WO1987007912A1 - Procede pour le depistage, chez les individus seropositifs des sequences d'adn du retrovirus htlv iii-lav et coffret pour sa mise en oeuvre - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Definitions
- the present invention relates generally to a process for revealing the DNA sequences of the HTLV III-LAV retrovirus at the level of the DNA of the T4 .lymphocytes, by a particular use of the conventional technique of molecular hybridization. Such a method can be applied to the on-line detection of the corresponding sequences in HIV-positive individuals.
- the method according to the invention makes it possible to prove the direct presence (or absence) of the virus - in free form or its conforma ions - in the genome of T4 lymphocytes and of the corresponding individuals.
- the invention also relates to a box allowing the implementation of the method, in ques t ion.
- HTLV III-LAV r trovirus is an RNA virus, it has already been established (HIRSCH M. S. And KAPLAN JC (1985) Prospects of therapy for infec ⁇ tions wi th human T- 1 ymphot rop ic virus Type III Annal s of Internai Med ic i ne, 103, 750-755) that at the moment of its integration in the T4 lymphocyte it passes, thanks to its reverse transcriptase enzyme, to the state of single DNA, then double -strand (we do not know
- the idea which is the basis of the present invention is to use the general technique of molecular hybridization in seropositive individuals, by adapting it. to make it safe to use for practical purposes.
- there is no additional method for authenticating the presence of the virus itself in such seropositive individuals Admittedly, one can think of using usual culture techniques, but these tests are too long and too expensive and, moreover, in the case of the HTLV III-LAV virus, they are random.
- the object of the invention is to respond to the aforementioned practical needs, by proposing a screening method in HIV-positive individuals, the results of which are obviously of extreme importance in deciding on the development of such individuals. towards disease.
- the invention therefore relates to a method for screening, in HIV-positive individuals, DNA sequences of the HTLV III-LAV r trovirus, method in which a general molecular hybridization technique is applied comprising the following steps: a) the blood of the individuals examined is drawn to isolate the white cells in a known manner and to obtain DNA 1 ymphocyta i re, which is used in a unit quantity equal to at least 30 A / g. b) treating said quantity of lymphocyte DNA with a restriction enzyme which does not cut within the DNA sequence of the virus, c) passing the medium from step b) which contains the virus in free or integrated form, on a ni trocel 1 ulose filter capable of retaining up to 80 g of DNA per cm of surface.
- the product retained by the filter is brought into contact with a probe, which is a cloned probe, and marked with the HTLV III-LAV virus, said probe being a subcloned fragment of the DNA of the virus which does not carry the coding part for the envelope region of the virus, the labeling being capable of giving an activity as close as possible of the value of 5.10 cpm per ,. g of probe DNA, in particular an activity of 5.10 8 to 2.10 9 cpm // * / g of DNA.
- the presence of characteristic bands of the virus is revealed in a known manner.
- the molecular hybridization technique is known to those skilled in the art and it is therefore not necessary to describe it in detail.
- the peripheral blood is taken from the individuals examined and the white cells are isolated in a known manner. After digestion with an appropriate enzyme, such as Xba I, the lymphocyte DNA is obtained.
- This unit quantity is at least equal to 30 ⁇ g of DNA. In practice, ranges from 30 to 50 g can be used. Values less than ⁇ ⁇ ⁇ / g do not provide a sufficiently reliable response. By the way, beyond 80 / g, it is necessary to draw excessively large quantities of blood; in addition we arrive at the limit of use of the filter of step c).
- Unit quantities of lymphocyte DNA included between 30 and 50 ⁇ / g can be easily obtained from about 10 million ions of white cells from the blood of the individuals examined. As is usual in this technique, these unit quantities are deposited in respective wells of gel, for example of agarose gel.
- step b) of the process of the invention the abovementioned quantity of DNA 1 ymphocyta i re is treated with a restriction enzyme chosen in such a way that it does not normally have a recognition site inside the DNA sequence of the virus This has the effect of concentrating the signal finally obtained into a small number of large autoradiographed bands, corresponding to the free virus and to its various conforma ions.
- a restriction enzyme chosen in such a way that it does not normally have a recognition site inside the DNA sequence of the virus
- step c) of the process of the invention a ni t rocel lulose filter of great sensitivity is used, presenting, per cm of surface, the highest possible load. The characteristics of this filter are compatible with the unitary quantities of DNA 1 ymphocyta i re used in step a).
- the filter is capable of retaining at least 30 ⁇ ⁇ g of DNA and preferably up to 80 / ⁇ g of DNA per cm 2 of surface.
- Millipore filters or better still the Sartorius Schleicher & Schull BA85 filter can be used. In this last In this case, preliminary experiments using DNA from the H9v3 culture as a test have shown that up to 0.1 ⁇ g of DNA from the cloned probe deposited was detectable by the technique described here, this amounts to saying that approximately 10 DNA molecules are well dé ⁇ nizable or in an infected cell theory of '500.
- a probe which is a subclone fragment of the DNA of the virus, which does not include the coding part for the enveloped region, variable, by nature, in the different isolates.
- a probe constituted by the fragment Sst 1-5 'of BH-10, which corresponds only to the 5' end and to the middle part of the genome.
- Such probes are known to those skilled in the art.
- the marking must be capable of providing a very high specific activity, as close as possible as the value of 5.10 cpm per / g of probe DNA, preferably an activity of
- FIG. 1 of the appended drawing represents the radiographed bands obtained in the case (1) of an HIV-positive individual> O, (2) in that of an HIV-positive individual / O, and of the H9v3 culture; in the latter case, the brace represents multiple integration sites.
