CA1234037A - Complexes organometalliques d'oestrogenes et leur application au dosage des recepteurs hormonaux - Google Patents
Complexes organometalliques d'oestrogenes et leur application au dosage des recepteurs hormonauxInfo
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- CA1234037A CA1234037A CA000532680A CA532680A CA1234037A CA 1234037 A CA1234037 A CA 1234037A CA 000532680 A CA000532680 A CA 000532680A CA 532680 A CA532680 A CA 532680A CA 1234037 A CA1234037 A CA 1234037A
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Abstract
La présente invention concerne un procédé pour la détection de récepteurs hormonaux comprenant: (1) la mise en présence d'échantillons porteurs de récepteurs spécifiques avec un complexe d'oestrogène, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un oestrogène ou d'un dérivé d'oestrogène complexé par un composé organométallique comportant au moins un ligand carbonyle libre, ledit complexe d'oestrogène comportant au moins un radical hydroxy libre et aucun radical hydroxy phénolique libre en .alpha. du site de fixation du composé organométallique; et (2) la détection dudit composé attaché à son récepteur par spectographie par leur bande de fréquence au voisinage de 1860 à 2000 cm-1.
Description
Dans un domaine en pleine expansion comme la chimie organom~tallique mol~culaire, les axes d'applications essentiels se sont jusqu'à pr~sent cantonnés a des synthèses organiques stoechiom~triques et catalytiques.
1a pr~sente invention propose un nouveaù domaine d'application pour ces d~riv~s de la chimie organo-métallique mol~culàire, il s'agit en particulier de la d~tection et du dosage des récepteurs hormonaux.
L'évènement primaire qui initie l'action de la majorité des hormones peptidique5 et st~roldes et des m~dicaments consiste dans leur association avec une prot~ine sp~cifique, appelée "récepteur", localisée sur la membrane cellulaire (cas des hormone$ peptidiques) où dans le cytoplasme (pour les hormones st~roides).
Dans la mesure o~ les récepteurs interviennent dans l'action de la suhstance biochimique ou du médicament, on s'attend ~ ce que des changements dans la concentration du r~cepteur refl~tent l'état de la maladie.
De nombreux systèmes illustrent la justesse d'un tel concept (J.P. Raynaud, T. Ojasoo, M.M. Bouton et D. Philibert, "Drug Design" vol. VIII, Acad. Press (1979) p. 170-214).
::~;Z 34~7 Par exemple dans le cas des tumeurs humaines du seln, un cas particulie~ des cancers hormono-dépendants ;
il y a relativement peu de r~cepteurs oestrog~niques dans le tissu mammaire sain mais la yuantité en devient importante dans environ la moiti~ des cancers primaires du sein. Un taux de 73 ~ de r~mission a ét~ obtenu pour : des patients dont la tumeur contient de hautes concentrations de r~cepteurs oestrogéniques tandis qu'un taux de 2 % seulement de r~mission a ét~ observ~
en leur absence (W.L. ~c Guire, "Hormones and Cancer"
vol. 14, Raven Press, (1980) p. 337-343).
Jusqu'ici, essentiellement pour des raisons de sensibilité, les méthodes de dosage des récepteurs sont bas~es sur des techniques radio-isotopiques en dépit de leurs désavantages bien connus (coûts ~leves, limi-tations l~gales, risques pour la santé, variét~ limitée des isotopes utilisables, difficultés de marquage, instabilités chimi~ue et biochimique).
La présente invention se propose de remplacer les techniques des marquages radio-isotopiques des oestrog~n2s par un mar~uage ~ l'aide de complexes de m~taux carbonyle, en utilisant une propri~t~ unique des complexes de m~taux carbonyle, ~ savoir l'exist~nce d'une bande I.R. ~ C0 dans la r~gion 1900-2000 cm 1, en fait juste dans la "fenetre" laiss~e libre dans les prot~ines.
Pour ce faire, la présente invention propose de nouveaux composés utiles notamment pour la détection et le dosage des récepteurs hormonaux qui sont constitu~s par des complexes d'oestrog~nes comportant un oestrog~ne ~ ou un dérivé d'oestrogène complexé par un composé organo-~ métallique poss~dant aa moins un li5and carbonyle libre, . ~23403'7 . 3 ledlt complexe d'oestrog~ne comportant au molns un radical hydroxy llbre et aucun radical hydroxy phénoli-que libre en ~ du slte de fixation du compos~ organo-m~talli~ue.
Dans la d~in~tion des composés pr~cédents, il faut rem2rquer :
- que l'existence d'un radical hydroxy libre est indispensable afin que le complexe obtenu présente un taux de reconnaissance raisonnable du récepteur sp~cifique ;
- que l'absence de radical hydroxy ph~nolique en ~, c'est-~-dire sur le carbone adjacent, du carbone où se trouve plac~ le compos~ organom~talli~ue est imposée pour des raisons de stabilité et, enfin - que la présence d'un ligand carbonyle libre sur le compos~ organométallique est indispensable puisque c'est pr~cisément cette fonction qui permettra de détecter le complexe.
Parmi les oestrog~nes et les dériv~s d'oestrog~nes utilisables dans le cadre de la présente invention, il convient de clter notamment 1'oestradiol, 1'~estrone, la 16c-hydroxy-oestrone, l'~estriol, l'éthynyloestradiol qui sont des st~roldes hormonaux, ainsi que des oestrog~nes non st~ro~diens, en particulier les d~riv~s du diphényléthane et du stillbène, tels que le di~thyl-stillboestrol et l'hexoestrol.
Comme cela a ~t~ indiqué pr~c~demment, il est possible d'utiliser des dériv~s d`oestrogènes, en particulier il est possible, si cela est nécessaire, de prot~ger certaines des fonctions hydroxy afin d'am~lioxer la stabilité des composés, par exemple par ~ ~th~rification ~ l'aide de dérivés de type silane par exemple ou par des groupements alkoxy en C1 ~ C7.
/
1~3~037 Il est également possible, afin d'augmenter la stabilité
des composés, de rennplacer une fonction hydroxy fixée directe-ment sur le squelette stéroidique par une chaîne hydroxylée, en particulier une chaîne hydroxy-alcoxy, de préférence en Cl à C7.
Lorsque des dérivés d'oestrogènes stéroïdiques sont mis en oeuvre, on utilisera, de préférence, des éthers en position 3 ou 17 et/ou des dérivés hydroxy-alcoxy en position 3.
Dans la limite de la définition générale, il est possible d'utiliser, dans les composes selon l'invention, un composé
10 organo- métallique d'un type quelconque, en particulier des composés organométalliques de métaux des groupes VIa, VIIa ou VIII de la Classification Périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungs~ène, le manganèse, le cobalt ou le nickel~ le technétium, le rhénium.
Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment C0, CS, CSe, CNRl, P(R2,R3,R4), cycl opentadiényle, Rl étant notamment un radical aLtcyle ou -CORs et R2, R3, R4 et R5 étànt notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy
1a pr~sente invention propose un nouveaù domaine d'application pour ces d~riv~s de la chimie organo-métallique mol~culàire, il s'agit en particulier de la d~tection et du dosage des récepteurs hormonaux.
L'évènement primaire qui initie l'action de la majorité des hormones peptidique5 et st~roldes et des m~dicaments consiste dans leur association avec une prot~ine sp~cifique, appelée "récepteur", localisée sur la membrane cellulaire (cas des hormone$ peptidiques) où dans le cytoplasme (pour les hormones st~roides).
Dans la mesure o~ les récepteurs interviennent dans l'action de la suhstance biochimique ou du médicament, on s'attend ~ ce que des changements dans la concentration du r~cepteur refl~tent l'état de la maladie.
De nombreux systèmes illustrent la justesse d'un tel concept (J.P. Raynaud, T. Ojasoo, M.M. Bouton et D. Philibert, "Drug Design" vol. VIII, Acad. Press (1979) p. 170-214).
