UA74529C2 - CASH (CASPASE HOMOLOGUE) WITH ôDEATH-EFFECTOR" DOMAIN, MODULATORS OF FAS-RECEPTOR FUNCTIONS - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід в цілому стосується галузі науки, що вивчає рецептори, які належать до суперсімейства 2 ТМЕ/МОв-рецепторів, і контроль за їх біологічними функціями. Суперсімейство ТМЕ/МОР-рецепторів включає такі рецептори як рецептор факторів некрозу пухлин р5Б5 і р75 (т. зв. "ТМЕ-К", що також позначаються, відповідно, як СО120а і СО120р: в даному тексті вони позначатимуться як р55-К і р/7/5-К) та рецептори ЕРАз-лігандів (що також позначаються як РЕАБ/АРОТ чи ГАЗ-К, або СОО5, а в даному тексті вони позначатимуться як РА5-К) та інші. Конкретніше, цей винахід стосується нових білків, що зв'язуються з іншими білками, які самі зв'язуються 70 з більом МОВТ-1 (або ЕАОЮ): вони також називаються МОКТ-1-зв'язними білками, або стосується білків, які прямо зв'язуються з білюм МОКТ-1, а конкретніше винахід стосується одного такого білка, який позначено тут як 1 (також позначається як "САБН" для "гомолога каспази", але далі буде називатися як "(1"), який зв'язується з МОКТ1-зв'язним білком Меп4 (що також позначається/називається як САБР-10) і, по-видимому, зв'язується з іншим МОКТ1-зв'язним, що називається МАСН (що також позначається/називається як СА5Р-8), і, 12 ймовірно, сам прямо зв'язується з МОКТ-1.

Відповідно, даний винахід, в принципі, стосується нових білків, які здатні модулювати або опосередковувати функції МОКТ-1 прямо чи непрямо або інших білків, що зв'язуються з МОКТ-1 прямо чи непрямо. Зокрема, цей винахід стосується білка С1, його одержання та його використання, а також деяких нових ізоформ С1, їх одержання та використання.

Фактор некрозу пухлин (ТМЕ-о) і лімфотоксин (ТМЕ-р) (далі абревіатура ТМЕ буде стосуватись і ТМР-А, і

ТМЕ-р) є багатофункціональними прозапальними цитокінами, які утворюються в основному моноядерними фагоцитуючими клітинами, що справляють різноманітні ефекти на клітини (ММаїЇаси, 1986, Іп "Іпіепегоп 7", ей.

Бу І.Сгеззег, Асад. Ргезв, І опаоп, рр.83-122; і Вешег 5 Сегаті, 1987). | ТМЕ-А, і ТМЕ-Д виявляють свою активність ре шляхом зв'язування з специфічними поверхнево-клітинними рецепторами. Деякі з їх проявів, певно, є с позитивними для організму: наприклад, вони можуть руйнувати пухлинні клітини або клітини, заражені вірусами, (о) і зумовлювати протибактеріальну активність гранулоцитів. В цьому випадку ТМЕ є факторами захисту організму проти пухлин і інфекційних агентів і беруть участь в загоєнні ран. Таким чином, ТМЕ можуть використовуватись в якості протипухлинного засобу, при застосуванні якого він зв'язується з своїми рецепторами на поверхні Фу 20 пухлинних клітин і таким чином ініціює події, що ведуть до загибелі пухлинних клітин. Також ТМЕ можуть використовуватись в якості протиінфекційних агентів. с

Однак, і ТМЕ-А, і ТМЕ-дД також мають негативні прояви. Існують докази того, що надлишкове продукування ою

ТМЕ-о, може відігравати основну патогенетичну роль у розвитку деяких захворювань. Наприклад, дія ТМЕ-о, в першу чергу на судинну систему, відома як головна причина розвитку симптомів септичного шоку |Ггасеу еї аї)., « 1986). При деяких захворюваннях ТМЕ може зумовлювати істотну втрату ваги (кахексію) шляхом пригнічення ча активності адипоцитів призводячи до анорексії, що привело до позначення ТМЕ- ж як кахетину. Також було описано, що ТМЕ-у є медіатором пошкоджень тканин при ревматичних захворюваннях |ІВешег 5 Сегаті, 1987) і основним медіатором пошкоджень, що спостерігаються при синдромі "трансплантат проти хазяїна" |Рідцеї еї « а!., 19871. Крім того, ТМЕ відомий як учасник запального процесу і багатьох інших захворювань.

Два рецептори, що чітко розрізняються і незалежно екс-пресуються - рбо5 і р/5 ТМЕ-К - які специфічно - с зв'язують і ТМЕ-о, і ТМЕ-Д, ініціюють та (або) опосередковують описані вище біологічні прояви ТМЕ. Ці два ц рецептори включають різні за структурою внутрішньоклітинні домени, що вказує на відмінність їх сигнальної "» активності |див. Ноптапп еї аї., 1989; Епдеітапп еї аї., 1990; Вгоскпаиз еї аїЇ.,, 1990; І еоївспег еї аї., 1990; 5снаїЇ еї аїЇ., 1990; Морнаг еї аї., 1990; тій еї аЇ., 1990; і Нейег еї аїЇ., 1990). Однак доки точно не встановлені клітинні механізми, за якими діють, наприклад, різні білки і, по-видимому, інші фактори, - І втягнуті в внутрішньоклітинну передачу сигналів на рецептори рб5б5 і р/5 ТМЕ-К. При цьому існує внутрішньоклітинний сигнальний шлях, який є активним зазвичай після зв'язування рецепторів свого ліганду, те тобто ТМЕ (о або р), і який асоційований з запуском каскаду реакцій, що, врешті-решт, приводять до відповіді 1 клітин на ТМЕ, що спостерігається. 7 50 З точки зору зазначеної вище цитотоксичної дії ТМЕ в більшості вивчених до нинішнього часу типів клітин даний прояв опосередковується в основному рецептором ро55 ТМЕ-К. Антитіла до позаклітинних доменів (тобто іЧе) доменів зв'язування ліганду) рецептора ро5 ТМЕ-К самі можуть опосередковувати цитотоксичну дію Ідив. ЕР 412486), що корелює з ефективністю перехресного зшивання рецептора з антитілами, що розглядається як перший етап в запуску внутрішньоклітинного сигнального механізму. Далі, мутаційний аналіз |Вгакеризсі еї аї., 1992; Тападіа ей аЇ.,, 1993| показав, що біологічні функції роб ТМЕ-К залежать від складання його о внутрішньоклітинного домену: відповідно, було підтверджено, що запуск внутрішньоклітинного сигнального механізму, який веде до цитотоксичної дії ТМЕ, є наслідком зв'язування двох або більшого числа іме) внутрішньоклітинних доменів роб ТМЕ-К. Більше того, ТМЕ (о; і В) є гомотримером, а оскільки це так, було підтверджено, що індукція внутрішньоклітинного сигнального механізму через ро5 ТМЕ-К відбувається завдяки 60 його здатності зв'язуватися і утворювати поперечні зшивки з молекулами рецепторів, тобто утворювати агрегації рецепторів.

Іншим членом суперсімейства ТМЕ/МОЕ-рецепторів є РАбЗ-рецептор (БАБ-К), що також називають

ЕАзЗ-антигеном: це поверхнево-клітинний білок, що експресується в різних тканинах і виявляє схожість з рядом інших поверхнево-клітинних рецепторів, включаючи ТМЕ-К і МОБ-К. Рецептор РГА5Б-К опосередковує загибель 65 клітин по типу апоптозу (МОП еї аї., 1991) і, по-видимому, працює як негативний селектор авто-реактивних

Т-лімфоцитів: тобто в ході визрівання Т-лімфоцитів ЕАБ-К опосередковує апоптотичну загибель Т-клітин, що розпізнають власні антигени. Також Ірг було встановлено, що мутація в гені РА5Б-К (мутації Ірг) зумовлюють лімфопроліферативний розлад у мишей, що нагадує системний червоний вовчак, який є автоїмунним захворюванням людини |(М/аїапабе-РикКипада еї аї., 19921. Лігандом для рецептора ГА5Б-К, як припускається, є

Молекула, що асоціюється з клітинною поверхнею, яку несуть, окрім інших типів клітин, Т-кілери (або цитотоксичні Т-лімфоцити - СТІ): відповідно, коли такі СТІ контактують з клітинами, що несуть ГАБ-К, вони здатні індукувати апоптотичну загибель клітин, що несуть ГА5Б-К. Крім того, було сформовано моноклональне антитіло, що є специфічним щодо ГА5-К, це моноклональне антитіло здатне індукувати загибель несучих ЕА5-К клітин по типу апоптозу, включаючи мишачі клітини, трансформовані внесенням кКДНК, що кодує ЕАБ-К людини 7/0 Шон еїа)., 19911.

При тому, що цитотоксична дія лімфоцитів опосередковується взаємодією ліганду, що продукується лімфоцитами, з широко розповсюдженим поверхнево-клітинним рецептором РБАБ-К (СО95), який здатен запускати механізм загибелі клітин, також було встановлено, що різні інші нормальні клітини, окрім

Т-лімфоцитів, експресують ГА5Б-К на своїй поверхні і можуть бути вбиті опосередковано дією цього рецептора. 7/5 Припускається, що неконтрольована індукція такої загибелі є фактором тканинних пошкоджень при певних захворюваннях, наприклад, руйнування клітин печінки при гострому гепатиті. Відповідно, виявлення шляхів стримування цитотоксичної активності РАБ-К може мати терапевтичне значення.

З іншого боку, оскільки було також виявлено, що деякі клітини злоякісних пухлин і клітини, заражені ВІЛ, несуть ЕАБ-К на своїй поверхні, антитіла до ГА5Б-К або ліганду ЕА5Б-К можуть використовуватись для контролю опосередковуваної ГАБ-К цитотоксичної дії на такі клітини і завдяки цьому служити способом боротьби з клітинами злоякісних пухлин або клітинами, зараженими ВІЛ |див. Мой еї аї., 1991). Відкриття ще якихось шляхів підсилення цитотоксичної активності ЕАБ-К також може мати терапевтичне значення.

Очевидно, має місце нагальна необхідність розробки способу модулювання клітинних відповідей на ТМЕ (о, або В) і ліганд ЕА5Б-К. Наприклад, при описаних вище патологіях, коли спостерігається надекспресія ТМЕ або с

Лліганду ЕА5-К, бажаним стає пригнічення цитотоксичної дії, що індукується ТМЕ або лігандом РАЗ5-К, в той час як при інших ситуаціях, наприклад, при загоєнні пошкоджень, бажаним виявляється підсилення дії ТМЕ, або у і) випадку з РГАБ-К у відношенні пухлинних або ВІЛ-заражених клітин бажаним є підсилення ефекту, що викликається ЕАЗ-К.

Заявниками було запропоновано ряд відповідних підходів |див., наприклад, заявки на європейські патенти Ге») 3о МоМо ЕР-186833, ЕР-308378, ЕР-398327 і ЕР-412486), спрямованих на контроль негативної дії ТМЕ шляхом пригнічення зв'язування ТМЕ на їх рецепторах з використанням антитіл до ТМЕ або з використанням розчинних с рецепторів ТМЕ (тобто достатніх для розчинення позаклітинних доменів таких рецепторів) з метою створення ю конкуренції за зв'язування ТМЕ на рецепторах ТМЕ-К, розташованих на клітинних поверхнях. Крім того, на основі того, що зв'язування ТМЕ з їх рецепторами є необхідним для прояву відповідних індукованих ефектів ТМЕ, в

Зз5 заявники пропонували підходи |див., наприклад, ЕРО-568925), скеровані на модулювання дії ТМЕ шляхом зміни ї- активності рецепторів ТМЕ-К.

Коротко, заявка ЕРО-568925 стосується способу модулювання передачі сигналу і (або) розщеплення ТМЕ-К таким чином, щоб пептиди або інші молекули могли взаємодіяти або з самим рецептором, або з ефекторними білками, які взаємодіють з цим рецептором, внаслідок чого забезпечується модуляція нормальної функції ТМЕ-К. « 20 ІВ заявці ЕРО-568925)| описана конструкція і подана характеристика різних мутантних форм ро5 ТМЕ-К, що шщ с мають мутації в складі позаклітинного, трансмембранного і внутрішньоклітинного доменів ро5 ТМЕ-К. В цьому й випадку були ідентифіковані ділянки цих доменів в складі роб ТМЕ-К, що є ключовими з точки зору забезпечення «» функцій рецептора, тобто зв'язування свого ліганду (ТМЕ) і подальшої передачі сигналу й запуску внутрішньоклітинного сигнального механізму, які, врешті-решт, і приводять до проявів дії ТМЕ на клітини, що спостерігаються. Крім того, також описаний ряд підходів до виділення й ідентифікації білків, пептидів або -і інших факторів, що здатні зв'язуватися з різними ділянками зазначених вище доменів ТМЕ-К, білки, пептиди та інші фактори яких можуть втягуватись в регулювання або модулювання активності рецептора ТМЕ-К. Також (|в те заявці ЕРО-568925) подано ряд підходів до виділення і клонування послідовностей ДНК, які кодують такі білки і «сл пептиди, для конструювання експресувальних векторів, призначених для продукування таких білків і пептидів, та одержання антитіл або їх фрагментів, які взаємодіють з ТМЕ-К або з названими вище білками і пептидами, що де зв'язуються з різними сегментами ТМЕ-К. Однак, |(заявка ЕРО-568925) не уточнює параметри білків і пептидів,

Ге) діючих відносно зв'язування з внутрішньоклітинним доменом рецепторів ТМЕ-К (наприклад, роб ТМЕ-К), і не описує "дигібридний дріжджовий підхід" для виділення та ідентифікації таких білків або пептидів, що зв'язуються з внутрішньоклітинними доменами рецепторів ТМЕ-К. Також |в заявці ЕРО-568925) немає опису білків або пептидів, здатних зв'язуватися з внутрішньоклітинним доменом рецептора ГА5-К.

Таким чином, якщо бажаним є пригнічення дії ТМЕ або ліганду ГА5Б-К, повинно бути бажаним зменшити іФ) кількість чи рівень активності ТМЕ-К або РАБ-К на поверхні клітин, у той час як збільшення кількості або ко рівня активності ТМЕ-К або РГА5Б-К повинно бути бажаним тоді, коли прагнуть підсилення дії ТМЕ або ліганду

ЕАБ-К. В зв'язку з цим були секвеновані та проаналізовані промотори генів, які кодують і р55 ТМЕ-К, і р75 бо ТМЕ-К: і були виявлені деякі ключові мотиви послідовностей, для яких була встановлена специфічність відносно до різних транскрипційних факторів: це означає, що експресія цих рецепторів ТМЕ-К може контролюватися на рівні відповідних промоторів - тобто пригнічення транскрипції з промотору веде до зменшення кількості цих рецепторів, а підсилення транскрипції з цих промоторів - до збільшення кількості цих рецепторів (ЕР-606869 і

МО 95/31206). Також ще немає повідомлень про дослідження регуляції ЕА5-К на рівні промотору гену, що кодує б5 цей рецептор.

Хоча і відомо, що рецептори факторів некрозу пухлин (ТМЕ) і структурно схожий рецептор ЕА5-К у відповідь на стимуляцію лігандами, що виробляються лейкоцитами, опосередковують деструктивну активність в межах клітин, що приводить до їх власної загибелі, механізми такого опосередкованого впливу досі остаточно неясні.

