UA86355U - Спосіб визначення ампліфікації гена mycn у дітей, хворих на нейробластому - Google Patents

Abstract

Спосіб визначення ампліфікації гена MYCN у дітей, хворих на нейробластому, включає дослідження методом полімеразно-ланцюгової реакції з використанням специфічних праймерів. Полімеразно-ланцюгову реакцію проводять з використанням специфічних TaqMan-зондів MGB-типу з детекцією результатів в режимі реального часу та при виявлені в пухлинній клітині ампліфікацію гена MYCN більше 10 копій, прогнозують несприятливий перебіг захворювання.

Description

Корисна модель належить до медицини, а саме - онкології, і може бути використана для визначення наявності ампліфікації гена МУСМ в пухлинних клітинах у дітей, хворих на нейробластому.

Нейробластома складає 7-11 95 загальної кількості злоякісних новоутворень у дітей, займаючи четверте місце у структурі онкологічної захворюваності дітей після гострих лейкозів, пухлин центральної нервової системи та злоякісних лімфом. Частота виникнення нейробластом становить 0,85-1,1 на 100 тисяч дітей віком до 15 років. Віковий розподіл неоднорідний, частота виявлення цієї пухлини з віком зменшується. 90 95 хворих - новонароджені та діти віком до 6 років ПІ.

Важливе значення, особливо при використані сучасної протокольної терапії, є виявлення специфічних онкогенів на молекулярно-генетичному рівні з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в режимі реального часу. Головна перевага ПЛР - її унікальна чутливість при досить невисокій вартості проведення досліджень. Метод дозволяє встановити несприятливий прогноз перебігу захворювання і точно визначити "групи ризику" хворих, з можливістю забезпечення оптимізації програм терапії вже на перших етапах лікування |21.

Нейробластома із агресивним перебігом характеризуються множинними сегментними абераціями хромосом та ампліфікацією гена МУСМ. Ген МУСМ є центральним стратифікаційним біологічним маркером, розташованим в дистальній частині короткого плеча 2- ої хромосоми (2ра24) та ампліфікується в пухлинних клітинах нейробластоми. Ампліфікація гена

МУСМ зазвичай досягає від 10 до 400 копій гена в пухлинній клітині з відповідним високим рівнем експресії, спостерігається у 25 95 первинних пухлин і корелює з прогресуючою стадією захворювання та резистентністю до лікування і дозволяє стратифікувати хворих дітей на нейробластому за групами ризику ІЗІ.

За прототип вибрано спосіб визначення ампліфікації гена МУСМ у зразках пухлинної тканини у дітей, хворих на нейробластому |Оцапійайме ВНеаїЇ-їйте РОСА ог диїсК зітийапеоив5 деїептіпаїйоп ої Шегару-зігаїйуіпд тапгкетз МУСМ атріїйісайоп, аеїейоп Тр апа 1194 / М. Воєпзспи,

А. Орепиег, М. РізсеНег Геї а!) // Оіадп. Мої. Раїйо!ї.-2005. - Мої. 14, Мо 3. - Р. 177-182, за яким використовують метод кількісної полімеразної ланцюгової реакції з використанням флуоресцентного барвника 5УВАСтееєп. Проведення аналізу включає такі етапи: виділення ДНК

Зо з біологічного матеріалу, ампліфікацію досліджуваної ділянки методом ПЛР з використанням двох пар специфічних праймерів та рлуоресцентного барвника 5УВРСтгееп, детекцію продуктів реакції методом кількісної ПЛР в режимі реального часу.

Позитивним в прототипі є те, що метод молекулярно-генетичного аналізу є досить чутливим та специфічним, і дозволяє виявити ампліфікацію гена у біологічному матеріалі.

Недоліком прототипу є те, що метод є трудомістким процесом та недостатньо чутливим при використанні флуоресцентного барвника 5УВВАСИтееп і допускає виникнення хибно позитивних результатів.

