone function into acid oxime, in particular with the carboxy-methyloxime (CMO) arm and by coupling the amide link type with the amine of an amine-alkyne, for example a propargyl amine. Complexation with a metal-carbonyl then takes place on the triple bond.
- CMO carboxy-methyloxime
- this carboxy-methyl oxime arm also called CMO arm
- the compound and the labeling element that is to say the alkyne-metal-carbonyl ciuster
- antibodies are often prepared from immunogen in which the coupling between the hapten compound and the vector protein is carried out using this CMO arm.
- the subject of the invention is also the application of the complexes obtained for assays of antigens and antibodies by IR-IA and of biological receptors by the method already described in patent No. 82 16024.
- estradiol receptors which has a high recognition power with respect to estradiol receptors (RBA - 35%).
- alpha position denotes regiospecificity with respect to an adjacent carbon
- alpha 'or beta' relate to different stereospecificities on the same carbon and denote faces.
- reaction is regioselective and stereospecific since the orientation of the attack exclusively leads to the product 16 alpha '.
- R CH 2 OCH 3 0.3 g (1.65 mmol.) Of Na N (SiMe 3 ) 2 are dissolved in 5 ml of THF (previously distilled on sodium, benzophenone) at room temperature. 0.24 g (0.75 mmol.) Of methylmethoxy-ether-estrone are added in solution in 3 ml of THF. The mixture is stirred for 20 minutes and then 0.4 ml of chlorotrimethylsilane are added. After 25 minutes, the solvent is evaporated, taken up in diethyl ether and poured into water. The ethereal solution is washed with a saturated NaHCO solution. then with water until neutral.
- the cation (9) is prepared in ether from 0.24 g (0.75 mmol.) Of complexed propargyl alcohol and of the ethereal complex of tetrafluoroboric acid. (9) is thoroughly washed with ether and then dried under vacuum and suspended in 5 ml of methylene chloride. The enol ether with 2 equivalents of HMDS is added at 0 ° C. dissolved in 3 ml of methylene chloride. The reaction is immediate. After 15 minutes, the brick-red solution is poured into water, washed with NaHCO-, then with water until neutral pH, dried over magnesium sulfate. The solvent is evaporated. In thin layer chromatography on silica, a majority red spot is observed (Rf 0.50 for ether 1, pentane 4).
- HEXACARBONYLOESTRADIOL (16) 0.08 g of (1 1) are dissolved in 5 ml of absolute ethanol and 0.07 g of NaBH 4 is added . The mixture is stirred overnight, after 16 hours water is added and left for 2 hours. A white precipitate appears. The whole is extracted with methylene chloride, washed with a hydrochloric acid solution then neutralized and dried. The solvent is evaporated. The crude product is chromatographed on silica plates (ether 1, pentane 1). Two products are separated. One no longer has acetylenic proton in NMR but there are vinyl protons in the spectrum. The other still has an acetylene proton, in the infrared the ketone band has disappeared.
- the acetylene product crystallizes (mass M + 35H M + H + 355, M + NH 4 + 372), 0.035 g are dissolved in 1 ml of CH 2 Cl 2 and 0.045 g of cobalt octacarbonyl are added. After 2 hours the solvent is evaporated, the residue is taken up in pentane to which a few drops of ether are added. The solution is filtered on a short florisil column. The solvent is evaporated and the product chromatography on a silica plate (eluent ether). The red band is recovered (16c). (16c), about 0.07 g, is dissolved in 3 ml of a 1: 1 ethanol-THF mixture.
- the two alpha 'and beta isomers are separated by chromatography on a silica plate.
- the phenol functions are released by the action of potassium fluoride.
- alpha 'and beta' can then be complexed with carbonyl metals.
- the non-complexed derivatives (28a and 28b) are easily obtained from zeralone (23a) and zearalenone (23b) by the action of carboxymethoxylamine in pyridine, the acid oxime obtained is then coupled to the propargyl amine by the conventional method ( hydroxy succinimide and carbodiimide in THF followed by the addition of the propargyl amine in the presence of triethylamine).
- the complexation is carried out according to the usual methods and the products purified by chromatography on a silica column (eluent CH 2 Cl 2 ) are identified with NMR, 1 H and mass.
- PROPARGYLAMIDE-METHYLOXIME 7 'ZERALONE 4 (See diagram 1) 200 mg (0.5 mmol) of carboxymethyloxime 7' zeralone (compound 3) are dissolved in 23 ml of THE and stirred 1/4 hour at 4oC. 67 mg (0.59 mmol) of N hydrosuccinimide are added thereto, as is a solution containing 160 mg (0.75 mmol) of NN'dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 4 cc of THE. The solution is thus stirred 4 hours at 4 ° C and then 20 hours at room temperature. A white precipitate is formed. After filtration, the solution is returned to 4 ° C. and 65 ⁇ l (1 mmol) of propargylamine and 520 ⁇ l (3.5 mmol) of triethylamine are added thereto. The mixture is left stirring for 4 hours at 4 ° C., then 20 hours at room temperature.
- the product analyzed is a mixture of the two Z and E isomers of oxime.
- the affinity of the modified hormones for the estradiol receptor is determined by a competition test between these hormones and the tritiated estradiol. For this, cytosol fractions (supernatant
- Binding Affinity which is the ratio X 100 of the concentration of nonradioactive estradiol displacing 50% of the specific binding of estradiol to its receptor on the molarity of modified hormone displacing 50% of this binding. The greater the value of RBA is high plus the hormone to be tested has affinity for the estradiol receptor.
- Cation (9) also easily reacts with sulfides such as dimethyl sulfide in methylene chloride to yield a sulfonium ion (9 ') which is quantitatively isolated from (9).
- This sulfonium ion is soluble and stable in CH 2 Cl 2 , acetone, acetonitrile, while (9) reacts on acetone and acetonitrile. In these solvents, it hydrolyzes slowly to give complexed propargyl alcohol. In methanol and ethanol, this modified carbenium ion (9 ′) is soluble and gives an alcoholysis reaction which requires more than ten minutes to be complete while (9) reacts almost instantaneously with these alcohols, Under these conditions ( 9 ') can advantageously be used for propargylation reactions of primary and secondary amines including in protic media.
- Another method of amino propargylation is the use of the cation (9 ") which involves a change of metal.
- the reaction can take place in other solvents, in particular ethanol or methanol.
- the reaction must then be brought to a lower temperature of the order of -15 to -20 °, for example 10 mg of cation is added in solution in 1 ml of ethanol, the whole is prepared at -15 ° C.
- 0.2 ml of isopropylamine dissolved in 0.5 ml of ethanol is added dropwise. The reaction is immediate, it rises to room temperature and the solvent is evaporated.
- This new carbocation makes it possible to alkylate the thiol functions, in particular in the form of thiolate.
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Abstract
Complexe constitué d'un bioréactif alkylé-complexé par un composé organométallique. Ce composé organométallique comporte un cluster alcyne-métal carbonyle. Application des complexes de bioréactifs, comme traceurs pour des dosages de récepteurs biologiques ou des dosages immunologiques d'antigène ou d'anticorps par application de l'IR-FT.
Description
NOUVEAUX TYPES DE BIOSONDES FROIDES COMPORTANT UN CLUSTER ALCYNE-METAL CARBONYLE.
Le domaine de la présente invention est, de manière générale, celui de l'emploi de complexes de coordination carbonyles comme biosondes froides en utilisant la propriété unique complexes des métaux carbonyles, à savoir : l'existence de bandes
CO extrêmement intenses dans la région 2 100-1 850 cm-1, en fait dans la "fenêtre" laissée libre dans les protéines. Cette particularité rend, en conséquence, les dérivés ainsi marqués utilisables pour toute analyse de mélanges de composés naturels. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-FT), convenablement adaptée, trouve idéalement à s'appliquer dans ce type de problème. Le développement de la méthode spectrale par IR-FT exige la synthèse spécifique de bioréactifs organométalliques présentant les meilleures spécifications de bioréactifs possibles.
A cet effet, la demande de brevet français n° 82 16024 proposait des complexes d'oestrogène de métaux carbonyles comme biosondes froides ou traceurs pour le dosage de récepteurs hormonaux par IR-FT.