- FIG. 1 which represents three channels of migration of the gel illustrates the signals observable on the autoradiogram, which materialize the results of the process of the invention.
- the H9v3 line there is a weak signal in the region of high molecular weight DNA which does not penetrate well into the gel wells; the main part of the signal is represented by a spot spread by weight (this spot is intense, since each cell of the culture comprises of the order of 50 to 100 viral particles); this spreading comes from the fact that the integration of the virus at the level of human DNA takes place in a polyclonal manner (there are multiple sites of insertion). In the case of channel l, this concerns an individual who is positive for the signal.
- the samples are simultaneously deposited on the gel, some being undigested and the others digested with the enzyme such as Xbal. Typical results obtained are shown in FIGS. 2 and 3.
- FIG. 2 which is similar to FIG. 1, but includes in duplicate, the undigested samples and the digested samples, that the signal obtained corresponds respectively to giant fragments, to a fragment integrated into 13 kb and a free fragment at 9 kb.
- the signal obtained corresponds respectively to giant fragments, to a fragment integrated into 13 kb and a free fragment at 9 kb.
- FIG. 3 illustrates the influence of the duration of exposure for the characteristic bands at 13 and 9 kb, respectively at 10 days and 1 month.
- Tg the measurement being made at the time of the sample and constituting a presumption that the subject is seropos i t i f.
- HBS / HBC antigens signifies the presence or absence of the antigens corresponding to the viral hepatitis.
- the subject of the invention is also a box or kit, containing the ingredients necessary for carrying out the process.
- the unit quantities of these ingredients will depend on the number of samples which it is intended to process.
- the box according to the invention essentially comprises:
- an HTLV III-LAV probe for example the probe corresponding to the ⁇ BH-5 subclone, excised from phage A,
- the products that can be used are, for example, those put on the market by the company Amersham France, Avenue du Canada 91944 Les Ulis France such as: - cold kit N55CO (nick-1rans 1at ion buffer and enzymes)
- a cold variant of marking for example marking by basic sulfonation currently marketed by the company Organics, 12 Avenue du Arthur Salvador Allende 94402 Vi try-sur-Se ine, France
- EXEM P LE 20 ml of whole blood are taken from EDTA at..5% in physiological water. The plasma is removed by vacuum suction after centr i fugat ion for 5 minutes at 1500 rpm. The lysis of the red blood cells is obtained by adding to the fresh pellet 50 ml of SLR buffer (Tris ÎO rrM, MgCl 2 , 5r ⁇ M, NaCl 10 rrM); homogenization is obtained until a lacquered appearance, then a centr i fugat ion is carried out 5 to 10 minutes at 2000 rpm; the supernatant is then aspirated with the vacuum tube.
- SLR buffer Tris ÎO rrM, MgCl 2 , 5r ⁇ M, NaCl 10 rrM
- the proteinase K solution is prepared in the TE buffer (Tris-EDTA) at a final concentration of 0.2 mg / ml.
- the pellet obtained crosscé ⁇ ously is redissolved in 3 ml of buffer and SLR r 'edissous again in 20 ml of PES buffer (Tris IO RRM RRM 10 EDTA, 50mM NaCl RRM, 0.2% SDS) and proteinase K at .3 mg per tube; a viscous block is thus obtained which is homogenized and then stirred gently (45 to 50 rpm in an orbital water bath) overnight at 42 ° C.
- a first extraction is carried out in 3/4 of phenol / 1/4 of chloroform and 1/24 of isoamyl alcohol; the upper aqueous phase is removed with a pipette.
- a second extraction is then prepared in pheno 1 -ch loroform; the two phases then separate and the DNA is in the upper phase; the lower organic phase is eliminated with a syringe.
- a third extraction is finally carried out to remove the phenol with chloroform + isoamylic acid.
- the DNA is precipitated by adding 300 ⁇ l of 3M NaCl and supplementing with 50 ml of absolute ethanol at -20 ° C.
- the ethanol is removed with a pipette and the precipitated DNA recovered with an inverted pipette; rinsed several times with absolute ethanol.
- the DNA is resuspended in 2 to 4 ml of TE at 4 ° C for several days. It is dosed at DOogg "and e * control of the size is done by agarose minigel O, 7% and staining with ethidium bromide in the TEA buffer.
- the indicated quantity of DNA for each sample is digested by the restriction enzyme Xbal in excess of 5 units per fg of DNA.
- the restriction fragments are then spread on a 0.8% horizontal agarose gel.
- the transfer buffer is 10 ⁇ SSC, the transfer to the ni troce11ulose filter being carried out overnight. The filter is finally dried and the DNA is fixed in the oven at 80 ° C for 6 hours.
- the probe used is the probe constituted by the Sst 1-5 'fragment of -BH-10. It is marked by nick-translat ion with dCTP + dATP at 8000 Cu / mole, or with dCTP alone.
- the filter is prehybridized at 65 ° C in an orbital water bath in a sealed plastic bag containing: 25 ml of buffer 5x SSC (1 hour), then 5x SSC, 10 x Denhardt (D), 0.1% SDS (1 hour ), then 5xSSC, 10xD, lmM EDTA and O, 1% SDS added with g / ml denatured and sonicated salmon sperm DNA (ss) (one nu it).