В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб визначення ампліфікації гена МУСМ у дітей, хворих на нейробластому, методом полімеразної ланцюгової реакції з детекцією результатів в режимі реального часу з використанням специфічних ТадМап-зондів

МавВ-типу та з більш високою специфічністю гібридизації, що дасть можливість стратифікувати хворих за "групами ризику", підвищити точність прогнозування перебігу захворювання з можливістю подальшої оптимізації програм терапії.

Поставлена задача вирішується наступним чином:

Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки, які містили 0,3 мл середовища для транспортування виробництва "Атбріоп", США, для стабілізації ДНК. Матеріал призначений для виділення ДНК, зберігався при температурі 2-8 "С протягом 1 доби або довготривало при - 7076.

Парафінізовану тканину звільняли від парафіну методом депарафінізації за допомогою ксилолу, згідно з методичними рекомендаціями (5). Геномну ДНК з пухлинної тканини виділяли методом адсорбції нуклеїнових кислот на "віїйса" мембрані за допомогою колонок "СОІАатрОМА

Міпіки" (ОІАСЕМ", США), згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Для роботи з ДНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, з маркуванням "Нпазе-ігее", "Опазе-їтеє". Використаний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 95-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти.

Отриманий зразок ДНК одразу використовували для постановки полімеразної ланцюгової реакції або зберігали (впродовж 7 днів при 2-8 "С, впродовж 1 року при температурі мінус 20 7 та довготривало при -70 "С).

Перед проведенням реакції ампліфікації концентрацію отриманої ДНК доводили до 10-20 нг/мкл. Вимірювання концентрації ДНК проводили методом спектрофотометрії на спектрофотометрі МапоОгор1000 ("Тнептовсієпійіс", США).

Послідовності праймерів та ТадМап зондів були підібрані нами з використанням програми

Ргітег Ехргез5Ф Боїймаге м3.0 ("АрріїєдВіовувієтв", США) та синтезовані фірмою "АрріїєаВіозувієтв" (США): - прямий праймер В-асіїп - "ТСАСССАСАСТАТаСССАТСТАСОАЗ: - зворотній праймер ВД-асіїп - З СОСОК АССОСТСАТТОССА АТО КУ - флюоресцентний зонд В-асійп -

ОБАМА СС СССАТССАТСОСТОСЮТ -ТАМКА - прямий праймер МУСМ - З ССССТОСОСЕСТОСОСССОС ТЕКУ - зворотній праймер МУСМ - У ССС АС АСВ АСТСАЛЕЮТУ - флюоресцентний зонд МУСМ -

УК СССАСССТСТОСИСТО ТО СТО СОТ. ТАМЕА

Праймери використовували в концентрації ЗО нМ/т!, та зонди в концентрації 20 нМ/т!1. Для проведення реакції ампліфікації готували реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер (МУСМ), 1 мкл зворотній праймер (МУСМ), 1 мкл флюоресцентний зонд (МУСМ), 1 мкл прямий праймер (В- асійп), 1 мкл зворотній праймер (В-асійпй), 1 мкл флюоресцентний зонд (В-асійп) 1,5 мкл ПЛР- води, 12,5 мкл ТадМап Опімегзаї РОСА Мавієї Міх ("Арріїєй Вуозузіетв", США). До суміші додавали 5 мкл розчину ДНК.

Ампліфікацію проводили на приладі 7300/7500 Аеаі-Тіте РОСА Бувієтв, "Арріїєа

Віозувзівєтв", (США), використовуючи наступний температурний режим: початок ампліфікації при 9570-5 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів 94 "0-3 с, 58 70-6 б. і 7270-27 б. та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 70-15 с, 60 "0-30 с, 95 70-15 б.

Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу, згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Кількість копій гена МУСМ розраховують за формулою: хе 2 сі

Ко) де х - кількість копій гена МУСМ,

Дої-сі (В-асіїп) - сії (МУСМ) (б.

Як негативний контроль використовували ДНК, отриману з тканини головного мозку, а позитивний - ДНК зразків з верифікованою ампліфікацією гена МУСМ.