La présente invention offre de nouveaux types de biosondes froides à base de complexes de coordination carbonyles présentant des vibrateurs CO intenses par l'introduction de petits ciusters alcynes-métal carbonyle sur le réactif à doser. On obtient ainsi des dérivés organométalliques par alkylation régiosélective à l'aide de carbocations dérivés d'alcynes complexés par un complexe de métal carbonyle (ou métaux carbonyles). Les complexes obtenus avec ces clusters alcynesmétaux carbonyles sont plus stables que ceux obtenus par σomplexation directe sans alkylation et surtout s'appliquent maintenant à d'autres substances que les complexes d'oestrogène, en fait toute substance possédant des structures compatibles avec cette chimie organométallique.
Cette stabilité accrue permet en effet, désormais, comme on le verra plus loin, la synthèse d'antigènes traceurs porteurs d'entité alcyne-métal carbonyle comme élément de marquage. Ainsi, selon la présente invention, s'ouvre un nouveau champ d'application de ces dérivés organométalliques avec, notamment, la détection et le dosage immunologique d'anticorps ou d'antigènes.
A titre d'exemple, les nouveaux types de biosondes froides selon l'invention s'appliquent aux composés d'oestrogènes, comme dans la demande de brevet n° 82 16024 avec le dosage de récepteurs hormonaux, mais encore à la détection et au dosage immunologique notamment de toxines et substances anabolisantes. Bien entendu, les oestrogènes synthétisés peuvent également servir d'antigènes dans le cadre de dosages immunologiques.
Parmi ces substances possédant des structures compatibles avec une chimie organométallique se trouvent, en effet, les mycotoxines alimentaires, en particulier celles de la série des zéranol, zéralone, zéaralénol, zéaralénone. Ces substances souffrent de la limite des méthodes analytiques actuelles, soit en raison de seuils de détection trop élevés, soit de limitations légales liées à l'usage de la radioactivité.
Le zéranol est un anabolisant utilisé pour la croissance des animaux dont la CEE prévoit la prochaine interdiction. L'efficacité d'une telle mesure dépend des moyens de contrôle dont on pourra disposer pour vérifier que ces mesures d'interdiction sont réellement appliquées. L'utilisation de l'IR-FT peut constituer une méthode originale, simple et efficace si l'on sait fabriquer les antigènes organométalliques susceptibles d'être "reconnus" par des anticorps anti-anabolisants. Ces dosages requièrent des marquages judicieux de ces substrats par alkylation sélective à l'aide de cations organométalliques.
Le cas de la zéaralénone et de ses dérivés illustre également parfaitement les considérations ci-dessus. Ce produit présente une basse toxicité aiguë. Il est utilisé avec ses dérivés dans l'élevage d'animaux à cause de ses effets oestrogeniques et anabolisants. En raison de sa persistance et de son transport dans la viande, cet usage de la zéaralénone et de ses analogues est source de préoccupations. De plus, la détection aussi bien que le dosage souffrent de sensibilités trop basses (2 000 ng/kg dans le maïs et le blé, 10 000 ng/kg dans le lait concentré) qui rendent difficile le contrôle.
La zéaralénone ( a) et le zéaralénol (b) présentent respectivement les structures suivantes :
Tandis que la zéaralénone (a) pollue naturellement les céréales humides, le zéaralénol (b) anabolisant oestrogène autorisé, est obtenu par réduction catalytique de cette mycotoxine (a). L'emploi du zéaralénol dans les élevages de veaux, d'agneaux et de poulets doit être réglementé en France et dans la CEE où des commissions ont pour objectifs de déterminer les seuils d'action toxique et hormonale de ce produit et de proposer des méthodes analytiques de contrôle ; la finalité étant la santé du consommateur.
Un dosage radio-immunologique est envisageable pour mesurer les taux de zéaralénol sérique chez des enfants atteints de maturité sexuelle précoce à la suite d'une alimentation ainsi contaminée. Le seuil de détection actuel étant de 0,5 mg/ml, il est souhaitable d'atteindre 25 pg/ml, mais la méthode radio-immunologique nécessite pour la détection de traces l'utilisation d'anticorps et de traceurs radioactifs à haute activité spécifique difficile d'accès.
C'est pourquoi la présente invention propose donc un nouveau dosage de très faibles quantités de substances d'intérêt biologique telles que, par exemple, du zéaralanol atteignant cette sensibilité et évitant l'appel à la radioactivité dont les inconvénients ont été énumérés plus haut. La chimie des métaux carbonyles apporte une réponse inédite à ce problème.
Le but est de réaliser à moindre coût, avec de meilleures sensibilité et répétabilité, un dosage simple par exemple du zéaralanol dans le sérum, les tissus animaux et les aliments . Cette démarche est directement transposable aux autres antigènes et notamment aux autres mycotoxines alimentaires .
L ' introduction de clusters alcynes-métal carbonyle permet de synthétiser des bioréactifs organométalliques présentant , outre une très bonne stabilité , un pouvoir de reconnaissance spécifique par rapport aux anticorps dans le cas d ' infrarouge "immuno-assay" (IR-IA) ou aux récepteurs dans le cas de dosages hormonaux, ainsi que des vibrateurs CO intenses par alkylation sélective .
Ces clusters offrent, par exemple, la possibilité d ' une alkylation sélective sur des fonctions éthers d ' énols , par rapport à un noyau aromatique activé par des substituants donneurs , notamment en utilisant un cation organo- métallique complexé en présence d ' hexaméthyldisilazane et , partant, la possibilité de déprotection finale de la fonc- tion phénol .
En outre , ces clusters offrent la possibilité de décoraplexation de précurseurs alcynes-cobalt carbonyle , ce qui permet d'accéder , à partir du dérivé acétylénique libre, à d' autres complexes de métaux carbonyles des groupes VI, VII , VIII , IX du Tableau Périodique et donc d' utiliser ces biosondes froides en analyse .
L ' invention a donc d 'une manière générale pour objet des complexes de bioréactifs alkylés-complexés par
un composé organométallique qui, selon la caractéristique essentielle de l'invention, comporte un ciuster alcyne de métal carbonyle.
Avantageusement, l' alcyne consiste en un dérivé propargyle, celui-ci donnant des cations particulièrement alkylants et stables.
On entend dans la présente demande par "bioréactif toute substance d'intérêt biologique.
On peut citer plus particulièrement comme bioréactifs des composés biologiques comportant notamment au moins un noyau aromatique phénolique et/ou au moins une fonction cétone ou hydroxy libre sur un carbone aliphatique et/ou au moins une fonction aminé, thiol ou carboxy. En effet, à titre d'exemple, on indique que l'alkylation-complexation peut avoir lieu, notamment
- sur un noyau phénolique en α de la fonction hydroxy protégée ou
- sur un carbone aliphatique en α d'une fonction cétone ou hydroxy ou
- sur un carbone aliphatique portant une fonction hydroxy ou une fonction cétone ou
- sur une fonction aminé, thiol ou carboxy.
Outre les oestrogènes et dérivés d'oestrogène, notamment choisis parmi les oestradiols, oestrones et leurs dérivés de formules :
Comme cela a été indiqué précédemment, il est possible d'utiliser des dérivés de ces composés. En particulier, il est possible, si cela est nécessaire, de protéger certaines des fonctions hydroxy afin d'améliorer la stabilité des composés, par exemple par éthérification à l'aide de dériv és de type silane ou par des groupements alkyle ou aikoxy en C 1 à C7, plus particulièrement en C1 pour les dérivés de l'oestradiol et en C 1 4 et C16 pour les dérivés des zéranol et zéaralénol. Se sont révélés particulièrement intéressants, les composés lorsque R est un radical silyloxy ou un radical HO(CH2)n, n étant compris entre l et 7.
Dans la limite de la définition générale, il est possible d'utiliser, dans les composés selon l'invention, un composé organométallique
de métaux des groupes VI, VII, VIII et IX de la classification périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, l'osmium, le ruthénium.
Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment CO, CS, CSe, CNR1, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényle, R1 étant notamment un radical alkyle ou -COR5 et R2, R3, R4 et R5 étant notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy en C1 à C7 substitué ou non ou bien un atome d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2Cl)2. Les composés métaux-carbonyles peuvent comporter plusieurs métaux et jusqu'à 12 ligands.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de complexe de bioréactifs, caractérisé en ce qu'on fait réagir le bioréactif avec un cation alcynique complexé par un composé de métaux-carbonyles en présence d'acide tétrafluoroborique.
De manière très intéressante, l'alkylation- complexation a lieu sélectivement en alpha d'une fonction cétone eu d'un radical hydroxy libre par rapport au noyau aromatique et de manière stéréospécifique.
Pour ce faire, on transforme la fonction cétone sous forme d'éther d'énol. Avantageusement, on fait réagir la fonction éther d'énol sur un cation alcyne-métal carbonyle en présence d'hexaméthyldisilazane (HMDS) . Dans ces procédés, un solvant avantageux est le chlorure de méthylène.
D'une manière générale, pour alkyler-complexer sélectivement, sur un site ou une fonction chimique, les carbocations complexés selon l'invention, on peut com- plexer une deuxième fois temporairement avec des solvants comportant des hétéroatomes, tels que la pyridine, les sulfures, etc., le carbocation déjà complexé avec le métal-car bony le.
En particulier, il est possible d'alkyler- complexer sélectivement une fonction aminé primaire et secondaire par rapport à une fonction hydroxyle lorsque la réaction a lieu en présence de sulfures. On peut alors utiliser des solvants protiques.
De même, en conduisant la réaction- en présence de pyridine, on obtient une alkylation-complexation sélective d'une fonction thiol (thiolate).
Pour alkyler-complexer sélectivement un site ou une fonction chimique, il est également possible de jouer sur la nature du métal engagé dans le complexe de métal-carbonyle.
Ainsi, en utilisant le cation spécifique o
on peut alkyler directement les aminés sélectivement en présence de groupe OH.
Selon la présente invention, on peut procéder à une décomplexation d'un premier composé de métaux- carbonyles sur la triple liaison C-C, puis une recomplexa- tion en un deuxième complexe avec un deuxième composé de métaux-carbonyles sur la triple liaison C-C.
Pour obtenir une complexation en alpha du radical hydroxy libre, on peut procéder à une décomplexation de la triple liaison C-C d'un premier complexe d'un composé de métaux-carbonyles en alpha d'une fonction cétone, puis une r-éduction de la fonction cétone en alcool, puis une recomplexation de la triple liaison C-C en alpha du radical hydroxy libre.
La décomplexation de la triple liaison du complexe a lieu par action de sels ferriques dans l'étha- nol.
L'alkylation-complexation selon l'invention peut avoir lieu sur le carbone aliphatique même portant une fonction hydroxy ou cétone, par exemple dans le cas des dérivés zéranol et zéaralénol en position 7. Pour ce faire, on fait réagir le composé par exemple la zéralone ou zéaralénone sur un composé organomagnésien acétylénique pour obtenir dans ce cas en position 7 un éthynyl zéranol ou zéaralénol, on libère les fonctions phénols, puis on complexe au niveau de la triple liaison C-C par un métal-carbonyle.
Il est possible aussi de fixer une triple liaison éloignée de plusieurs atomes de la fonction cétone par exemple dans le cas de la zéralone ou zéaralénone de la position 7 en transformant la fonction cétone en oxime acide, notamment avec le bras carboxy-méthyloxime (CMO) et en effectuant un couplage du type lien amide avec l'aminé d'une amine-alcyne par exemple une aminé propargylique. La complexation avec un métal- carbonyle a ensuite lieu sur la triple liaison. L'intérêt de ce bras carboxy-méthyl oxime encore appelé bras CMO, entre le composé et l'élément de marquage, (c'est-à-dire le ciuster alcyne-métal-carbonyle) et que les anticorps sont souvent préparés à partir d'immunogène dans lesquels le couplage entre le composé haptène et la protéine vectrice est réalisé à l'aide de ce bras CMO.
L'invention a également pour objet l'application des complexes obtenus pour des dosages d'antigènes et d'anticorps par IR-IA et de récepteurs biologiques par la méthode déjà décrite dans le brevet n° 82 16024.
L'invention sera maintenant explicitée par les exemples suivants et la figure 1 qui représente le spectre IR du produit 28b de l'exemple 5 (métal = cobalt).
EXEMPLE 1
SYNTHESE SELECTIVE DE BIOREACTIFS METAUX CARBONYLES
DE L'OESTRADIOL EN POSITION 2,4 A L'AIDE DE
CATIONS PROPARGYLIQUES COMPLEXES L'expérience montre qu'il est nécessaire de protéger la fonction phénol pour obtenir des produits suffisamment stables pour être utilisés dans les conditions des tests biologiques. On a choisi le groupe protecteur propanoi-1 qui conduit au dérivé :
A partir de (2) la propargylation par le cation in situ se produit en 2 et k avec un bon rendement. On a utilisé les cations propargyliques dicobait hexacarbonyle. La propargylation conduit aux dérivés organométalliques (3) et (4) :
Dans un tube de Schlenck, préalablement séché et purgé par de l'argon, on introduit 1,6 cm3 du complexe éthéré de l'acide tétrafluoroborique et 3 cm3 d'éther dialkylique (préalablement distillé sur du sodium et de la benzophenone). On ajoute alors goutte à goutte une solution de 0,22 g d'alcool propargylique dicobait hexacarbonyle dans 3 cm3 d'éther ethylique. U se forme une huile rouge insoluble. On additionne alors goutte à goutte 0,2 g (0,6.10-3 mol.) de (2) en solution dans 5 cm3 de chlorure de méthylène (préalablement distillé sur hydrure de calcium). Après 2 à 3 heures, l'ensemble forme une solution rouge brique, indiquant que tout le cation formé a réagi. Celle-ci est lavée avec une solution saturée de bicarbonate de sodium puis à l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium et évaporation du solvant, on obtient Q,<* g d'une huile rouge. Les produits (3) et (4 ) (R1 = H) sont séparés par chromatographie sur plaque de silice (éluant CH2CH2/MeOH : 98/2). Les produits (3) et (4 ) sont obtenus en proportions équivalentes avec un rendement global de 50 %.
IR (3) et (4) CH2Cl2 CO 2080, 2020, 2005, 1990 cm-1
RMN CDCI3 (3) 1H(s) 7,08 ; 1H(s) 6,60 ; 1H(s) 6,00 ; 2H(s) 4,07 ppm (4) 1H(d) 7,27 ; 7,17 ; 1H(d) 6,80 ; 6,70 ; 1H(s) 6,00 , 2H(s) 4,20 ppm
Masse sur le produit décomplexé (3) M+ 368
(4) M+ 368. Le Schéma réactionnel est donc le suivant :
La décomplexation de (3) et (4) par des sels ferriques en solution dans l'éthanol conduit aux produits (3') et (4') :
Ces dérivés acétyléniques permettent alors d'accéder à d'autres types de composés métaux carbonyles dérivés du molybdène Mo2Cp2(CO)6 ou de l'osmium Os 3(CO)12, par exemple.
EXEMPLE 2
PROPARGYLATION SELECTIVE DE LA POSITION
16 alpha' DE L'OESTRADIOL
Dans cette demande de brevet, la position alpha désigne une régiospécificité par rapport à un carbone adjacent, et alpha' ou beta' concernent des stéréospécificités différentes sur un même carbone et dés ig nent des faces .
En faisant réagir en suspension dans le chlorure de méthylène le cation propargylique dicobait hexacarbonyle sur l'éther d'énol sililé d'un dérivé protégé de l'oestrone (5) :
Pour (5a) (5b) les produits (6), (7), (8) sont obtenus en égales proportions. Dans le cas de (5c) seul le produit (6) est formé. Or, le groupe protecteur méthylméthoxy-éther est particulièrement intéressant puisqu'il permet de retrouver facilement la fonction phénol en milieu acide sans toucher au ciuster. On a donc cherché une méthode sélective d'alkylation en 16 en présence de ce groupe protecteur du phénol de l'oestrone. Les ions carboniums (9) réagissent facilement avec les aminés primaires et secondaires, même encombrées, et sur les aminés aromatiques comme la pyridine.