::~;Z 34~7 Par exemple dans le cas des tumeurs humaines du seln, un cas particulie~ des cancers hormono-dépendants ;
il y a relativement peu de r~cepteurs oestrog~niques dans le tissu mammaire sain mais la yuantité en devient importante dans environ la moiti~ des cancers primaires du sein. Un taux de 73 ~ de r~mission a ét~ obtenu pour : des patients dont la tumeur contient de hautes concentrations de r~cepteurs oestrogéniques tandis qu'un taux de 2 % seulement de r~mission a ét~ observ~
en leur absence (W.L. ~c Guire, "Hormones and Cancer"
vol. 14, Raven Press, (1980) p. 337-343).
Jusqu'ici, essentiellement pour des raisons de sensibilité, les méthodes de dosage des récepteurs sont bas~es sur des techniques radio-isotopiques en dépit de leurs désavantages bien connus (coûts ~leves, limi-tations l~gales, risques pour la santé, variét~ limitée des isotopes utilisables, difficultés de marquage, instabilités chimi~ue et biochimique).
La présente invention se propose de remplacer les techniques des marquages radio-isotopiques des oestrog~n2s par un mar~uage ~ l'aide de complexes de m~taux carbonyle, en utilisant une propri~t~ unique des complexes de m~taux carbonyle, ~ savoir l'exist~nce d'une bande I.R. ~ C0 dans la r~gion 1900-2000 cm 1, en fait juste dans la "fenetre" laiss~e libre dans les prot~ines.
Pour ce faire, la présente invention propose de nouveaux composés utiles notamment pour la détection et le dosage des récepteurs hormonaux qui sont constitu~s par des complexes d'oestrog~nes comportant un oestrog~ne ~ ou un dérivé d'oestrogène complexé par un composé organo-~ métallique poss~dant aa moins un li5and carbonyle libre, . ~23403'7 . 3 ledlt complexe d'oestrog~ne comportant au molns un radical hydroxy llbre et aucun radical hydroxy phénoli-que libre en ~ du slte de fixation du compos~ organo-m~talli~ue.
Dans la d~in~tion des composés pr~cédents, il faut rem2rquer :
- que l'existence d'un radical hydroxy libre est indispensable afin que le complexe obtenu présente un taux de reconnaissance raisonnable du récepteur sp~cifique ;
- que l'absence de radical hydroxy ph~nolique en ~, c'est-~-dire sur le carbone adjacent, du carbone où se trouve plac~ le compos~ organom~talli~ue est imposée pour des raisons de stabilité et, enfin - que la présence d'un ligand carbonyle libre sur le compos~ organométallique est indispensable puisque c'est pr~cisément cette fonction qui permettra de détecter le complexe.
Parmi les oestrog~nes et les dériv~s d'oestrog~nes utilisables dans le cadre de la présente invention, il convient de clter notamment 1'oestradiol, 1'~estrone, la 16c-hydroxy-oestrone, l'~estriol, l'éthynyloestradiol qui sont des st~roldes hormonaux, ainsi que des oestrog~nes non st~ro~diens, en particulier les d~riv~s du diphényléthane et du stillbène, tels que le di~thyl-stillboestrol et l'hexoestrol.
Comme cela a ~t~ indiqué pr~c~demment, il est possible d'utiliser des dériv~s d`oestrogènes, en particulier il est possible, si cela est nécessaire, de prot~ger certaines des fonctions hydroxy afin d'am~lioxer la stabilité des composés, par exemple par ~ ~th~rification ~ l'aide de dérivés de type silane par exemple ou par des groupements alkoxy en C1 ~ C7.
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1~3~037 Il est également possible, afin d'augmenter la stabilité
des composés, de rennplacer une fonction hydroxy fixée directe-ment sur le squelette stéroidique par une chaîne hydroxylée, en particulier une chaîne hydroxy-alcoxy, de préférence en Cl à C7.
Lorsque des dérivés d'oestrogènes stéroïdiques sont mis en oeuvre, on utilisera, de préférence, des éthers en position 3 ou 17 et/ou des dérivés hydroxy-alcoxy en position 3.
Dans la limite de la définition générale, il est possible d'utiliser, dans les composes selon l'invention, un composé
10 organo- métallique d'un type quelconque, en particulier des composés organométalliques de métaux des groupes VIa, VIIa ou VIII de la Classification Périodique, notamment le chrome, le molybdène, le tungs~ène, le manganèse, le cobalt ou le nickel~ le technétium, le rhénium.
Les ligands de ces composés organométalliques peuvent être très variés, notamment C0, CS, CSe, CNRl, P(R2,R3,R4), cycl opentadiényle, Rl étant notamment un radical aLtcyle ou -CORs et R2, R3, R4 et R5 étànt notamment des radicaux phényle ou phénoxy substitué ou non, alkyle ou alcoxy
2 0 en Cl à C7 substitué ou non ou bien Im atome d'halogène, Rs pouvant 8tre -N(CH2CH2Cl)2.
Parmi ces composés organométalliques, il faut citer plus particulièrement les greffons de forrnule:
M (C0) (L') (L") dans laquelle M est un métal du groupe VIa et L' et L", indépen-~239~37 dammen~, sont des ligands mentionnés précédemment, parexemple Cr(C0)3, Cr(CO)~CS, Cr(C0)2CSe, Cr(CO)2CNCO0, Cr(C0)2P03, Cr(C0)2P(00)3, Cr(C0)2PF3~ ~o(CO)3, W(CO)3.
Ces composés organométalliques sont plus particulièrement destinés à être fixés sur un cycle aromatique du composé oestrogène.
Il est également possible de fixer sur les oestrogènes ou les dérivés d'oestrogènes, en particulier lorsque celui-ci comporte une triple liaison, des greffons de formule:
(M' M") (L) dans laquelle M' et M" représentent, indépendamment, un métal du groupe VIa, VIIa ou VIII, en particulier le manganèse, le cobalt, le nickel, le molybclène, et L représente les ligands qui peuvent être choisis comme indiqué précédemment pour L' et L", par exemple Co2(CO)6, Co(CO)3NiCp, Co(CO)3Mo(CO)2Cp, ~(CO)4MCp (Cp: cyclopentadiényle).
Parmi les composés précédents, ceux de formule:
OH
i ''`~,,, ~39~037 dans laquelle E~ est un radical protecteur ou un groupement hydroxy-alcoxy et X est un composé orgaTIo-métallique, ce sont révélés particulièrement intéressants, notamment lorsque R est un radical silyloxy ou un radical HO(CH2)n-, n étant compris entre 1 et 7.
De même les composés de formule:
OR' RO~
X R"
dans laquelle R et R' et X peuvent avoir les significations données précédemment et R" est de préférence un radical HO(CH2)n-, n 0 étant compris entre 1 et 7.
Les composés selon la présente invention peuvent être préparés pal des procédés connus, notamment par action sur le composé oestrogène, ou le dérivé de composé oestrogène, du dérivé organométallique correspondant. Bien entendu, lorsque cela sera nécessaire, certaines des fonctions du composé
oestrogène pourront être protégées, notamment par silylation, là
encore grâce à des procédés connus.
La présente invention concerne également l'appl;cation de ces composés au dosage des récepteurs ~Z34()3'~
hormonaux par des techniques de spectrographies infrarouge ou Raman notamment.
Dans ce type de procédé de détection et de dosage, on met en présence les composés selon la présente invention et les échantillons porteurs de récep~eurs spécifiques et on détecte par spectrographie infrarouge ou raman la présence des composés selon la présente invention fixés sur les récepteurs hormonawc pa~ leur bande de fréquence au voisinage de 1860 à 2000 cm~~.
Comme cela sera démontré dans les exemples 10 ci-apres, ce procédé permet de détecter des quantités très faibles de compo~s, sans fa*e appel à des produits radioactifs dont les inconvé- nients sont bien connus.