- the filters are washed in successive baths: (250 ml in a box at 66 ° C): 30 minutes in 5xSSC, lOxD, 0.1% SDS, 0.1% NaPPi, then 30 minutes in 3SSC, lOxD, 1% SDS, O, 1% NaPPI, then 15 minutes in 2xSSC, lxD, O, 1% SDS, O, 1% NaPPi and the time required (metering) in ISSC buffer, lxD, 0.1% SDS, 0.1% NaPPi.
- the filters are then dried under the lamp, fixed on Wathman 3Mv paper
- the autoradiograms are revealed for 5 minutes, rinsed with water, fixed for 5 minutes, washed and dried in the dryer.
- the size of the autoradiographed bands is calculated relative to that of the size scale represented by the Hind I I I fragments of phage A DNA.
- the invention thus provides a sensitive method capable of detecting in vivo and under the conditions of practical reality, the retrovirus HTLV III-LAV, which is known to be present in minute quantities in seropositive individuals.
- the retrovirus HTLV III-LAV which is known to be present in minute quantities in seropositive individuals.
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Abstract
Procédé basé sur la technique générale d'hybridation moléculaire, pour le dépistage, chez les individus séropositifs, des séquences d'ADN du rétrovirus HTLV III-LAV. Elle a également pour objet un coffret pour la mise en oeuvre du procédé. Application au dépistage du SIDA chez les individus séropositifs.
Description
Procédé pour le dépistage, chez les individus séropositifs des séquences d'ADN du retrovirus HTLV III-LAV et coffret pour sa mise en oeuvre.
La présente invention concerne d'une façon générale un procédé de révélation des séquences d'ADN du retrovirus HTLV III-LAV au niveau de 1 'ADN des .lymphocytes T4, par une util isation particulière de la technique classique d'hybridation moléculaire. Un tel procédé est appl icable à la détection en rou- t i ne des séquences correspondantes chez les indivi¬ dus séropositifs. Le procédé selon l' invention permet de prouver la présence (ou l'absence) directe du virus -sous forme libre ou ses conforma ions - dans le génome des lymphocytes T4 et des individus correspondants . L' invention a également pour objet un coffret permettant la mise en oeuvre du procédé , en ques t ion .
Des publications récentes ont étudié le retrovirus HTLV III-LAV et ont montré qu' il était responsable de la maladie du SIDA. A titre d'exemple de référence bibliographique pertinente dans ce do¬ maine, on peut citer l'article de SHAW, G.M. , HAHN B.H., A YA., S.K. GROOPMAN J.E., GALLO R.C. et VONG-STAAL, F. (1984) Molecular charac e r i zat ion of human ce 11 leukemia virus type III in the acquired immune deficiency syndrome, Se ience , 226 -1165-1171.
Bien que le r trovirus HTLV III-LAV soit un virus à ARN, il est déjà établi (HIRSCH M. S . et KAPLAN J.C. ( 1985) Prospects of therapy for infec¬ tions wi th human T- 1 ymphot rop ic virus Type III. Annal s of Internai Med ic i ne , 103, 750-755) qu'au mo¬ ment de son intégration dans le lymphocyte T4 il passe, grâce à son enzyme transcriptase inverse, à l'état d'ADN simple, puis double-brin (on ne sait
*f*
cependant encore pas de façon très précise s' il existe à ce niveau sous forme libre ou intégrée dans le génome de l'hôte.)
Il a déjà été suggéré de détecter la présence du virus à cet instant par la technique d'hybridation moléculaire ADN-ADN, beaucoup plus fa¬ cile à mettre en oeuvre que celle entre molécules d'ARN. Cependant, la vérification de la présence des séquences virales par cette technique ne peut pas être réalisée dans la pratique d'une manière suffi¬ samment sûre .11 a déjà été établi que des résultats positifs n'ont été déterminés que dans un très petit nombre de cas hautement particuliers : 1 cas sur 16 individus atteints de SIDA pour ce qui concerne la détection au niveau des cellules mononuclées du sang périphérique (SHAW G.M., HAHN B.H., GROOPMAN J.E., BRODER S., VvONG-STAAL F. et GALLO R.C.(1985) Molecular character iza ion of HTLV III DNA séquences in french tissue (abstract, Colloque Interna ional sur le SIDA Atlanta).
L' idée qui est à la base de la présente in¬ vention est d'utiliser la technique générale d'hybridation moléculaire chez les individus séropo¬ sitifs, en l ' adaptant . pour la rendre utilisable de manière sûre pour les besoins pratiques. On sait, en effet, que lorsqu'un individu a été en contact avec le virus, sans pour autant être atteint du SIDA, il devient séropositif et cet état comporte des risques car les études les plus récentes montrent qu' il peut y avoir alors une évolution lente et progressive vers la maladie proprement dite du SIDA. Pour les besoins de la prévention, il es donc hautement sou¬ haitable de disposer d'un procédé de diagnostic et de dépistage du virus HTLV III-LAV chez les indivi-
dus séropositifs. On dispose d jà de tests devenus classiques, permettant d'établir si un individu est, ou non, séropositif. Mais , à la connaissance du de¬ mandeur, il n'existe pas de procédé complémentaire permettant d'authentifier la présence du virus lui- même chez de tels individus séropositifs. Certes, on peut songer à util iser des techniques usuelles de culture, mais ces tests sont trop longs et trop coû¬ teux et, en outre, dans le cas du virus HTLV III-LAV, ils sont aléatoires.
L' invention a pour objet de répondre aux be¬ soins pratiques précités, en proposant un procédé de dépistage chez les individus séropositifs, dont les résultats sont de toute évidence d'une extrême im- portance pour se prononcer sur l'évolution de tels individus vers la maladie.