La réaction est régiosélective et stéréospécifique puisque l'orientation de l'attaque conduit exclusivement au produit 16 alpha'.
Propargylation en position 16 alpha' - obtention de (7) R = CH 2OCH3 0,3 g (1,65 mmol.) de Na N(SiMe3)2 sont dissous dans 5 ml de THF (préalablement distillé sur sodium, benzophenone) à température ambiante. 0,24 g (0,75 mmol.) de méthylméthoxy-éther-oestrone sont ajoutés en solution dans 3 ml de THF. Le mélange est agité 20 minutes puis 0,4 ml de chlorotrimethylsilane sont additionnés. Après 25 minutes, le solvant est évaporé, repris par de l'étherdiéthylique et versé dans de l'eau.
La solution éthérée est lavée avec une solution saturée de NaHCO. puis à l'eau jusqu'à neutralité. Après séchage sur sulfate de magnésium, le solvant est évaporé et on obtient une huile jaune. La RMN montre que la transformation en éther d'énol est quasi quantitative et que l'huile contient deux équivalents d'hexaméthyldisilazane. Ce matériau est donc utilisé tel quel pour la réaction de propargylation.
Le cation (9) est préparé dans l'éther à partir de 0,24 g (0,75 mmol.) d'alcool propargylique complexé et du complexe éthéré de l'acide tétrafluoroborique. (9) est abondamment lavé à l'éther puis séché sous vide et mis en suspension dans 5 ml de chlorure de méthylène. L'éther d'énol avec 2 équivalents d'HMDS est ajouté à 0ºC en solution dans 3 ml de chlorure de méthylène. La réaction est immédiate. Après 15 minutes, la solution rouge brique est versée dans de l'eau, lavée avec NaHCO-, puis avec de l'eau jusqu'à pH neutre, séchée sur sulfate de magnésium. Le solvant est évaporé. En chromatographie de couche mince sur silice on observe une tache rouge majoritaire (Rf 0,50 pour éther 1, pentane 4).
Le produit brut est adsorbé sur de la silice (colonne 220 x
35 mm) et élue avec un mélange pentane-éther (5:1). Après que la première fraction colorée soit passée, on change le mélange éluant (pentane-éther 2:1) et on collecte un produit (0,38 g, 80 %% pur par chromatographie sur couche mince.
IR CH2Cl2 CO 2090, 2050, 2020, 2000, 1760 cm- 1 RMN 250 MHz CDCl3 : 1H 7,21 ppm (d) ; 1H 6,81 (d,d) ; 1H 6,79 (d) ; 1H 6,07 (s) ; 2H 5,07 (s) ; 3H 3,38 (s) ; 1H 3,31 (d,d) ; 2H 2,81 (d,d) ; 1H 2,61 (d,d) ; 1H 2,47 (m) ; 1H 2,3 (m) ; IH 2,12 (m) ; 4H 1 ,85 (m) ;
5H 1,43 (m) ; 3H 0,89 (s). Masse M + NH4 + 656 (produit décomplexé)
- M+ 352 M + H+ 353 M + NH4 + 370.
EXEMPLE 3 RECOMPLEXATION DE (7) Le dérivé (7) est préalablement décomplexé avant que de réduire la fonction cétone en alcool (voir plus loin), le produit résultant ( 1 1 )
est alors réduit par NaBR4 en milieu alcoolique, cette réaction conduit à deux produits en quantités équivalentes résultant probablement d'une attaque compétitive de l'ion hydrure sur les faces alpha' et beta . Un seul de ces produits, le 16 α -propargyl 17 β -ol (12) conserve la fonction acétylénique et peut être recompiexé par différents métaux carbonyles, par exemple Co2(CO)8,
Mo2Cp2(CO)6, Os3(CO) 1 2, permettant d'obtenir respectivement ( 16), ( 17) et ( 18)
Pour (16c), (17c) et (18c) on obtient facilement l'oestradiol substitué en 16 alpha. Par traitement en milieu acide (HBF, éthanoi, eau), on obtient respectivement (19), (20) et (21) :
RMN 250 MHz CDCL3 : 1H 7, 19 ppm (d) ; 1H 6,82 (d,d) ; 1H 6,8 (d) ; 2H 5,15 (d) ; 3H 3,47 (d) ; 2H 2,90 (d,d) ; 1H 2,72 (m) ; 1H 2,6 (m) ; 3H 2,2 à 2,45 (m) ; 4H 2,00 (m) ; 1H 1,94 (t) ; 5H 1,52 ppm (m) ; 1H 0,96 ppm (s).
EXEMPLE 4
OBTENTION DU 16 alpha' -PROPARGYLOICOBALT-
HEXACARBONYLOESTRADIOL ( 16) 0,08 g de ( 1 1) sont dissous dans 5 ml d'éthanol absolu et on ajoute 0,07 g de NaBH4. Le mélange est agité pendant la nuit, après 16 heures on ajoute de l'eau et on laisse 2 heures. Il apparaît un précipité blanc. Le tout est extrait au chlorure de méthylène, lavé avec une solution d'acide chlorhydrique puis neutralisé et séché. Le solvant est évaporé. Le produit brut est chromatographie sur des plaques de silice (éther 1, pentane 1). Deux produits sont séparés. L'un ne présente plus de proton acétylénique en RMN mais il y a des protons vinyliques dans le spectre. L'autre présente toujours un proton acétylénique, en infrarouge la bande cétone a disparu. Après 5 jours, le produit acétylénique cristallise (masse M+ 35H M + H+ 355, M + NH4 + 372), 0,035 g sont dissous dans 1 ml de CH2Cl2 et 0,045 g de cobalt octacarbonyle sont ajoutés. Après 2 heures le solvant est évaporé, le résidu est repris dans du pentane auquel on additionne quelques gouttes d'éther. La solution est filtrée sur une courte
colonne de florisil. Le solvant est évaporé et le produit chromatographie sur plaque de silice (éluant éther). La bande rouge est récupérée ( 16c). ( 16c), environ 0,07 g, est dissous dans 3 ml d'un mélange 1:1 éthanol-THF. 5 gouttes de HBF4 Et2O sont ajoutées à la température ambiante, après 10 minutes un produit plus polaire rouge apparaît sur plaque de silice (éluant éther 1, pentane 1). Après 20 heures la réaction est presque complète. Le mélange est versé dans l'eau, extrait au chlorure de méthylène, après séchage on chromatographie sur plaque de silice en éluant à l'éther. La bande rouge majoritaire est récupérée, elle conduit à une huile rouge qui cristallise doucement. Le rendement est de 80 %. RMN 250 MHz (CDCl3) : 1H 7,07 (d) ; 1H 6,81 (d,d) ; 1H 6,54 (d) ;
1H 6,03 (t) ; 1H 4,54 (s) ; 1H 3,40 (d) ; 1H 3,29 (d,d) ; 1H 2,84 (d,d) ;
1H 2,82 (q) ; 2H 2,26 (m) ; 3H 1,93 (m) ; 7H (1 ,7 à 1,2) ; 3H 0,80 (t). Masse après décomplexation M+ 310.
EXEMPLE 5
SYNTHESE D'ANTIGENES ORGANOMETALLIQUES
DANS LA SERIE DE L'alpha- ZERANOL (22), DE LA ZERALONE (23)
ET DE LA ZEARALENONE (23')
A priori la complexation du noyau par un groupe cobalt tricarbonyle paraît l'approche la plus évidente. Cependant son utilisation est limitée par le fait que le produit organométallique résultant n'est pas très stable (il faut alors protéger les fonctions phénols). C'est pourquoi on a orienté le travail sur l'alkylation du noyau par des ions carbéniums organométalliques et l'alkylation sélective des positions alpha de la zeralone (23) et sur la complexation des éthynylzéranol alpha' et beta'.
1 ) Propargylation du noyau aromatique en 13 et 15
Comme pour l'oestradiol, il faut au préalable protéger la fonction phénol libre pour obtenir des produits stables. Le schéma réactionnel est le suivant :
2) Propargylation des positions 6 et 8
La réaction du cation (9) sur l'éther d'énol obtenu à partir de (23), R = CH3, R' = CH3, conduit dans les conditions habituelles à la substitution du noyau aromatique en position 13. Dans les mêmes conditions avec l'éther d'énol dérivé de l'oestrone, on obtient une compétition entre l'attaque sur le noyau et sur l'éther d'énol. La réaction devient régiosélective sur l'éther d'énol en utilisant le cation (9) en présence d'hexaméthyldisilazane.