Аналіз мутації вказує на те, що БАБ-К і рецептор рб55 ТМЕ (р55-К) втягують різні ділянки своїх внутрішньоклітинних доменів в сигнальні механізми цитотоксичності |ВгаКеризсі еї аі., 1992; Тападіїа еї аї., 1993; Мой 8 Мадаїйа, 1993). Ці сегменти (т.зв. "загибель-домени" або "загибель-ефекторні домени", або "СЕО") характеризуються схожістю амінокислотних послідовностей. "Загибель-домени" в складі БАБ-К і рб5Б-К виявляють тенденцію до самозв'язування. Таке їх самозв'язування, як припускають, сприяє утворенню агрегацій рецепторів, необхідних для ініціації сигнальних механізмів |див. бопо еї аї., 1994; МУаМаси еї аї., 1994; 7/0 Воїаїп еї аї., 1995), а високий рівень інтенсивності експресії рецепторів може приводити до опосередкування незалежних від лігандів сигнальних механізмів (Воіїаїп еї аї., 1995).

Деякі прояви цитотоксичності у лімфоцитів опосередковуються взаємодією ліганду, що виробляється лімфоцитом, з рецептором РАБ-К (СО95) - широко розповсюдженим поверхнево-клітинним рецептором, який здатний опосередковувати загибель клітин (також див. Мадаїа 48: Соївієїп, 1995), і ця загибель клітин 7/5 Моноядерними фагоцитами втягує комплекс "ліганд-рецептор" в складі ТМЕ і його рецептора р55-К (СО120), що структурно подібний до комплексу рецептора ГА5-К і його ліганду (також див. Мапдепабееїйе еї аї., 1995). Як і у випадку з іншими проявами, які індукуються за участю рецепторів, індукція загибелі клітин за участю рецепторів ТМЕ і ЕА5-К відбувається шляхом серії міжбілкових взаємодій, які починаються зі зв'язування білка ліганду і рецептора з можливою активацією ферментних ефекторних функцій, які у випадку, що аналізується, 2о визначають неферментні міжбілкові взаємодії, що ініціюють сигнал про загибель клітин: зв'язування тримерних

ТМЕ або молекул лігандів рецептора БАБ-К з їх рецепторами, що відбувається внаслідок взаємодії їх внутрішньоклітинних доменів ІВгаКеризсі еї а!.,1992; Тагадіїа еї аї., 1993; Цой 5 Мадагїа, 1993), що визначається властивістю "загибель-доменів" (або "загибель-ефекторних доменів", ОЕО) самозв'язуватись |Воїдіп еї аї., 1995а), та індукція зв'язування двох цитоплазматичних білків (що також можуть зв'язуватися один з одним) з сч ов ВНнутрішньоклітинними доменами рецепторів - білка МОКТ-1 (або ГАЮ) з РА5-К |Воіїаіп еї аї., 19956; Спіппаіуап еї аї,, 1995; КізсиКе! еї аіІ., 1995)| та білка ТКАЮО з р5Б5-К |Нзи еї аї., 1995; Нзи еї аї., 1996). Три білки, (8) що зв'язуються з внутрішньоклітинним доменом РА5Б-К і р55-К по їх "загибель-домену", втягнуті в індукцію клітинної загибелі рецепторами через утворення гетеро-зв'язаних гомологічних сегментів і також здатні незалежно опосередковувати клітинну загибель незалежно один від одного, були ідентифіковані з Ге! зо застосуванням процедури дигібридного дріжджового скринінгу. Один з цих білків - МОКТ-1 |Воїадіп еї аї., 19950), також відомий як ЕАОО (Спіппаїуап еї аї!., 1995) специфічно зв'язується з РГА5Б-К. Інший такий білок - с

ТКАО також див. Нзги еї аї., 1995, 1996) - зв'язується з р55-К, а третій такий білок - КІР також див. ю еЗіапдег еї аї., 1995) - зв'язується і з РАБ-К, і з р55-К. Крім того, що вони зв'язуються з ЕА5-К і р55Б-К, ці білки також здатні зв'язуватися один з одним, що може зумовлювати функціональний механізм "перехресного « обміну інформацією" між рецепторами РА5Б-К і р55-К. Такі зв'язування відбуваються за участю консервативного ї- сегменту послідовності - т. зв. "модуля загибель-домена" (також що позначається як "СЕЮ" за "Оєваїй ЕПесіог

Ботаїп" - "загибель-ефекторний домен"), - звичайного для рецепторів і білків, що зв'язуються з ними. Більше того, хоча в дигібридному дріжджовому тесті білок МОКТ-1 виявляв спонтанну зв'язуваність на ГА5-К, в клітинах ссавців таке зв'язування мало місце лише після стимуляції рецептора: це підтверджує, що МОКТ-1 бере участь в « процесі ініціації сигнального механізму ГА5-К. Білок МОКТ-1 не містить якогось мотиву в своїй амінокислотній сплю) с послідовності, характерного для прояву каталітичної активності: тобто його здатність опосередковувати загибель клітин, як припускають, не грунтується на активності самого МОКТ-1, а, скоріше за все, зумовлюється ;» активацією деяких інших білків (білка), що зв'язують МОКТ-1 і діють далі вниз по сигнальному каскаду.

Експресія в клітинах мутантних варіантів МОКТ-1, що втратили М-кінцеву частину молекули, як було показано, блокує цитотоксичність, що індукується БАБ/АРОЇТ (БАБ-К) або р55-К |Нзи еї аїЇ., 1996; Спіппаїуап еї аї., -І 1996): це вказує на те, що цей М-кінцевий сегмент передає сигнал про загибель клітин від обох рецепторів через міжбілкові взаємодії. о Недавні дослідження виявили групи цитоплазматичних тіолових протеаз, які демонструють структурну с схожість з протеазою СЕОЗ вільно живучої нематоди Саепогнабаїїз еіедапз і з конвертазою ІСЕ інтерлейкіну-1р 5ор людини в зв'язку з різними фізіологічними параметрами процесів загибелі клітин |див. огляди Китаг, 1995 і де Непкаїпї, 1996). Також є ряд вказівок про те, що протеази (протеаза) цього сімейства можуть брати участь в

Ге) прояві цитотоксичності клітин, що індукується за участю рецепторів ЕАБ-К і ТМЕ-К. Для специфічних пептидних інгібіторів протеаз і двох білків-блокаторів їх функцій, що кодуються вірусами - білка вірусу коров'ячої віспи сптА та бакуловірусного білка рЗб5 - було показане забезпечення захисту клітин від прояву ЦцИитОТОКСсИичНності (Епагі еї аї.,, 1995; оз еї аїЇ., 1995; Темагі еї аї., 1995; Хце еї аї., 1995; Веїдіег еї аї., 1995). Швидке розщеплення деяких специфічних клітинних білків, як припускають, дією протеаз сімейства іФ) СЕОЗ/ЛСЕ може бути продемонстроване в клітинах невдовзі після стимуляції рецепторів ЕАБ-К або ТМЕ-К. ко Необхідно зазначити, що ці протеази сімейства СЕОЗ/СЕ, які також називаються каспазами, продукуються у вигляді неактивних попередників і активуються шляхом протеолітичного розщеплення в ході індукції загибелі бо Клітин. Ці каспази є консервативними цистеїновими протеазами, що розщеплюють специфічні клітинні білки нижче від залишків аспарагінової кислоти і, відповідно, відіграють ключову роль в усіх відомих до нинішнього часу процесах запрограмованої загибелі клітин. Окрім їх гомологічних С-кінцевих ділянок, з вмісту яких утворюються зрілі форми протеаз, білки-попередники включають унікальні М-кінцеві сегменти. Взаємодії цих "продоменів" зі специфічними регуляторними молекулами забезпечує диференційовану активацію різних каспаз б5 за участю різних сигналів індукції загибелі клітин ІВоїаіп еї а!., 1996; Миліо еї а!., 1996; Юцап 45. Ріхії, 1997, Мап

Стіекіпде еї аї., 1996; Аптаасд еї! аї., 1997).

Недавно було виділено, клоновано й охарактеризовано одну таку протеазу і її різні ізоформи (включаючи інгібіторні форми), позначену МАСН (також позначається САБР-8), що є МОКТІ1-зв'язним білком та служить модулятором МОКТ-1 і, відповідно, ЕАЗ-К і р55-К, і яка також може діяти незалежно від МОКТ-1; також було описане можливе використання даної протеази, зокрема, в наведених в докладному списку матеріалів, що цитуються, спільних заявок, які водночас очікують рішення, Іна ізраїльський патент МоМо114 615, 114986, 115319, 116588 і 117932, а також у відповідному РСТ - Мо РСТ/ЛІ596/105211), рівно як і в недавній публікації заявників

ІВоїдіп еї аї., 1996). Інша така протеаза, включаючи її ізоформи (включаючи |інгібіторні форми), позначена

Мена (що також позначається САБЗР10), також недавно була виділена і охарактеризована заявниками даного /о винаходу (неопубліковані матеріали) та іншими дослідниками (Регпапдез-АІпетгі еї аї., 1996; Згіпімазца еї аІ.,, 1996). Цей білок Мсеп4 також є МОКТІ1-зв'язним білком, що служить для модуляції активності МОКТ-1 і, відповідно, по-видимому, як модулятор РГА5Б-К і р55-К, і який також може діяти незалежно від МОКТ-1. Таким чином, подробиці, що стосуються всіх аспектів властивостей, характеристик і шляхів використання Меп подані в названих вище публікаціях, що повністю включені до списку цитування даного винаходу.

Також треба зазначити, що каспази МАСН (САЗБР-8) і Меп4 (САЗРІ10), що включають схожі "продомени" див.

Воїдіп еї аї., 1996; Миліо еї аїІ., 1996; Регпапдез-АІпетгі еї аіІ., 1996; Міпсепі «5 Оіхії, 1997), взаємодіють за допомогою своїх "продоменів" з МОКТ-1: ця взаємодія опосередковується мотивом "загибель-домена" або "загибель-ефекторними доменами" (ОЕбБ), які знаходяться в М-кінцевій частині МОКТ-1 і наявні в дуплікованому вигляді в складі МАСН (САБР-8) і Мена (САБР-10) |див. Воїаїп еї а!., 1995р; Спіппаїуап еї а!., 1995).

Також заслуговує на згадування те, що, з точки зору сказаного вище, різні білки, ферменти і рецептори, втягнуті у внутрішньоклітинні сигнальні процеси, що приводять до загибелі клітин, одержували неодинакові найменування. Для подолання можливих неточностей пропонується поданий нижче список різних найменувань, включаючи нові найменування, які приймаються у зв'язку з новими стандартами, для кожного з даних білків або їх складових, а також подані найменування, прийняті до використання в цьому тексті з урахуванням відповідної сч ов Зручності. о найменування, з яким описаний найменування використовується тут вперше

Ф зо сч мов 00011 ю 00011111 мою 0011110 ю ч з ЕНН МОН по ОН в 0 ЩЕЩЕНОННИ" шення "загибель-ефекторний мотив" (ОЕО), "загибель-доменний мотив", "МОКкТ-модулі" "МОКкТ-модулі" « протя 00000000 00000010 протам ємовисє 77711111 1САВР 0 сво о с Об'єктом цього винаходу є подання нових білків, включаючи всі їх ізоформи, аналоги, фрагменти або з похідні, що здатні зв'язуватися з МОКТ1-зв'язними білками, такими як, наприклад, названі вище білки Мена і

МАСН та їх ізоформи, або здатні зв'язуватися з самим МОКТ-1. З урахуванням того, що сам білок МОКТ-1

Зв'язується з внутрішньоклітинним доменом рецептора РА5-К, нові білки відповідно до цього винаходу завдяки -і зв'язуванню з МОКТ1-зв'язними білками і, відповідно, непрямо з МОКТ-1, або завдяки прямому зв'язуванню з білююм МОКЖКТ-1, здатні таким чином пригнічувати внутрішньоклітинні сигнальні механізми, ініційовані те зв'язуванням РАб-ліганду на його рецепторі: тобто таким чином нові білки відповідно до цього винаходу є «сл модуляторами опосередкованого ЕАБ-К впливу на клітини. Білок МОКТ-1 також втягнутий у модулювання 5р Впливу ТМЕ на клітини через його участь в модуляції р55-К: відповідно, нові білки згідно з цим винаходом о також розглядаються як модулятори впливу ТМЕ на клітини, здійснюваного через рецептор р55-К. Також, по

Ге) аналогії з охарактеризованим вище модулюванням впливу на клітини, що опосередковується рецепторами

ЕАБ-К і р55-К, білки відповідно до цього винаходу також можуть бути медіаторами або модуляторами інших цитотоксичних медіаторів або індукторів шляхом дії на загальні або сполучені внутрішньоклітинні сигнальні ов механізми, в яких беруть участь Т білки відповідно до цього винаходу - наприклад, 1 і його ізоформи. Ці нові білки відповідно до цього винаходу позначені білками "С1" і, як зазначалося вище, включають власне білок 1 (Ф, (розглянутий нижче), всі його ізоформи, аналоги, фрагменти і похідні. ка Іншим об'єктом винаходу є подання антагоністів (наприклад, антитіл, пептидів, органічних сполук або навіть деяких ізоформ вищезазначених нових білків 1, їх ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних, що можуть бо Використовуватись для пригнічення сигнального механізму або, більш конкретно, прояв цитотоксичності, якщо це є бажаним.

Подальшим об'єктом даного винаходу є використання названих вище нових білків 1, їх ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних з метою виділення і охарактеризування додаткових білків або факторів, що можуть бути втягнуті в регулювання активності рецепторів, наприклад, інших протеаз, що розщепляють нові білки з б5 перетворенням їх на біологічно активні, і (або) з метою виділення і ідентифікації інших рецепторів, розташованих до початку сигнальних процесів, що зв'язують ці нові білки, їх аналоги, фрагменти і похідні

(наприклад, інші ЕА5-К або споріднені рецептори), в функціонування яких, відповідно, вони також втягуються.

Ще одним об'єктом даного винаходу є подання інгібіторів, які можуть бути внесені в клітини з метою зв'язування або взаємодії з білком 1 і можливими ізоформами 1, що мають протеазну активність (білок 1

Включає ділянку, гомологічну протеолітичним сегментам Меп4 і МАСН), та інгібування їх внутрішньоклітинної активності, яка, принаймні, для деяких ізоформ С1, є протеолітичною активністю.

Крім того, об'єктом даного винаходу є використання названих вище нових білків 1, їх ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних в якості антигенів для приготування поліклональних і (або) моноклональних антитіл до них. Зі свого боку ці антитіла можуть використовуватись, наприклад, для очистки нових білків з різних джерел, /о таких як клітинні екстракти або трансформовані клітинні лінії.

Далі, ці антитіла можуть використовуватись з метою діагностики, наприклад, для ідентифікації розладів, пов'язаних з аномальним функціонуванням клітинних процесів, опосередкованих ЕБА5Б-К або іншими спорідненими рецепторами.

Іншим об'єктом цього винаходу є надання фармацевтичних композицій, що включають названі вище білки 1, 7/5 їх ізоформи або аналоги, фрагменти чи похідні, рівно як і фармацевтичні композиції, які включають названі вище антитіла або інші антагоністи.