Відсутність ампліфікації гена МУСМ в пухлинній клітині свідчить про сприятливий перебіг захворювання та дозволяє оптимізувати програму терапії хворого. Виявлення більше 10 копій ампліфікації гена МУСМ в пухлинній клітині свідчить про несприятливий перебіг захворювання та відносить хворих до "групи високого ризику".

Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені результати молекулярно-генетичних досліджень біологічного матеріалу хворих.

Ї Хворий Б. Д. Д. 2007 р. н., (амб. медична карта Мо 113523). Госпіталізований на консультацію в Національний інститут раку з діагнозом нейробластома лівого наднирника, з метастазами в печінку, парааортальні лімфовузли, кістковий мозок. Патогістологічний висновок (ПГ3) Мо 62117 від 02.12.201: нейробластома лівого наднирника, з метастазами печінку парааортальні лімфовузли, кістковий мозок, 4 стадія. В 2011 року було проведено операцію по резекції пухлини.

У хворого отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки, які містили 0,3 мл середовища для транспортування виробництва "Атрбіоп", (США), для стабілізації ДНК. Матеріал призначений для виділення ДНК, зберігався при температурі 2-8 "С протягом 1 доби або довготривало при -70 "С.

Парафінізовану тканину звільняли від парафіну методом депарафінізації за допомогою ксилолу, згідно з методичними рекомендаціями. Геномну ДНК з пухлинної тканини виділяли методом адсорбції нуклеїнових кислот на "віїйса" мембрані за допомогою колонок "СОІАатрОМА

Міпіки" (ОІАСЕМ", США), згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Для роботи з ДНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, з маркуванням "Нпазе-ігее", "Опазе-їтеє". Використаний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 95-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти.

Отриманий зразок ДНК одразу використовували для постановки полімеразної ланцюгової реакції або зберігали (впродовж 7 днів при 2-8 "С, впродовж 1 року при температурі мінус 207 бо та довготривало при -70 "С).

Перед проведенням реакції ампліфікації концентрацію отриманої ДНК доводили до 10-20 нг/мкл. Вимірювання концентрації ДНК проводили методом спектрофотометрії на спектрофотометрі МапоОгор1000 ("Тнептовсієпійіс", США).

Послідовності праймерів та ТадМап зондів були підібрані нами з використанням програми

Ргітег Ехргез5Ф Боїймаге м3.0 ("АрріїєдВіовувієтв", США) та синтезовані фірмою "АрріїєаВіозувієтв" (США): - прямий праймер р-асіп - ГТС АСССАСАСТОТОСССАТСТАСОСАВ - зворотній праймер р-асііп - З САОСОСААССОСТСАТТОССААТОАВ - флуоресцентний зонд р-асійп - -БАМ АТС ССТОССССАТОССАТОСТОСИТ-ТА МВА - прямий праймер МУСМ - З -СССТОСКСТСТОССОССТТУ - зворотній праймер МУСМ - МОНА АСТАСААСТСАТСТТВЕ - флуоресцентний зонд МУСМ -

АОС ССС ОО ССО ГГ ТАМКА

Праймери використовували в концентрації ЗО нНМ/Лп1, та зонди в концентрації 20 нМ/ті!1.

Для проведення реакції ампліфікації готували реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер (ММСМ), 1 мкл зворотній праймер (МУСМ), 1 мкл флуоресцентний зонд (МУСМ), 1 мкл прямий праймер (В-асійп), 1 мкл зворотній праймер (р-асіїп), 1 мкл флуоресцентний зонд (В-асійп) 1,5 мкл ПЛР- води, 12,5 мкл ТадМап Опімегзаї РОСА Мавієї Міх ("Арріїєй Вуозузіетв", США). До суміші додавали 5 мкл розчину ДНК.

Ампліфікацію проводили на приладі 7300/7500 Аеаі-Тіте РОСА Бувієтв, "Арріїєа

Віозузієтв", США, використовуючи наступний температурний режим: початок ампліфікації при 9570-5 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів 94 70-3 с, 58 "0-6 с і 7270-27 б. та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 70-15 с, 60 "0-30 с, 95 706-156

Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу, згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Кількість копій гена МУСМ розраховують за формулою: х-2га

Ко) де х - кількість копій гена МУСМ,

Дої-сі (В-асіїп) - сі (МУСМ).