Par ailleurs, le procédé de dosage ainsi mis au point entre parfaitement dans la gamme des sensibilités requises pour les applications actuelles, à savoir notamment la détection des cancers primaires du sein.
C:e procédé présente, en outre, l'avantage de ne nécessiter qu'un temps de mesure très bref (environ 1 heure).
Les exemples ci-après sont destinés à illustrer la pré-2 o sente invention.
Les solvants son~ désignés par: éther = E; ether depétrole = Ep. Les spectres de RMN ont été relevés sur l'appareil VARIAN(~ EM 360.
a) Svnthèse du 13-oestradiol mono-silvlé
Dans un ballon purgé d'azote, on met en suspension 1,2 g (2,5.10-~ mole) de NaH à 50% dans 40 ml de THF. On ;~23~ 3~
ajoute ensuite doucement 5,54 g (2.10-2 mole) d'oestradiol dissous dans 40 ml de THl~. Une demie heure après, 3,5 g (2,33.10-2 mole) de t.BuMe2SiCl sont ajoutés à l'état solide dans le milieu réactionnel et on laisse tourner pendant 3 heures. Le mélange est ensuite versé avec précaution dans l'eau glacée, puis on extrait le produit au CH2Cl2. Après lavage et évaporation du solvant, on obtient 7,86 g de solide blanc. La recristallisation dans l'éther de pétrole donne facilement 5,7 g du composé de formule 1; F 158Q, 73%, cristaux blancs.
0 Analyse: C27H3gOgCrSi. Trouvé: C 74,95; H 9,97;
Calculé: C 74,57; H 9,91;
RMN (CDCl3) cycle ~ = 7,2 d, 6,7 dd, 6,61 d; Me ~ = 0,86 s;
Me2 ~ = 0,23 s; t.Bu ~ = 1,03 s.
OH
t.~u(CH3)~5iO \ (I) b) Complexation du 13-oestradiol mono-silvlé
Dans un ballon de 250 ml, 3,2 g (8,3.10-3 mole) de ~-oestradiol mono-silylé préparé en a) et 3,7 g (1,6.10-2 mole) de Cr(CO)6 sont mis avec 150 ml d'éther dibutylique fraîchement distille.
On chau~fe à reflux, sous atmosphère d'azote, pendant 8 heures.
. ~
~;~3~(~3'7 Après évaporation de solvant, le brut réactionnel, 6,18 g, solide jaune, est chromatographié sur colonne de gel de silice 7734 avec comme éluant E/Ep = 1/1.
On isole:
- fraction de tête: produit 2, 1,27 g, 29%, F 220Q
(lE/Ep3, cristaux jaunes.
Analyse: C27H3gOsCrSi. Trouvé: C 61,82; H 7,27 Calculé: C 62,05; H 7,33 RMl~ (CDCl3) cycle ~ = 5,76, d, 5.03 dd, 4,97 d; Me ~ = 0,73 s;
0 Me2 ~ = 0,20 s; t.Bu ô = 0,90 s;
- fraction de queue: produit 3, 1,8 g, 41,5%, F 179Q
(E/Ep), cristaux jaunes.
Analyse: C27H36OsCrSi. Trouvé: C 62,00; H 7,30 Calcuié: C 62,05; H 7,33 RMN (CDC13) cycle ~ = 5,65 d, 4,96 d, 4.90 dd; Me ~ = 0,83 s;
Me2 ~ = 0,26 s; t.Bu ~= 0,96 s.
OH
~ /~exe t.Bu(CH3)2 SiO
C~(CO) 3 , , 23~037 exe 13 t.Bu(CH3)2 SiO
EXEMPT.F 2, a) Complexe du 13-oestradiQl d~lylé
Par silylation du composé 2 avec un excès de NaH et de chlorure de silane, on obtient le complexe du ti~e.
Complexe oestradiol mono-silyle 2: 770 mg (1,47.10-3 mole), NaH: 600 mg (1,2.10-2 mole~ t.BuMe2SiCl: 900 rng (6.10-3 mole).
Après ex~Lraction à l'éther et évaporation du solvant, 10 on obtient 1,9 g de solide jaune que l'on purifie sur colonne de gel de silice 7734 avec un éluant E/Ep = ln.
On isole finalement 0,9 g de produit, 96%, F 225Q
(E/Ep), cristaux jaunes.
Analyse: C33Hs2Crssi2- Trouvé: C 62,32; H 8,27 Calculé: C 62,22; ~I 8,23 RMN (CDC13) cycle ~ = 5,80 d, 5.03 dd, 4.97 d; Me ~ = 0,73 s;
Me2 ~ = 0,26 s, 0,09 s; t.Bu ~- 0,96 s, 0.90 s.
b) Complexe ~ du B-oestrad;ol disilvlé
Le mode operatoire est identique à celui de son .
~3403 diastér~oi som~re . En partant clu composé 3, on obtient le produit avec 93% de rendement, F 253Q (E/Ep), cristaux jaunes.
Analyse C33~52CrOSSi2. Trouvé: C 62,23; H 8,21 Calculé: C 62,22; H 8,23 RMN (CDCl3) cycle ~= 5,66 d, 4,94 d, 4,~7 dd; Me ~ = 0,75 s;
Me2 ~ = 0,21 s, - 0,05 s; t.Bu ~ = 0,90 s, 0,83 s.
OSiMe2t.Bu Cr(CO) t.BuMe25iO ~\ 4~: cr(C0)~3 en 4": Cr(CO)3 en 13 EXEMl?LE 3 Synthèse du composé 5 On irradie pentant 3 heures une solution d'oestradiol mono-silylé a chrome tricarbonyle (composé 2), 0,52 g (10-3 mole), dans 150 ml de ben~ène et ~5 ml de cyclooctène où
barbote un courant d'azote. On ajoute ensuite 1 g de P(Ph)3 et 25 ml de CS2 et on chauffe à 50Q pendant 1 heure 1/2. Après ltration et evaporati on, le brut est chromatographié sur colonne de gel de silice Merck 9385 avec cornme éluant E/Ep =
Parmi ces composés organométalliques, il faut citer plus particulièrement les greffons de forrnule:
M (C0) (L') (L") dans laquelle M est un métal du groupe VIa et L' et L", indépen-~239~37 dammen~, sont des ligands mentionnés précédemment, parexemple Cr(C0)3, Cr(CO)~CS, Cr(C0)2CSe, Cr(CO)2CNCO0, Cr(C0)2P03, Cr(C0)2P(00)3, Cr(C0)2PF3~ ~o(CO)3, W(CO)3.
Ces composés organométalliques sont plus particulièrement destinés à être fixés sur un cycle aromatique du composé oestrogène.
Il est également possible de fixer sur les oestrogènes ou les dérivés d'oestrogènes, en particulier lorsque celui-ci comporte une triple liaison, des greffons de formule:
(M' M") (L) dans laquelle M' et M" représentent, indépendamment, un métal du groupe VIa, VIIa ou VIII, en particulier le manganèse, le cobalt, le nickel, le molybclène, et L représente les ligands qui peuvent être choisis comme indiqué précédemment pour L' et L", par exemple Co2(CO)6, Co(CO)3NiCp, Co(CO)3Mo(CO)2Cp, ~(CO)4MCp (Cp: cyclopentadiényle).
Parmi les composés précédents, ceux de formule:
OH
i ''`~,,, ~39~037 dans laquelle E~ est un radical protecteur ou un groupement hydroxy-alcoxy et X est un composé orgaTIo-métallique, ce sont révélés particulièrement intéressants, notamment lorsque R est un radical silyloxy ou un radical HO(CH2)n-, n étant compris entre 1 et 7.
De même les composés de formule:
OR' RO~
X R"
dans laquelle R et R' et X peuvent avoir les significations données précédemment et R" est de préférence un radical HO(CH2)n-, n 0 étant compris entre 1 et 7.