Згідно з цим винаходом виділений новий білок - 21, який здатний зв'язуватися або взаємодіяти з Меп4, що сам зв'язується з МОКТ-1, який, в свою чергу, зв'язується з внутрішньоклітинним доменом РА5Б-К. Також 01 може взаємодіяти з іншим МОКТ1-зв'язним білком, що називається МАСН, і також може бути здатним 2о Зв'язуватися або взаємодіяти прямо з МОКТ-1. Білок 51, по-видимому, функціонує як модуляторний фактор механізму загибелі клітин, що ініціюється зв'язуванням РАз-ліганду на рецепторі РГА5-К на поверхні клітин, що, по-видимому, забезпечується наявністю у нього протеолітичного сегменту, схожого з протеолітичними сегментами Мена і МАСН: відповідно, білок (31 також може бути активною внутрішньоклітинною протеазою. Далі, залежно від процесів транскрипції і трансляції в ході експресії 51, особливо по його протеолітичному сч ов сегменту, деякі ізоформи 51 можуть бути експресовані з виключенням активного протеолітичного сегменту і о таким чином можуть служити в якості антагоністів протеолітичної активності, що опосередковується, наприклад, участю Мені і МАСН. Протеази сімейства СЕОЗ/ЛСЕ можуть бути втягнуті в процеси апоптозу, опосередковувані

ЕАБ-К. Білок МОКТ-1 (або ГАЮ) зв'язується з внутрішньоклітинним доменом РА5-К в ході активації цього рецептора, а новий білок 1 відповідно до цього винаходу зв'язується з МОКТ1-зв'язними білками, такими як Ге! зо Мспа і, ймовірно, також МАСН, або прямо з більоом МОКТ-1. Білок С1, клонований та охарактеризований згідно з цим винаходом, може існувати у вигляді множинних ізоформ, деякі з яких включають сегмент гомології з с

СЕОЗ/ЛСЕ, що має протеолітичну активність (протеолітичний домен), схожий з таким у Меп і у деяких ізоформ ю

МАСН, і які можуть зумовлювати загибель клітин у випадку експресії в них. Таким чином, активація цього нового гомолога СЕОЗ/ЛСЕ (тобто різних ізоформ 1, що включають протеолітичний домен) за участю ГА5Б-К (шляхом « прямої або непрямої взаємодії з МОКТ-1), по-видимому, формує ефекторний компонент опосередковуваного ї-

ЕА5-К механізму загибелі клітин.

Більше того, білок 51 також функціонує в якості ефекторного компонента механізму загибелі клітин, що ініціюється зв'язуванням ТМЕ на рецепторі ро5-К на поверхні клітин: в цьому випадку шляхом непрямого зв'язування МОКТ-1 з білююом ТКАОО - білком, що сам зв'язується з внутрішньоклітинним доменом ро5б5-К ІНзи еї « 81. 1995); після цього або водночас з цим відбувається зв'язування білка 51 з МОКТІ1-зв'язними білками, з с такими як, наприклад, Мсп4 чи МАСН, або зв'язування з МОКТ-1 прямо з перетворенням С1 на активну протеазу, втягнуту в опосередкування клітинної загибелі. з Також слід зазначити, що, хоча (31 виявляє, принаймні деякі параметри послідовності, ключові для функціонування протеаз СЕЮОЗ/ЛСЕ, він, однак, має і ряд відмітних характеристик послідовності, що можуть забезпечити йому унікальний і, по-видимому, тканино/клітиноспецифічний характер активності. -І Таким чином, згідно з цим винаходом, надається новий білок, позначений 1. Цей білок (31 було виділено і клоновано з застосуванням дигібридного скринінгу і був охарактеризований як молекула, що зв'язується з Мена. пи Як зазначалося вище, Мсеп4 є МОКТІ1-зв'язним білком, що здатний запускати клітинну загибель, хоча, однак, с також треба зазначити, що деякі ізоформи Меп4 мають протилежну активність, а саме вони інгібують знищення 5ор Клітин. Крім того, секвену-вання 1 показало, що цей білок включає в складі своєї М-кінцевої частини два так ю званих "МОКТ-МОДУЛІ" (ММ), які також виявляються в складі МОКТ1-зв'язних білків Мсп4 і МАСН. Ці

Ге) "МОКкТ-модулі" в складі 1, як припускають, надають йому здатність зв'язуватися з Меп4, а також можуть бути фактором прямого зв'язування з МОКТ-1 і зв'язування з МАСН або з специфічними ізоформами МАСН (специфічними варіантами сплайсингу МАСН). В амінокислотній послідовності («31 услід за М-кінцевим ов бегментом, що включає "МОКТ-модулі", також знаходиться довгий сегмент, який виявляє схожість з протеолітичним сегментом МАСН і Месп4. Більше того, виходячи з даних початкового аналізу ймовірної (Ф) локалізації послідовності гену 21 на хромосомах людини, стало ясно, що ген 1 знаходиться на хромосомі Мо2 в ка тісній близькості від локалізацій генів Мсй4 і МАСН, що також вказує на наявність зв'язку між білками ої,

Мена і МАСН. во Більш докладно, принаймні, три можливі ізоформи білка 01 були одержані згідно з цим винаходом (див. нижче приклад 1). Дві з цих ізоформ були виділені і клоновані: вважається, що вони являють собою два варіанти альтернативного сплайсингу нового білка, позначеного 1 (або САЗН). Ці дві ізоформи були названі с19, (або

САЗНО) для більш довгої ізоформи та С1 р (або САНД) для більш короткої ізоформи (оскільки існує більше однієї короткої ізоформи, то дану коротку ізоформу 51р позначають як 1 Дт, а іншу коротку ізоформу - як б5 5182: див. нижче Приклад 1). Кожна з цих ізоформ 01 - А і В включає два М-кінцеві "загибель-домени"/МОКтТ-модулі та може зв'язуватися одна з одною опосередковано через ці "загибель-доменні мотиви", а також може зв'язуватися з МОКТ-1, Месп4 і МАСН опосередковано через ці ж "загибель-доменні мотиви". Більш довга ізоформа С19, має унікальний С-кінцевий сегмент (порівняно з короткою ізоформою С1р), при тому, що цей унікальний С-кінцевий сегмент характеризується гомологією послідовності з такою в сегменті протеазної активності каспаз. З точки зору біологічної активності, більш коротка ізоформа с1р пригнічує загибель клітин і цитотоксичність, опосередковувану рецепторами р55-К і ЕА5-К, в той час як, навпроти, більш довга ізоформа С19у, має цитотоксичну дію відносно до принаймні деяких типів клітин (наприклад, клітин лінії 293) при тому, що ця цитотоксичність залучає їх протеазо-гомологічний сегмент. Однак слід зазначити, що довга ізоформа С19у також може інгібувати цитотоксичність, опосередковувану рецепторами ро5-К і РГА5Б-К в інших 70 типах клітин (наприклад, клітин Не! а). Ці дані визначають, що білок 1 (а саме його різні ізоформи) діють як ослаблювачі-інгібітори і (або) індуктори-підсилювачі сигнальних механізмів клітинної загибелі, опосередковуваних рецепторами р55-К і ЕА5Б-К.

Також слід зазначити, що заради простоти позначення різних ізоформ 1, наприклад С1о і 1Д, часто в цьому тексті буде застосовуватися проста позначка "51", але при цьому повинно бути зрозуміло, що в цих 75 випадках поняття "З1" позначатиме всі ізоформи (01 - тобто воно позначатиме і індуктори-підсилювачі цитотоксичності, і інгібітори-ослаблювачі клітинної цитотоксичності. Коли ж маються на увазі специфічні ізоформи С1, вони будуть і називатися у відповідний спосіб, наприклад, С1о, або С1р. З урахуванням сказаного, коли використовується збірне позначення "С1", що стосується різних ізоформ, воно часто позначатиметься в даному тексті як "модулятор": це означає, що він може виявляти і інгібіторну, і підсилювальну дію відносно до біологічної функції, що обговорюється.

З точки зору сказаного вище стає ясно, як це було описано вище і буде розглянуто нижче, що 1 є модулятором активності МОКТ-1 і, відповідно, модулятором клітинних ефектів, опосередковуваних рецепторами

ЕАЗ-К і р55-К, а також, по-видимому, іншими рецепторами з сімейства рецепторів ТМЕ/ЧОЕ та інших, що можуть брати участь в схожих компонентах і механізмах внутрішньоклітинної передачі сигналів. с

Таким чином, оскільки (31 має протеазо-подібний сегмент (принаймні, в складі довгої ізоформи), він може Ге) прямо відповідати за цитотоксичність і запальні процеси, що викликаються або індукуються різними стимуляторами, включаючи ті, які потрапляють через рецептори з складу сімейства рецепторів ТМЕ/МОБЕ і, певно, також інших сімейств рецепторів.

Також (31 може служити в якості інгібітору цитотоксичності та запальних процесів за рахунок того, що він (22) входить до складу комплексу інших білків і, відповідно, може впливати на цитотоксичну і запальну активність с цих інших білків (наприклад, білків, Месйп4 і МАСН або навіть МОЇ Т-1), що, врешті-решт, призводить до пригнічення їх цитотоксичної активності або їх активності при запаленні. Щео,

Також ще 01 може служити в якості підсилювача або зумовлювача клітинної цитотоксичності та запальних « процесів, інших білків (наприклад, білків, Мей4 і МАСН або навіть МОКТ-1), за рахунок зв'язування із ними з

Зо подальшим зв'язуванням з МОКТ-1, або діючи незалежно від МОКТ-1, але в кожному випадку забезпечуючи о цитотоксичну активність різних білків або їх дію з індукції запальних процесів.

Також у аналогічний спосіб білок 1 може служити в якості інгібітору або зумовлювача інших внутрішньоклітинних медіаторів або модуляторів, втягнутих в механізми, в яких активно бере участь сам 1. «

Білок МОКТ-1 (абревіатура "Медіаюг ої Кесеріог Тохісйу" - медіатор токсичності, рецепторів - (Воїадіп еї а, 199551) здатний зв'язуватися з внутрішньоклітинним доменом ЕА5Б-К. Цей ЕАб-зв'язний білок, як о) с припускають, діє в якості медіатора або модулятора дії ліганду рецептора РА5Б-К на клітини шляхом "» опосередкування або модулювання внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, які зазвичай запускаються після " зв'язування ліганду ЕАЗ-К на поверхні клітин. Додатково до специфічності з РА5-зв'язування, для МОКТ-1 було показано наявність інших параметрів (див. приклад-посилання 1): наприклад, в його складі є сегмент, гомологічний сегментам "загибель-доменів" (00) в складі ро5-ТМЕ-К і ЕА5-К (р55-00 і ЕА5З-ОО) - відповідно, він - також здатний до самозв'язування. Також МОКТ-1 сам по собі здатний активувати клітинну цитотоксичність: така їх активність, по-видимому, зв'язана з здатністю до самозв'язування. Також було виявлено, що ко-експресія сегменту МОКТ-1, який включає послідовність, гомологічну "загибель-домену" (МОКТ-ОО - наявний в С-кінцевій 1 частині МОКТ-1), істотною мірою порушує процеси загибелі клітин, що індукуються РАБ, чого можна очікувати г 20 виходячи з здатності до зв'язування з "загибель-доменом" в складі ЕА5-ІС. Крім того, за тих самих умов експерименту, було виявлено, що ко-експресія частини МОРТ-1, яка не містить сегменту МОКТ-0О (М-кінцева

Ме; частина МОКТ-1, амінокислоти 1-117: "головна частина МОКТ-1"), призводить в результаті до відсутності перешкод РА5З-індукованій клітинної загибелі, а то і до деякого зростання цитотоксичності, що індукується ГА5.

Відповідно, досить ймовірним є те, що МОЖКТ-1 також зв'язується з іншими білками, залучені в го Ввнутрішньоклітинні сигнальні механізми. Ці МОКТ1-зв'язні білки також можуть, відповідно, діяти в якості

ГФ! непрямих медіаторів або модуляторів впливу лігандів рецептора ЕА5-К на клітини шляхом опосередкування або модулювання активності МОКТ-1; або ж ці МОКТІ1-зв'язні білки можуть діяти прямо як медіатори або о модулятори зв'язаного з МОКТ-1 внутрішньоклітинного сигнального механізму шляхом опосередкування або модулювання активності МОКТ-1, який, як випливає з описаного вище, має незалежну здатність активувати 60 клітинну цитотоксичність. Ці МОКТ1-зв'язні білки також можуть використовуватись у будь-якій з стандартних процедур скринінгу з метою виділення, ідентифікації і охарактеризування додаткових білків, пептидів, факторів, антитіл тощо, які можуть бути втягнуті в сигнальні механізми, пов'язані з МОКТ-1 чи пов'язані з

ЕАБ-К, або можуть бути елементами інших внутрішньоклітинних сигнальних процесів. Були виділені такі

МОКТ1-зв'язні білки, і вони описані в названих вище спільних ізраїльських заявках, що перебувають на стадії бо розгляду, МоМо114615, 114986, 115319, 116588, 117932 і у відповідному РСТ МеРСТ/О5-96/10521 (в частині, що стосується МАСН і його ізоформ) і |в статтях Регпапаев-АІпетгі еї а!., (1996) та Згіпімазшіа еї аї., (1996),

(в частині, що стосується Меп4 та інших "Мейп"-білків). Один з таких МОКТ1-зв'язних білків - білок, що раніше згадувався МАСН - був спочатку клонований, секвенований і частково охарактеризований як такий, що має такі параметри: кДНК МАСН кодує відкриту рамку ОКЕ-В; МАСН зв'язується з МОКТ-1 по дуже жорсткому і високоспецифічному типу; МАСН-зв'язний сайт в складі МОКТ-1 покладений вище від "загибель-доменного мотиву" МОКТ-1; ділянка ОКЕ-В для МАСН є його ділянкою взаємодії з МОКТ-1; і МАСН характеризується здатністю до самозв'язування і сам по собі може індукувати клітинну цитотоксичність. Крім того, пізніше проведені дослідження, також відображені в названих вище спільних заявках, що перебувають на стадії розгляду, а також |в публікації Воїдіп еї аї., (1996)), показали, що дійсно МАСН існує у вигляді серії /о ізоформ. Більше того, названа вище ОКР-В МАСН насправді є однією з ізоформ МАСН, позначеною як

МАСНДВІ. В названих вище публікаціях, що стосуються білка Месп4, було показано, що цей білок також зв'язується з МОКТ-1 (або ЕАОО) і прямо втягнутий в клітинну цитотоксичність за участю МОКТ-1 або незалежну від нього, що зв'язується з його протеолітичною активністю.

Відповідно, даний винахід подає послідовність ДНК, що кодує білок 1, його аналоги або фрагменти, здатні 75 зв'язуватися або взаємодіяти прямо або опосередковано з МОКТ-1 і (або) з МОКТ1-зв'язними білками, такими, як, наприклад, Мсп4 або МАСН, при тому, що зазначений білок (31, його аналоги або фрагменти здатні опосередковувати внутрішньоклітинний ефект, опосередкований ГА5Б-К або р55-ТМЕ-К, або що зазначений білок 1, його аналоги або фрагменти здатні також модулювати або опосередковувати внутрішньоклітинні ефекти активності інших білків, з якими вони можуть зв'язуватися прямо або непрямо.