Le schéma réactionnel est le suivan t et le mode opératoire est similaire :
3) Obtention des ethynyls zéranols alpha' et béta' complexés
A partir de (23) avec, par exemple, R = R' = t.but-diméthylsily l, il est facile d'obtenir les deux ethynyls zéranols protégés alpha' et beta' par action du magnésium acétylénique.
(26) alpha' et beta' peuvent alors être complexés par des métaux carbonyles. Co2(CO)8, Mo2Co2(CO)6, Os3(CO)1 2 pour donner respectivement (27) alpha', beta', (28) alpha', beta' et (29) alpha', beta'.
De la même manière, les composés (24) et (25), après avoir été décomplexés par action de sels ferriques dans l'ethanol, peuvent être recomplexés par des métaux carbonyles du molybdène et de l'osmium.
A partir des dérivés 26 alpha et beta complexés par MoCp2(CO)4 , on obtient les dérivés (27a et b) résultant de la déshydratation par catalyse acide des alcools acétyléniques complexés :
A 1 mmol. de l'éther de la TBMS zéralone dissous dans 5 ml de THF on ajoute un excès de Grignard de l'acétylène et laisse à réagir 12 heures. Le mélange réactionnel est additionné dans une solution diluée d'acide chlorhydrique, extraite à l'éther, lavée, séchée. On obtient environ 0,7 g d'une huile jaune, présentant en RMN dans CDCl3 deux signaux pour un proton acétylénique à 2,4 ppm. Sur couche mince de silice (éther 1. pentane 1) on observe deux taches (Rf 0,5 et 0,6). Les deux produits sont séparés sur 6 plaques préparatives de silice (éther 1, pentane 1 ). Le rendement en produits isolés alpha' et beta' est de 66 %. Les fractions phénols sont libérées par action de Bu. NF en solution dans le THF suivie d'une hydrolyse à l'eau. Masse M* 346 M + H+ 347, M + NH^+ 364.
5) Préparation d'antigfenes métallocarbonyles (28a et 28b) dérivés de la zéralone (23a) et de la zéaralénone (23b) avec le bras CMO
Les dérivés (28a et 28b) non complexés sont facilement obtenus à partir des zéralone (23a) et zéaralénone (23b) par action de carboxyméthoxylamine dans la pyridine, l'oxime acide obtenue est alors couplée à l'aminé propargylique par la méthode classique (hydroxy succinimide et carbodiimide dans le THF suivi de l'addition de l'aminé propargylique en présence de triéthylamine). La complexation est effectuée suivant les méthodes habituelles et les produits purifiés par chroma- tographie sur colonne de silice (éluant CH2Cl2) sont identifiés au RMN, IH et masse.
CARBOXY-METHYLOXIME 7' ZERALONE : 3 (Voir schéma 1 ciaprès)
A une solution de 200 mg (0,62 mmole) de zéralone 2 dissous dans 20 ml de pyridine, on ajoute 400 mg (1,8 mmoles) de carbométhoxylamine. On laisse agiter 24 heures à l'obscurité. Après évaporation de la pyridine, on reprend le résidu avec de l'acétate d'é- thyle-. On rince abondamment à l'eau. La solution est ensuite séchée sur sulfate de magnésium puis évaporée. On obtient 220 mg d'un solide blanc.
On remarque en RMN l'existence des deux isomères Z et E de l'oxime. Les différents essais de séparation de ces deux isomères sur plaque de silice pré- parâtive se sont avérés infructueux (Eluants testés : éther; mélange éther-pentane avec quelque» gouttes de méthanol; chloroforme2-propanol1)
FUSION 125°C
RMN 1H (250 MHz, Acétone deutérée) δ en ppm :
Spectre de l'isomère majoritaire : 1,39 (3H, d, 3J-6Hz, 19-CH3)
2,32 et 3,19 (1H, td, 3J=12Hz, 2J=4,5Hz, 12-CH-H) 4,58 (2H, s, CH2COOH) 5,17 (1H,m, 3- CH)
6,24 (1H,d,4J=2,5Hz, 15- CH) 6,29(1H,d,4J=2,5Hz,13-CH) 9,14 (1H,s,14- COH) 12,08(1H,s,16- COH)
Au spectre de l'isomère majoritaire viennent s'ajouter d'autres raies moins importantes correspondant à l'isomère minoritaire : 11,78 (16-COH); 5,35 (3-CH); 4,58(CH2COOH); 1,40 (19- CH3)
IR en cm-1
3337 (F et i,ν COOH) 2964(e,vaCH3) 2945(m, ν CH2) 2928 (m, va CH3) 2870(m,vsCH2) 1732,1643,1628(F,ν CO) 1585(m, C=C aromatique)
MASSE (Par désorption chimique avec comme gaz réac- tant NH3) Pic de masse = pic de base MH+=394; m/z=411 (M+NH4 +)
PROPARGYLAMIDE-METHYLOXIME 7' ZERALONE:4 (Voir schéma 1) 200 mg (0,5 mmole) de carboxyméthyloxime 7 ' zéralone (composé 3) sont dissous dans 23 ml de THE et agités 1/4 d'heure à 4ºC. On y ajoute 67 mg (0,59 mmole) de N hydrosuccinimide ainsi qu'une solution contenant 160 mg (0,75 mmole) de NN'dicyclohexylcarbodiimide dis- sous dans 4 ce de THE. La solution est ainsi agitée 4 heures à 4°C puis 20 heures à température ambiante. Il se forme un précipité blanc.
Après filtration, la solution est remise à 4°C et on y ajoute 65μl (1 mmole) de propargylamine et 520 μl (3,5 mmoles) de triéthylamine. On laisse sous agitation 4 heures à 4°C, puis 20 heures à température ambiante.
Le THF est évaporé au rotavapor et le résidu est repris avec 20 ml de dichlorométhane. La phase organique est lavée trois fois à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium puis évaporée. On obtient 190 mg de solide jaunâtre (rendement 90 %).
Les produits sont purifiés sur plaque de silice préparative et les deux isomères séparés (éther comme éluant).
Rf = 0,42 et 0,49 pour les deux isomères, Rf = 0,1 pour l'oxime qui n'a pas réagie.
FUSION 160°C
RMN 1H (250 Mhz, Acétone deutérée) δ en ppm :
Pour l'isomère majoritaire : 1,35 (3H,d,3J=6Hz, 19- CH3) 2,68(1H,t,4J=2,5Hz, C≡CH) 3,19 (1H,td,3J=12Hz, 2J=4,5Hz, 12- CH-H)
4,04 (2H,16 raies, système AB,4J=2,5Hz, 3J=5,9Hz,
NH-CH2-C≡C) 4,45 (2H,s, NO-CH2-CO) 5,17(1H,m,3-CH) 6,23(1H,d,4J=2,5Hz,15-CH) 6,29(1H,d,4J=2,5Hz,13-CH) 7,22(1H,s large, NH) 9,15(1H,s large, 14- COH)
12,0(1H,s,16-COH)
Pour l'isomère minoritaire
1,36(3H,d,3J=6Hz, 19-CH3) 2,67(1H,t,4J-2,5Hz,C≡CH) 4,02(2H,4 raies,4j=2,45Hz,3J=5,7Hz,NH-CH2-C≡CH) 4,42(2H,s,NO-CH2-CO) 5,25(1H,m,3-CH)
6,23(1H,d,4J=2,5Hz,15-CH) 6,29(1H,d,4J=2,5Hz,13-CH) 7,15(1H,s,NH) 9,14(1H,s large, 14-COH)
11,70(1H,s,16-COH)
IR ( en cm-1 )
3275 (F et I,ν OH associé) 2964 (e, va CH3) 2945 (m,ν CH2) 2828 (m, va CH2) 2853 (m, vs CH2) 2120 (f,ν C≡C) 1697 et 1639 (F, ν CO) 1580 (m, ν C=C aromatique)
MASSE (Par désorption chimique avec comme gaz réactant NH3) Pic de masse : MH =431 Pic de base : m/z=207 (M+NH4 +) m/z=448 ANALYSE ELEMENTAIRE
Pour C23 H30N2O6
Calculé (%) C 64,19 H 6,97 N 6,51 O 22 ,32
Trouvé (%) 64,37 7,58 6,80 20 ,75
DICOBALT HEXACARBONYL PROPARGYLAMIDE METHYLOXIME 7'
ZERALONE : 5 (voir schéma 1)
Toute la manipulation se fait sous atmosphère d'argon. Après avoir dissous dans 10 ml de THF 190 mg (0,48 mmole) de composé 4, on ajoute 170 mg de dicobalthexacarbonyl (0,5 mmole) dissous dans 3 ml de THF. On observe alors une ffervescence gazeuse et une coloration rouge apparaît. La réaction est suivie sur plaque chromato graphique silice et est complète après 1/4 d'heure.