L' invention concerne donc un procédé pour le dépistage , chez les individus séropositifs, des sé¬ quences d'ADN du r trovirus HTLV III-LAV, procédé dans lequel on applique une technique générale d'hybridation moléculaire comprenant les étapes sui¬ vantes : a) on prélève le sang des individus examinés pour en isoler de manière connue les cellules blan- ches et obtenir de I 'ADN 1 ymphocyta i re , qui est uti¬ lisé en quantité unitaire égale à au moins 30 A/g . b)on traite ladite quantité d'ADN lymphocy- taire par une enzyme de restriction ne coupant pas à l ' intérieur de la séquence de l'ADN du virus, c)on fait passer le milieu de l'étape b) qui contient le virus sous forme libre ou intégrée, sur un filtre de ni trocel 1 ulose capable de retenir jusqu'à 80 g d'ADN par cm de surface. d)on met en contact le produit retenu par le filtre avec une sonde, qui est une sonde clonée et
marquée du virus HTLV III-LAV , ladite sonde étant un fragment sous-cloné de l'ADN du virus qui ne com¬ porte pas la partie codante pour la région enveloppe du virus, le marquage étant capable de donner une activité aussi proche que possible de la valeur de 5.10 cpm par,. g d'ADN de la sonde, notamment une activité de 5.108 à 2.109 cpm//*/ g d'ADN. e)on révèle de façon connue la présence de bandes caractéris iques du virus. La technique d'hybrida ion moléculaire est connue de l'homme du métier et il n'est donc pas né¬ cessaire de la décrire en détail. Dans le cas du retrovirus HTLV III-LAV, on peut se reporter à l'article de SHAW et al (1985) précédemment men- tionné . L'adaptation de cette technique aux besoins de la présente invention ressortira de la descrip¬ tion qui suit et de l'exemple pratique donné ci- après pour illustrer l' invention.
Dans la première étape du procédé, on prélève le sang périphérique des individus examinés et on en isole de manière connue les cellules blanches Après digestion avec une enzyme appropriée, telle que Xba I , on obtient l'ADN lymphocy a i re . Selon une particularité de la présente invention,on met en oeuvre les quantités d'ADN lymphocytaire les plus élevées possibles compatibles avec la charge du fil¬ tre util isé à l 'étape c). Cette quantité unitaire est au moins égale à 30 ug d'ADN. Dans la pratique, des fourchettes de 30 à 50 g peuvent être utilisées. Les valeurs inférieures à ~ θ À/ g ne permettent pas d'obtenir une réponse suffisamment sûre . Par ail¬ leurs, au-delà de 80 / g, il faut prélever des quan¬ tités de sang trop importantes; en outre on arrive à la limite d'util isation du filtre de l'étape c). Des quantités unitaires d'ADN lymphocytai re comprises
entre 30 et 50 ^/ g peuvent être facilement obtenues à partir d'environ 10 mill ions de cel lules blanches du sang des individus examinés. Ainsi qu' il est usuel dans cette technique, ces quantités unitaires sont déposées dans des puits respectifs de gel , par exemple de gel d'agarose.
Dans l'étape b) du procédé de l ' invention, la quantité précitée d'ADN 1 ymphocyta i re est traitée par une enzyme de restriction choisie de façon telle qu'elle n'a pas, normalement, de site de reconnais¬ sance à l ' intérieur de la séquence de l'ADN du virus Ceci a pour effet de concentrer le signal finalement obtenu en un petit nombre de bandes autorad iogra- phiées de grande taille, correspondant au virus li- bre et à ses différentes conforma ions . A titre d'enzyme convenant aux besoins du procédé de l ' invention, il faut citer en premier lieu l'enzyme XbA I dont on sait qu'elle ne coupe pas à l' intérieur de la séquence virale : voir HAHN B.H. , SHAW G.M. , ARYA S.K., POPOVIC M. GALLO R.C. , et VDNG-STAAL F., ( 1984) Molecular cloning and charac er i zat ion of the HTLV I virus associated with AIDS . Nature , 312 : 166-169. D'autres enzymes équivalentes sont cepen¬ dant ut i 1 i sab les . Dans l'étape c) du procédé de l ' invention, on util ise un filtre en ni t rocel l ulose d'une grande sensibil ité présentant, par cm de surface, la char¬ ge la plus élevée possible . Les caractéristiques de ce filtre sont compatibles avec les quantités un i - taires d'ADN 1 ymphocyta i re mises en oeuvre à l'étape a). Le filtre est capable de retenir au moins 30κ^ g d'ADN et de préférence jusqu'à 80 /^ g d'ADN par cm2 de surface . Dans la pratique, les filtres Millipore, ou mieux le filtre Sartorius Schleicher & Schull BA85 peuvent être utilisés. Dans ce dernier
cas, des expériences préliminaires utilisant l'ADN de la culture H9v3 comme test ont montré que jusqu'à 0,1 pg d'ADN de la sonde clonée déposée était détec¬ table par la technique décrite ici , ceci revient à dire qu'environ 10 molécules d'ADN sont ainsi dé¬ tectables , soit en théorie une cellule infectée sur '500 .
