UA86355U - Method for detection of mycn amplification in children with neuroblastoma - Google Patents
Method for detection of mycn amplification in children with neuroblastoma Download PDFInfo
- Publication number
- UA86355U UA86355U UAU201308500U UAU201308500U UA86355U UA 86355 U UA86355 U UA 86355U UA U201308500 U UAU201308500 U UA U201308500U UA U201308500 U UAU201308500 U UA U201308500U UA 86355 U UA86355 U UA 86355U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- musm
- amplification
- gene
- neuroblastoma
- dna
- Prior art date
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 101150022024 MYCN gene Proteins 0.000 title abstract 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 5
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108700012912 MYCN Proteins 0.000 abstract 1
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 abstract 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000574 retroperitoneal space Anatomy 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 101150082201 ASIP gene Proteins 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 208000016800 primary central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Корисна модель належить до медицини, а саме - онкології, і може бути використана для визначення наявності ампліфікації гена МУСМ в пухлинних клітинах у дітей, хворих на нейробластому.A useful model belongs to medicine, namely oncology, and can be used to determine the presence of MUSM gene amplification in tumor cells in children with neuroblastoma.
Нейробластома складає 7-11 95 загальної кількості злоякісних новоутворень у дітей, займаючи четверте місце у структурі онкологічної захворюваності дітей після гострих лейкозів, пухлин центральної нервової системи та злоякісних лімфом. Частота виникнення нейробластом становить 0,85-1,1 на 100 тисяч дітей віком до 15 років. Віковий розподіл неоднорідний, частота виявлення цієї пухлини з віком зменшується. 90 95 хворих - новонароджені та діти віком до 6 років ПІ.Neuroblastoma makes up 7-11 95 of the total number of malignant neoplasms in children, occupying the fourth place in the structure of oncological morbidity in children after acute leukemias, tumors of the central nervous system and malignant lymphomas. The incidence of neuroblastoma is 0.85-1.1 per 100,000 children under the age of 15. The age distribution is heterogeneous, the frequency of detection of this tumor decreases with age. 90 95 patients - newborns and children under the age of 6 PI.
Важливе значення, особливо при використані сучасної протокольної терапії, є виявлення специфічних онкогенів на молекулярно-генетичному рівні з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в режимі реального часу. Головна перевага ПЛР - її унікальна чутливість при досить невисокій вартості проведення досліджень. Метод дозволяє встановити несприятливий прогноз перебігу захворювання і точно визначити "групи ризику" хворих, з можливістю забезпечення оптимізації програм терапії вже на перших етапах лікування |21.Of great importance, especially when using modern protocol therapy, is the detection of specific oncogenes at the molecular genetic level using polymerase chain reaction (PCR) in real time. The main advantage of PCR is its unique sensitivity at a fairly low cost of research. The method makes it possible to establish an unfavorable prognosis of the course of the disease and accurately determine "risk groups" of patients, with the possibility of ensuring optimization of therapy programs already at the first stages of treatment |21.
Нейробластома із агресивним перебігом характеризуються множинними сегментними абераціями хромосом та ампліфікацією гена МУСМ. Ген МУСМ є центральним стратифікаційним біологічним маркером, розташованим в дистальній частині короткого плеча 2- ої хромосоми (2ра24) та ампліфікується в пухлинних клітинах нейробластоми. Ампліфікація генаNeuroblastoma with an aggressive course is characterized by multiple segmental aberrations of chromosomes and amplification of the MUSM gene. The MUSM gene is a central stratification biological marker located in the distal part of the short arm of chromosome 2 (2ra24) and is amplified in neuroblastoma tumor cells. Gene amplification
МУСМ зазвичай досягає від 10 до 400 копій гена в пухлинній клітині з відповідним високим рівнем експресії, спостерігається у 25 95 первинних пухлин і корелює з прогресуючою стадією захворювання та резистентністю до лікування і дозволяє стратифікувати хворих дітей на нейробластому за групами ризику ІЗІ.MUSM usually reaches from 10 to 400 copies of the gene in a tumor cell with a correspondingly high level of expression, is observed in 25 95 primary tumors and correlates with the progressive stage of the disease and resistance to treatment and allows stratification of children with neuroblastoma according to risk groups of ISI.
За прототип вибрано спосіб визначення ампліфікації гена МУСМ у зразках пухлинної тканини у дітей, хворих на нейробластому |Оцапійайме ВНеаїЇ-їйте РОСА ог диїсК зітийапеоив5 деїептіпаїйоп ої Шегару-зігаїйуіпд тапгкетз МУСМ атріїйісайоп, аеїейоп Тр апа 1194 / М. Воєпзспи,As a prototype, the method of determining the amplification of the MUSM gene in tumor tissue samples from children with neuroblastoma was chosen.