On chromatographie alors la solution sur colonne de silice sous pression d'argon avec de l'éther comme éluant et on recueille avec un faible rendement (environ 10 %) un produit qui après évaporation est un solide rouge. Sur plaque de silice préparative (éluant : éther2-pentane1), on peut séparer les deux isomères Z et E) (Rf = 0,2 et 0,25)
FUSION : Le produit se décompose à partir de 55°C
RMN 1H (250 MHz, acétone deutérée)
Pour l'isomère majoritaire : 1,35 (3H,d,5J=6Hz, 19-CH3) 3,17(1H,td,3J=12Hz,2J=4,5Hz,12-CH) 4,47(2H, système AB(4raies), NO-CH2-CO)
12,00(1H,s,16-COH) 4,70(2H,16 raies, système AB,4J=2,5Hz,5J=5,9Hz,
NH-CH2-C≡CH) 5,17(1H,m,3-CH) 6,22(1H,d,4J=2,5Hz,15-CH) 6,29(lH,d,4J=2,5Hz,13-CH) 6,40(1H,S,C≡CH)
7 ,72(1H,t,CO-NH) 9,14(1H,s,14-COH)
IR (en cm-1)
3238(F et I,ν OH associé) 2928 (F, va CH2) 2858 (m,vs CH2) 2095;2052;2014 (F,ν CO sur le métal) 1637 (F, v CO) 1585 (m, ν C=C aromatique)
DIMOLYBDENE DICYCLOPENTADIENYL TETRACARBONYL PROPARGYLAMIDE METHYLOXIME 7' ZERALONE : 6 (schéma 1)
- Synthèse de Mo2Cp2CO6 à partir de Mo2Cp2CO4
370 mg (0,75 mmole) de Mo2Cp2CO6 sont dissous dans 6 ce de diglyme sous atmosphe re d'argon. On laisse 3 heures au reflux à 160°C sous courant d'argon. Après filtration, on obtient une solution marron-rouge de Mo2Cp2CO4.
- Synthèse du composé 6 160 mg (0,38 mmole) de composé 4 dissous dans 10 ml de THF sont mélangés au dimolybdènedicyclo- pentadiényltétracarbonyl Mo2Cp2CO4 préparé précédemment (à partir de deux équivalents de Mo2Cp2CO6). On obtient très vite une solution rouge que l'on chromatographie sur colonne d'alumine (éther comme éluant) et sous courant d'argon. On sépare ainsi le produit synthétisé du complexe du molybdène de départ. Les
deux isomères Z et E de l'oxime sont séparés sur plaque de silice preparative avec un mélange éluant éther 2-pentane1. (Rf=0,18 et 0,23).
FUSION : Le produit se décompose à partir de 110°C. RMN 1H (250 MHz, tone deutérée) δ en ppm :
Spectre de l'isomère majoritaire : 1,35 (3H,d,3J=6Hz,19-CH3) 3,17(1H,td,3J=12Hz, 2J=4,5Hz,12-CH) 4,35(2H,m,4J=6Hz,CH2-C≡C) 4,42(2H,s,NO-CH2-CO) 5,18(1H,m,3-CH) 5,42(10H,s,2 Cp) 6,09(1H,s,C≡CH)
6,23(1H,d,4j=2,5Hz,15-CH) 6,29(1H,d,4J=2,5Hz,13-CH) 6,91(1H,s,NH) 9,11(1H,s,14-COH)
12,00(1H,s,16-COH) IR (en cm-1)
3422 (F et I ,v OH associé ) 2922 (F , va CH2)
2851 (m , vs CH2)
1990, 1907,1834 (F, ν CO sur le métal) 1641 (f,ν CO)
1583 (m, ν C=C aromatique) ZEARALENONE 7 (voir schéma 2 ci-après)
FUSION : 164°C
RMN 1H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm :
Tous les hydrogènes ont été attribués grâce à un .spectre de corrélation proton-proton (cosy) 1,36(3H,d,3J=6Hz,19-CH3) 1,68(2H,d,4-CH2)
2,06(5H,m,5-CH2,9-CH2,6-CH-H) 2,13(2H,m,10-CH2)
2,26(1H,m,8-CH-H) 2,33(2H,m,10-CH2)
2,68(1H,m,6-CH-H) 2,88(1H,m,8-CH-H)
5,00(1H,m,3-CH) 5,75(1H,m,C=CH)
6 ,30 (1H,d ,4J=2 , 5Hz , 15-CH) 9 ,19(1H, s ,14-COH)
6 ,44(1H,d ,4J=2 ,5Hz , 13-CH) 11 ,94(1H,s ,16-COH)
7 ,05(1H,d , 3J=15Hz ,12-CH=C)
RMN 15C (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm : La position des CH2 a été repéré par une expérience DEPT.
26(19-C) (27,28,38,40,41,49)=(4-C,5-C,6-C,8-C,9,C)
10-C) 79(3-C) (108,115)=(13-C,15-C) (139,140)=(11-C,12-C) (150,159,161,178)=(14-C,16-C,17-C,18-C) (207,215)=(1-CO,7-CO)
IR (en cm-1) 3314(F et I,ν OH associé) 2976 (m, va CH3) 2935 (e, va CH2) 2868 (f, vs CH2) 1691,1649,1618 (F,ν CO) 1580 (m, ν C=C aromatique)
MASSE (Par désorption chimique avec NH3 comme gaz réactant) Pic de masse = pic de base MH+=319 m/z=336 (M+NH4 +) CARBOXYMETHYLOXIME 7' ZEARALENONE : 8 (voir schéma 2)
Nous avons utilisé le même mode opératoire que pour la synthèse du composé 3. La réaction a été réalisé à partir de 400 mg (1,25 mmole) de zéaralénone 7. On obtient 435 mg (1,1 mmole) d'un produit visqueux (Rdt=88 %). Avec une faible concentration de produit, on peut réussir à séparer les deux isomères Z et E de l'oxime en utilisant comme mélange éluant du chloroforme2 propanol1 : Rf=O,35 et 0,48
RMN 1H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm
Pour l'isomère majoritaire :
1,35(3H,d,3J=6Hz, 19-CH3) 2,85(2H,m,8-CH2)
4,59(2H,s,NO-CH2-COOH) 4,95(1H,m,3-CH) 5,74(1H,m,11-CH=C) 6,28(1H,d,4J=2,5Hz,15-CH)
6,42(1H,d,4J=2,5Hz, 13-CH) 7,05(1H,d,5J=15Hz, 12-CH=C) 12,0 (1H,s,16-COH)
Le produit analysé est un mélange des deux isomères Z et E de l'oxime. Le produit minoritaire présente peu de différence spectrale avec celui de l'isomère majoritaire : 1,36 (19-CH3), 4,55 (NO-CH2-COOH), 5,13 (3-CH), 6,0 (11-CH=C) On peut ainsi estimer la proportion des deux isomères : 85 % - 15 %. IR (en cm-1)
3412 (I,ν COOH) 2932(F, va CH2) 2870 (e,vs CH2) 1717;1669 (f, ν CO) 1647;1669(F, ν CO)
MASSE (Par désorption chimique avec NH3 comme gaz réactant) Pic de masse = pic de base : MH+=392 m/z=392 (M+NH4 +)
PROPARGYLAMIDE METHYLOXIME 7' ZEARALENONE : 9
(voir schéma 2)
Le mode opératoire est le même que celui de la synthèse du composé 4, en utilisant 200 mg (0,5 mmole) de 8. On obtient 183 mg de solide amorphe légèrement coloré (rdt = 90 % ). La séparation des deux isomères s'effectue sur plaque preparative de silice (avec de l'éther comme éluant) : Rf = 0,46 et 0,6.