Як негативний контроль використовували ДНК, отриману з тканини головного мозку, а позитивний - ДНК зразків з верифікованою ампліфікацією гена МУСМ.

В результаті досліджень у хворого не було виявлено ампліфікацію гена МУСМ методом ПЦР в режимі реального часу, що свідчити про сприятливий перебіг захворювання. Хворому проведено 8 блоків хіміотерапії по протоколу СОЦЕК після операції. Спостерігається повна відповідь у хворого на лікування та 19 місячна ремісія.

Я. Хворий В.А.В. 2006 р. н. (амб. медична картка Мо 900581). Госпіталізований на консультацію в Національний інститут раку з діагнозом нейробластома заочеревинного простору справа. ПГЗ Мо 4/2009 від 12.01.2009 нейробластома заочеревинного простору справа, З стадія.

У хворого отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки, які містили 0,3 мл середовища для транспортування виробництва "Атрбіоп", (США), для стабілізації ДНК. Матеріал призначений для виділення ДНК, зберігався при температурі 2-8 "С протягом 1 доби або довготривало при -70 "С.

Парафінізовану тканину звільняли від парафіну методом депарафінізації за допомогою ксилола, згідно з методичними рекомендаціями.

Геномну ДНК з пухлинної тканини виділяли методом адсорбції нуклеїнових кислот на "віїїса" мембрані за допомогою колонок "ОІАатрОМА Міпіки" ("СОІАСЕМ", США), згідно з рекомендацією фірми-виробника. Для роботи з ДНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, з маркуванням "Нпазе-їтеє", "Опавзе-їеєєе". Використаний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 уо-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти.

Отриманий зразок ДНК одразу використовували для постановки полімеразної ланцюгової реакції або зберігали (впродовж 7 днів при 2-8 "С, впродовж 1 року при температурі мінус 20 "С та довготривало при -70 "С).

Перед проведенням реакції ампліфікації концентрацію отриманої ДНК доводили до 10-20 нг/мкл. Вимірювання концентрації ДНК проводили методом спектрофотометрії на спектрофотометрі МапоОгор1000 ("Тнептовсієпійіс", США).

Послідовності праймерів та ТадМап зондів були підібрані нами з використанням програми

Ргітег Ехргез5Ф Боїймаге м3.0 ("АрріїєдВіовувієтв", США) та синтезовані фірмою "АрріїєаВіозувієтв" (США): - прямий праймер Р-асіп - З ТСАСССАСАСЄТО ОСОСАТСТАСВАХУ - зворотній праймер Р-асіїп - З САССОЗАЛОСОСТСАТТОССААТОА Є - флуоресцентний зонд Р-асіїйп - еКАМ АНТ КАТ САС ТА МКА - прямий праймер МУСМ -

КОТ ОО СОС

- зворотній праймер МУСМ -

ГО ААСТАСААСТСАТСТТК

- флуоресцентний зонд МУСМ - ув АС АССЦСТСТОСОО ОСТ СО ОТГ А ТАМ

Праймери використовували в концентрації ЗО нМ/т!, та зонди в концентрації 20 нМ/т!1. Для проведення реакції ампліфікації готували реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер (МУСМ), 1 мкл зворотній праймер (МУСМ), 1 мкл флуоресцентний зонд (МУСМ), 1 мкл прямий праймер (ВД- асінп), 1 мкл зворотній праймер (р-асііп), 1 мкл флуоресцентний зонд (В-асіїп) 1,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл ТадМап Опімегза! РОСА Мавієг Міх ("Арріїеєд Вуозузієтв", США). До суміші додавали 5 мкл розчину ДНК.

Ампліфікацію проводили на приладі 7300/7500 Аеаі-Тіте РОСА Бувієтв, "Арріїєа

Віозузієтв", США, використовуючи наступний температурний режим: початок ампліфікації при 9570-5 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів 94 "0-3 с, 58 70-6 б. і 7270-27 б. та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 70-15 с, 60 "0-30 с, 95 "С-15 с.

Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу, згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Кількість копій гена МУСМ розраховують за формулою: хе 2 сі де х - кількість копій гену МУСМ,

Зо Деї-сі (В-асіїп) - сі (МУСМ).

Як негативний контроль використовували ДНК отриману з тканини головного мозку, а позитивного - ДНК зразків з верифікованою ампліфікацією гена МУСМ.

В результаті досліджень методом ПЦР в режимі реального часу, у хворого було виявлено 512 копій гена МУСМ, що свідчить про належність хворого до "групи високого ризику" та передбачає поганий прогноз. Після повторного проведення досліджень методом ПЦР в режимі реального часу з використанням парафінізованого операційного матеріалу було виявлено 512 копій гена МУСМ. Хворий належить до "групи високого ризику" Йому проведено 8 блоків хіміотерапії за протоколом НА-МВІ-1/ЕБІОР. Спостерігалась неповна відповідь на лікування.

Через 1 рік у хворого розвився рецидив. Враховуючи належність хворого до "групи високого ризику" та ускладнень під час проведення хіміотерапії, прогноз захворювання несприятливий.

Таким чином, визначення наявності ампліфікації гена МУСМ в пухлинній тканині за допомогою молекулярно-генетичних методів, а саме полімеразно-ланцюгової реакції в режимі реального, дозволяє передбачити ризик виникнення несприятливого прогнозу перебігу захворювання, своєчасно визначити "групи ризику" хворих та забезпечити можливість оптимізації програм терапії вже на перших етапах лікування.

Джерела інформації: 1. Ткгадегб. Мешигобіазюта: іпсідепсе, Біоіосду апа оцісоте / С. Тгадег. - «осКНоїЇт: КагоїїпеоКа

Іпзійшес, 2009. - 56 р. 2. ВеаїЇ-їте диапійайме РОСА ог Ше теєавзигетепі ої МУСМ аптрійїісайоп іп питап пешигоріазіота м/йй Ше ТадМап аеїесійоп зузієт / С. Вадді, М. Вадпопі, сх. Топіпі Геї а // Сііп.

Спнет. - 1999. - Мої. 45, Мо 11. - Р. 1918-1924.

З. Сіїпіса! відпі'тісапсе ої МУСМ атрійісайоп апа ріоіду іп Тамогаріє-5їаде пепгобіазюта: а героп їот Ше Спіідгеп'є ОпсоЇоду Стоир / ). Зсппеіденптап, МУ. І опдоп, С. Вгодеитг Геї а!) // 9. Сіїп.

Опсо). - 2008. - Мої. 26, Ме 6. - Р. 913-918. 4. СОцапійайме Неа!-іте РСВ ог диіскК вітийапеоив дегептіпаїйоп ої Іегару-в5ігайуїпу таке

МУСМ атріїйісайоп, адеїейоп Тр апа 114 / М. Воепзсі, А. Обепиег, М. РізеНег Геї а. // Оіадп. Мої.

Раїної. - 2005. - Мої. 14, Мо 3. - Р. 177-182 (прототип). 5. Виділення нуклеїнових кислот з клінічного матеріалу: методичні рекомендацій / Н.Г.

Горовенко, 3.1. Россоха, С.В. Подольська |га ін.|. - К., 2010. - 39 с.

6. біпда! А. Титог таКегз іп реаіайіс зоїїд їштогз / А. Зіпдаї, 5. Адагмаїа // 9. Іпаіап. Авзвос

Реадіаїг. Зигу. - 2005. - Мої. 10, Мо 3. - Р. 183-190.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ

   Спосіб визначення ампліфікації гена МУСМ у дітей, хворих на нейробластому, що включає дослідження методом полімеразно-ланцюгової реакції з використанням специфічних праймерів, який відрізняється тим, що полімеразно-ланцюгову реакцію проводять з використанням специфічних ТадМап-зондів МОЕВ-типу з детекцією результатів в режимі реального часу та при виявлені в пухлинній клітині ампліфікацію гена МУСМ більше 10 копій, прогнозують несприятливий перебіг захворювання.