А. Орепиег, М. РізсеНег Геї а!) // Оіадп. Мої. Раїйо!ї.-2005. - Мої. 14, Мо 3. - Р. 177-182, за яким використовують метод кількісної полімеразної ланцюгової реакції з використанням флуоресцентного барвника 5УВАСтееєп. Проведення аналізу включає такі етапи: виділення ДНКA. Orepieg, M. RisseNeg Geyi a!) // Oiadp. My. Raiyo!i.-2005. - Mine. 14, Mo. 3. - P. 177-182, according to which the quantitative polymerase chain reaction method is used using the fluorescent dye 5UVASteep. Conducting the analysis includes the following stages: DNA isolation
Зо з біологічного матеріалу, ампліфікацію досліджуваної ділянки методом ПЛР з використанням двох пар специфічних праймерів та рлуоресцентного барвника 5УВРСтгееп, детекцію продуктів реакції методом кількісної ПЛР в режимі реального часу.Zo from biological material, amplification of the studied site by the PCR method using two pairs of specific primers and fluorescent dye 5UVRStgeep, detection of reaction products by the quantitative PCR method in real time.
Позитивним в прототипі є те, що метод молекулярно-генетичного аналізу є досить чутливим та специфічним, і дозволяє виявити ампліфікацію гена у біологічному матеріалі.The positive thing about the prototype is that the method of molecular genetic analysis is quite sensitive and specific, and allows to detect gene amplification in biological material.
Недоліком прототипу є те, що метод є трудомістким процесом та недостатньо чутливим при використанні флуоресцентного барвника 5УВВАСИтееп і допускає виникнення хибно позитивних результатів.The disadvantage of the prototype is that the method is a time-consuming process and is not sufficiently sensitive when using the fluorescent dye 5UVVASIteep and allows the occurrence of false positive results.
В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб визначення ампліфікації гена МУСМ у дітей, хворих на нейробластому, методом полімеразної ланцюгової реакції з детекцією результатів в режимі реального часу з використанням специфічних ТадМап-зондівThe basis of the useful model is the task of improving the method of determining the amplification of the MUSM gene in children with neuroblastoma by the polymerase chain reaction method with the detection of results in real time using specific TadMap probes
МавВ-типу та з більш високою специфічністю гібридизації, що дасть можливість стратифікувати хворих за "групами ризику", підвищити точність прогнозування перебігу захворювання з можливістю подальшої оптимізації програм терапії.MavB-type and with a higher specificity of hybridization, which will make it possible to stratify patients according to "risk groups", increase the accuracy of predicting the course of the disease with the possibility of further optimization of therapy programs.
Поставлена задача вирішується наступним чином:The task is solved as follows:
Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки, які містили 0,3 мл середовища для транспортування виробництва "Атбріоп", США, для стабілізації ДНК. Матеріал призначений для виділення ДНК, зберігався при температурі 2-8 "С протягом 1 доби або довготривало при - 7076.Tumor biopsies were placed in microtubes containing 0.3 ml of transport medium manufactured by Atbriop, USA, for DNA stabilization. The material is intended for DNA isolation, stored at a temperature of 2-8 "C for 1 day or long-term at - 7076.
Парафінізовану тканину звільняли від парафіну методом депарафінізації за допомогою ксилолу, згідно з методичними рекомендаціями (5). Геномну ДНК з пухлинної тканини виділяли методом адсорбції нуклеїнових кислот на "віїйса" мембрані за допомогою колонок "СОІАатрОМАParaffinized tissue was freed from paraffin by the method of deparaffinization using xylene, according to methodical recommendations (5). Genomic DNA from the tumor tissue was isolated by the method of nucleic acid adsorption on the "viiisa" membrane using "SOIAatroMA" columns
Міпіки" (ОІАСЕМ", США), згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Для роботи з ДНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, з маркуванням "Нпазе-ігее", "Опазе-їтеє". Використаний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 95-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти.Mipiky" (OIASEM", USA), according to the recommendations of the manufacturer. To work with DNA, only disposable sterile plastic materials were used, marked "Npaze-igee", "Opaze-itee". Used plastic utensils (tubes, tips) were disinfected in a special container containing a disinfectant 5% chloramine solution or 1N hydrochloric acid solution.
Отриманий зразок ДНК одразу використовували для постановки полімеразної ланцюгової реакції або зберігали (впродовж 7 днів при 2-8 "С, впродовж 1 року при температурі мінус 20 7 та довготривало при -70 "С).The obtained DNA sample was immediately used for polymerase chain reaction or stored (for 7 days at 2-8 "С, for 1 year at a temperature of minus 20 7 and for a long time at -70 "С).
Перед проведенням реакції ампліфікації концентрацію отриманої ДНК доводили до 10-20 нг/мкл. Вимірювання концентрації ДНК проводили методом спектрофотометрії на спектрофотометрі МапоОгор1000 ("Тнептовсієпійіс", США).Before carrying out the amplification reaction, the concentration of the obtained DNA was adjusted to 10-20 ng/μl. DNA concentration was measured by spectrophotometry on a MapoOhor1000 spectrophotometer ("Tneptovsiepiyis", USA).