Зокрема, даний винахід подає послідовність ДНК, що вибирається з групи, яка включає: а) послідовність КДНК, похідну від сегменту, що кодує нативний білок 1;

Б) послідовності ДНК, здатні гібридизувати з послідовністю (а) в умовах середнього степеня жорсткості і які кодують біологічно активний білок 1; і с) послідовності ДНК, які є виродженими внаслідок зміни генетичного коду в послідовностях ДНК, визначених Га

В пп.(а) та (Б) і які кодують біологічно активний білок 1.

Іншим спеціальним варіантом названої вище послідовності ДНК відповідно до цього винаходу є послідовність о

ДНК, що включає, принаймні, частину послідовності, яка кодує, принаймні, одну з ізоформ білка 1. Інший варіант названої вище послідовності ДНК - це послідовність, яка кодує білок С1, поданий на Фіг.1 (ізоформа

С10). Інший подібний варіант - це друга ізоформа білка С1, наведена на Фіг.2 (ізоформа С1р). Ге)

Цей винахід подає білки С1, їх аналоги, фрагменти або похідні, які кодуються будь-якими з названих вище сч послідовностей ДНК відповідно до цього винаходу, при тому, що зазначені білки, їх аналоги, фрагменти або похідні здатні зв'язуватися або взаємодіяти прямо чи непрямо з МОКТ-1 і (або) з будь-якими МОКТ1-зв'язними ІФ) білками, такими, як, наприклад, Мсп4 або МАСН, і опосередковувати внутрішньоклітинний ефект, « опосередкований ГА5Б-К чи р55-ТМЕ-К, або активністю будь-яких інших медіаторів чи індукторів цитотоксичності, з якими названі білки 1, їх аналоги, фрагменти або похідні здатні прямо або непрямо зв'язуватися. -

Спеціальний варіант цього винаходу пов'язаний з білками С1, їх аналогами, фрагментами і похідними. Інший варіант подає будь-яку ізоформу білка 1, їх аналоги, фрагменти і похідні.

Також цим винаходом подаються вектори, кодуючі названий вище білок (31 та його аналоги, фрагменти або « похідні відповідно до цього винаходу, що включають названі вище послідовності ДНК відповідно до цього винаходу, так, що ці вектори здатні експресуватись в підхожих прокаріотичних або еукаріотичних - с клітинах-хазяхнах; трансформовані еукаріотичні або прокаріотичні клітини-хазяїни, що несуть такі вектори; і и спосіб одержання білка 51 або його аналогів, фрагментів чи похідних відповідно до цього винаходу шляхом є» вирощування таких трансформованих клітин-хазяїнів в умовах, підхожих для експресії зазначеного білка, його аналогів, фрагментів чи похідних і ефективних з точки зору посттрансляційних модифікацій зазначеного білка у випадку, якщо необхідно одержувати зазначений білок і екстрагувати зазначений експресований білок, його -і аналоги, фрагменти чи похідні з культурального середовища з зазначеними трансформованими клітинами або з їх клітинних екстрактів, одержаних з зазначених трансформованих клітин. Всі наведені визначення передбачають включення всіх ізоформ білка 1. 1 В іншому варіанті цей винахід також подає антитіла або їх активні похідні чи фрагменти, специфічні 7 50 відносно до білка 1, його аналогів, фрагментів і похідних відповідно до цього винаходу.

В ще одному варіанті цей винахід подає різні шляхи використання названих вище послідовностей ДНК або 3е) білків, що кодуються ними, згідно з цим винаходом, при тому, що, окрім іншого, таке використання передбачає таке: (А) Спосіб модулювання загибелі клітин або запальних процесів, що включає обробку зазначених клітин одним чи більшою кількістю білків (31, їх аналогів, фрагментів або похідних відповідно до цього винаходу, як о описувалося вище, притому, що зазначена обробка зазначених клітин включає внесення у зазначені клітини одного чи більшої кількості білків, їх аналогів, фрагментів або похідних у формі, підхожій для їх іме) внутрішньоклітинного введення, або внесення у зазначені клітини нуклеотидної послідовності, яка кодує один чи більше число зазначених білків, їх аналогів, фрагментів чи похідних у формі підхожого вектору, що несе бо названу послідовність так, щоб зазначений вектор був здатний забезпечувати включення названої послідовності у зазначені клітини таким чином, щоб названа послідовність експресувалась в зазначених клітинах; і (В) Спосіб модулювання загибелі клітин або запальних процесів, що включає обробку зазначених клітин одним чи більшим числом інгібіторів одного чи більшої кількості білків/ферментів, які опосередковують загибель зазначених клітин або запальні процеси, при тому, що зазначені інгібітори вибирають з групи, яка 65 включає: (1) один чи більшу кількість білків (31, їх аналогів, фрагментів або похідних відповідно до цього винаходу, здатні інгібувати загибель зазначених клітин або запальні процеси; та (2) інгібітори одного чи більшої кількості білків 21 відповідно до цього винаходу, при тому, що зазначені один або більше число білків 01 зміцнюють/посилюють або опосередковують загибель зазначених клітин або запальні процеси.

Більш конкретно, названі вище способи відповідно до цього винаходу включають такі спеціальні варіанти: 1) спосіб модулювання впливу ліганду ЕАБ-К або ТМЕ на клітини, що несуть рецептори ГА5Б-К або р5Б5-К, який включає обробку зазначених клітин одним чи більшою кількістю білків (31, їх аналогів, фрагментів або похідних відповідно до цього винаходу, здатних зв'язуватися з МОКТ1-зв'язними білками, такими як Мей4 або

МАСН, притому, що, в свою чергу, зв'язаний з ними МОРТ-1 прямо зв'язується з внутрішньоклітинним доменом

ЕАЗ-К, або здатних зв'язуватися прямо або опосередковано з МОКТ-1 або з МОКТ1-зв'язними білками так, як 7/0 описане вище, при тому, що в цьому випадку МОКТ-1 зв'язується з ТКАОО, який, в свою Чергу, зв'язується з внутрішньоклітинним доменом ро5-К, що завдяки цьому забезпечує здатність модулювати/опосередковувати активність зазначених рецепторів ЕАБ-К або р55-К, при тому, що названа обробка зазначених клітин включає внесення у зазначені клітин одного чи більшої кількості білків, їх аналогів, фрагментів або похідних в формі, придатній для їх внутрішньоклітинного введення, або внесення в зазначені клітин послідовності ДНК, що кодує /5 Зазначені один чи більшу кількість білків, їх аналогів, фрагментів чи похідних у формі підхожого вектору, який несе зазначену послідовність, так, що названий вектор здатний забезпечувати потрапляння зазначеної послідовності в названі клітини таким чином, щоб зазначена послідовність експресувалась в зазначених клітинах; 2) спосіб модулювання впливу ліганду ГА5-К або ТМЕ на клітини згідно з п.(1), описаним вище, при тому, що 2о зазначена обробка клітин включає внесення в названі клітини зазначеного білка (31 або його аналогів, фрагментів чи похідних у формі, придатній для внутрішньоклітинного введення або внесення в названі клітини послідовності ДНК, що кодує зазначений білок 1 або його аналоги, фрагменти чи похідні у вигляді підхожого вектору, що несе зазначену послідовність, так, щоб названий вектор забезпечував попадання зазначеної послідовності в названі клітини таким чином, щоб зазначена послідовність експресувалась в зазначених с г клітинах;

З) спосіб згідно з п.(2), описаним вище, притому, що зазначена обробка названих клітин здійснюється і) шляхом трансфекції зазначених клітин рекомбінантим вірусним вектором, який включає такі етапи: (а) конструювання рекомбінантного вектору вірусу тварини, що несе послідовність, яка кодує вірусний поверхневий білок (ліганд), який здатний зв'язуватися з специфічним поверхнево-клітинним рецептором на Ге! зо поверхні клітин, які несуть рецептори ГА5-К або р55-К, і другу послідовність, яка кодує білок, що вибирається з білка 1, його аналогів, фрагментів і похідних, так, що при експресії в зазначених клітинах забезпечується с здатність до модуляції-опосередкування активності зазначених ЕА5-К або р55-К, і ю (5) інфікування зазначених клітин названим в п.(а) вектором; 4) спосіб модулювання впливу ліганду ЕА5Б-К або ТМЕ на клітини, що несуть рецептори ЕА5Б-К або р55-К, що « зв Включає обробку зазначених клітин антитілами або їх активними фрагментами, або їх похідними згідно з цим ї- винаходом так, що зазначена обробка здійснюється шляхом внесення підхожої композиції, яка включає зазначені антитіла, їх активні фрагменти або їх похідні в зазначені клітини, притому, що, коли, принаймні частина білка 01 з'являється на поверхні клітини, зазначена композиція формується для позаклітинного застосування, а коли зазначені білки (31 повністю внутрішньоклітинні, то зазначена композиція формується для « ВНнутрішньоклітинного внесення; в с 5) спосіб модулювання впливу ліганду ГА5Б-К або ТМЕ на клітини, що несуть ЕАБ-К або р55-К, який включає . обробку зазначених клітин олігонуклеотидною послідовністю, що кодує антисмислову послідовність відносно до, и? принаймні, частини послідовності білка (31 відповідно до цього винаходу, притому, що зазначена олігонуклеотидна послідовність здатна блокувати експресію білка 1; 6) спосіб за п.(2), описаному вище, для обробки пухлинних клітин, або клітин, інфікованих ВІЛ, чи інших -І хворих клітин, який включає: (а) конструювання рекомбінантного вектору вірусу тварини, що несе послідовність, яка кодує вірусний о поверхневий антиген, здатний зв'язуватися з специфічним рецептором поверхні пухлинних клітин або з с рецептором поверхні клітин, заражених вірусом ВІЛ, чи з рецептором інших хворих клітин, а також послідовність, що кодує білок, який вибирається з білка (31, його аналогів, фрагментів і похідних відповідно ю до цього винаходу, таким чином, що у разі експресії зазначені пухлинні, ВІЛ-заражені або інші хворі клітини

Ге) стають здатними знищувати названі клітини; і (в) інфікування зазначених пухлинних або заражених вірусом ВІЛ клітин, чи інших хворих клітин названим в п.(а) вектором; 7) спосіб модулювання впливу ліганду ГАБ-К або ТМЕ на клітини, що включає застосування рибозимної процедури, в якій вектор, що кодує рибозимну послідовність, здатну взаємодіяти з клітинною послідовністю (Ф) МРНК, яка кодує білок 1 відповідно до цього винаходу, вносять в зазначені клітини в такій формі, що дозволяє ка експресувати зазначену рибозимну послідовність в названих клітинах, і при тому, що зазначена рибозимна послідовність експресується в зазначених клітинах так, що взаємодіє з зазначеною клітинною послідовністю бо МРНК та розщепляє зазначену послідовність мРНК, внаслідок чого відбувається інгібування експресії зазначеного білка 1 в зазначених клітинах; 8) спосіб, що вибирається з методів відповідно до цього винаходу, при тому, що послідовність, яка кодує зазначений білок 1, включає, принаймні одну з ізоформ С1, аналоги, фрагменти і похідні будь-якої з поданих винаходом форм, що здатні зв'язуватися прямо або непрямо з МОКТ-1 або з МОКТ1-зв'язними білками, такими, 65 Як, наприклад, Мена або МАСН, при тому, що зв'язаний із ними МОКТ-1, в свою чергу, специфічно зв'язується з

ЕАЗ-ІС, або які здатні зв'язуватися прямо або непрямо з МОКТ-1 або названими вище МОКТ1-зв'язними білками, при тому, що зв'язаний із ними МОКТ-1, в свою чергу, зв'язується з ТКАЮО або, в свою чергу, зв'язується з р5б5Б-ІС; 9) спосіб виділення та ідентифікації білків відповідно до цього винаходу, здатних зв'язуватися прямо або непрямо з білком МОКТ-1 або з МОКТ1-зв'язними білками, що включає застосування дигібридного дріжджового тесту, в якій послідовність, що кодує зазначені біллк МОКТ-1 або МОКТІ1-зв'язні білки, входить до складу одного гібридного вектору, а послідовність з бібліотек КДНК або геномної ДНК входить до складу другого гібридного вектору, притому, що вектори потім використовують для трансформації дріжджових клітин-хазяїв і виділяються позитивні трансформовані клітини з подальшим екстрагуванням зазначеного другого гібридного /о вектору з метою одержання послідовності, яка кодує білок, що зв'язується з зазначеними білююм МОКТ-1 або з

МОРЕТ1-зв'язними білками; 10) спосіб згідно з будь-яким з пп.(1)-(9)У, описаних вище, при тому, що зазначений білок 51 є однією з ізоформ С1, аналогом, фрагментом або похідним будь-якої з них; 11) спосіб згідно з будь-яким з пп.(1)-(10), описаних вище, при тому, що білок 51 або будь-які з його 7/5 іІзоформ, аналогів, фрагментів або похідних залучені в модулювання клітинного ефекту, опосередковуваного або модульованого будь-яким іншим цитотоксичним медіатором або індуктором, з яким зазначені білок 1, його ізоформа, аналог, фрагмент або похідна здатні зв'язуватися прямо або непрямо; 12) спосіб скринінгу інших сполук, таких як, наприклад, пептиди, органічні сполуки, антитіла тощо з метою одержання специфічних лікарських препаратів, які були б здатні пригнічувати активність 1, наприклад, пригнічувати протеазну активність ізоформи Сто, пригнічуючи таким чином клітинну цитотоксичність або посилюючи цитотоксичність за рахунок пригнічення активності С1рД.