Les composés selon la présente invention peuvent être préparés pal des procédés connus, notamment par action sur le composé oestrogène, ou le dérivé de composé oestrogène, du dérivé organométallique correspondant. Bien entendu, lorsque cela sera nécessaire, certaines des fonctions du composé
oestrogène pourront être protégées, notamment par silylation, là
encore grâce à des procédés connus.
La présente invention concerne également l'appl;cation de ces composés au dosage des récepteurs ~Z34()3'~
hormonaux par des techniques de spectrographies infrarouge ou Raman notamment.
Dans ce type de procédé de détection et de dosage, on met en présence les composés selon la présente invention et les échantillons porteurs de récep~eurs spécifiques et on détecte par spectrographie infrarouge ou raman la présence des composés selon la présente invention fixés sur les récepteurs hormonawc pa~ leur bande de fréquence au voisinage de 1860 à 2000 cm~~.
Comme cela sera démontré dans les exemples 10 ci-apres, ce procédé permet de détecter des quantités très faibles de compo~s, sans fa*e appel à des produits radioactifs dont les inconvé- nients sont bien connus.
Par ailleurs, le procédé de dosage ainsi mis au point entre parfaitement dans la gamme des sensibilités requises pour les applications actuelles, à savoir notamment la détection des cancers primaires du sein.
C:e procédé présente, en outre, l'avantage de ne nécessiter qu'un temps de mesure très bref (environ 1 heure).
Les exemples ci-après sont destinés à illustrer la pré-2 o sente invention.
Les solvants son~ désignés par: éther = E; ether depétrole = Ep. Les spectres de RMN ont été relevés sur l'appareil VARIAN(~ EM 360.
a) Svnthèse du 13-oestradiol mono-silvlé
Dans un ballon purgé d'azote, on met en suspension 1,2 g (2,5.10-~ mole) de NaH à 50% dans 40 ml de THF. On ;~23~ 3~
ajoute ensuite doucement 5,54 g (2.10-2 mole) d'oestradiol dissous dans 40 ml de THl~. Une demie heure après, 3,5 g (2,33.10-2 mole) de t.BuMe2SiCl sont ajoutés à l'état solide dans le milieu réactionnel et on laisse tourner pendant 3 heures. Le mélange est ensuite versé avec précaution dans l'eau glacée, puis on extrait le produit au CH2Cl2. Après lavage et évaporation du solvant, on obtient 7,86 g de solide blanc. La recristallisation dans l'éther de pétrole donne facilement 5,7 g du composé de formule 1; F 158Q, 73%, cristaux blancs.
0 Analyse: C27H3gOgCrSi. Trouvé: C 74,95; H 9,97;
Calculé: C 74,57; H 9,91;
RMN (CDCl3) cycle ~ = 7,2 d, 6,7 dd, 6,61 d; Me ~ = 0,86 s;
Me2 ~ = 0,23 s; t.Bu ~ = 1,03 s.
OH
t.~u(CH3)~5iO \ (I) b) Complexation du 13-oestradiol mono-silvlé
Dans un ballon de 250 ml, 3,2 g (8,3.10-3 mole) de ~-oestradiol mono-silylé préparé en a) et 3,7 g (1,6.10-2 mole) de Cr(CO)6 sont mis avec 150 ml d'éther dibutylique fraîchement distille.
On chau~fe à reflux, sous atmosphère d'azote, pendant 8 heures.
. ~
~;~3~(~3'7 Après évaporation de solvant, le brut réactionnel, 6,18 g, solide jaune, est chromatographié sur colonne de gel de silice 7734 avec comme éluant E/Ep = 1/1.
On isole:
- fraction de tête: produit 2, 1,27 g, 29%, F 220Q
(lE/Ep3, cristaux jaunes.
Analyse: C27H3gOsCrSi. Trouvé: C 61,82; H 7,27 Calculé: C 62,05; H 7,33 RMl~ (CDCl3) cycle ~ = 5,76, d, 5.03 dd, 4,97 d; Me ~ = 0,73 s;
0 Me2 ~ = 0,20 s; t.Bu ô = 0,90 s;
- fraction de queue: produit 3, 1,8 g, 41,5%, F 179Q
(E/Ep), cristaux jaunes.
Analyse: C27H36OsCrSi. Trouvé: C 62,00; H 7,30 Calcuié: C 62,05; H 7,33 RMN (CDC13) cycle ~ = 5,65 d, 4,96 d, 4.90 dd; Me ~ = 0,83 s;
Me2 ~ = 0,26 s; t.Bu ~= 0,96 s.
OH
~ /~exe t.Bu(CH3)2 SiO
C~(CO) 3 , , 23~037 exe 13 t.Bu(CH3)2 SiO
EXEMPT.F 2, a) Complexe du 13-oestradiQl d~lylé
Par silylation du composé 2 avec un excès de NaH et de chlorure de silane, on obtient le complexe du ti~e.
Complexe oestradiol mono-silyle 2: 770 mg (1,47.10-3 mole), NaH: 600 mg (1,2.10-2 mole~ t.BuMe2SiCl: 900 rng (6.10-3 mole).
Après ex~Lraction à l'éther et évaporation du solvant, 10 on obtient 1,9 g de solide jaune que l'on purifie sur colonne de gel de silice 7734 avec un éluant E/Ep = ln.
On isole finalement 0,9 g de produit, 96%, F 225Q
(E/Ep), cristaux jaunes.
Analyse: C33Hs2Crssi2- Trouvé: C 62,32; H 8,27 Calculé: C 62,22; ~I 8,23 RMN (CDC13) cycle ~ = 5,80 d, 5.03 dd, 4.97 d; Me ~ = 0,73 s;
Me2 ~ = 0,26 s, 0,09 s; t.Bu ~- 0,96 s, 0.90 s.
b) Complexe ~ du B-oestrad;ol disilvlé
Le mode operatoire est identique à celui de son .
~3403 diastér~oi som~re . En partant clu composé 3, on obtient le produit avec 93% de rendement, F 253Q (E/Ep), cristaux jaunes.
Analyse C33~52CrOSSi2. Trouvé: C 62,23; H 8,21 Calculé: C 62,22; H 8,23 RMN (CDCl3) cycle ~= 5,66 d, 4,94 d, 4,~7 dd; Me ~ = 0,75 s;
Me2 ~ = 0,21 s, - 0,05 s; t.Bu ~ = 0,90 s, 0,83 s.
OSiMe2t.Bu Cr(CO) t.BuMe25iO ~\ 4~: cr(C0)~3 en 4": Cr(CO)3 en 13 EXEMl?LE 3 Synthèse du composé 5 On irradie pentant 3 heures une solution d'oestradiol mono-silylé a chrome tricarbonyle (composé 2), 0,52 g (10-3 mole), dans 150 ml de ben~ène et ~5 ml de cyclooctène où
barbote un courant d'azote. On ajoute ensuite 1 g de P(Ph)3 et 25 ml de CS2 et on chauffe à 50Q pendant 1 heure 1/2. Après ltration et evaporati on, le brut est chromatographié sur colonne de gel de silice Merck 9385 avec cornme éluant E/Ep =
3/2. On isole finalement 60 mg du produit désiré, 11%, F 142 (E/Ep).
~234(~3 RMN (CDC13) cycle ô = 5,93 d (1), 5,24 dd (1), 5,11 d (1); Me ô =
0,78 s; Me2 ~ ~ 0,25 s; t.Bu ô = 0,~3 s.
OH
exe t.BuMe 2SiO
,Cr~
CO I CS
CO
a) Dé~vé pro~nol éther de l'oestradiol On chauffe à reflux pendant lS heures 1,08 g d'oestradiol (4.10-3 mole) avec 320 mg de soude (8.10-3 mole) dissous dans 50 cm3 d'acétone, puis 1,4 g de bromopropanol (10-2 mole) est ensuite ajouté et le chauffage est maintenu 10 pendant 2 jou:rs.