Послідовності праймерів та ТадМап зондів були підібрані нами з використанням програмиSequences of primers and TadMap probes were selected by us using the program
Ргітег Ехргез5Ф Боїймаге м3.0 ("АрріїєдВіовувієтв", США) та синтезовані фірмою "АрріїєаВіозувієтв" (США): - прямий праймер В-асіїп - "ТСАСССАСАСТАТаСССАТСТАСОАЗ: - зворотній праймер ВД-асіїп - З СОСОК АССОСТСАТТОССА АТО КУ - флюоресцентний зонд В-асійп -Rgiteg Ehrgez5F Boiimage m3.0 ("ArriedViovuvietv", USA) and synthesized by the company "ArriedViovuvietv" (USA): - forward primer B-asyip - "TSASSSSASASTATaSSSATSTASOAZ: - reverse primer VD-asyip - Z SOSOK ASSOSTSATTOSSA ATO KU - fluorescent probe B- asip -
ОБАМА СС СССАТССАТСОСТОСЮТ -ТАМКА - прямий праймер МУСМ - З ССССТОСОСЕСТОСОСССОС ТЕКУ - зворотній праймер МУСМ - У ССС АС АСВ АСТСАЛЕЮТУ - флюоресцентний зонд МУСМ -OBAMA SS SSSATSSATSOSTOSTOSYUT -TAMKA - forward primer MUSM - WITH SSSSTOSOSESTOSSOSSOS TEKU - reverse primer MUSM - IN SSS AS ASV ASTSALEYUTU - fluorescent probe MUSM -
УК СССАСССТСТОСИСТО ТО СТО СОТ. ТАМЕАCC SSSASSSTSTOSISTO TO STO SOT. TAMEA
Праймери використовували в концентрації ЗО нМ/т!, та зонди в концентрації 20 нМ/т!1. Для проведення реакції ампліфікації готували реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер (МУСМ), 1 мкл зворотній праймер (МУСМ), 1 мкл флюоресцентний зонд (МУСМ), 1 мкл прямий праймер (В- асійп), 1 мкл зворотній праймер (В-асійпй), 1 мкл флюоресцентний зонд (В-асійп) 1,5 мкл ПЛР- води, 12,5 мкл ТадМап Опімегзаї РОСА Мавієї Міх ("Арріїєй Вуозузіетв", США). До суміші додавали 5 мкл розчину ДНК.Primers were used at a concentration of 30 nM/t!, and probes at a concentration of 20 nM/t!1. To carry out the amplification reaction, the reaction mixture was prepared: 1 μl of forward primer (MUSM), 1 μl of reverse primer (MUSM), 1 μl of fluorescent probe (MUSM), 1 μl of forward primer (B-asciip), 1 μl of reverse primer (B-asciip ), 1 μl fluorescent probe (B-assayp) 1.5 μl PCR-water, 12.5 μl TadMap Opimegzai ROSA Mawiei Mich ("Arriei Wuozuzietv", USA). 5 μl of DNA solution was added to the mixture.
Ампліфікацію проводили на приладі 7300/7500 Аеаі-Тіте РОСА Бувієтв, "АрріїєаAmplification was carried out on the device 7300/7500 Aeai-Tite ROSA Buvietv, "Arriiea
Віозувзівєтв", (США), використовуючи наступний температурний режим: початок ампліфікації при 9570-5 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів 94 "0-3 с, 58 70-6 б. і 7270-27 б. та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 70-15 с, 60 "0-30 с, 95 70-15 б.Viozuvzivetv", (USA), using the following temperature regime: the beginning of amplification at 9570-5 min, accumulation of the amplification product during 50 cycles 94 "0-3 s, 58 70-6 b. and 7270-27 b. and the dissociation stage (separation of the obtained products by melting point) 95 70-15 s, 60 "0-30 s, 95 70-15 b.
Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу, згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Кількість копій гена МУСМ розраховують за формулою: хе 2 сіAfter the end of the amplification reaction, the results were recorded in real time, according to the recommendations of the device manufacturer. The number of copies of the MUSM gene is calculated according to the formula: xe 2 si
Ко) де х - кількість копій гена МУСМ,Ko) where x is the number of copies of the MUSM gene,
Дої-сі (В-асіїп) - сії (МУСМ) (б.Doi-si (V-asiip) - siyi (MUSM) (b.
Як негативний контроль використовували ДНК, отриману з тканини головного мозку, а позитивний - ДНК зразків з верифікованою ампліфікацією гена МУСМ.DNA obtained from brain tissue was used as a negative control, and DNA from samples with verified amplification of the MUSM gene was used as a positive control.
Відсутність ампліфікації гена МУСМ в пухлинній клітині свідчить про сприятливий перебіг захворювання та дозволяє оптимізувати програму терапії хворого. Виявлення більше 10 копій ампліфікації гена МУСМ в пухлинній клітині свідчить про несприятливий перебіг захворювання та відносить хворих до "групи високого ризику".The absence of amplification of the MUSM gene in the tumor cell indicates a favorable course of the disease and allows optimizing the patient's therapy program. Detection of more than 10 copies of MUSM gene amplification in a tumor cell indicates an unfavorable course of the disease and refers patients to the "high risk group".
Переконливими прикладами ефективності запропонованого способу є представлені результати молекулярно-генетичних досліджень біологічного матеріалу хворих.Convincing examples of the effectiveness of the proposed method are the presented results of molecular genetic studies of the biological material of patients.