Варіанти названого вище способу скринінгу за п.(12) включають: (1) спосіб скринінгу ліганду, здатного зв'язуватися з білююм С1 відповідно до цього винаходу так, як це було описано вище, який включає контактування матриксу в афінній хроматографії, до якого приєднаний Га зазначений білок, з клітинним екстрактом так, що внаслідок цього ліганд зв'язується з зазначеним матриксом з подальшою елюцією, виділенням і аналізом зазначеного ліганду; о (2) спосіб скринінгу послідовності ДНК, яка кодує ліганд, здатний зв'язуватися з білком 1 відповідно до цього винаходу, що включає застосування дигібридного дріжджового тесту, в якому послідовність, яка кодує зазначений білок, входить до складу одного гібридного вектору, а послідовності з бібліотек КДНК або геномної ФУ)

ДНК входять до складу другого гібридного вектору, з трансформацією дріжджових клітин-хазяїв зазначеними векторами з подальшим виділенням позитивних трансформованих клітин і екстрагуванням зазначеного другого сч гібридного вектору з метою одержання послідовності, що кодує зазначений ліганд; ю (3) спосіб ідентифікації і продукування ліганду, здатного модулювати клітинну активність модульовану/опосередковану білоюм МОКТ-1 або МОКТ1-зв'язним білком, який включає: З (а) скринінг ліганду, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що включає принаймні частину білка МОКТ-1 або ч-

МОКТ1-зв'язних білків, що вибираються з білків МАСН, білків Мей4 та інших МОКТ1-зв'язних білків; (Б) ідентифікація та охарактеризування ліганду, окрім МОКТ-1 або зазначених МОКТ1-зв'язних білків чи частин рецептора, що входить в сімейство рецепторів ТМЕ/МОР, знайденого за допомогою зазначеного етапу « скринінгу за здатністю до зазначеного зв'язування; і (с) одержання зазначеного ліганду в по суті ізольованому і очищеному вигляді; - с (4) спосіб ідентифікації і одержання ліганду, здатного модулювати клітинну активність білка (31 відповідно ц до цього винаходу, що виявляється в модуляції або опосередкуванні, який включає: "» (а) скринінг ліганду, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що включає, принаймні, частину послідовності с10, наведеної на Фіг.1, або, принаймні, частину послідовності С1р, наведеної на Фіг.2; (Б) ідентифікація і охарактеризування ліганду, окрім МОКТ-1 або МОКТІ1-зв'язних білків чи частин -і рецептора, що входить в сімейство рецепторів ТМЕ/МОЕ, знайденого за допомогою зазначеного етапу скринінгу їз за здатністю до зазначеного зв'язування; і (с) одержання зазначеного ліганду в достатньо ізольованому і очищеному вигляді; (9) (5) спосіб ідентифікації і одержання ліганду, здатного модулювати клітинну активність, юю 50 модульовану/опосередковану білком С1, що включає: (а) скринінг ліганду, здатного зв'язуватися, принаймні, з частиною послідовності (1 у, поданої на Фіг.1, або (Че) з послідовністю з1р, наведеною на Фіг.2; (Б) ідентифікація і охарактеризування ліганду, окрім МОКТ-1 або МОКТІ1-зв'язних білків чи частин рецептора, що входить в сімейство рецепторів ТМЕ/МОЕ, знайденого за допомогою зазначеного етапу скринінгу го за здатністю до зазначеного зв'язування; і

Ге! (с) одержання зазначеного ліганду в по суті ізольованому і очищеному вигляді; (6) спосіб ідентифікації і одержання молекули, здатної прямо або опосередковано модулювати клітинну ко активність, модульовану/опосередковану С1, який включає: (а) скринінг молекули, здатної модулювати активність 1, що виявляється в модуляції опосередкуванні; 60 (в) ідентифікація та охарактеризування зазначеної молекули; і (с) одержання зазначеної молекули в по суті ізольованому і очищеному вигляді; (7) спосіб ідентифікації і одержання молекули, здатної прямо або непрямо модулювати клітинну активність, модульовану/опосередковану білком 1 відповідно до цього винаходу, що включає: (а) скринінг молекули, здатної модулювати активність зазначеного білка С1, що виявляється в б5 модуляції/опосередкуванні; (в) ідентифікація і охарактеризування зазначеної молекули; і

(с) одержання зазначеної молекули в по суті ізольованому і очищеному вигляді.

Цей винахід також надає фармацевтичну композицію, призначену для модулювання впливу ліганду ЕА5-К або ТМЕ на клітини або впливу будь-яких інших цитотоксичних медіаторів чи індукторів на клітини так, як це було описано вище, що включають в якості активного інгредієнта один з наведених далі компонентів: (Ї) білок С1 згідно з цим винаходом і його біологічно активні фрагменти, аналоги, похідні сумішей; (ї) рекомбінантний вектор вірусу тварини, що кодує білок, здатний зв'язуватися на поверхнево-клітинному рецепторі і який кодує білок 1 або його біологічні активні фрагменти чи аналоги згідно з цим винаходом; (ії) олігонуклеотидну послідовність, що кодує анти-смислову послідовність відносно до послідовності 70 білка (31 відповідно до цього винаходу, при тому, що зазначений олігонуклеотид може бути другою послідовністю в складі вірусного вектору згідно з п.(і), описаним вище.

Також

І. Спосіб модулювання МОКТ-1-індукованого впливу або МОКТ1-зв'язним білково-індукованого впливу, або впливу будь-якого іншого цитотоксичного медіатора чи індуктора на клітини, який включає обробку зазначених 7/5 Клітин згідно з способом за будь-яким з пп.(1)-(10), описаних вище з використанням білків 1, їх аналогів, фрагментів чи похідних або з використанням послідовностей, що кодують білки 1, їх аналоги або фрагменти, при тому, що зазначена обробка веде в результаті до підсилення або пригнічення названого впливу, викликаного

МОКТ-1, і таким чином впливу, опосередковуваного рецепторами РА5Б-К і р55-К, або зазначених інших цитотоксичних медіаторів чи індукторів.

ІП. Спосіб згідно з описаним вище, при тому, що зазначені білок 51, його аналог, фрагмент чи похідна є тією частиною білка 1, яка специфічно бере участь в зв'язуванні з МОКТ-1 або з МОКТ1-зв'язними білками, або з зазначеними іншими цитотоксичними медіатором чи індуктором, або при тому, що зазначена послідовність білка С1 кодує ту частину білка 01, що специфічно бере участь в зв'язуванні з МОКТ-1 чи з МОКТ1-зв'язними білками, або з іншими цитотоксичними медіатором або індуктором. сч

Ш. Спосіб згідно з описаним вище, при тому, що зазначений білок 51 є будь-якою з ізоформ с1, а зазначені ізоформи здатні посилювати пов'язаний з МОКТ-1 вплив або зв'язаний з іншими цитотоксичними і) медіатором або індуктором вплив, завдяки цьому також посилюючи вплив на клітини, зв'язані з рецепторами

ЕАБ-К або р55-К, або вплив на клітини іншого цитотоксичного медіатора або індуктора.

ІМ. Спосіб згідно з описаним вище, при тому, що білок 51 є будь-якою, з ізоформ С1, а зазначені ізоформи Ге! зо здатні пригнічувати вплив, пов'язаний з МОКТ-1, або пов'язаний з іншим цитотоксичним медіатором чи індуктором вплив на клітини, завдяки цьому також пригнічуючи вплив на клітини, зв'язаний з рецепторами ЕА5Б-К с або р55-К, або вплив на клітини іншого цитотоксичного медіатора або індуктора. ю

Як видно з всього сказаного вище, а також і з докладного опису нижче, 51 також може використовуватись поза зв'язком з білюм МОЖКТ-1 з метою обробки (лікування) клітин або тканин. Виділення білків 1, їх « ідентифікація і характеристика можуть здійснюватись за допомогою будь-якої з стандартних пошукових ї- технологій, що використовуються для виділення та ідентифікації білків, наприклад, за допомогою дигібридного дріжджового тесту, методів афінної хроматографії і будь-яких інших добре відомих стандартних процедур, які застосовуються для подібних цілей.

Більше того, деякі ізоформи білка (31 можуть включати лише протеазоподібний сегмент (що виявляє « Гомологію з описаними вище протеазними сегментами в складі інших відомих протеаз), але за відсутності Ше) с реальної протеазної активності, внаслідок чого такі ізоформи можуть служити в першу чергу в якості інгібіторів так, як це було описано вище. ;» Далі, оскільки 51 або будь-яка з його ізоформ можуть бути втягнуті в модуляцію внутрішньоклітинних механізмів, не зв'язаних з МОКТ-1, то 51 або будь-яка з його ізоформ можуть використовуватись для Модулювання сигналів в будь-яких інших внутрішньоклітинних шляхах і механізмах. -І Інші аспекти і варіанти цього винаходу також надаються, виходячи з поданого нижче докладного опису цього винаходу. ве Слід зазначити, що, по мірі використання, такі терміни - "модулювання впливу РГАб-ліганду або ТМЕ на с клітини" Її "жодулювання впливу МОКТ-1 або МОКТІ1-зв'язного білка на клітини" - розуміються як такі, що 5о бтосуються впливу як іп мйго, так і іп мімо, а, крім того, також передбачають і пригнічення (інгібування), о та підсилення/зумовлювання.

Ге) Фіг1А є схематичним зображенням первинної нуклеотидної послідовності, що кодує одну з ізоформ білка 1, докладно описаної в прикладі 1.

Фіг1В8 є схематичним зображенням розшифрованої амінокислотної послідовності ізоформи, поданої на вв ФігЛА.

Фіг2 є схематичним зображенням первинної нуклеотидной послідовності і розшифрованої амінокислотної (Ф) послідовності другої ізоформи білка 1, докладно описаної в прикладі 1. ка Фіг.3 є схемою порівняння амінокислотних послідовностей сплайсингових варіантів білка 51 (або САН) людини (НСАЗНо, ПСАЗНВ) і миші (САЗНОо), а також консервативних мотивів, знайдених в складі цих білків. бо На Фіг.З здійснене паралельне зіставлення амінокислотних послідовностей 1 о; миші (ПГСАЗНОо) , С1о; людини (ПСАБНоО) ота 518 (ПСАБНВ) , САБР-8 (МАСН/РГІСЕЙМси5), САБР-10 (Мепа/РГІСЕ2), САБР-З (СРРЗ2/апопаїн//ата) і САБР-1 (СЕ). САБР-1 і САБР-З показані без їх продоменних сегментів. В кожній послідовності амінокислотні залишки пронумеровані справа. Переривчасті лінії вказують на розриви послідовностей, зроблені з метою оптимізації зіставлення. Затінені модулі "загибель-доменів" (ОЕБ). Обведені 65 амінокислоти, що виявляються ідентичними більш ніж в трьох білках. В межах ділянок "протеазної гомології" амінокислоти, зіставлені з залишками в складі САБР-1 так, що їх участь в забезпеченні каталітичної активності була підтверджена з застосуванням кристалографічної рентгенографії, позначені так: залишки, які, як припускають, беруть участь в каталізі і відповідіддають гістидину-237 та цистеїну-285 в складі САБР-1, інтенсивно затемнені та позначені забарвленими колами під стовпчиком зіставлення. Залишки, що утворюють Ккарман зв'язування для карбоксилатного бокового ланцюга РіІ-Агвр і відповідають аргініну-179, глутаміну-238, аргініну-341 і серину-347 в складі САБР-1, затемнені менше і позначені незабарвленими колами. Відомі і виявлені в експериментах сайти розщеплення по Агр-Х і сайти потенційного розщеплення, знайдені в однакових положеннях в 1 (САН), затінені. Горизонтальні стрілки вказують на М- та С-термінальні кінці малої і великої субодиниць САБР-1. С-кінці білків позначені зірочками. 70 Фіг.4 (А і В) відтворюють авторадіограми, одержані в ході ідентифікації транскриптів 51 за допомогою методу Нозерн-блотингу в різних тканинах людини (серце, головний мозок, плацента, легені, печінка, скелетні м'язи, нирки, підшлункова залоза, селезінка, тимус, простата, сіменники, яєчники, тонкий кишечник, товстий кишечник і лімфоцити периферійної крові-?РВІ). Тестування із застосуванням методу Нозерн-блотингу проводилось так: помічений ізотопно зонд мРНК, що відповідає "загибель-домену" (ОЕО) в складі 1 (згідно з 7/5 Нуклеотидами 482-1070 в складі 18 (|див. Фіг.2), тобто сегменту, спільному для обох клонованих сплайсингових варіантів 51 |САБНІ) був одержаний з використанням РНК-полімерази Т7 (Рготеода) і застосований для аналізу множинних тканинних точок людини (Сіопіесі), які включають полі(А) "-РНК (2мкг на одну лінію), що походять з різних тканин людини.

Фіг.5 є схематичним поданням результатів аналізу взаємодії 10; (САЗНОо) і 1р (САНД) з іншими білками, що включають "загибель-домени" (ОЕО) в трансфікованих клітинах дріжджів - наприклад, МОКТ-1/РА0О,

МАСНої (САБР-8бВа1), МАСНрІ (САБР-8Д1), МАСНрВ4 (САБР-8р4), Месйп4 (САБР-10), Сто (САЗНО), 18 (САНД), роб5-К (ро5-ІС), ТКАОО, КІР та ламін (як негативний контроль). Параметри зв'язування 18 (САЗНрД) , так само як і 10, (САЗНОо), були оцінені в репортерному штамі дріжджів ЗЕУ526 (Сіопіесні) з використанням ДНК-зв'язувального домену в складі вектора рОоВТ9-сАІ4 і активаторних доменів в складі с векторів рОАОІ1318 і рОАОН-ЗА14. Кількісний аналіз зв'язування в клітинах дріжджів в тесті по Го) експресії р-галактозидази був проведений так, як це описано в прикладах-посиланнях 1-3. Одержані результати виражені в часі, необхідному для одержання чіткого забарвлення. В усіх тестованих випадках ідентичні результати були одержані тоді, коли тестовані нуклеотидні вставки були приміщені в обох комбінаціях в межах

ДНК-зв'язувального домену і конструкцій активаторного домену плазмід. Жодна з тестованих вставок не Ф взаємодіяла з рядом контрольних білків, включаючи внутрішньоклітинні домени ро5-К (СО120а),р75-К(СО1205),,..ДЦ ЄМ

СОа40, ламін, і порожні САГА вектори.

Фіг.6 (А-О0) подає результати оцінки впливу мутантних варіантів 195; (САЗНо), 61рф8 (САНД) і Сто, (САЗНОо) о на життєздатність клітин та індукцію клітинної загибелі. Кількісний аналіз загибелі клітин, індукованої в «І клітинах Неї! а-Раз (дані схематично показані у вигляді діаграми на Фіг.бА) і в клітинах 293-Т (дані схематично м подані у вигляді діаграми на ФігбВ і 6С) шляхом трансфекції цих клітин визначеними конструкціями, був проведений так, як це описано в Прикладі 1. Клітини (5х109 клітин 293-Т або 3Х102 клітин Неї а в розрахунку на б-сантиметрові чашки) були у перемежувальний спосіб трансфіковані з використанням кДНК певних білків разом з плазмідою рОММ-рбо1 за допомогою методу осадження в розчині фосфату кальцію. Кожну чашку « трансфікували 5мкг конструкції р(кДНК); якщо ж трансфекція здійснювалася двома диференційованими шщ с конструкціями, то по 2,5мкг кожної з них плюс 1,5мкг вектора, що експресує р-галактозидазу. Клітини промивали ц протягом 6-10 годин після трансфекції і потім інкубували ще 14 годин без додаткової обробки. Моноклональне "» антитіло до С0О5 (анти-РАЗ-К) (СНІ11 |Опсог, Сайпегериго, МО, О,бмкг/мл) і рекомбінантний ТМЕо людини (10Онг/мл) були додані до клітин одночасно разом з циклогексимідом (1Омкг/мл) з подальшою інкубацією протягом ще 4 годин. Потім клітини забарвлювали з використанням -і 5-бром-4-хлор-З-індоксил- Д-ЮО-галактопіранозиду (Х-боа1) й тестували їх за допомогою фазо-контрастного їз мікроскопу. В усіх проілюстрованих експериментах загибель клітин оцінювали через 24 години після трансфекції клітин Неї а-Раз і через 20 годин після трансфекції клітин 293-Т. Наведені дані (середнє - 5.0.; п усереднено 1 принаймні по трьом експериментам) є відсотком забарвлених в синій колір клітин, які підраховують з г 20 урахуванням демонстрації ними блебінгу ("пухирчастості") мембран.