Après fil~ation et evaporation, le résidu obtenu est redissous dans CH2Clz. La solution obtenue est d'abord lavée à
l'eau jusqu'à pH neutre, puis séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. On a alors un solide blanc ~que l'on lave au pentane.
On obtient finalement une masse de 1,3 g.
La chromatogr~phie sur couche mince (éluant E/E~p =
2/1) révèle que le produit est pur (Rendement: 100%).
La recristallisation dans l'éther donne des cristaux blancs, Y 168Q, 900 mg.
'!~"
3~03'7 RMN (CI)3COCD3) cycle ~ = 7,31 d (l), 6,83 dd (1), 6,74 d (1); CH3 ~= 0,83 s (3); (:)CH2 ~ = 4,14 t ~2).
Analyse: C21H303 Trouvé: C 76,05; H 9,17 Calculé: C 76,32; H 9,1~.
Masse: M+/C = 330,2197 [~]21 = 70,6 (CH2Cl2, C = 0,51.
b) Complexation du dénvé propanoléther de l oestradiol Dans un ballon de 250 ml, on met 600 mg du composé
plécédant (1,8.10-3 mole), 1,1 g de Cr(CO)6 (5.10-3 mole) et 150 10 cm3 d'éther dibutylique. On chau~fe à reflux le mélange pendant 6 heures. La solution devient jaune limpide.
Après évaporation, on obtient 1,24 g d'huile jaune contenant plusieurs produits.
La chromatographie sur plaques épaisses de gel de silice 7731 avec éluant THF/Ep = 2/3, permet d'isoler deux produits:
- en tête: composé 6, complexe a, 270 mg, rendement 32~o, solide jaune. La cristallisation dans E/Ep donne des cristaux jaunes, F 130Q.
2 o RMN (CD3COCD3) cycle ~ = 6,08 d (1), 5,40 dd (1), 5,34 d (1); CH3 - 0,67 s (3); OCH2 ~ - 4,0 t (2). [a]21 = 41,7 (C~2C12, C = 1,08). Masse: 466 = M+, 382 = M+ - 3 CO, 330 = M+ -Cr(C0)3-Analyse: C24H30O6Cr Trouvé: C 61,30; H 6,68 Calculé: C 61,79; EI 6,48;
:~34C~37 - en queue: composé 7, complexe ~, 210 mg, rende-ment 25%, solide jaune. La cristallisation dans E/Ep donne des cristaux jaunes, F 157Q.
RMN (CD3COCD3) cycle ~ = 6,00 d (1), 5,31 d (1), 5.23 dd (1); CH3 = 0,78 s (3), OCH2 ~ = 4,04 t (2) [~]21 = 70,0 (CH2C12, C = 1.08). Masse: 466 = M+, 382 = M+ - 3 CO, 330 = M+ -Cr~C0)3.
Analyse: C24H30O6Cr Trouvé: C 61,84; H 6,60 Calculé: C 61,79; H 6,48.
OH
H(CH2)3)~6--: Cr(CO)~ en ~
cr(co)3 7: Cr(C0~3 en 13 n~ i~o2~co!6 Sous atmosphère d'argon, on ajoute doucement 0,6 g d'éthynyl oestradiol (2.10-3 mole) dissous dans 20 ml d'éther anhydre dans une solution de 1,05 g de C02~CO)8 (3.10-3 mole) dans 10 ml d'ether. On laisse la réaction se poursuivre pendant 1 heure, puis on filtre et évapore le solvant. Le brut obtenu est purifié sur colonne de gel de silice Merck(~ 8395 avec éluant J t.b~.
3403~7 E/Ep: 1/1. On obtient ~lnalement 1 g de produit des :ré, sol;de rouge sang. Il est d;fficile de donner un point de fusion exact à
cause de la décomposition du produit RMN (CDCl3) cycle ~ = 6.63 d (1), 6.70 dd (1), 7,23 d (1); 3 -OH~ ~6,21 s(l);CH3~ = 1,1(3).
Analys~: C2~5H24C2n8-Trouvé: C 53,80; H4,61; (:O 19 70 Calculé: C 53,62; H 4,15; CO 20,24.
C XCH
CO--Co--Co--CO
~0~ CO CO lo co (8) HO
Préparation du dérivé 6-hydroxyméthyl du 3-benzyloxy 17~ t.butyl-diméthylsiloxy oestradiol chrome tricarbonyle.
Le schéma ci-après résume la synthèse du composé
en cause.
~23403'7 OH
~~ R - PhCH3 HO/W R' = t.Bu~![e2Si Cr(CO)~
OH / OH
~o '`A ~ol~
Cr(C0)3 l.NaH, RBr l.NaH, RBr 2.N~H, R'Cl 2.N~H, R'Cl OR ' / OR ' RO~ RO
Cr(C0)3 (Me 2si)2 NNa (Me 2si)2 NNa . , CH20 ~ , CH20 ~iL23~)3~7 OR' OR' RO ~ RO)~
Cr(C0)3 H `CH20H
Schéma~
L'oestradiol est complexé par chauffage avec CI(CO)6 dans l'éther dibutylique.
Le mélange des deux dérivés Cr CO3 oestradiol c~ et 13 est traité rapidement avec NaH et C6 H~ CH2 Br.
Les deux dérivés 3' benzyloxy sont séparés sur une colonne de silicagel (éluant: éther/ether de pétrole: 2/1).
- Chaque diastéréomère est traité avec NaH et t.Bu Me2 SiCl pour lO donner les produits 4 et 5 avec un rendement de 45%.
L'iden~ification des diastéréomères est effectuée par corrélation chimique avec un composé de type correspondant dont la structure a été déterminée par analyse aux rayons X.
Les diastéréomères 14 et 15 sont mis en réaction séparément avec (Me3Si)2NNa et le formaldéhyde dans le OM~O.
On obtient ainsi stéréospécifiquement les complexes 16 et 17 avec un rendement de 56%, pour le complexe 16 et avec un rendement de 62% pour le complexe 17.
Ces complexes peuvent être des précurseurs inté-2 o ressants dans l'étude et la solution des problèmes endocrino-logiques, par exemple dans la fixation des groupes cytotoxiques, ;1~
234~37 la préparation d'oestrogene éme~tant des a et des marqueurs d'af~mité.
Mise en évidence des récepteurs honnonaux à
l'aide des composés des composés selon l'invention Dif:~érents composés selon la présente invention ont été testés pour leur pouvoir compéti~eur vis-à-vis de l'oestradiol, grâce à des courbes Log/log it, comme décrit dans Rao et al.
Endocrinology, 92, 1229 (1973).
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau I
ci-après:
Tableau I
CQmposé RBA (%) Oestradiol 100 éthynyloestradiol 7 1,4 2 1,0 3 0,3~
~234(~3 RMN (CDC13) cycle ô = 5,93 d (1), 5,24 dd (1), 5,11 d (1); Me ô =
0,78 s; Me2 ~ ~ 0,25 s; t.Bu ô = 0,~3 s.
OH
exe t.BuMe 2SiO
,Cr~
CO I CS
CO
a) Dé~vé pro~nol éther de l'oestradiol On chauffe à reflux pendant lS heures 1,08 g d'oestradiol (4.10-3 mole) avec 320 mg de soude (8.10-3 mole) dissous dans 50 cm3 d'acétone, puis 1,4 g de bromopropanol (10-2 mole) est ensuite ajouté et le chauffage est maintenu 10 pendant 2 jou:rs.
Après fil~ation et evaporation, le résidu obtenu est redissous dans CH2Clz. La solution obtenue est d'abord lavée à
l'eau jusqu'à pH neutre, puis séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. On a alors un solide blanc ~que l'on lave au pentane.
On obtient finalement une masse de 1,3 g.
La chromatogr~phie sur couche mince (éluant E/E~p =
2/1) révèle que le produit est pur (Rendement: 100%).