Ї Хворий Б. Д. Д. 2007 р. н., (амб. медична карта Мо 113523). Госпіталізований на консультацію в Національний інститут раку з діагнозом нейробластома лівого наднирника, з метастазами в печінку, парааортальні лімфовузли, кістковий мозок. Патогістологічний висновок (ПГ3) Мо 62117 від 02.12.201: нейробластома лівого наднирника, з метастазами печінку парааортальні лімфовузли, кістковий мозок, 4 стадія. В 2011 року було проведено операцію по резекції пухлини.І Patient B. D. D., born in 2007, (amb. medical card Mo 113523). Hospitalized for consultation at the National Cancer Institute with a diagnosis of neuroblastoma of the left adrenal gland, with metastases in the liver, para-aortic lymph nodes, and bone marrow. Pathohistological conclusion (PG3) Mo 62117 from 02.12.201: neuroblastoma of the left adrenal gland, with metastases of the liver, para-aortic lymph nodes, bone marrow, stage 4. In 2011, an operation to resect the tumor was performed.
У хворого отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки, які містили 0,3 мл середовища для транспортування виробництва "Атрбіоп", (США), для стабілізації ДНК. Матеріал призначений для виділення ДНК, зберігався при температурі 2-8 "С протягом 1 доби або довготривало при -70 "С.The patient received biopsy material of the tumor before treatment. The tumor biopsies were placed in microtubes containing 0.3 ml of medium for transportation manufactured by Atrbiop (USA) for DNA stabilization. The material is intended for DNA isolation, stored at a temperature of 2-8 "C for 1 day or long-term at -70 "C.
Парафінізовану тканину звільняли від парафіну методом депарафінізації за допомогою ксилолу, згідно з методичними рекомендаціями. Геномну ДНК з пухлинної тканини виділяли методом адсорбції нуклеїнових кислот на "віїйса" мембрані за допомогою колонок "СОІАатрОМАParaffinized tissue was freed from paraffin by the method of deparaffinization using xylene, according to methodical recommendations. Genomic DNA from the tumor tissue was isolated by the method of nucleic acid adsorption on the "viiisa" membrane using "SOIAatroMA" columns
Міпіки" (ОІАСЕМ", США), згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Для роботи з ДНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, з маркуванням "Нпазе-ігее", "Опазе-їтеє". Використаний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 95-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти.Mipiky" (OIASEM", USA), according to the recommendations of the manufacturer. To work with DNA, only disposable sterile plastic materials were used, marked "Npaze-igee", "Opaze-itee". Used plastic utensils (tubes, tips) were disinfected in a special container containing a disinfectant 5% chloramine solution or 1N hydrochloric acid solution.
Отриманий зразок ДНК одразу використовували для постановки полімеразної ланцюгової реакції або зберігали (впродовж 7 днів при 2-8 "С, впродовж 1 року при температурі мінус 207 бо та довготривало при -70 "С).The obtained DNA sample was immediately used for polymerase chain reaction or stored (for 7 days at 2-8 "С, for 1 year at a temperature of minus 207 °C and long-term at -70 "С).
Перед проведенням реакції ампліфікації концентрацію отриманої ДНК доводили до 10-20 нг/мкл. Вимірювання концентрації ДНК проводили методом спектрофотометрії на спектрофотометрі МапоОгор1000 ("Тнептовсієпійіс", США).Before carrying out the amplification reaction, the concentration of the obtained DNA was adjusted to 10-20 ng/μl. DNA concentration was measured by spectrophotometry on a MapoOhor1000 spectrophotometer ("Tneptovsiepiyis", USA).
Послідовності праймерів та ТадМап зондів були підібрані нами з використанням програмиSequences of primers and TadMap probes were selected by us using the program
Ргітег Ехргез5Ф Боїймаге м3.0 ("АрріїєдВіовувієтв", США) та синтезовані фірмою "АрріїєаВіозувієтв" (США): - прямий праймер р-асіп - ГТС АСССАСАСТОТОСССАТСТАСОСАВ - зворотній праймер р-асііп - З САОСОСААССОСТСАТТОССААТОАВ - флуоресцентний зонд р-асійп - -БАМ АТС ССТОССССАТОССАТОСТОСИТ-ТА МВА - прямий праймер МУСМ - З -СССТОСКСТСТОССОССТТУ - зворотній праймер МУСМ - МОНА АСТАСААСТСАТСТТВЕ - флуоресцентний зонд МУСМ -Rgiteg Ehrgez5F Boiimage m3.0 ("ArriedViovuvietv", USA) and synthesized by the company "ArriedViovuvietv" (USA): - forward primer p-assip - GTS АСССАСАСТОССSATСТАСОСАВ - reverse primer r-асип - Z САОСОСАССОСТСТОССААТОАВ - fluorescent probe r-асип - -BAM АТС ССТОСССАТОССАТОСТОСИТ-ТА МВА - direct primer МУСМ - З -СССТОССТСТОССОСТТУ - reverse primer МУСМ - MONA АСТАСАСТСАСТТВЕ - fluorescent probe МУСМ -
АОС ССС ОО ССО ГГ ТАМКАAOS SSS OO SSO GG TAMKA
Праймери використовували в концентрації ЗО нНМ/Лп1, та зонди в концентрації 20 нМ/ті!1.Primers were used at a concentration of 30 nM/Lp1, and probes at a concentration of 20 nM/ti!1.