Dans l'étape d), on utilise une sonde qui est un fragment sous—clone de l'ADN du virus, qui ne comporte pas la partie codante pour la région enve¬ loppe, variable, par nature, dans les différents isolats. Dans la pratique, de bons résultats ont été obtenus avec une sonde constituée par le fragment Sst 1-5' de BH-10, qui ne correspond qu'à l'extrémité 5' et à la partie médiane du génome. De telles sondes sont connues de l'homme du métier. On peut se référer à cet égard à la demande de brevet européen publiée sous le n° 0173529. Selon une autre caractéristique très importante du procédé de l ' invent ion, le marquage doi - être capable de fournir une activité spécifique très élevée, aussi proche α que possible de la valeur de 5.10 cpm par /g d'ADN de la sonde, soit de préférence une activité de
5.108 à 2.109 cpm/ Lj g d'ADN. Dans la pratique, on obtient une telle activité avec un système de mar¬ quage utilisant une grande quantité d'amorces de pe¬ tites tailles et le marquage au dCTP utilisant la polymérase de Kleno ; ou le marquage par déplacement de coupure (dit nick-translat ion)faisant intervenir deux radioéléments (dCTP + dATP) à 8CO Cu/mole (kit froid N5500 et marquage PB 10384 et PB10385 d'Amersham - voir exemple ci-après);
Les meilleurs résultats ont été obtenus en mar¬ quant la sonde par la méthode des ol igonuc 1éot ides de synthèse, utilisés comme amorce, en faisant
intervenir un seul radioélément (dCTP)avec marquage au •52P. En routine et en mettant en oeuvre le kit correspondant d'Amersham disponible sur le marché, on a obtenu une activité spécifique de l'ordre de 1 - 2 x 10 cpm/ J g. On a également constaté que, dans ces conditions, le procédé ne consomme que de très faibles quantités de sonde (de l'ordre de 100 ng à chaque marquage ) et ne nécessite pas une très grande pureté de la sonde par rapport aux contami- nants protéiques. De ce fait, le procédé est plus aisé et moins coûteux à mettre en oeuvre.
La révélation est réal isée de manière connue par exposition autorad iograph i que . On a constaté, lors de la mise en oeuvre de l' invention, qu'une du- rée d'exposition de quelques jours, par exemple 4 jours ,. suffisait pour la lecture et, par conséquent le dépistage .Les meilleurs résultats ont été obte¬ nus avec les films autorad iograph iques hypersensi¬ bles p (Amersham) . Le procédé selon l'invention , qui utilise la technique de l'hybrida ion moléculaire, peut en par¬ ticulier comporter les principales étapes suivantes: (1) extraction de l'ADN 1ymphocytai re long brin par un mélange phénol -ch loroforme après digestion protéique par la protéinase K; (2) dosage spectro- photométr ique de l'ADN obtenu, vérification de sa longueur sur minigel d'agarose, et de sa digestibi- l i té par essai nucléasique; (3) digestion par l'enzyme de restriction Xbal , en excès de 5 unités par A g d'ADN à digérer; (4) étalement des frag¬ ments de restriction sur gel d'agarose à O, 8% en tampon de transfert lOxSSC; (5) marquage de la sonde par déplacement de coupure au PdCTP+dATP à 8CO cu/mmole pour 250 Ci ou au 52PdCTP seul; (6) hybridation de la sonde dénaturée avec le filtre en
tampon 5xSSC, lOXDenhardt, 0,1% SDS , 50 rrM EDTA; 50 rrM Tris-HCl pH= 7,5 avec 10 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé pendant 48 heures à 67°C; (7) lavage final en tampon IxSSC et 0,1% SDS; (8)séchage du filtre et son inclusion dans une cas¬ sette comportant deux écrans renforçateurs en pré¬ sence de films sensibles, 1 ' autoradiograph ie étant réalisée à -70°C ; (9) révélation des bandes autora- diograph iées ; ( lb) lecture des bandes autoradiogra- phiées sur plateforme éclairante en se servant comme échelle de taille de l'ADN du phage Λ digéré par Hind III.
La figure 1 du dessin annexé représente les bandes radiographiées obtenues dans le cas (1) d'un individu séropositif ^> O, (2) dans celui d'un indi¬ vidu séropositif / O, et de la culture H9v3; dans ce dernier cas, l'accolade représente les sites multi¬ ples d' intégration.
Ainsi, on observe chez les individus séroposi- tifs les fragments Xbal suivants :
-un fragment géant, correspondant à l'ADN de haut poids moléculaire n'ayant pas, ou peu, pénétré dans le gel,
-un fragment à environ 13 kb , correspondant au virus sous forme circulaire et coupé de façon haplo- tonique ,
-un fragment à environ 9kb, correspondant au virus sous forme linéaire . Ces deux dernières ban¬ des correspondent à la forme libre du virus. Par comparaison, l'ADN de H9v3 dans les mêmes conditions donne un signal correspondant au fragment géant, ainsi qu'un autre de grande taille dont les limites de poids, floues, indiquent les modalités d' intégration polyclonale du virus.
La photographie de la figure 1, qui représente trois canaux de migration du gel illustre les si¬ gnaux observables sur 1 ' autoradiogramme, lesquels matérialisent les résultats du procédé de l' invention. Dans le cas de la lignée H9v3 il exis¬ te un signal, faible, dans la région de l'ADN de haut poids moléculaire, qui pénètre mal dans les puits du gel; l'essentiel du signal est représenté par une tache é.talée en poids (cette tache est in- tense, car chaque cellule de la culture comporte de l'ordre de 50 à 100 particules virales); cet étale¬ ment provient du fait que l' intégration du virus au niveau de l'ADN humain se fait de façon polyclonale (il existe des sites multiples d' insertion). Dans le cas du canal l, celui-ci concerne un individu séro¬ positif positif pour le signal. Trois bandes autora- diographiées sont présentes: une dans l'ADN de haut poids moléculaire, qui ne pénètre pas dans le puits du gel; et deux bandes autoradiographiées de taille approximative 13 et 9kb correspondant à la forme li¬ bre du virus, probablement sous deux conformations différentes (surenroulées et/ou relâchées) Certains individus sont fortement positifs (c'est le cas représenté figure l) avec bandes nettes parti- culièrement marquées, visibles dès après 4 jours d* autoradiographie . Dans le cas du canal 2, celui- ci concerne un individu séropositif, mais négatif pour le signal (même après exposition prolongée).