Цей винахід в одному з своїх аспектів стосується нових білків 21, що здатні зв'язуватися або взаємодіяти

Ме; прямо чи непрямо з МОКТ-1 або з МОКТ1-зв'язними білками, такими, як, наприклад, Меп4 або МАСН, завдяки цьому, зв'язуючись з внутрішньоклітинним доменом рецептора РА5Б-К, з яким зв'язується МОКТ-1, або, зв'язуючись з внутрішньоклітинним доменом рецептора ро5ТМЕ-К, з яким зв'язується білок ТКАОО, з яким, в го свою чергу, зв'язується білок МОВТ-1. Відповідно, білки С1 згідно з цим винаходом розглядаються в якості

ГФ! медіаторів або модуляторів РГА5-К, відіграючи завдяки цьому роль, наприклад, в сигнальних механізмах, що ініціюються зв'язуванням ліганду ЕА5 з рецептором ЕАЗ-К, а також відіграючи роль в сигнальних механізмах, що о ініціюються зв'язуванням ТМЕ на рецепторі р55-К. До групи білків 01 відповідно до цього винаходу включено новий білок 1 та його ізоформи. 60 Більш конкретно, згідно з цим винаходом подано новий білок 51 (який також називається САЗН), який, очевидно, є гомологом протеази СЕЮОЗ нематоди. Цей новий білок С1, хоча і є близькоспорідненим, при цьому виявляє певні відзнаки щодо структури і субстратної специфічності: відповідно, він може виконувати якоюсь мірою відмінні функції в клітинах ссавців. Дійсно, відомі два різних типи активності протеаз. Основною функцією ІСЕ (що також називається СА5Р-1) здається процесування попередника ІІ -1р, в той час як для СЕОЗ бо було чітко показане функціонування в якості ефектора запрограмованої клітинної загибелі. Ця остання функція також, як вважається, є функцією, принаймні, деяких гомологічних білків ссавців, наприклад, деяких ізоформ білків МАСН (що також називаються СА5БР-8), описаних в названих вище спільних, перебуваючих на стадії розгляду патентних заявках, а також згаданих вище споріднених білків Мей4 (що також називаються САБР-10), з

ЯКИМИ білок С1 відповідно до цього винаходу зв'язується. Амінокислотна послідовність МАСН 91 показує тісну спорідненість з СРРЗ2 (що також називаються САЗР-3), який є найбільш близьким з відомих гомологом ссавців

СЕЮОЗ. Субстратна специфічність МАСН також схожа з такою у СРРЗ2, за винятком того, що МАСН 491, по-видимому, характеризується більш обмеженою субстратною специфічністю порівняно з СРРЗ32. Протеаза

СРРЗ2 більш прийнятно розщепляє пептиди, що є субстратом, по відповідному сайту в складі 70 полі-АДФ-рибозо)-полімерази (РАКР), а також ще виявляє протеолітичну активність відносно до пептидів, що відповідають сайту розщеплення протеазою ІСЕ в складі попередника інтерлейкіну-1 Д. Однак, як здається,

МАСНЯО/1 здатна розщепляти винятково РАКР-відповідну послідовність. Таке співвідношення МАСН 91 з СРРЗ2 і

СЕЮОЗ та відсутність його схожості з ІСЕ відповідає тому припущенню, що МАСНоОї! подібно до СЕЮОЗ є регулятором клітинної загибелі. МАСН 91 у той же час виявляє ряд параметрів послідовності, які відрізняють 75 його від СЕОЗ і від СРРЗ2, так само як і від інших членів сімейства СЕОЗ/ЛСЕ. С-кінцева частина МАСН 41, розташована вище його ділянки, гомологічної СЕЮОЗЛСЕ, показує відсутність будь-якої схожості з всіма аналогічно розташованими сегментами будь-якого з відповідних гомологів. Крім того, є і ряд унікальних характеристик послідовності і в межах сегменту гомології з протеазами сімейства СЕОЗ/ЛСЕ. Наявність таких відмінностей підтверджує, що МАСНе1 належить до відокремленої еволюційної гілки даного сімейства і що його 20 участь в контролі клітинної загибелі певною мірою відрізняється від такого, описаного раніше для гомологів з сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ. Також білок 51 відповідно до цього винаходу і його ймовірні ізоформи показують деякі чіткі відмінності в межах сегменту гомології з протеазами СЕОЗ/ЛСЕ в складі послідовності 1, а раз так, то такі відмінності можуть представляти унікальні характеристики, що відбивають специфічність активності 1 в клітинах ссавців. с 25 Одна важлива відмінність може стосуватися механізму, за яким здійснюється регулювання протеази. Будучи Ге) втягнутою і в онтогенетично регульовані процеси клітинної загибелі, і в індукований рецепторами імунний цитоліз, розщеплення білків протеазами сімейства СЕОЗ/ЛСЕ має піддаватись регулюванню як сигналами, що формуються всередині клітини, так і сигналами, що приходять з рецепторів, які знаходяться на зовнішній поверхні клітини. В онтогенетичних процесах клітинної загибелі активація таких протеаз, як припускають, о 30 включає механізми, що впливають на експресію генів, внаслідок чого відбувається підсилення синтезу цих Га протеаз, так само як і зниження інтенсивності синтезу деяких білків, таких як ВСІ -2, який є антагоністом апоптотичної індукції. Однак це точно не відповідає випадку, коли цитотоксичність опосередковується о рецепторами РГАБ-К або ТМЕ-К. Клітини можуть бути знищені за участю ліганду ТМЕ-К або РА5-К навіть тоді, «ф коли активність білкового синтезу всередині них повністю заблокована (в дійсності вони можуть бути знищені в 3о цьому випадку з більшою ефективністю) і залишаються стимуло-залежними і в таких умовах. Активація протеаз в сімейства СЕОЗЛСЕ рецепторами ТМЕ і РА5Б-К також може відбуватися по механізму, який є незалежним від білкового синтезу. Унікальні параметри послідовності МАСНОої! можуть дозволити йому брати участь в роботі такого механізму. У подібний спосіб унікальні характеристики послідовності білка 1 відповідно до цього « винаходу також погоджуються з його ймовірною здатністю брати участь в роботі такого механізму. З

Таким чином, новий білок 51 може бути ще одним членом недавно виявленої групи протеаз, що включає с названу вище протеазу МАСН (і її ізоформи) та Мені, для яких була встановлена зв'язність, або прямо, або "з через білок-адаптор, з внутрішньоклітинним доменом поверхнево-клітинного рецептора. Відповідно до взаємодії механізмів дії зв'язаних з рецепторами білків, які мають інші каталітичні властивості, здається ймовірним, що зв'язування 1 з Ме/4 або 1 з МАСН (або ізоформою МАСНОа/1) і, в свою чергу, зв'язування Мейп4 або МАСН з - 15 МОКТ-1, або ж пряме зв'язування 1 з МОКТ-1 дозволяє стимулювати протеазну активність 01 і (або) Мей і (або) МАСН в ході зв'язування ГА5-ліганду на рецепторі ЕАБ-К. Також це може дозволяти активувати протеазу т» рецептором р55Б-К за рахунок зв'язування МОКТ-1 з ТКАОО, який, в свою чергу, зв'язується з рб5-К. сл Для інших членів сімейства протеаз СЕЮОЗ/ЛСЕ був виявлений прояв повної своєї активності лише після протеолітичного процесингу, який відбувається або шляхом саморозщеплення, або під впливом протеаз цього ж ко 50 сімейства (огляд Китаз, 1995; НепкКагії, 1996). Наприклад, як це було докладно описано в названих вище с спільних, перебуваючих на стадії розгляду патентних заявках в зв'язку з МАСН, цитотоксична дія внаслідок ко-експресії двох основних продуктів МАСНОе/1, що потенційно саморозщепляються, на протилежність відсутності цитотоксичності в клітинах у випадку експресії повнорозмірної ділянки гомології СЕЮОЗЛСЕ, погоджується з 5 ймовірністю того, що МАСНо! також виявляє свою повну активність тільки після процесингу. Ферментна активність, що спостерігається в лізатах бактерій, які експресують повно-розмірний сегмент, по-видимому, (Ф) відбиває наявність автопроцесингу даного білка, що відбувається в таких умовах, або процесингу, здійснюваного

ГІ деякими бактеріальними протеазами. Доки неясно, за яким механізмом такий процесинг протікає в клітинах ссавців і як він може здійснюватися при опосередкуванні рецепторами РА5Б-К і рб55-К, а також доки ще точно не бо Визначено, яким є відносний внесок протеаз-ної активності МАСНо/1 в цитотоксичність, яка індукується ГАЗ5-К і

ТМЕ. Оцінка такого внеску ускладнена тим, що має місце також експресія МАСН рт, в складі якої відсутній сегмент гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ, яка веде до вираженої цитотоксичності. Мабуть, такий прояв цитотоксичності відбиває здатність МАСНРрІ1 зв'язуватися з МАСН «1. Через таку здатність трансфіковані молекули МАСН можуть внаслідок агре-гованості призводити до конформаційних змін молекул МАСНОї, що є загрозливим для 65 трансфікованої клітини. Такий механізм може також зумовлювати цитотоксичність, що спостерігається тоді, коли в клітинах надекспресовані молекули, які діють до МАСН (білки МОКТІ1, ТКАСО або "загибель-домени" в складі або р55-К, або РАБ-К). В той самий час, однак, не можна виключити того, що цитотоксичність, яка спостерігається при індукції експресії МАСН або молекул, що діють до її прояву, також відбиває, окрім протеолітичної активності гомологічного СЕЮОЗ/ЛСЕ сегменту в складі МАСН, активацію деяких інших механізмів, які, як припускають, беруть участь в цитотоксичному прояві ГА5Б-К і рб55-К (наприклад, активацію нейтральної або кислої сфінгомієліназ). Також не можна виключати і того, що протеолітична активність сегменту гомології

СЕОЗЛ/ЛСЕ служить іншим функціям, окрім індукції цитотоксичності. Для більш чіткого розуміння функції МАСН о1 необхідно було б ідентифікувати ендогенні білкові субстрати, які розщепляються внаслідок активації МАСН «1.

Відкриття шляхів порушення активності МАСН 491, наприклад, шляхом експресування молекул-інгібіторів, також 70 може внести вклад в розуміння функцій цього білка і завдяки цьому сприяти з'ясуванню шляхів регулювання його активності, якщо це є бажаним.

Відповідно, білок (31 відповідно до цього винаходу і його ймовірні ізоформи можуть бути активними в аналогічному ключі у порівнянні з вище зазначеними білюками МАСН за наявності або відсутності прямої взаємодії з іншими білками, а саме 1 може діяти прямо шляхом зв'язування з МОКТ-1 або діяти непрямо через 75 зв'язування з Меп і (або) МАСН і, в свою чергу, шляхом зв'язування Мей і (або) МАСН з МОКТ-1 або згідно з іншим, доки ще точно не встановленим механізмом, специфічним для білка 1. У подібний спосіб регулювання активності 31 може бути аналогічною тій, що раніше була охарактеризована для білків МАСН.

Таке може існувати всередині клітин, які експресують природні інгібітори 51 відносно до протеазної активності, що виявляється цим білком. Існування ізоформ, які утворюються внаслідок альтернативного сплайсингу, характерних для інших членів сімейства СЕОЗЛСЕ, було визначене як фактор фізіологічного обмеження функцій цих протеаз. Для деяких з ізоформ таких інших протеаз повідомлялось про їх активність в якості природних інгібіторів повнорозмірних ізоформ, що, певно, зумовлюється формуванням неактивних гетеродимерів між ними. Це може бути справедливим також і для 1 та його деяких ймовірних ізоформ, наприклад, таких ізоформ, в яких потенційний М-кінцевий сайт розщеплення відсутній. Експресія таких Ге інгібіторних ізоформ може визначати роботу механізму клітинного самозахисту проти цитотоксичності, що о зумовлюється ЕГАБ-К і ТЕ. 1 може мати ще й інші функції: наприклад, 51 або будь-яка з його ізоформ можуть справляти вплив посилення або зміцнення на інші білки, які мають ферментну активність, наприклад, на протеолітичну активність різних ізоформ Меп4 і МАСН; така підсилювальна або зміцнююча активність здійснюється за механізмом, в Ге») якому 1 виступає в якості індуктора зв'язування інших білків з МОКТ-1 (наприклад, білків Мей4 і МАСН). Крім того, (31 або будь-яка з його ізоформ також можуть відігравати роль, не пов'язану з цитотоксичністю, але см можуть виступати в якості "притулку" для молекул (т. зв. "депо-сайта") , які залучені в дію РА5Б-К і ТМЕ, не юю пов'язану з проявом цитотоксичності.

Деякі з специфічних ізоформ 01 відповідно до цього винаходу проілюстровані нижче в прикладі 1. Одна з них З

С19, (САЗНО), - виділена у людини й миші (відповідно, Но1о/пСАЗНо і тОЛТо/пСАЗНОо), очевидно, являє собою ч- 1мг варіанту сплайсингу, що включає протеазний гомологічний сегмент і, принаймні, в деяких типах клітин (наприклад, в клітинах 293Т) має цитотоксичну активність. Інша ізоформа, позначена 51р (САЗНВ), виділена у людини, по-видимому, є коротким варіантом сплайсингу без протеазного гомологічного сегменту, ця ізоформа, « яка діє як інгібітор сигнальних механізмів клітинної загибелі.

Через унікальну здатність рецепторів ЕА5Б-К і ТМЕ-К зумовлювати клітинну загибель, так само як і здатність т с рецепторів ТМЕ опосередковувати різні інші типи активності, пов'язані з пошкодженням тканин, порушення ч функцій цих рецепторів може мати негативні наслідки для організму. Дійсно, для обох типів функцій цих » рецепторів - надлишкової і недостатньої - була продемонстрована участь в патологічних проявах різних захворювань. Ідентифікація молекул, які беруть участь в сигнальній активності цих рецепторів, і відкриття шляхів модулювання функцій цих молекул являє собою можливий ключовий прийом, необхідний для нових - лікувальних методологій відносно до таких захворювань. З точки зору передбачуваної важливої ролі 1 в їз токсичності, що зумовлюється участю БАБ-К і ТМЕ, вважається, зокрема, важливим створити ліки, які могли б блокувати протеолітичну функцію таких молекул, що раніше було виконано відносно до інших представників о сімейства протеаз СЕЮОЗ/ЛСЕ. Унікальні параметри послідовності гомологічного СЕОЗЛСЕ сегменту в складі 1 з 50 можуть дозволити створювати ліки, які б порушували їх захищеність від цитотоксичності, що зумовлюється надлишковою імунною активністю, без порушення фізіологічних процесів загибелі клітин, в які втягнуті інші

Ме, члени сімейства СЕОЗ/ЛСЕ.

Як відзначалося вище, 01 або будь-які з його ізоформ також можуть бути втягнуті в модулювання інших внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, таких як, наприклад, дія інших цитотоксичних медіаторів або

Індукторів чи інших білків, діючих поза залежністю від зв'язування з МОКТ-1 або з МОКТ1-незалежно-зв'язними о білками. Далі, 21 або, принаймні, його ізоформи, які включають протеазо-подібний сегмент, але без реальної протеазної активності, можуть бути втягнуті в первинну інгібіторну функцію: тобто пригнічувати ті механізми де (наприклад, сигнальні механізми в загальних або цитотоксичних механізмах), в яких 1 або його ізоформи беруть участь або шляхом прямого зв'язування з учасниками цих механізмів, або шляхом непрямого зв'язування 60 з іншими білками, які, в свою Чергу, зв'язуються з учасниками цих механізмів.