Для проведення реакції ампліфікації готували реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер (ММСМ), 1 мкл зворотній праймер (МУСМ), 1 мкл флуоресцентний зонд (МУСМ), 1 мкл прямий праймер (В-асійп), 1 мкл зворотній праймер (р-асіїп), 1 мкл флуоресцентний зонд (В-асійп) 1,5 мкл ПЛР- води, 12,5 мкл ТадМап Опімегзаї РОСА Мавієї Міх ("Арріїєй Вуозузіетв", США). До суміші додавали 5 мкл розчину ДНК.To carry out the amplification reaction, the reaction mixture was prepared: 1 μl of forward primer (MMSM), 1 μl of reverse primer (MUSM), 1 μl of fluorescent probe (MUSM), 1 μl of forward primer (B-asyp), 1 μl of reverse primer (p-asyp ), 1 μl fluorescent probe (B-assayp) 1.5 μl PCR-water, 12.5 μl TadMap Opimegzai ROSA Mawie Mich ("Arriley Wuozuzietv", USA). 5 μl of DNA solution was added to the mixture.
Ампліфікацію проводили на приладі 7300/7500 Аеаі-Тіте РОСА Бувієтв, "АрріїєаAmplification was carried out on the device 7300/7500 Aeai-Tite ROSA Buvietv, "Arriiea
Віозузієтв", США, використовуючи наступний температурний режим: початок ампліфікації при 9570-5 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів 94 70-3 с, 58 "0-6 с і 7270-27 б. та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 70-15 с, 60 "0-30 с, 95 706-156Viozuzietv", USA, using the following temperature regime: the beginning of amplification at 9570-5 min, accumulation of the amplification product during 50 cycles of 94 70-3 s, 58 "0-6 s and 7270-27 b. and dissociation stage (separation of the obtained products by melting point) 95 70-15 s, 60 "0-30 s, 95 706-156
Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу, згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Кількість копій гена МУСМ розраховують за формулою: х-2гаAfter the end of the amplification reaction, the results were recorded in real time, according to the recommendations of the device manufacturer. The number of copies of the MUSM gene is calculated using the formula: x-2ha
Ко) де х - кількість копій гена МУСМ,Ko) where x is the number of copies of the MUSM gene,
Дої-сі (В-асіїп) - сі (МУСМ).Doi-si (V-asiip) - si (MUSM).
Як негативний контроль використовували ДНК, отриману з тканини головного мозку, а позитивний - ДНК зразків з верифікованою ампліфікацією гена МУСМ.DNA obtained from brain tissue was used as a negative control, and DNA from samples with verified amplification of the MUSM gene was used as a positive control.
В результаті досліджень у хворого не було виявлено ампліфікацію гена МУСМ методом ПЦР в режимі реального часу, що свідчити про сприятливий перебіг захворювання. Хворому проведено 8 блоків хіміотерапії по протоколу СОЦЕК після операції. Спостерігається повна відповідь у хворого на лікування та 19 місячна ремісія.As a result of research, amplification of the MUSM gene was not detected in the patient by real-time PCR, which indicates a favorable course of the disease. The patient underwent 8 blocks of chemotherapy according to the SOCEK protocol after surgery. The patient has a complete response to treatment and a 19-month remission.
Я. Хворий В.А.В. 2006 р. н. (амб. медична картка Мо 900581). Госпіталізований на консультацію в Національний інститут раку з діагнозом нейробластома заочеревинного простору справа. ПГЗ Мо 4/2009 від 12.01.2009 нейробластома заочеревинного простору справа, З стадія.Y. Hvoryy V.A.V. Born in 2006 (amb. medical card Mo 900581). Hospitalized for consultation at the National Cancer Institute with a diagnosis of neuroblastoma of the right retroperitoneal space. PGZ Mo 4/2009 dated 12.01.2009 neuroblastoma of the retroperitoneal space on the right, C stage.
У хворого отримували біопсійний матеріал пухлини до лікування. Біоптат пухлини поміщали в мікропробірки, які містили 0,3 мл середовища для транспортування виробництва "Атрбіоп", (США), для стабілізації ДНК. Матеріал призначений для виділення ДНК, зберігався при температурі 2-8 "С протягом 1 доби або довготривало при -70 "С.The patient received biopsy material of the tumor before treatment. The tumor biopsies were placed in microtubes containing 0.3 ml of medium for transportation manufactured by Atrbiop (USA) for DNA stabilization. The material is intended for DNA isolation, stored at a temperature of 2-8 "C for 1 day or long-term at -70 "C.
Парафінізовану тканину звільняли від парафіну методом депарафінізації за допомогою ксилола, згідно з методичними рекомендаціями.Paraffinized tissue was freed from paraffin by the method of deparaffinization using xylene, according to methodical recommendations.