Ces résultats montrent que la lecture des ré- sultats procurés par le procédé de l' invention peut être faite de manière sûre et reproductible pour dé¬ celer la présence du virus HTLVIII-LAV chez les in¬ dividus séroposi ifs.
Sur un total de quatorze individus examinés, neuf montrent les séquences virales . Sur ces neuf positifs, quatre d'entre eux montrent des bandes plus intenses et sont donc qualifiés de positifs in- tenses , les cinq autres ne montrant que faiblement les bandes , et ce, même après exposition prolongée; ces différences d' intensité sont indépendantes de la quantité d'ADN déposée dans chaque puits et. reflè¬ tent sans doute le nombre de copies virales présen- tes.
Dans une variante avantageuse du procédé de l' invention, on dépose simultanément les échantil¬ lons sur le gel, les uns étant non digérés et les autres digérés par l'enzyme telle que Xbal.Des ré- sultats types obtenus sont représentés aux figures 2 et 3.
On voit à la figure 2, qui est similaire à la figure 1, mais comporte en double, les échantillons non digérés et les échantillons digérés, que le si- gnal obtenu correspond respectivement à des frag¬ ments géants, à un fragment intégré à 13 kb et à un fragment libre à 9 kb. Dans un tel mode de mise en oeuvre, il y a d'abord une indication de la présence du virus dans l'échantillon non diféré, laquelle est vérifiée et confirmée après digestion.
La figure 3 illustre l' influence de la durée d'exposition pour les bandes caractéristiques à 13 et 9 kb , respectivement à 10 jours et 1 mois.
En utilisant le mode de mise en oeuvre avec double échantillon (non digéré et digéré), on a ap¬ pliqué le procédé de l'invention à 25 sujets séropo¬ sitifs . Chaque essai a été recommencé deux fois. Les résultats sont rassemblés dans le tableau qui suit . Dans ce tableau:
-l' indication " ^/ Tg prélèvement" signifie le rapport entre les lymphocytes T^ et les lymphocytes
Tg, la mesure étant faite au moment du prélèvement et constituant une présomption que le sujet est sé- ropos i t i f .
-l' indication "HBS /HBC antigènes" signifie la présence ou l'absence des antigènes correspondant à l ' hépa t i te virale.
Les autres' légences du tableau sont communes . Le procédé de l' invention permet, comme cela ressort des résulta-ts du tableau, d'affirmer que 16 indivi¬ dus soit 64% du total testé, sont positifs.
Le fait que les trois bandes observées corres¬ pondent bien aux séquences du virus est indiqué pour les raisons suivantes :
- le signal obtenu l'est après hybridation avec une sonde spécifique,
-les bandes de taille attendue sont observées, -elles sont voisines de celles de la culture H9v3 de contrôle.
Dans le cas d'un ADN témoin pris au hasard dans la population et digéré par Xba I , les bandes ne sont pas visibles . Elles ne le sont pas non plus dans le cas d'un SIDA véritable, dans les mêmes conditions; comme déjà signalé, la détection du virus par cette méthode n'est pas pratiquable pour les malades (dans ce cas, la quantité de cellules T^ est très abais¬ sée, et l'essentiel du virus se trouve sous forme d'ARN ).
Les bandes observées ne sont pas le résultat d'une contamination de la sonde par le phage ^ Digéré par Xbal ,ce 1 u i-c i donne deux fragments de restriction à 23,9 et 24,5 kb, nettement plus grands que ceux observés , comme établi dans une digestion témoin de ce type. Par contre, la présence des sé¬ quences virales libres dans l 'ADN lymphocytai re des individus ^- O séropositifs est prouvée en faisant migrer de l'ADN de ces individus non digérés sur le gel , et hybridant les canaux correspondants avec la sonde: dans la plupart des cas, un signal est obte¬ nu, intense, dans l'ADN non digéré (séquences intégrées), un autre, beaucoup plus faible, dans une bande de poids moléculaire di 10 kb (forme libre).
L' invention a également pour objet un coffret ou trousse, contenant les ingrédients nécessaires à la mise en oeuvre du procédé. Les quantités unitai- res de ces ingrédients dépendront du nombre
d'échantillons qu' il est envisagé de traiter. Le coffret selon l' invention comprend essentiellement:
-une sonde HTLV III-LAV, par exemple la sonde correspondant au sous-clone π BH-5, excisée du phage A ,
-une préparation de l'ADN du phage n digéré par Xbal , utilisée comme témoin,
-l'enzyme XbaI dans le tampon de conservation de 1 ' enzyme , -le tampon de digestion de l'enzyme.
Pour le marquage, les produits utilisables sont, par exemple, ceux mis sur le marché par la Société Amersham France, Avenue du Canada 91944 Les Ulis France tels que: - kit froid N55CO (tampon de nick-1rans 1at ion et enzymes )
- \ p32 dCTP (PB 10385) et < P32 dATP (PB 10384) à 800 Ci/mmole (250/t/Ci de chaque).