Отже, цей винахід також стосується послідовності ДНК, що кодує білок С1, і білків С1, які кодуються такими послідовностями ДНК.

Більше того, цей винахід також стосується послідовностей ДНК, які кодують біологічно активні аналоги, фрагменти і похідні білка С1, так само як і аналоги, фрагменти і похідні, що ними кодуються. Одержання таких б5 аналогів, фрагментів і похідних проводиться за допомогою стандартних методик |див., наприклад, методичний посібник Затьгоок еї а/!., 1989), за допомогою яких в послідовностях ДНК, які кодують білок 1, один чи більше число кодонів може бути делетоване, додане або замінене іншими з подальшим одержанням аналогів, що мають, принаймні, одну заміну амінокислотного залишку порівняно з нативним білком.

Поліпептид або білок, який "по суті відповідає" білку (31, включає не тільки білок С1, але також і поліпептиди або білки, що є аналогами 01.

Аналогами, які істотною мірою відповідають білку С1, є поліпептиди, в складі яких одна чи більше число амінокислот нативної амінокислотної послідовності (31 заміщені іншою амінокислотою, делетовані і (або) вставлені, внаслідок чого одержуваний білок виявляє по суті такий самий або більший рівень біологічної активності порівняно з білком С1, якому він відповідає. 70 З метою забезпечення відповідності білку С1 по суті зміни в амінокислотній послідовності білків 1, таких як його ізоформи, повинно бути відносно невеликим. Хоча кількість замін може бути більше десяті, більш прийнятно, щоб вона не перевищувала десяти замін, ще більш прийнятно, щоб число замін не було більше п'яти, а найбільш прийнятно - не більше трьох таких замін. При тому, що будь-які методики можуть використовуватись для виявлення біологічно активних білків, які істотною мірою відповідають білкам 1, одним /5 З таких методів є використання стандартної процедури мутагенезу відносно до ДНК, що кодує білок, з одержанням в результаті малого числа модифікацій. Білки, які експресуються такими клонами, потім можуть піддаватись скринінгу за їх здатністю зв'язуватися з різними МОКТІ1-зв'язними білками, такими, як, наприклад,

Мена і МАСН, або навіть прямо з МОКТ-1, і (або) за їх ЕА5-К - і ро5-К-опосередковувальній активності та (або) здатності опосередковувати активність будь-яких інших внутрішньоклітинних механізмів у такий спосіб, як це 20 було описано вище.

Під "консервативними" змінами розуміють ті зміни, які, як очікується, не повинні змінювати активність білка і які зазвичай піддаються скринінгу в першу чергу, оскільки вони, як очікується, не призводять до істотної зміни розміру, заряду або конфігурації даного білка і, отже, як також очікується, не призводять до зміни його біологічних властивостей. с 25 Консервативні заміщення в білках 51 включають такий аналог, в якому, принаймні, один амінокислотний залишок в складі поліпептиду заміщений у консервативний спосіб іншою амінокислотою. Більш прийнятно і) виконувати такі заміщення згідно з переліком, наведеним в таблиця 14А: такі заміщення можуть бути визначені шляхом рутинного експериментування з метою одержання модифікованих структурних і функціональних характеристик синтезованої поліпептидної молекули при підтриманні біологічної активності, характерної для Ге! білка С1. 30 сч ю - зв ці ч 4 З с . ї» 6000 вим - в т, ще ср

З іншого боку, інша група заміщень в складі білка 51 подана такими заміщеннями, коли принаймні один амінокислотний залишок в складі поліпептиду вилучається і інший залишок вноситься на його місце згідно з таблиці 18. Типи заміщень, що можуть здійснюватись в складі поліпептиду, можуть грунтуватися на аналізі о частоти амінокислотних замін між гомологічними білками у різних видів організмів, такі як ті, що подані в ко таблицях 1-2 Ту Зспці2 еї аї., 1978, Ргіпсіріев ої Ргоївіїп Зігисіцге, Зргіпдег-Мегпад, Мем Могк, МУ, і на мал.3-9 у Стеідпіоп Т. Є., 1983, Ргоїеіпв: Зігисіге апа МоіІесшіаг Ргорегпієв, ГРгеетап 5 Со., Зап Егапсізсо, СА). бо Грунтуючись на подібних аналізах, альтернативні консервативні заміщення визначені тут як заміни в межах однієї з таких п'яти груп: вв

З |Полярні, позитивно заряджені залишки: Нів, Ага, Гув

Три амінокислотні залишки, взяті в наведеній вище таблиці в дужки, характеризуються специфічною роллю в просторовій архітектурі білків. Гліцин є єдиною амінокислотою, позбавленою будь-якого бокового ланцюга і таким чином забезпечує рухливість ланцюга. Це, однак, має тенденцію до утворення будь-якої іншої вторинної структури, окрім о-спіральної. Пролін завдяки своїй незвичайній геометрії забезпечує щільність упаковки ланцюга і в принципі забезпечує тенденцію до утворення структур типу Д-площин, хоча в деяких випадках /о залишок цистеїну може приймати участь в утворенні дисульфідних зв'язків, що важливі для просторової складчастості білка. Слід зазначити, що цитований вище Зспці7 еї а). об'єднував названі вище групи 1 і 2.

Треба зазначити також, що тирозин, завдяки його потенціалу до утворення водневого зв'язку, виявляє істотну спорідненість з серином і треоніном, тощо.

Консервативні амінокислотні заміщення згідно з цим винаходом, наприклад, такі, що описані вище, добре відомі в даній галузі техніки і, як очікується, повинні підтримувати біологічні і структурні властивості даного поліпептиду після заміщення амінокислот. Більшість делецій і замін згідно з цим винаходом є такими, що не призводять до радикальних змін характеристик даного білка або поліпептидної молекули. Під "характеристиками" розуміються як зміни у вторинній структурі, наприклад, наявність А-спіралей або р-площин, так і зміни в біологічній активності, наприклад, зв'язування з МОКТ1-зв'язними білками чи з МОКТ-1, або опосередкування впливу на клітини ліганду ГАБ-К чи ТМЕ.

Приклади проведення амінокислотних замін в складі білків, що можуть використовуватись для одержання аналогів білків 51 для використання в цьому винаході, включають будь-які відомі методи, такі як наведені |в патентах США КЕ-33653, 4959314, 4588585 і 4737462 у Мак еї аї.; 5116943 у Коїйз еї аі.; 4965195 у Матеп еї аІ.; 4879111 у Спопд еї аї.; і 5017 691 у І ее еї а); та лізин-заміщені білки, подані патентом США 4904584 с ов (Зпам ега/.).

Окрім консервативних заміщень, що обговорювалися вище, які не повинні скільки-небудь істотно змінювати о активність білка 1, та консервативні заміщення, і менш консервативні і "більш випадкові" зміни, що ведуть до збільшення біологічної активності аналогів білків (31, також входять до обсягу цього винаходу.

Коли треба визначити точний прояв заміщення або делецій, фахівцю в цій галузі техніки повинно бути ясно, б зо що такий прояв заміщення (заміщень), делецій (поділів) тощо може оцінюватись за допомогою стандартних тестів на зв'язування і загибель клітин. Проведення скринінгу з використанням таких стандартних тестів не с включає будь-яких непідхожих експериментів. ю

Прийнятними аналогами є ті з них, які зберігають, принаймні, здатність зв'язування з МОКТ1-зв'язними білками, як це відзначалося вище, або з МОКТ-1, чи з іншими білками, завдяки цьому згідно з описаним вище -

Зз5 опосередковуючи активність рецепторів РАЗ-К і р55-К або інших білків, які було названо вище. Таким чином, че можуть бути одержані аналоги, що виявляють так званий "домінантно-негативний ефект", а саме аналоги, які дефектні або за зв'язуванням з МОКТ1-зв'язними білками (наприклад, Меп4 або МАСН), або за зв'язуванням з

МОКТ-1, або з іншими білками, або за подальшій сигнальній або протеазній активності після такого зв'язування.

Такі аналоги можуть використовуватись, наприклад, для пригнічення впливу ліганду ГА5-К або впливу інших « білків за рахунок конкуренції з природними МОКТ1-зв'язними білками або іншими білками. Наприклад, здається шщ с ймовірним, що ізоформи МАСН-МАСНеЯ2 і МАСНеЗ - є "природними" аналогами, що служать в якості ц інгібіторів активності МАСН за рахунок конкуренції по зв'язуванню активних (про-теазних) ізоформ МАСН з "» МОКТ-1, що здається істотним для активації цих ізоформ МАСН. Оскільки в результаті активні ізоформи МАСН не можуть зв'язуватися з МОКТ-1, внутрішньоклітинні сигнальні механізми, що опосередковуються рецепторами ЕАЗ-К і р55-К, також виявляться пригніченими. У подібний спосіб 1 або будь-яка з його ізоформ також можуть -І служити в якості інгібіторів впливу РАзЗ-ліганду за рахунок конкуренції з різними МОКТІ1-зв'язними білками по зв'язуванню з МОКТ-1 або за рахунок взаємодії з ними таким шляхом, який відвертає їх зв'язування з МОКТ-1. ть Також можуть бути одержані так звані "домінантно-позитивні" аналоги С1, які будуть служити для підсилення ос впливу ЕАбЗ-ліганду або ТМЕ. Вони можуть мати таку ж саму або кращу здатність до зв'язування з МОКТ1-зв'язними білками або навіть такі ж або кращі властивості щодо зв'язування з МОКТ-1 і такі ж або кращі ді характеристики відносно до сигнальних механізмів порівняно з природними білками 1. (Че) На генетичному рівні ці аналоги в принципі одержують шляхом сайт-спрямованого мутагенезу відносно нуклеотидів в складі ДНК, що кодує білок 51, завдяки цьому одержуючи ДНК, яка коду даний аналог, з подальшим синтезом цієї ДНК і експресією рекомбінантного поліпептиду в клітинній культурі . Як правило аналоги виявляють такі ж або покращені якісні показники біологічної активності порівняно з білком, що трапляється в природі: |(Аизибвбеї еї аї., 1987-1995, Сицтепі Ргоїосоїв іп МоіІесціаг Віоїоду, Сгеепе Рирі. 5 УМіеу іФ) Іп(егесі., Мем/ Могк, МУ; ЗатрбгооК еї аїЇ., 1989, МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїгу Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагрог ко І аб., Соїа 5ргіпд Нагброг, МУ).

Приготування білка 1 згідно з викладеним тут або альтернативної нуклеотидної послідовності, що кодує бо такий самий поліпептид, яка відрізняється від природної послідовності через зміни, що враховують відому виродженість генетичного коду, може здійснюватись шляхом сайт-специфічного мутагенезу ДНК, яка кодує раніше приготований аналог або нативний варіант білка 51. Сайт-специфічний мутагенез дозволяє одержувати аналоги шляхом використання специфічних олігонуклеотидних послідовностей, що кодують послідовність ДНК з бажаною мутацією, а також достатнє число сусідніх нуклеотидів з одержанням затравкової послідовності 65 достатнього розміру і складності, необхідних для утворення стабільного дуплекса по обидві сторони від делеційного з'єднання, "що перетинається". Зазвичай більш прийнятною є затравка, яка складається приблизно з 20-25 нуклеотидів при тому, що приблизно 5-10 комплементуючих нуклеотидів з кожного боку послідовності замінюються. В цілому, методика сайт-специфічного мутагенезу добре відома у цій галузі техніки, прикладом чого служить публікація Адеї!тап е! а!., 1983 (ОМА, 2, 183), дані що включені в цей текст шляхом цитування.

Треба прийняти до уваги, методика сайт-специфічного мутагенезу зазвичай використовує фаговий вектор, що існує як в одноланцюжковій, так і в дволанцюжковій формах. Звичайні вектори, що використовуються в методі спрямованого мутагенезу, включають такі вектори, як фаг М13, наприклад, так, як це описано Месингом з співавт. |Мезвіпуд еї аї., 1981, за Сіемеїапа бутр. оп МасготоЇесцез 5 Кесотбріпапі ОМА, ей. А. УмУаїюоп,

ЕІвеміег, Атзіегдаті, дані якого включені тут у вигляді цитування. Ці фаги є легко доступними на комерційній 7/0 основі ії їх використання в принципі добре відомо фахівцям у цій галузі техніки. З іншого боку, також для одержання одноланцюжкової ДНК можуть використовуватись плазмідні вектори, що несуть одноланцюжковий фаговий сайт початку реплікації (Меїга еї а!., 1987, Меййоаз Епгутої)., 153, 31.

В цілому, сайт-специфічний мутагенез згідно з описаним тут здійснюють спочатку шляхом одержання одноланцюжкового вектору, який включає в межах своєї послідовності послідовність ДНК, яка кодує необхідний 7/5 поліпептид. Олігонуклеотидну затравку, що несе послідовність, яку мутовано у бажаний спосіб, одержують синтетичним шляхом за допомогою автоматичного ДНК-олігонуклеотидного синтезу. Цю затравку потім відпалюють з одноланцюжковим вектором, що містить білок-кодуючу послідовність, і піддають впливу

ДНК-полімеризуючих ферментів, таких як фрагмент Кльонова полімерази | кишкової палички, з метою завершення синтезу ланцюга, який несе дану мутацію. Таким чином, як і послідовність, що мутувала, другий го ланцюг несе бажану мутацію. Такий гетеродуплексний вектор потім використовують для трансформації підхожих клітин, таких як клітини УМ101 Е. соїї, а клони відбирають за включенням рекомбінантних векторів, що несуть мутантну послідовність.

Після того, як такий клон відібраний, мутантний білок С1 може бути виділено і внесено до складу підхожого вектору, зазвичай до складу трансформаційного або експресувального вектору такого типу, що може с ов ВИКОристовуватись для трансфекції підхожого організму-хазяїна.

Відповідно, ген або нуклеїнова кислота, які кодують білок 51, також можуть бути виявлені, одержані і (8) (або) модифіковані іп міїго, іп зі і (або) іп мімо шляхом використання відомих методик ампліфікації ДНК або

РНК, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і хімічний олігонуклеотидний синтез. ПЛР дозволяє ампліфікувати (збільшувати кількісно) специфічні послідовності ДНК шляхом повторення реакцій за участю Ге!

ДНК-полімерази. Ця реакція може використовуватись замість клонування: всі, що в цьому випадку вимагається, - це знати склад нуклеотидної послідовності. З метою здійснення ПЛР формують затравки, які є с комплементарними до послідовності, що цікавить. Потім ці затравки генерують за допомогою автоматизованого (У синтезу ДНК. Оскільки затравки можуть бути сформовані так, щоб вони гібридизували з частиною конкретного гену, можуть бути створені такі умови, за яких можливим стає пропускання помилок в комплементарності основ. -

Ампліфікація таких ділянок, що несуть помилки, може призводити до синтезу мутантного продукту, внаслідок ї- чого утворюється пептид, який має нові властивості (тобто по суті - це сайт-спрямований мутагенез). Див. також посібник А!зиБбеї еї аіІ.), що цитувався вище, глава 16. Також шляхом об'єднання синтезу комплементарної

ДНК (КкДНК) з використанням зворотної транскриптази і методу ПЛР РНК може використовуватись в якості вихідного матеріалу для синтезу позаклітинного домену рецептора пролактину з виключенням етапу клонування. «

Більше того, затравки для ПЛР можуть бути сконструйовані так, щоб включати нові рестрикційні сайти або пт») с інші елементи, такі як термінуючі кодони по кінцям генного сегменту, призначеного для ампліфікування. Таке . приміщення рестрикційних сайтів по 5- і З3-кінцям генної послідовності, що ампліфікується, дає змогу и?» спрямовано одержувати генні сегменти, які кодують білок 51 або його фрагменти, сформовані так, щоб бути придатними для літування на інші послідовності і (або) клонуючі сайти в складі векторів.