Геномну ДНК з пухлинної тканини виділяли методом адсорбції нуклеїнових кислот на "віїїса" мембрані за допомогою колонок "ОІАатрОМА Міпіки" ("СОІАСЕМ", США), згідно з рекомендацією фірми-виробника. Для роботи з ДНК використовували тільки одноразові стерильні пластикові матеріали, з маркуванням "Нпазе-їтеє", "Опавзе-їеєєе". Використаний пластиковий посуд (пробірки, наконечники) знезаражували в спеціальному контейнері, який містить дезінфікуючий 5 уо-ний розчин хлораміну або 1Н розчин соляної кислоти.Genomic DNA from the tumor tissue was isolated by the method of adsorption of nucleic acids on the "viiisa" membrane with the help of the columns "OIAtroMA Mipica" ("SOIASEM", USA), according to the recommendation of the manufacturer. To work with DNA, only disposable sterile plastic materials were used, marked "Npaze-itee", "Opavze-yeeeee". Used plastic dishes (tubes, tips) were disinfected in a special container containing a disinfectant 5% chloramine solution or 1N hydrochloric acid solution.
Отриманий зразок ДНК одразу використовували для постановки полімеразної ланцюгової реакції або зберігали (впродовж 7 днів при 2-8 "С, впродовж 1 року при температурі мінус 20 "С та довготривало при -70 "С).The obtained DNA sample was immediately used for polymerase chain reaction or stored (for 7 days at 2-8 "C, for 1 year at minus 20 "C and long-term at -70 "C).
Перед проведенням реакції ампліфікації концентрацію отриманої ДНК доводили до 10-20 нг/мкл. Вимірювання концентрації ДНК проводили методом спектрофотометрії на спектрофотометрі МапоОгор1000 ("Тнептовсієпійіс", США).Before carrying out the amplification reaction, the concentration of the obtained DNA was adjusted to 10-20 ng/μl. DNA concentration was measured by spectrophotometry on a MapoOhor1000 spectrophotometer ("Tneptovsiepiyis", USA).
Послідовності праймерів та ТадМап зондів були підібрані нами з використанням програмиSequences of primers and TadMap probes were selected by us using the program
Ргітег Ехргез5Ф Боїймаге м3.0 ("АрріїєдВіовувієтв", США) та синтезовані фірмою "АрріїєаВіозувієтв" (США): - прямий праймер Р-асіп - З ТСАСССАСАСЄТО ОСОСАТСТАСВАХУ - зворотній праймер Р-асіїп - З САССОЗАЛОСОСТСАТТОССААТОА Є - флуоресцентний зонд Р-асіїйп - еКАМ АНТ КАТ САС ТА МКА - прямий праймер МУСМ -Rgiteg Ehrgez5F Boiimage m3.0 ("ArriedViovuvietv", USA) and synthesized by the company "ArriedViovuvietv" (USA): - forward primer P-asip - Z TSASSSASASACETO OSOSATSTASVAHU - reverse primer R-asip - Z SASSOZALOSOSTSATTOSSAATOA E - fluorescent probe R-asip - eKAM ANT CAT SAS AND MKA - direct primer MUSM -
КОТ ОО СОСKOT OO SOS
- зворотній праймер МУСМ -- reverse primer MUSM -
ГО ААСТАСААСТСАТСТТКGO AASTASAASTSATSTTK
- флуоресцентний зонд МУСМ - ув АС АССЦСТСТОСОО ОСТ СО ОТГ А ТАМ- fluorescent probe MUSM - in AS ASSCSTSTOSOO OST SO OTG A TAM
Праймери використовували в концентрації ЗО нМ/т!, та зонди в концентрації 20 нМ/т!1. Для проведення реакції ампліфікації готували реакційну суміш: 1 мкл прямий праймер (МУСМ), 1 мкл зворотній праймер (МУСМ), 1 мкл флуоресцентний зонд (МУСМ), 1 мкл прямий праймер (ВД- асінп), 1 мкл зворотній праймер (р-асііп), 1 мкл флуоресцентний зонд (В-асіїп) 1,5 мкл ПЛР-води, 12,5 мкл ТадМап Опімегза! РОСА Мавієг Міх ("Арріїеєд Вуозузієтв", США). До суміші додавали 5 мкл розчину ДНК.Primers were used at a concentration of 30 nM/t!, and probes at a concentration of 20 nM/t!1. To carry out the amplification reaction, the reaction mixture was prepared: 1 μl forward primer (MUSM), 1 μl reverse primer (MUSM), 1 μl fluorescent probe (MUSM), 1 μl forward primer (VD-acynp), 1 μl reverse primer (p-acynp ), 1 μl fluorescent probe (B-assip) 1.5 μl PCR-water, 12.5 μl TadMap Opimegza! ROSA Mawieg Mich ("Arriyeed Voozuzietv", USA). 5 μl of DNA solution was added to the mixture.