Une variante froide de marquage (par exemple marquage par sulfonation de base actuellement com¬ mercialisé par la Société Organics, 12 Avenue du Président Salvador Allende 94402 Vi try-sur-Se ine , France) peut également être utilisée.En variante, on peut aussi pratiquer des hybridations in situ en utilisant un marquage froid ou un marquage radioac¬ tif, par exemple H .
L' invention sera encore illustrée par un exem¬ ple illustratif complet de mise en oeuvre. EXEMPLE: 20 ml de sang total sont prélevés sur EDTA à..5% dans l'eau physiologique . Le plasma est éliminé par aspiration à la trompe à vide après centr i fugat ion pendant 5 minutes à 1500 rpm. La lyse des globules rouges est obtenue en ajoutant au culot frais 50 ml de tampon SLR (Tris ÎO rrM, MgCl2, 5rτM, NaCl 10 rrM);
une homogénéisation est obtenue jusqu'à un aspect laqué, puis une centr i fugat ion est effectuée 5 à 10 minutes à 2000 rpm; le surnageant est ensuite aspiré à la trompe à vide. La solution de protéinase K est préparée dans le tampon TE (Tris-EDTA) à une concen¬ tration finale de 0,2 mg/ml . Le culot obtenu précé¬ demment est redissous dans 3 ml du tampon SLR et r'edissous à nouveau dans 20 ml de tampon SLB (Tris ÎO rrM, EDTA 10 rrM, NaCl 50 rrM, SDS à 0,2%) et la protéinase K à .3 mg par tube; on obtient ainsi un bloc visqueux qui est homogénéisé, puis mis à agiter doucement (45 à 50 rpm au bain-marie orbital) pen¬ dant la nuit à 42°C.
Le phénol util isé pour l 'extraction est saturé en Tris 0,2 M à pH= 7,6 . Une première extraction est pratiquée dans 3/4 de phénol/i/4 de chloroforme et 1/24 d'alcool isoamylique; la phase aqueuse supé¬ rieure est éliminée à la pipette.Une seconde extrac¬ tion est ensuite préparée en phéno 1 -ch loroforme ; les deux phases se séparent ensuite et l'ADN se trouve dans la phase supérieure; la phase organique infé¬ rieure est éliminée à la seringue . Une troisième extraction est enfin pratiquée pour éliminer le phé¬ nol avec le chloroforme + acide isoamylique. Dans la phase résiduelle l'ADN est précipité par ajout de 300 f l de NaCl 3M et en complétant avec 50 ml d'éthanol absolu à - 20°C . L'éthanol est éli¬ miné à la pipette et l'ADN précipité récupéré à la pipette inversée; on rince plusieurs fois à l'éthanol absolu. l 'ADN est resuspendu dans 2 à 4 ml de TE à 4°C pendant plusieurs jours. Il est dosé à DOogg» et *e contrôle de sa taille est effectué en minigel d'agarose à O, 7% et coloration au bromure d'éthidium dans le tampon TEA.
Après migration le gel est dépuriné (HC1 0,25 M)', dénaturé (NaOH 0,5 M en NaCl lM)et neutralisé (Tris 0,5 en NaCl 1,5 M à pH = 7,0). Le tampon de transfert est le lO x SSC, le transfert sur filtre de ni troce11ulose étant réalisé pendant la nuit. Le filtre est enfin séché et l'ADN y est fixé au four à 80°C pendant 6 heures.
La sonde utilisée est la sonde constituée par le fragment Sst 1-5' de
-BH-10. Elle est marquée par nick-translat ion avec dCTP +dATP à 8000 Cu/mole, ou avec dCTP seul .
Le filtre est préhybridé à 65°C au bain-marie orbital dans un sac plastique scellé contenant : 25 ml de tampon 5x SSC (1 heure),puis 5x SSC, 10 x Denhardt (D), 0,1% SDS (1 heure) , puis 5xSSC, 10xD,lmM EDTA et O, 1% SDS additionné de
g/ml d'ADN de sperme de saumon (ss) dénaturé et soniqué (une nu it ) .
L'hybridation avec la sonde dénaturée est réali- sée dans 10 ml : 5xSSC, lOxD, 0, 1 % SDS, 5nrM EDTA, 50rrM Tris-HCl pH= 7,5 et IO mg/ml d'ADN ss à 67°C au bain-marie orbital pendant au moins 24 heures.
Après hybridation les filtres sont lavés dans les bains successifs : (250 ml dans une boite à 66°C): 30 minutes en 5xSSC, lOxD, 0, 1% SDS , 0,1% NaPPi, puis 30 minutes en 3SSC, lOxD, 1% SDS, O, 1% NaPPI, puis 15 minutes en 2xSSC, lxD, O, 1% SDS, O, 1% NaPPi et le temps nécessaire (suivi au compteur) en tampon ISSC ,lxD, 0,1% SDS, O, 1% NaPPi.
Les filtres sont ensuite séchés sous la lampe, fixés sur papier Wathman 3Mv| et enrobés d'un fi lm plastique, puis disposés pour autoradiographie à -7O0C pendant 1 à 30 jours dans une cassette compor- tant deux écrans renforçateurs.
Les autoradiogrammes sont révélés pendant 5 mi¬ nutes, rincés à l 'eau, fixés pendant 5 minutes, re¬ lavés et séchés au séchoir. La taille des bandes autorad iograph iéés est calculée par rapport à celle de l'échelle de taille représentée par les fragments Hind I I I de l 'ADN de phage A .