RMN 1H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm
1,39 (3H,d,3J=6Hz, 19-CH3) 1,38
2,67 (1H,t,3J=2,5Hz, C≡CH) 2,64 4,03 (2H,8raies, 3J=2,4Hz,4J=1,2Hz, NH-CH2-C≡CH) 4,02
4,47 (2H,s,NO-CH2-CO) 4,42
5,00 (1H,m,3-CH) 5,15
5,77 (1H,m,11-CH=C) 5,94
6,28 (1H,d,4J=2,5Hz,15-CH) 6,28 6,44 (1H,d,4J=2,5Hz, 13-CH) 6,46
7,08 (1H,d,3J=15Hz, 12-CH=C) 7,10
7,21 (1H, s large, NH) 7,23
La position des hydrogènes de l'isomère majoritaire est indiquée à gauche; celle de l'isomère minoritaire à droite.
IR (en cm-1)
3288 (I , v OH assoc ié ) 2930 (f ,va CH2) 2853(m, vs CH2)
2125 (f , ν C≡CH) 1734(f , ν CO) 1651 (F , v CO) 1580 (m, ν C=C aromatique)
ANALYSE ELEMENTAIRE: : Pour C23H28N2O6
Calculé en % C 64,48 H 6,54 N 6,54 O 22,43 Trouvé en % 61,57 6,95 6,09 22,26
DICOBALT HEXACARBONYL PROPARGYLAMIDE METHYLOXIME 7' ZEARALENONE : 10 (voir schéma 2)
Nous avons utilisé le même mode opératoire que pour la synthèse du composé 5, le produit obtenu a une coloration rouge.
FUSION : Le produit se décompose à partir de 80°C.
RMN 1H (250 MHz, acétone deutérée) δ en ppm
Pour l'isomère majoritaire :
1,39 (3H,d, 3J=6Hz, 19-CH3) 4,53 (2H,système AB, 4 raies, NO-CH2-CO) 5,00 (1H,m,3-CH)
4,72 (2H, 16raies, 3J=6,3Hz, 4J=1Hz,NH-CH2-C≡CH). 5,77 (1H,m,11-CH=C) 6,29(1H,d,4J=2,5Hz,15-CH) 6,43(1H,d,4J=2,5Hz,13-CH) 7,07(1H,d,3J=15Hz,12-CH=C)
IR (en solution dans CH2Cl2) 2955 (F,va CH2) 2097 (m, ν CO) 2029;2058(F, ν CO)
AFFINITE RELATIVE DE LIAISON (ARL) VIS-A-VIS DES ANTICORPS DU ZERANOL
Produit ARL
28a (Métal≈molybdène) 31 % 28a (Métal≈cobalt) 39 %
28b (Métal≈cobalt) 57 %
26 (α,8) 5 %
27 17 %
Ces résultats montrent que tous ces complexes sont compétiteurs du zéranol- 3H, donc se fixent sur les anticorps. Les pourcentages élevés obtenus pour plusieurs complexes indiquent clairement la possibilité d'utiliser ces antigènes pour le dosage immunologique du zéranol. D'autre part, le spectre infra-Rouge en micropastille de KBr du complexe 28b est représenté sur lafigure 1. Les bandes caractéristiques du greffon organométallique apparaissent à 2094, 2051 et 2024 cm-1. Ces bandes que T'on retrouve dans tous les complexes de ce type sont nettement plus intenses que toutes les autres bandes du spectre et sont situés dans une zone où les protéines n'absorbent pas.
METHODOLOGIE DES TESTS BIOLOGIQUES EFFECTUES
ET RESULTATS
L'affinité des hormones modifiées pour le récepteur de l'oestradiol est déterminée par un test de compétition entre ces hormones et l'oestradiol tritié. Pour cela, des fractions de cytosol (surnageant
105 000Xg) sont incubées en présence d'une concentration fixe d'oestradiol tritié (2.10" ) et de concentrations variables de l'hormone à tester (9 points entre 10-8 et 10-7). On détermine ainsi la valeur de RBA ("Relative
Binding Affinity") qui est le rapport X 100 de la concentration d'oestradiol non radioactif déplaçant 50 % de la liaison spécifique de l'oestradiol a son récepteur sur la molarité d'hormone modifiée déplaçant 50 % de cette liaison. Plus la valeur de RBA est élevée plus l'hormone à tester à de l'affinité pour le récepteur de l'oestradiol.
Produit RBA 3'(acétylénique en 2) 2,5 %
4'(acétyiénique en 4) 2,5 %
3(complexé en 2) 0,001
4 (complexé en 4) 1,9 %
19(acétylénique en 16) 1,2 % zéranol 32,5 %.
EXEMPLE 7
ALKYLATION-COMPLEXATION SELECTIVE DE FONCTIONS AMINES ET THIOLS
Le cation (9) réagit aussi, facilement, avec les sulfures tels que le diméthylsulfure dans le chlorure de méthylène pour conduire à un ion sulfonium (9 ' ) qui est isolé quantitativement à partir de (9).
Cet ion sulfonium est soluble et stable dans CH2Cl2, l'acétone, l'acétonitrile, alors que (9) réagit sur l'acétone et l'acétonitrile. Dans ces solvants, il s'hydrolyse lentement pour donner l'alcool propargylique complexé. Dans le méthanol et l'ethanol, cet ion carbénium (9') modifié est soluble et donne une réaction d'alcoolyse qui requiert plus de dix minutes pour être complète tandis que (9) réagit quasi instantanément sur ces alcools, Dans ces conditions (9') peut être utilisé avantageusement pour des réactions de propargylation d'aminés primaires et secondaires y compris dans des milieux protiques.
Une autre méthode de propargylation des aminés consiste dans l'utilisation du cation (9") qui implique un changement de métal.
Sa réactivité sur les aminés dans le chlorure de méthyle est immédiate, mais nous avons étendu cette réaction à d'autres milieux, acétone et acétonitrile ainsi que dans l'ethanol ou des milieux biphasiques tels que chlorure de méthylène et eau. Cette méthode est particulièrement valable pour des dérivés solubles dans l'eau et peu solubles dans les milieux organiques comme les catécholamines.
D'autres hétéroatomes peuvent être utilisés pour complexer temporairement le cation (9) (par exemple la pyridine et ses dérivés) et moduler encore la réactivité en milieu protique avec une alkylation de thiolates dans le cas de la pyridine. A partir de (9) on possède donc une nouvelle génération d'alkylants régio et chemiosélectifs de nucléophiles.
Ci-après vont être explicités les modes opératoires pour certaines opérations intervenant dans l'alkylation-complexation sur une aminé ou une fonction thiol.
1)
A 0,34 g d'alcool propargylique complexé dans 5 ml d'éther, on ajoute 1 ml de HBF4 éther. Après formation du cation, on procède au lavage à l'éther, puis au séchage sous vide. On ajoute ensuite 10 ml de CH2Cl2 et 0,5 ml de CH3S CH3 (diméthyl- sulfure). Après quelques minutes, un précipité brillant rouge se forme, on décante, on lave le précipité à l'éther. On sèche sous vide, on obtient une poudre rouge pâle (brique) légèrement brillante que l'on met au bac à froid sous argon.
2)
On ajoute 10 mg de cation dans 2 n.1 d'acétone. On laisse à 0ºC et on ajoute goutte à goutte en solution dans l'acétone 0,2 ml d'isopropylamine. La réaction est immédiate, il se forme un produit rouge marron. Le rendement est de l'ordre de 75 %.