Ампліфікацію проводили на приладі 7300/7500 Аеаі-Тіте РОСА Бувієтв, "АрріїєаAmplification was carried out on the device 7300/7500 Aeai-Tite ROSA Buvietv, "Arriiea
Віозузієтв", США, використовуючи наступний температурний режим: початок ампліфікації при 9570-5 хв, накопичення ампліфікаційного продукту протягом 50 циклів 94 "0-3 с, 58 70-6 б. і 7270-27 б. та стадія дисоціації (розділення отриманих продуктів за температурою плавлення) 95 70-15 с, 60 "0-30 с, 95 "С-15 с.Viozuzietv", USA, using the following temperature regime: the beginning of amplification at 9570-5 min, accumulation of the amplification product during 50 cycles 94 "0-3 s, 58 70-6 b. and 7270-27 b. and the dissociation stage (separation of the obtained products by melting point) 95 70-15 s, 60 "0-30 s, 95 "С-15 s.
Після закінчення реакції ампліфікації проводили облік одержаних результатів в режимі реального часу, згідно з рекомендаціями фірми-виробника приладу. Кількість копій гена МУСМ розраховують за формулою: хе 2 сі де х - кількість копій гену МУСМ,After the end of the amplification reaction, the results were recorded in real time, according to the recommendations of the device manufacturer. The number of copies of the MUSM gene is calculated according to the formula: xe 2 si where x is the number of copies of the MUSM gene,
Зо Деї-сі (В-асіїп) - сі (МУСМ).From Dei-si (V-assiip) - si (MUSM).
Як негативний контроль використовували ДНК отриману з тканини головного мозку, а позитивного - ДНК зразків з верифікованою ампліфікацією гена МУСМ.DNA obtained from brain tissue was used as a negative control, and DNA from samples with verified amplification of the MUSM gene was used as a positive control.
В результаті досліджень методом ПЦР в режимі реального часу, у хворого було виявлено 512 копій гена МУСМ, що свідчить про належність хворого до "групи високого ризику" та передбачає поганий прогноз. Після повторного проведення досліджень методом ПЦР в режимі реального часу з використанням парафінізованого операційного матеріалу було виявлено 512 копій гена МУСМ. Хворий належить до "групи високого ризику" Йому проведено 8 блоків хіміотерапії за протоколом НА-МВІ-1/ЕБІОР. Спостерігалась неповна відповідь на лікування.As a result of real-time PCR studies, 512 copies of the MUSM gene were found in the patient, which indicates that the patient belongs to the "high-risk group" and predicts a poor prognosis. After repeated research by real-time PCR using paraffinized operating material, 512 copies of the MUSM gene were detected. The patient belongs to the "high risk group". He underwent 8 blocks of chemotherapy according to the NA-MVI-1/EBIOR protocol. An incomplete response to treatment was observed.
Через 1 рік у хворого розвився рецидив. Враховуючи належність хворого до "групи високого ризику" та ускладнень під час проведення хіміотерапії, прогноз захворювання несприятливий.After 1 year, the patient developed a relapse. Taking into account the patient's belonging to the "high risk group" and complications during chemotherapy, the prognosis of the disease is unfavorable.
Таким чином, визначення наявності ампліфікації гена МУСМ в пухлинній тканині за допомогою молекулярно-генетичних методів, а саме полімеразно-ланцюгової реакції в режимі реального, дозволяє передбачити ризик виникнення несприятливого прогнозу перебігу захворювання, своєчасно визначити "групи ризику" хворих та забезпечити можливість оптимізації програм терапії вже на перших етапах лікування.Thus, determining the presence of amplification of the MUSM gene in tumor tissue using molecular genetic methods, namely polymerase chain reaction in real mode, allows predicting the risk of an unfavorable prognosis of the course of the disease, timely identifying "risk groups" of patients and ensuring the possibility of optimizing therapy programs already at the first stages of treatment.
Джерела інформації: 1. Ткгадегб. Мешигобіазюта: іпсідепсе, Біоіосду апа оцісоте / С. Тгадег. - «осКНоїЇт: КагоїїпеоКаSources of information: 1. Tkgadegb. Meshygobiazyuta: ipsidepse, Bioiosdu apa otsisote / S. Tgadeg. - "OsknoiIt: KagoiiipeoKa."
Іпзійшес, 2009. - 56 р. 2. ВеаїЇ-їте диапійайме РОСА ог Ше теєавзигетепі ої МУСМ аптрійїісайоп іп питап пешигоріазіота м/йй Ше ТадМап аеїесійоп зузієт / С. Вадді, М. Вадпопі, сх. Топіпі Геї а // Сііп.Ipziyshes, 2009. - 56 years 2. VeaiYi-ite diapiyaime ROSA og She teeavzygetepi oi MUSM aptriyiisayop ip pitap peshihoriaziota m/yy She TadMap aeiyesiyop zuziet / S. Vaddi, M. Vadpopi, skh. Topipi Gei a // Siip.
Спнет. - 1999. - Мої. 45, Мо 11. - Р. 1918-1924.Turn off - 1999. - Mine. 45, Mo. 11. - R. 1918-1924.