La recristallisation dans l'éther donne des cristaux blancs, Y 168Q, 900 mg.
'!~"
3~03'7 RMN (CI)3COCD3) cycle ~ = 7,31 d (l), 6,83 dd (1), 6,74 d (1); CH3 ~= 0,83 s (3); (:)CH2 ~ = 4,14 t ~2).
Analyse: C21H303 Trouvé: C 76,05; H 9,17 Calculé: C 76,32; H 9,1~.
Masse: M+/C = 330,2197 [~]21 = 70,6 (CH2Cl2, C = 0,51.
b) Complexation du dénvé propanoléther de l oestradiol Dans un ballon de 250 ml, on met 600 mg du composé
plécédant (1,8.10-3 mole), 1,1 g de Cr(CO)6 (5.10-3 mole) et 150 10 cm3 d'éther dibutylique. On chau~fe à reflux le mélange pendant 6 heures. La solution devient jaune limpide.
Après évaporation, on obtient 1,24 g d'huile jaune contenant plusieurs produits.
La chromatographie sur plaques épaisses de gel de silice 7731 avec éluant THF/Ep = 2/3, permet d'isoler deux produits:
- en tête: composé 6, complexe a, 270 mg, rendement 32~o, solide jaune. La cristallisation dans E/Ep donne des cristaux jaunes, F 130Q.
2 o RMN (CD3COCD3) cycle ~ = 6,08 d (1), 5,40 dd (1), 5,34 d (1); CH3 - 0,67 s (3); OCH2 ~ - 4,0 t (2). [a]21 = 41,7 (C~2C12, C = 1,08). Masse: 466 = M+, 382 = M+ - 3 CO, 330 = M+ -Cr(C0)3-Analyse: C24H30O6Cr Trouvé: C 61,30; H 6,68 Calculé: C 61,79; EI 6,48;
:~34C~37 - en queue: composé 7, complexe ~, 210 mg, rende-ment 25%, solide jaune. La cristallisation dans E/Ep donne des cristaux jaunes, F 157Q.
RMN (CD3COCD3) cycle ~ = 6,00 d (1), 5,31 d (1), 5.23 dd (1); CH3 = 0,78 s (3), OCH2 ~ = 4,04 t (2) [~]21 = 70,0 (CH2C12, C = 1.08). Masse: 466 = M+, 382 = M+ - 3 CO, 330 = M+ -Cr~C0)3.
Analyse: C24H30O6Cr Trouvé: C 61,84; H 6,60 Calculé: C 61,79; H 6,48.
OH
H(CH2)3)~6--: Cr(CO)~ en ~
cr(co)3 7: Cr(C0~3 en 13 n~ i~o2~co!6 Sous atmosphère d'argon, on ajoute doucement 0,6 g d'éthynyl oestradiol (2.10-3 mole) dissous dans 20 ml d'éther anhydre dans une solution de 1,05 g de C02~CO)8 (3.10-3 mole) dans 10 ml d'ether. On laisse la réaction se poursuivre pendant 1 heure, puis on filtre et évapore le solvant. Le brut obtenu est purifié sur colonne de gel de silice Merck(~ 8395 avec éluant J t.b~.
3403~7 E/Ep: 1/1. On obtient ~lnalement 1 g de produit des :ré, sol;de rouge sang. Il est d;fficile de donner un point de fusion exact à
cause de la décomposition du produit RMN (CDCl3) cycle ~ = 6.63 d (1), 6.70 dd (1), 7,23 d (1); 3 -OH~ ~6,21 s(l);CH3~ = 1,1(3).
Analys~: C2~5H24C2n8-Trouvé: C 53,80; H4,61; (:O 19 70 Calculé: C 53,62; H 4,15; CO 20,24.
C XCH
CO--Co--Co--CO
~0~ CO CO lo co (8) HO
Préparation du dérivé 6-hydroxyméthyl du 3-benzyloxy 17~ t.butyl-diméthylsiloxy oestradiol chrome tricarbonyle.
Le schéma ci-après résume la synthèse du composé
en cause.
~23403'7 OH
~~ R - PhCH3 HO/W R' = t.Bu~![e2Si Cr(CO)~
OH / OH
~o '`A ~ol~
Cr(C0)3 l.NaH, RBr l.NaH, RBr 2.N~H, R'Cl 2.N~H, R'Cl OR ' / OR ' RO~ RO
Cr(C0)3 (Me 2si)2 NNa (Me 2si)2 NNa . , CH20 ~ , CH20 ~iL23~)3~7 OR' OR' RO ~ RO)~
Cr(C0)3 H `CH20H
Schéma~
L'oestradiol est complexé par chauffage avec CI(CO)6 dans l'éther dibutylique.
Le mélange des deux dérivés Cr CO3 oestradiol c~ et 13 est traité rapidement avec NaH et C6 H~ CH2 Br.
Les deux dérivés 3' benzyloxy sont séparés sur une colonne de silicagel (éluant: éther/ether de pétrole: 2/1).
- Chaque diastéréomère est traité avec NaH et t.Bu Me2 SiCl pour lO donner les produits 4 et 5 avec un rendement de 45%.
L'iden~ification des diastéréomères est effectuée par corrélation chimique avec un composé de type correspondant dont la structure a été déterminée par analyse aux rayons X.
Les diastéréomères 14 et 15 sont mis en réaction séparément avec (Me3Si)2NNa et le formaldéhyde dans le OM~O.
On obtient ainsi stéréospécifiquement les complexes 16 et 17 avec un rendement de 56%, pour le complexe 16 et avec un rendement de 62% pour le complexe 17.
Ces complexes peuvent être des précurseurs inté-2 o ressants dans l'étude et la solution des problèmes endocrino-logiques, par exemple dans la fixation des groupes cytotoxiques, ;1~
234~37 la préparation d'oestrogene éme~tant des a et des marqueurs d'af~mité.
Mise en évidence des récepteurs honnonaux à
l'aide des composés des composés selon l'invention Dif:~érents composés selon la présente invention ont été testés pour leur pouvoir compéti~eur vis-à-vis de l'oestradiol, grâce à des courbes Log/log it, comme décrit dans Rao et al.
Endocrinology, 92, 1229 (1973).
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau I
ci-après:
Tableau I
CQmposé RBA (%) Oestradiol 100 éthynyloestradiol 7 1,4 2 1,0 3 0,3~
4' aucune compétition 2 o 4" aucune competition 1,5 1,2 8 3,5 :~239~)3'7 ~ 9 Il faut rappeler que, plus la valeur de RBA ("Relative Binding Affinity") s'éloigne de 100, plus le pouvoir compétiteur du stéroide testé est faible. Afin de fixer les idées, notons qu'un médicament aussi utilisé que le tamoxifène (Novaldex(~)) présente un RBA de 3%.
On constate à la lecture de ce tableau que, le tnar-quage par une entité organométallique dirr~inue le pouvoir compétiteur de l~hormone ainsi modifiée.
Cependant, les composés selon l'invention présentent, l0 sauf pour le composé 3, une préservation du pouvoir de reconnaissance du récepteur tout à fait compatible avec une utilisation de ces produits à des fins analytiques.
Ces complexes de l'invention sont stables à l'état solide et peuvent etre conservés en milieu non-oxydant sans problème.
Toutefois, la présence d'une fonction hydroxy phéno-lique adjacente d'un groupement organométallique est incompa-tible avec la stabilité du produit, qui se décompose rapidement.
A ce propos, il convient de noter qu'1m composé du type de ceux 20 de l'invention a été décrit par G. Pouskouleli, I.S. Butler et J.P.
Hickey, J. Inorg. Nucl. Chem., 42, 1659-1662 (19~0), mais il s'agit précisément d'un composé ayant une fonction phénol adjacente du site de fixation du composé organométallique, ce qui rend ce composé instable.