L'exemple détaillé ci-dessus est illustratif mais nullement limitatif du procédé de l' invention. Des variantes sur le mode opératoire peuvent être apportées par l'homme du métier, comme cela a été illustré précédemment avec le mode de mise en oeuvre avec ou sans digestion (double échantillon).
L' invention procure ainsi un procédé sensible, capable de détecter in vivo et dans les conditions de la réal ité pratique, le retrovirus HTLV III-LAV, dont on sait qu' il est présent en quantités infimes dans les individus séropositifs . Un tel résultat est très avantageux et d'autant plus surprenant que la littérature spécialisée enseignait qu'une telle technique de détection n'était pas utilisable prati¬ quement .
Par ailleurs, les travaux concernant la sonde ont été réal isés dans des conditions optimales et seulement in vitro sur des cellules de culture, ce qui est complètement différent de l'application in vivo .
Claims
o
REVENDICATIONS 1.Procédé pour le dépistage, chez les indivi¬ dus séropositifs, des séquences d'ADN du retrovirus HTLV III-LAV, procédé dans lequel on applique une technique générale d'hybridation moléculaire com- prenant les étapes suivantes: a) on prélève le sang des individus examinés pour en isoler de manière connue les cellules blanches et obtenir de l'ADN 1ymphocytai re, qui est utilisé en quantité unitaire égale à au moins 30/^'g, b)on traite ladite quantité d'ADN lymphocyta i re par une enzyme de restriction ne coupant pas à l' intérieur de la séquence de l'ADN du virus, c)on fait passer le milieu de l'étape b) qui contient le virus sous forme libre ou intégrée, sur un filtre de ni troce11 u lose capable de retenir jusqu'à 80/C/ g d'ADN par cm de surface, d) on met en contact le produit retenu par le fil¬ tre avec une sonde, qui est une sonde clonée et marquée du virus HTLV III-LAV, ladite sonde étant un fragment sous-cloné de l'ADN du virus qui ne comporte pas la partie codante pour la région enve¬ loppe du virus, le marquage étant capable de donner une activité aussi proche que possible de la valeur g de 5.10' cpm par >c g d'ADN de la sonde, notamment une activité de 5.108 à 2.109 cpm^ g d'ADN. e)on révèle de façon connue la présence de bandes caractéris iques du virus.
2.Procédé selon la revendication 1, caracté¬ risé en ce que l'enzyme de restriction est XbaI ou une enzyme équivalente.
3.Procédé selon l'une des revendications l ou 2, caractérisé en ce que la quantité- unitaire d'ADN 1ymphocyta i re est comprise entre 30 et 50 θ g envi¬ ron .
4.Procédé selon l'une quelconque des revendi¬ cations 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise une sonde correspondant au sous-clone BH-5, excisée du phage Λ
5.Procédé selon l'une quelconque des revendica¬ tions I. à 4, caractérisé en ce que le marquage de la sonde est un marquage froid ou un marquage radioac¬ tif .
6.Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 5, caractérisé en ce qu' il comporte les principales étapes suivantes: (1) extraction de l'ADN lymphocyta i re long brin par un mélange phénol- chloroforme après digestion protéique par la protéi¬ nase K; (2) dosage spectrophotom r ique de l'ADN obtenu , vérification de sa longueur sur minigel d'agarose , et de sa digest ib i 1 i é par essai nucléa- sique ; (3) digestion par l'enzyme de restriction Xba I , en excès de 5 unités par > g d'ADN à digérer;
(4) étalement des fragments de restriction sur gel d'agarose à 0,8% en tampon de transfert lOxSSC;
(5) marquage de la sonde par déplacement de coupure au 32PdCTP+dATP à 800 cu/ mole pour 250 y( Ci ou au
PdCTP seul; (6) hybridation de la sonde dénaturée avec le filtre en tampon 5xSSC, lOxDenhardt, 0,1% SDS, 50 rrM EDTA, 50 rrM Tris-HCl pH= 7,5 avec 10 mg/ml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé pendant 48 heures à 67°C ; (7) lavage final en tam¬ pon lxSSC et 0, 1% SDS; (8)séchage du filtre et son inclusion dans une cassette comportant deux écrans renforçateurs en présence de fi lms sensibles, 1 ' autoradiograph ie étant réalisée à -70°C ; (9) ré¬ vélation des bandes autoradiograph iées ; (10) lecture des bandes autoradiographiées sur plateforme éclai¬ rante en se servant comme échelle de taille de l'ADN du phage digéré par Hi nd III.
7.Coffret ou trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu' il comprend partiellement:
-une sonde HTLV III-LAV, par exemple la sonde correspondant au sous-clone Λ BH-5, excisée du phage
-une préparation de l'ADN du phage - digéré par Xbal , ut i 1 i sée comme témoin,
-l'enzyme XbaI dans le tampon de conservation de l'enzyme ,
-le tampon de digestion de l'enzyme.
8.Coffret selon la revendication 7,caracterise en ce que le marqueur est radioactif ou froid.
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| US6300056B1 (en) | 1991-12-23 | 2001-10-09 | Chiron Corporation | HIV probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
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| Science, Vol. 226, 7 Decembre 1984 G.M. SHAW et al.: "Molecular Characterization of Human T-Cell Leukemia (Lymphotropic) Virus Type III in the Acquired Immune Deficiency Syndrome", pages 1165-1171, voir pages 1165-1171 (cite dans la demande) * |
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