З. Сіїпіса! відпі'тісапсе ої МУСМ атрійісайоп апа ріоіду іп Тамогаріє-5їаде пепгобіазюта: а героп їот Ше Спіідгеп'є ОпсоЇоду Стоир / ). Зсппеіденптап, МУ. І опдоп, С. Вгодеитг Геї а!) // 9. Сіїп.Z. Siipisa! vidpi'tisapse oi MUSM atriiisayop apa rioidu ip Tamogariye-5iade pepgobiazyuta: a gerop iot She Spiidgepye OpsoYodu Stoyr / ). Zsppeidenptap, MU. And opdop, S. Vgodeitg Gei a!) // 9. Siip.
Опсо). - 2008. - Мої. 26, Ме 6. - Р. 913-918. 4. СОцапійайме Неа!-іте РСВ ог диіскК вітийапеоив дегептіпаїйоп ої Іегару-в5ігайуїпу такеOpso). - 2008. - Mine. 26, Me 6. - R. 913-918. 4. SOtsapiyaime Nea!-ite RSV og diiskK vitiyapeoiv degeptipaiiop oi Iegaru-v5igayuipu such
МУСМ атріїйісайоп, адеїейоп Тр апа 114 / М. Воепзсі, А. Обепиег, М. РізеНег Геї а. // Оіадп. Мої.MUSM atriiiisayop, adeiyeop Tr apa 114 / M. Voepzsi, A. Obepieg, M. Rizeneg Geyi a. // Oiadp. My.
Раїної. - 2005. - Мої. 14, Мо 3. - Р. 177-182 (прототип). 5. Виділення нуклеїнових кислот з клінічного матеріалу: методичні рекомендацій / Н.Г.Raina - 2005. - Mine. 14, Mo. 3. - R. 177-182 (prototype). 5. Isolation of nucleic acids from clinical material: methodological recommendations / N.G.
Горовенко, 3.1. Россоха, С.В. Подольська |га ін.|. - К., 2010. - 39 с.Horovenko, 3.1. Rossokha, S.V. Podolska |ha and others|. - K., 2010. - 39 p.
6. біпда! А. Титог таКегз іп реаіайіс зоїїд їштогз / А. Зіпдаї, 5. Адагмаїа // 9. Іпаіап. Авзвос6. bipda! A. Tytog taKegz ip reaiaiis zoiid yshtogz / A. Zipdaii, 5. Adagmaia // 9. Ipaiap. Avzvos
Реадіаїг. Зигу. - 2005. - Мої. 10, Мо 3. - Р. 183-190.Readiaig. Zygu - 2005. - Mine. 10, Mo. 3. - R. 183-190.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201308500U UA86355U (en) | 2013-07-08 | 2013-07-08 | Method for detection of mycn amplification in children with neuroblastoma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201308500U UA86355U (en) | 2013-07-08 | 2013-07-08 | Method for detection of mycn amplification in children with neuroblastoma |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA86355U true UA86355U (en) | 2013-12-25 |
Family
ID=52286027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU201308500U UA86355U (en) | 2013-07-08 | 2013-07-08 | Method for detection of mycn amplification in children with neuroblastoma |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA86355U (en) |
-
2013
- 2013-07-08 UA UAU201308500U patent/UA86355U/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220325350A1 (en) | Methods, compositions, and devices for rapid analysis of biological markers | |
| US20230348971A1 (en) | Transposition into native chromatin for personal epigenomics | |
| US20230181173A1 (en) | Methods, compositions, kits and devices for rapid analysis of biological markers | |
| JP2015530096A (en) | Multiplex pyrosequencing using non-interfering, noise-cancelling polynucleotide identification tags | |
| Afrin et al. | Targeted next-generation sequencing for detecting MLL gene fusions in leukemia | |
| ES2767853T3 (en) | Detection of immunoglobulin light chain restriction by in situ hybridization of RNA | |
| JP2017530710A (en) | Polymerase chain reaction primers and probes for Mycobacterium tuberculosis | |
| Wang et al. | Nanolock–nanopore facilitated digital diagnostics of cancer driver mutation in tumor tissue | |
| CN103993083A (en) | Method for detecting activity of DNA methylase and DNA methyltranseferase by unlabeled fluorescent detection based on restriction endonuclease and exonuclease III | |
| AU2017348369B2 (en) | Detection method | |
| JP2018504123A5 (en) | ||
| US20240084389A1 (en) | Use of simultaneous marker detection for assessing difuse glioma and responsiveness to treatment | |
| UA86355U (en) | Method for detection of mycn amplification in children with neuroblastoma | |
| CN103866024A (en) | Pyrosequencing-based method for detecting tolerance of mycobacterium tuberculosis ethambutol | |
| JP2014187934A (en) | Detection method of target nucleic acid | |
| US11162141B2 (en) | Molecular pathogenesis of microcarcinoma of the thyroid | |
| JP6551656B2 (en) | Method for obtaining information on ovarian cancer, and marker for obtaining information on ovarian cancer and kit for detecting ovarian cancer | |
| Beaver et al. | Circulating cell-free DNA for molecular diagnostics and therapeutic monitoring | |
| EP2818865A1 (en) | Method for the identification of effective drugs |