Ce tableau montre que la préservation des fonctions hydroxylées en 3 ou en 17 dans ces produits est nécessaire pour obtenir un bon taux de compétitivité, à titre d'exemple, les com-3~3~7 posés 4' et 4" ne présentent aucune compétition, il est nécessairede trouver des solutions concillant les deux impératifs précédents.
Comme cela ressort du tableau, il est d'abord possible d'effectuer la complexation loin du groupement hydroxy phénolique, par exemple en 17 a comme dans le composé 8.
Il est possible également de protéger le groupement en position 3 par ethérification, comme dans les composés 2 et 3, par exemple, tout en conservant la fonction hydroxy en 17 libre.
Enfin, il est possible en quelque sorte "d'eloigner" la fonction hydroxy libre en position 3 en greffant dans cette position un radical hydroxy-alcoxy, comme dans les produits 6 et 7.
Le résultat le plus spectaculaire est fourni par le produit 6 (RBA 28%) dans lequel la greffe d'une chaîne (CH2)3OH
en 3 associée à une complexation de la face a à l'aide du groupe Cr(CO)3 offre une solution excellente au problème.
Détection de récepteur spécifique d'oestradiol 2 o Les échantillons utilisés dans cet exemple ont été
prépares à partir de cytosols utérins de brebis partiellement purifiés par précipitation au sulfate d'ammonium à 35%9 pro-cédé qui présente le double avantage d'atténuer l'absorbance parasite dans la région spectrale à étudier et d'éliminer la majo-rité des associations protéiniques non liantes avec l'hormone.
(J. Katznellenbogen et al., Cytotoxic estrogens in Hormone .
- .~;234~3 ~1 Receptive Tumors, Acad. Press. London (1980) p. 3-38).
Pour la préparation des échantillons destinés à l'étude I.R., on a utilisé la technique de précipitation au sulfate de protamine (A.W. Steggles et R.J.B. King, J. Biochem. 118, 695-701 (1970)) qui fournit une poudre blanche utilisable sans au~e traitement.
Les figures ci-annexées permettent de comprendre les applications des composés selon l'invention.
Figure 1 Spectre I.R. des protéines présentes dans le cytosol de brebis purifiées et traitées comme précisé précédemment. Il y a lieu de noter la remarquable "fenê~e" dans la région de 1950 cm~l et la faible absorbance ~i cet endroit. Le reste de la région spectrale se caractérise par la présence de massifs d'ab-sorption (maxima hors échelle dans le cas présent pour plus de clarté). Le spectre comme les suivants a été obtenu à l'aide d'un appareil I.R. F.T. Nicolet~) 6000c, l'echantillon solide pesé
et pressé est simplement porté par des "micropellets". Si la protéine réceptrice de l'oestradiol est présente dans l'échan-2û tillon étudié seul un ligand marqué résonnant de façon intense et spéci~lque vers 1900 cm~l en permettra la détection.
Figure 2 Spectre l.R. de l'honnone modifiée 2 en solution. On note les deux bandes intenses ~ CO de modes Al et E respecti-vement à 19S9,6 em~l et 1876,4 cm~l. Ce produi~, à taux de compétition moyen, a été utilisé dans la suite de l'expérience ~23~037 relatée ici.
Figure 3 Même échantillon que celui de la figure 1, mais traité
par l'hormone 2. On note les deux pics au-dessous de 2000 cm~1. Cette région a été élargie dans un souci de clarté. Il faut noter qu'il y a donc bien du récepteur de l'oestradiol dans le mélange des protéines étudiées et que celui-ci est détectable par I.R. à l'aide d'hormones modifiées. En raison des concentrations en récepteur, on n'attend pas, à ce niveau, une manifestation 10 plus intense de sa présence.
Fi~ure 4 Même échantillon que celui de la figure 3 obtenu après soustraction du "blanc" (figure 1). Le résultat est suffisamment spectaculaire (comparer avec l'hormone en solution: figure 2) pour se passer de commentaire.
Il faut ajouter que l'on a détecté ici 51 fentomoles de récepteur par mg de protéine, ce qui représente un taux tou~ à
fait usuel en cancérologie. Au dessous de 10 fm/mg de protéine le dosage est considéré comme ER- (seuil de prise en considé-20 ration). Tandis qu0 des taux dépassant 100 fm/mg de protéinesont fréquents. On est donc avec cette technique dans la gamme des sensibilités requises pour ces analyses ~mes.
Pour fixer les idées, notons que l'on a décelé ici 10-1 g de métal sans problème (la limite n'a pas été précisée) alors que par absorption atomique on n'arrive pas en dessous de 10-6 g de métal avec des précautions draconiennes. De plus, la mor-phologie typique de la courbe (caractéristique d'lme symétrie l;
~23~37 C3V ; le léger "splitting" est dû au spectre du solide) constitue une mesure de protection contre les artefacts éventuels. En~in la présence de chrome dans l'~chan-tillon a été confirm~e grace ~ des expérience indépen-dantes d'ac~ivation de neutron.
Cette demande est une divisionnaire de la ;~ demande d8posée le 22 septembre, 1983 et portant le num~ro de serie 437,375.
, ~,
On constate à la lecture de ce tableau que, le tnar-quage par une entité organométallique dirr~inue le pouvoir compétiteur de l~hormone ainsi modifiée.
Cependant, les composés selon l'invention présentent, l0 sauf pour le composé 3, une préservation du pouvoir de reconnaissance du récepteur tout à fait compatible avec une utilisation de ces produits à des fins analytiques.
Ces complexes de l'invention sont stables à l'état solide et peuvent etre conservés en milieu non-oxydant sans problème.
Toutefois, la présence d'une fonction hydroxy phéno-lique adjacente d'un groupement organométallique est incompa-tible avec la stabilité du produit, qui se décompose rapidement.
A ce propos, il convient de noter qu'1m composé du type de ceux 20 de l'invention a été décrit par G. Pouskouleli, I.S. Butler et J.P.
Hickey, J. Inorg. Nucl. Chem., 42, 1659-1662 (19~0), mais il s'agit précisément d'un composé ayant une fonction phénol adjacente du site de fixation du composé organométallique, ce qui rend ce composé instable.
Ce tableau montre que la préservation des fonctions hydroxylées en 3 ou en 17 dans ces produits est nécessaire pour obtenir un bon taux de compétitivité, à titre d'exemple, les com-3~3~7 posés 4' et 4" ne présentent aucune compétition, il est nécessairede trouver des solutions concillant les deux impératifs précédents.
Comme cela ressort du tableau, il est d'abord possible d'effectuer la complexation loin du groupement hydroxy phénolique, par exemple en 17 a comme dans le composé 8.
Il est possible également de protéger le groupement en position 3 par ethérification, comme dans les composés 2 et 3, par exemple, tout en conservant la fonction hydroxy en 17 libre.
Enfin, il est possible en quelque sorte "d'eloigner" la fonction hydroxy libre en position 3 en greffant dans cette position un radical hydroxy-alcoxy, comme dans les produits 6 et 7.
Le résultat le plus spectaculaire est fourni par le produit 6 (RBA 28%) dans lequel la greffe d'une chaîne (CH2)3OH
en 3 associée à une complexation de la face a à l'aide du groupe Cr(CO)3 offre une solution excellente au problème.
Détection de récepteur spécifique d'oestradiol 2 o Les échantillons utilisés dans cet exemple ont été
prépares à partir de cytosols utérins de brebis partiellement purifiés par précipitation au sulfate d'ammonium à 35%9 pro-cédé qui présente le double avantage d'atténuer l'absorbance parasite dans la région spectrale à étudier et d'éliminer la majo-rité des associations protéiniques non liantes avec l'hormone.
(J. Katznellenbogen et al., Cytotoxic estrogens in Hormone .
- .~;234~3 ~1 Receptive Tumors, Acad. Press. London (1980) p. 3-38).