La réaction peut avoir lieu dans d'autres solvants, notamment l'ethanol ou le méthanol. La réaction doit être alors portée à une température plus basse de l'ordre de -15 à -20°, par exemple on ajoute 10 mg de cation en solution dans 1 ml d'éthanol, le tout est préparé à -15°C. Après dissolution du cation, on ajoute goutte à goutte 0,2 ml d'isopropylamine en solution dans 0,5 ml d'éthanol. La réaction est immédiate, on remonte à la température ambiante et on évapore le solvant.
3)
On ajoute 0,16 g de cation dans 8 ml de CH-OH, on ajoute goutte à goutte 0,2 ml de diisopropyl- amine dans 1 ml de méthanol, la solution au départ orangée devient rouge. On évapore le solvant.
Le cation a été préparé de la manière suivante Préparation de Mo2Cp2(CO)4
HO-CH2-C≡CH + Mo2Cp2(CO)4
On ajoute 5 g de Mo2Cp2(CO)6 dans 40 ml de dyglime traité (Na+benzophénone) au reflux sous argon pendant 3 heures. Filtration, puis évaporation du dyglime. Addition de l'alcool propargylique. 4 g d'alcool en solution dans 50 ml d'éther sont ajoutés, puis 3 ml de HBF4 aqueux dans 150 ml d'éther (goutte à goutte). Il se forme un précipité orange. Filtration, lavage, on obtient une poudre jaune.
4)
Ce nouveau carbocation permet d'alkyler les fonctions thiol, notamment sous forme de thiolate.
Sur 0,3 g d'alcool propargylique, on obtient un cation lavé à l'éther, séché puis additionné d'un excès de pyridine d'environ 1 ml dans CH2Cl2, après évaporation du solvant et lavage à l'éther du résidu on obtient un résidu rose.
Claims
1. Complexe constitué d'un bioréactif alkyié- complexé par un composé organométallique, caractérisé en ce que ledit composé organométallique comporte un ciuster alcyne-métal carbonyle.
2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'alcyne est un dérivé propargyle.
3. Composé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bioréactif comporte au moins un noyau aromatique phénolique et/ou au moins une fonction cétone ou hydroxy libre sur un carbone aliphatique et/ou au moins une fonction aminé, une fonction thiol ou une fonction carboxy, l'alkylation-complexation ayant lieu
- sur un noyau phénolique en α de la fonction hydroxy protégée ou - sur un. carbone aliphatique en α d'une fonction cétone ou hydroxy ou
- sur un carbone aliphatique portant une fonction hydroxy ou une fonction cétone ou
- sur une fonction aminé, thiol ou carboxy .
4. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bioréactif est un oestrogène ou dérivé d'oestrogène, notamment un oestrogène ayant pour formules
5. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bioréactif est une mycotoxine alimentaire, notamment choisie parmi le zéralone, le zéarélénol, la zéaralone et leurs dérivés de formules
dans lesquelles R et R' représentent l'hydrogène ou des radicaux protecteurs tels que des groupements hydroxy alcoxy.
6. Complexe selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que R et R' sont des dérivés du type silane ou des groupements alkyle, alcoxy ou hydroxyalcoxy en C1 à C16.
7. Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que R et R' sont des groupements alkyle, alcoxy ou hydroxyalcoxy en C1.
8. Complexe selon la revendication 5, caractérisé en ce que R et R' sont des groupements alkyle, alcoxy ou hydroxyalcoxy en C14 à C16.
9. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés organométalliques sont des composés des métaux des groupes VI, VII, VIII, IX de la classification périodique.
10. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés organométalliques sont des composés d'un ou plusieurs métaux choisis parmi le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt, le nickel, le technétium, le rhénium, l'osmium, le ruthénium.
11. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ligands des métaux des composés organométalliques sont choisis parmi CO, CS, CSe, CNR1, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényl, R1 étant un radical alkyle ou -COR5, R2,R3,R4 et R5 étant choisis parmi les radicaux phényl ou phénoxy substitué ou non, et les radicaux alkyle ou alcoxy substitué ou non substitué et les atomes d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2Cl)2.
12. Complexe selon l'une des revendications
4 ou 5, caractérisé en ce que le bioréactif est complexé sur un noyau aromatique, ou en alpha d'une fonction cétone ou d'un radical hydroxy libre.
13. Complexe selon l'une des revendications
4 ou 5, caractérisé en ce que le bioréactif est alkylé- complexé sélectivement en α d'une fonction cétone ou d'un radical hydroxy libre porté par un carbone aliphatique par rapport au. noyau aromatique et stéréospécifiquement.
14. Complexe selon l'une des revendications
5 à 13, caractérisé en ce qu'il est alkylé-complexé en position 7 du zéranol ou du zéaralénol.
15. Complexe selon l'une des revendications 5 à 13, caractérisé en ce qu'il est alkylé-complexé en position 7 de la zéaralénone et la zéralone dont la fonction cétone a été transformée en fonction oxime acide, cette dernière ayant été ensuite couplée avec une aminé propargylique, laquelle est complexée par un métal carbonyle sur sa triple liaison.
16. Procédé de préparation de complexes selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on alkyle le bioréactif avec un cation alcynique complexé par un composé de métal-carbonyle.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le cation alcynique complexé par un composé de métal-carbonyle est obtenu en faisant réagir l'alcool alcynique avec le composé de métal-carbonyle en présence d'acide tétrafluoroborique.
18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le bioréactif a une fonction cétone que l'on transforme sous forme d'éther d'énol, la réaction d'alkylation-complexation du bioréactif par le cation alcynique complexé par un composé de métal- carbonyle ayant lieu en présence d'hexaméthyldisilazane.
19. Procédé selon l'une des revendications
16 à 18, caractérisé en ce que le solvant est le chlorure de méthylène.
20. Procédé de préparation de complexes selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'on fait réagir la fonction cétone sur un composé organomagnésien acétylénique pour obtenir sur le carbone portant la fonction cétone, un radical éthynyl et une fonction OH , le radical éthynyl étant ensuite complexé sur sa triple liaison par un composé de métal-carbonyle.
21. Procédé de préparation de complexes selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que l'on transforme une fonction cétone en oxime acide, par l'intermédiaire d'un bras carboxy-méthyl-oxime, la fonction acide étant ensuite couplée par un lien amide à une fonction aminé d'un composé aminé propargylique et la complexation par un métal-carbonyle ayant lieu sur la triple liaison de l'aminé propargylique.
22. Procédé selon l'une des revendications 16 à 21, caractérisé en ce qu'on procède à une décomplexation d'un premier composé de métal-carbonyle sur la triple liaison C-C, puis une recomplexation en un deuxième complexe avec un deuxième composé de métal-carbonyle sur la triple liaison C-C.
23. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 19, caractérisé en ce qu'on procède à une décomplexation de la triple liaison C-C d'un premier complexe d'un composé de métal-carbonyle en alpha d'une fonction cétone, puis une réduction de la fonction cétone en alcool, puis une recomplexation de la triple liaison C-C en alpha du radical hydroxy libre.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisé en ce que la décomplexation du métalcarbonyle sur la triple liaison a lieu par action de sels ferriques dans l'ethanol.
25. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le bioréactif a une fonction aminé que l'on alkyle-complexe en conduisant la réaction en présence de sulfure.
26. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le bioréactif a une fonction aminé que l'on alkyle-complexe directement en utilisant le carbocation 
Mo2Cp2(CO)4 avec R1 = H ou CH3
27. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17, caractérisé en ce que le bioréactif a une fonction thiol que l'on alkyle-complexe en conduisant la réaction en présence de pyridine.
28. Application des complexes de bioréactifs, selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'on les utilise comme traceurs pour des dosages de récepteurs biologiques ou des dosages immunologiques d'antigène ou d'anticorps par application de l'IR-FT.
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| US5468644A (en) * | 1991-05-09 | 1995-11-21 | British Technology Group Limited | Spectroscopic investigation using organometallic compounds |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP0105785A1 (fr) * | 1982-09-23 | 1984-04-18 | Etablissement Public dit: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) | Complexes organométalliques d'oestrogènes et leur application au dosage des récepteurs hormonaux |
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1987
- 1987-01-27 FR FR8700914A patent/FR2610113B1/fr not_active Expired
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1988
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- 1988-01-27 WO PCT/FR1988/000045 patent/WO1988005439A1/fr not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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