Pour la préparation des échantillons destinés à l'étude I.R., on a utilisé la technique de précipitation au sulfate de protamine (A.W. Steggles et R.J.B. King, J. Biochem. 118, 695-701 (1970)) qui fournit une poudre blanche utilisable sans au~e traitement.
Les figures ci-annexées permettent de comprendre les applications des composés selon l'invention.
Figure 1 Spectre I.R. des protéines présentes dans le cytosol de brebis purifiées et traitées comme précisé précédemment. Il y a lieu de noter la remarquable "fenê~e" dans la région de 1950 cm~l et la faible absorbance ~i cet endroit. Le reste de la région spectrale se caractérise par la présence de massifs d'ab-sorption (maxima hors échelle dans le cas présent pour plus de clarté). Le spectre comme les suivants a été obtenu à l'aide d'un appareil I.R. F.T. Nicolet~) 6000c, l'echantillon solide pesé
et pressé est simplement porté par des "micropellets". Si la protéine réceptrice de l'oestradiol est présente dans l'échan-2û tillon étudié seul un ligand marqué résonnant de façon intense et spéci~lque vers 1900 cm~l en permettra la détection.
Figure 2 Spectre l.R. de l'honnone modifiée 2 en solution. On note les deux bandes intenses ~ CO de modes Al et E respecti-vement à 19S9,6 em~l et 1876,4 cm~l. Ce produi~, à taux de compétition moyen, a été utilisé dans la suite de l'expérience ~23~037 relatée ici.
Figure 3 Même échantillon que celui de la figure 1, mais traité
par l'hormone 2. On note les deux pics au-dessous de 2000 cm~1. Cette région a été élargie dans un souci de clarté. Il faut noter qu'il y a donc bien du récepteur de l'oestradiol dans le mélange des protéines étudiées et que celui-ci est détectable par I.R. à l'aide d'hormones modifiées. En raison des concentrations en récepteur, on n'attend pas, à ce niveau, une manifestation 10 plus intense de sa présence.
Fi~ure 4 Même échantillon que celui de la figure 3 obtenu après soustraction du "blanc" (figure 1). Le résultat est suffisamment spectaculaire (comparer avec l'hormone en solution: figure 2) pour se passer de commentaire.
Il faut ajouter que l'on a détecté ici 51 fentomoles de récepteur par mg de protéine, ce qui représente un taux tou~ à
fait usuel en cancérologie. Au dessous de 10 fm/mg de protéine le dosage est considéré comme ER- (seuil de prise en considé-20 ration). Tandis qu0 des taux dépassant 100 fm/mg de protéinesont fréquents. On est donc avec cette technique dans la gamme des sensibilités requises pour ces analyses ~mes.
Pour fixer les idées, notons que l'on a décelé ici 10-1 g de métal sans problème (la limite n'a pas été précisée) alors que par absorption atomique on n'arrive pas en dessous de 10-6 g de métal avec des précautions draconiennes. De plus, la mor-phologie typique de la courbe (caractéristique d'lme symétrie l;
~23~37 C3V ; le léger "splitting" est dû au spectre du solide) constitue une mesure de protection contre les artefacts éventuels. En~in la présence de chrome dans l'~chan-tillon a été confirm~e grace ~ des expérience indépen-dantes d'ac~ivation de neutron.
Cette demande est une divisionnaire de la ;~ demande d8posée le 22 septembre, 1983 et portant le num~ro de serie 437,375.
, ~,
Claims (11)
1. Procédé pour la détection de récepteurs hormonaux comprenant:
(1) la mise en présence d'échantillons porteurs de récepteurs spécifiques avec un complexe d'oes-trogène, caractérisé en ce qu'il est constitué
d'un oestrogène ou d'un dérivé d'oestrogène complexé par un composé organométallique com-portant au moins un ligand carbonyle libre, ledit complexe d'oestrogène comportant au moins un radical hydroxy libre et aucun radi-cal hydroxy phénolique libre en .alpha. du site de fixation du composé organométallique; et (2) la détection dudit composé attaché à son récepteur par spectographie par leur bande de fréquence au voisinage de 1860 à 2000 cm-1.
(1) la mise en présence d'échantillons porteurs de récepteurs spécifiques avec un complexe d'oes-trogène, caractérisé en ce qu'il est constitué
d'un oestrogène ou d'un dérivé d'oestrogène complexé par un composé organométallique com-portant au moins un ligand carbonyle libre, ledit complexe d'oestrogène comportant au moins un radical hydroxy libre et aucun radi-cal hydroxy phénolique libre en .alpha. du site de fixation du composé organométallique; et (2) la détection dudit composé attaché à son récepteur par spectographie par leur bande de fréquence au voisinage de 1860 à 2000 cm-1.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le type de spectographie est la spectographie infrarouge ou la spectographie Raman.
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène est caractérisé en ce que l'oestrogène est choisi parmi l'oestradiol, l'oes-trone, le 16.alpha.-hydroxyestrone, l'oestriol, l'éthynyl-oestradiol, le diéthylstillboestrol, l'hexoestrol, ainsi que leurs dérivés.
4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène est caractérisé en ce que les dérivés des oestrogènes stéroïdiques sont des éthers en position 3 ou 17 et/ou des dérivés hydroxy-alcoxy en position 3.
5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène est caractérisé en ce que les composés organométalliques sont des composés des métaux des groupes VIa, VIIa et VIII de la Classifi-cation Périodique.
6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène est caractérisé en ce que les composés organométalliques sont des composés d'un ou plusieurs métaux choisis parmi le chrome, le molybdène, le tungstène, le manganèse, le cobalt et le nickel, le technétium et le rhénium.
7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène est caractérisé en ce que les ligands des métaux des composés organométalli-ques sont choisis parmi : CO, CS, CSe, CNR1, P(R2,R3,R4), cyclopentadiényl, R1 étant un radical alkyle ou -COR5, R2, R3, R4 et R5 étant choisis parmi les radicaux phényle ou phénoxy substitue ou non substitué et les radicaux alkyle ou alcoxy substitué ou non substitué et les atomes d'halogène, R5 pouvant être -N(CH2CH2Cl)2.
8. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène est caractérisé en ce que les composés organométalliques sont choisis parmi :
Cr(CO)3, Cr(CO)2CS, Cr(CO)2CSe, et CO2(CO)6.
Cr(CO)3, Cr(CO)2CS, Cr(CO)2CSe, et CO2(CO)6.
9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène a la formule:
dans laquelle R est un radical protecteur ou un groupe-ment hydroxyalcoxy et X est un greffon organométallique.
dans laquelle R est un radical protecteur ou un groupe-ment hydroxyalcoxy et X est un greffon organométallique.
10. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le complexe d'oestrogène a la formule:
dans laquelle R et R' sont des radicaux protecteurs ou un groupement hydroxyalcoxy et X est un greffon organo-métallique et R" est un radical hydroxylé.
dans laquelle R et R' sont des radicaux protecteurs ou un groupement hydroxyalcoxy et X est un greffon organo-métallique et R" est un radical hydroxylé.
11. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce X est le radical Cr(CO)3, Cr(CO)2CS, Cr(CO)2CSe et R est le radical HO(CH2)n-, n étant compris entre 1 et 7.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CA000532680A CA1234037A (fr) | 1982-09-23 | 1987-03-20 | Complexes organometalliques d'oestrogenes et leur application au dosage des recepteurs hormonaux |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8216024A FR2533570B1 (fr) | 1982-09-23 | 1982-09-23 | Complexes organometalliques d'oestrogenes et leur application au dosage des recepteurs hormonaux |
| FR8216024 | 1982-09-23 | ||
| CA000437375A CA1220469A (fr) | 1982-09-23 | 1983-09-22 | Complexes organometalliques d'oestrogenes et leur application au dosage des recepteurs hormonaux |
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Family Applications (1)
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1987
- 1987-03-20 CA CA000532680A patent/CA1234037A/fr not_active Expired
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