ПЛР та інші методи ампліфікації РНК і (або) ДНК добре відомі у цій галузі техніки і можуть -І використовуватись згідно з цим винаходом без зайвих експериментів, грунтуючись на порадах, наведених в цьому тексті. Відомі методи ампліфікації ДНК або РНК включають, але цим не обмежуються, полімеразну ве ланцюгову реакцію (ПЛР) і подібні ампліфікаційні процеси |див., наприклад, патенти США 4683195, 4683202, с 4800159, 4965188 (Мийв еї аї.), 4795699 і 4921794 (Тарог еї а), 5142033 (Іппів), 5122464 (УМівоп еї аї.), 2091310 (Іппів), 5066584 (СуПепвієп еї а), 4889818 (СеМапа еї а), 4994370 (Зімег еї аї.), 4766067 ю (Візвм'аз), 4656134 (Кіпдоі4) і посібник Іппіз ей аїЇ. Іедв3, РСК Ргоїосоіїв: А Сціде юю Меїйод4 апа

Ге) Атрійісайоп|, а також ампліфікація по РНК-посередникам, що грунтується на використанні РНК, яка є антисмисловою відносно до послідовності-мішені і використовується в якості матриці для синтезу дволанцюжкової ДНК (патент США 5130238 - Маїек еї аі.: торгова марка МАЗВА) та імунна ПЛР, що є комбінацією

ДНК-ампліфікації з міченням антитіл |(Кигіска еї аїЇ.,, 1993, Зсіепсе, 260, 487; Запо еї аї., 1992, Зсіепсе, 258, 120; Запо еї аїЇ., 1991, Віоїесппідоез, 9, 1378), при тому, що повний зміст патентів і статей, що (Ф, цитуються, повністю включений у вигляді посилань. ка У аналогічний спосіб біологічно активні фрагменти білків 1 (наприклад, такі як будь-які білки (31 чи його ізоформи) можуть бути одержані так, як це було описано вище щодо одержання аналогів білків 51. Підхожими бо фрагментами білків (31 є ті, що зберігають притаманну білку (31 здатність опосередковувати біологічну активність рецепторів РА5Б-К і р55-К або інших білків так, як це було описано вище. Відповідно, можуть бути одержані такі фрагменти білків (31, що мають "домінантно-негативну" або "домінантно-позитивну" дію згідно з описаним вище для характеристики аналогів. Слід зазначити, що ці фрагменти являють собою спеціальний тип аналогів відповідно до цього винаходу, а саме вони визначають ділянки білків 51, що є похідними від повної 65 послідовності білка 1 (наприклад, від послідовності будь-якого 1 або їх ізоформ), при тому, що така частина або фрагмент мали будь-яку з вище названих бажаних характеристик. Такий фрагмент може бути, наприклад,

пептидом.

У подібний спосіб похідні можуть бути одержані шляхом стандартних модифікацій бокових груп одного чи більшої кількості амінокислотних залишків в складі білка 1, його аналогів чи фрагментів або шляхом з'єднання білка 1, його аналогів або фрагментів з іншою молекулою, наприклад, антитілом, ферментом, рецептором тощо, що добре відомо у цій галузі техніки. Відповідно, під поняттям "похідних" в даному тексті розуміють похідні, які можуть бути одержані з функціональних груп, що знаходяться на бокових ланцюгах амінокислотних залишків або М-, або С-кінцевих груп за допомогою відомих методик, і вони включені в цей винахід. Похідні можуть бути хімічними складовими, такими як вуглеводні або фосфатні залишки, внаслідок чого одержувана 7/0 фракція матиме таку ж або більш високу біологічну активність порівняно з білками 1.

Наприклад, похідні можуть включати аліфатичні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, одержані в результаті реакцій з амонієм або з первинними чи вторинними амінами, М-ацильні похідні або вільні аміногрупи амінокислотних залишків, утворені ацильними складовими (наприклад, алканоїльні групи або ароїльні групи з вуглецевим кільцем) або 0-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (наприклад, в залишках 7/5 Серину або треоніну), утворені адильними складовими.

Термін "похідна" повинен включати лише ті похідні, що не змінюють одну амінокислоту на іншу з 20 природних амінокислот.

Хоча білок 51 є білком або поліпептидом, він є послідовністю амінокислотних залишків. Поліпептид, що включає більш довгу послідовність, який містить повну послідовність білка 1, згідно з прийнятими тут 2о визначеннями, повинен також включатися в параметри такого поліпептиду, оскільки додання не впливають на основні і нові характеристики винаходу: тобто, якщо воно зберігає або посилює біологічну активність білка 1 або якщо подовжений поліпептид може бути згодом розщеплений з одержанням білка або поліпептиду, що має біологічну активність білка 1. Таким чином, наприклад, цей винахід також включає злиті білки, які складаються з білка 1 та інших амінокислот або пептидів. сч

Новий білок С1, його аналоги, фрагменти і похідні придатні для використання в ряді напрямків, наприклад: (1) Білок С1, його аналоги, фрагменти і похідні можуть використовуватись для міметування або підсилення і) функцій МОКТ1-зв'язних білків, таких як, наприклад, Мсп4 або МАСН (включаючи їх різні ізоформи) або навіть самого МОКТ-1 і, отже, ліганду ЕА5-К чи ТМЕ, або інших білків в випадках, коли бажаним є підсилення впливу ліганду РАБ-К чи ТМЕ, або іншого білка, як, наприклад, при застосуванні з протипухлинною, протизапальною, Ге! зо проти-ВІЛ і т. ії. метою, при досягненні якої бажаною є індукція цитотоксичності за участю ліганду ЕАБ-К чи

ТМЕ, або інших білків. В цьому випадку білок 1, його аналоги, фрагменти або похідні, що посилюють вплив с ліганду ГА5Б-К, або ТМЕ, або іншого білка, тобто цитотоксичну дію, можуть вноситись в клітини за допомогою ю стандартних процедур, відомих до цього часу. Наприклад, тоді, коли білок 51 є повністю внутрішньоклітинним (як це припускається) і повинен вноситись лише всередину клітин, в яких бажаним є прояв впливу ліганду ЕА5-К, « або ТМЕ, або іншого білка, необхідно застосовувати спеціальну систему для внутрішньоклітинного ї- впровадження білка. Одним з шляхів для вирішення такої задачі є створення рекомбінантного тваринного вірусу, наприклад, похідного від Массіпіа, до складу ДНК якого повинні бути вбудовані такі два гени: ген, який кодує ліганд, що зв'язується з поверхнево-клітинними рецепторами, які специфічно експресуються даними клітинами, наприклад, такий ліганд як антиген др120 СНІДу (ВІЛ), який специфічно зв'язується на деяких типах клітин (на « 04 лімфоцитах і споріднених лейкозних клітинах), або ж будь-як інший ліганд, який специфічно зв'язується з з с клітинами, що несуть рецептори ЕА5Б-К або р55-К, таким чином, щоб такий рекомбінантний вірусний вектор був би здатний зв'язуватися такими клітинами, що несуть ГА5Б-К або р55-К; і ген, який кодує білок С1. Таким чином, ;» експресія на поверхні вірусу антигену, який зв'язується на поверхні клітини-мішені, дозволить точно спрямовувати цей вірус на пухлинну клітину або іншу клітину, що несе РГА5Б-К або р55-К для того, щоб після

Цього послідовність, яка кодує білок С1 (наприклад, послідовність 51 у) було внесено всередину клітин за -і допомогою цього вірусу і, відповідно, експресовано в цих клітинах, що в результаті приведе до підсилення впливу ліганду ЕАБ-К або ТМЕ і далі приведе до загибелі пухлинних клітин або інших клітин, що несуть ЕАБ-К ть або р55-К, якщо їх бажано знищити. Конструювання такого рекомбінантного тваринного вірусу здійснюється за с допомогою стандартних процедур |див., наприклад, Затьгоок еї аї., 1989). Іншим можливим шляхом внесення 5р послідовності білка (51 (наприклад, або білка (1, або будь-якої з його ізоформ) є внесення у формі о олігонуклеотидів, які можуть поглинатись клітиною з подальшою їх експресією всередині неї.

Ге) Ще одним шляхом підсилення такої клітинної цитотоксич-ності може бути пригнічення активності ізоформ 1 (наприклад, С1р), які самі по собі є інгібіторами клітинної цитотоксичності. Шляхи інгібування таких ізоформ 1 численні і включають ті, що розглянуті в поданому нижче п.(2) у зв'язку з їх застосуванням для специфічного пригнічення інгібіторних ізоформ білка С1, таких як, наприклад, ізоформа С1р. (2) Вони можуть використовуватись для пригнічення впливу на клітини ліганду ЕАЗ-К, або ТМЕ, або іншого о білка, наприклад, в таких випадках, як пошкодження тканин при септичному шоку, відторгненні при синдромі іме) "трансплантат проти хазяїна" або гострому гепатиті, тобто тоді, коли бажаним є блокування індукованих лігандом РА5Б-К або ТМЕ внутрішньоклітинних сигналів з ЕАБ-К або з р55-К, або сигналів, що індукуються бо іншими білками. У цьому випадку можливим є, наприклад, внесення до клітин за допомогою стандартних процедур олігонуклеотидів, що мають антисмислові кодуючі послідовності відносно до послідовності, яка кодує білок 1, що забезпечує ефективне блокування трансляції мРНК, які кодують білок 1, і завдяки цьому блокування його експресії, що веде до пригнічення впливу ліганду ГА5Б-К, чи ТМЕ, або іншого білка. Такі олігонуклеотиди можуть бути внесені в клітини з використанням вище описаного способу конструювання 65 рекомбінантних тваринних вірусів, друга вбудована послідовність в складі яких є даною олігонуклеотидною послідовністю.

Далі, як вже зазначалось вище і нижче буде розглянуто в якості прикладу, була виділена принаймні одна ізоформа білка 21, що розглядається в якості "природного інгібітору" клітинної цитотоксичності - це 1 р1.

Відповідно, така ізоформа білка 31 може вводитись в клітини прямо або з використанням підхожого вектору, що

Несе нуклеотидну послідовність, яка кодує цю ізоформу: отже, у разі експресії в цих клітинах ця ізоформа 01 буде працювати як інгібітор цитотоксичності.

Інша можливість надається використанням антитіл, специфічних відносно до білка 01 щодо інгібування його внутрішньоклітинної сигнальної активності.

Ще одним шляхом пригнічення впливу ліганду ЕАБ-К або ТМЕ є нещодавно розроблений "рибозимний 70 підхід". Рибозими - це молекули РНК, які мають каталітичну активність, спрямовану на розщеплення молекул

РНК. Рибозими можуть бути штучно сконструйовані таким чином, щоб селективно розщепляти РНК-мішень, наприклад, мРНК, яка кодує білок 01 відповідно до цього винаходу. Такі рибозими повинні характеризуватися послідовністю, специфічною відносно до мРНК білка 51 і мають бути здатними взаємодіяти з нею (шляхом комплементарного зв'язування) з подальшим розщепленням мРНК, внаслідок чого відбувається зменшення (або 7/5 повне припинення) експресії білка С1, а міра зменшення експресії залежить від рівня інтенсивності експресії рибозиму в клітині-мішені. Для внесення до вибраної клітини рибозимів (наприклад, в клітини, що несуть рецептори ГА5Б-К або р55-К) може використовуватись будь-який підхожий вектор, наприклад, плазміда, вектори на основі вірусів тварин (ретровіруси), які зазвичай використовуються для подібних цілей (див. також п.(1), описаний вище, де описані вірусні вектори, які включають в якості другої вбудовуваної послідовності кДНК, Кодуючу послідовність рибозиму, що вибирається). Як огляди методів застосування рибозимів |див. Снеп еї а)., 1992; 2пао 85. Ріск, 1993; Зпоге еї аї., 1993; дозерп « ВигКе, 1993; Зпітауата еї аї., 1993; Сапіог еї аї., 1993;

Вагіпада, 1993; Стівеї! еї а!., 1993 і Коігиті еї а!., 1993). (3) Білок 1, його аналоги, фрагменти або похідні також можуть використовуватись для виділення, ідентифікації і клонування інших білків того ж типу, тобто тих, що зв'язуються з внутрішньоклітинним доменом с рецептора РГАБ-К або з функціонально спорідненими рецепторами, або тих, які зв'язуються з описаними вище

МОКТІ-зв'язними білками, або тих, що зв'язуються з білююом МОКТ-1 і завдяки цьому зв'язуються з о функціонально спорідненими рецепторами, такими, як БРАБ-К і р5бБ-К, і, відповідно, втягнуті в внутрішньоклітинні сигнальні процеси. В цьому випадку може використовуватись названа вище система дигібридного дріжджового скринінгу, або може використовуватись нещодавно розроблена система д блотгібридизації по Саузерну з подальшим ПЛР-клонуванням в нежорстких умовах ГУМіїке еї аї!., 1989). В цій публікації були описані ідентифікація і клонування двох потенційних протеїнтирозинкіназ з застосуванням с

Саузерн-блот-гібридизації в нежорстких умовах з подальшим ПЛР-клонуванням, що грунтується на відомій ю послідовності основного кіназного мотиву. Такий підхід може застосовуватись відповідно до цього винаходу з використанням послідовності білка (31 при ідентифікації і клонуванні тих білків, що споріднені з в МОКТІ-зв'язними білками. ї- (4) Ще одним підходом до використання білка 51 або його аналогів, фрагментів чи похідних відповідно до цього винаходу є використання їх в афінній хроматографії з метою виділення і ідентифікація інших білків або факторів, з якими вони можуть зв'язуватися, наприклад, біль»а МОКТ-1, МОКТ1-зв'язних білків або інших білків чи факторів, втягнутих в внутрішньоклітинні сигнальні процеси. У випадку такого застосування білок 1, його « аналоги, фрагменти або похідні відповідно до цього винаходу можуть бути окремо приєднані до матриксів для шщ с афінної хроматографії і потім піддані контакту з клітинними екстрактами або ізольованими білками чи й факторами, які, як припускають, беруть участь в внутрішньоклітинних сигнальних процесах. По закінченні «» процедури афінної хроматографії інші білки або фактори, які виявилися зв'язаними з білком 51 або з його аналогами, фрагментами чи похідними відповідно до цього винаходу, можуть елююватись, виділятись і бути охарактеризованими. -і (5) Як зазначалося вище, білок (31 або його аналоги, фрагменти чи похідні відповідно до цього винаходу можуть також використовуватись в якості антигенів (імуногенів) з метою продукування специфічних до них ть антитіл. Ці антитіла також можуть використовуватись з метою очистки даного білка 51 (наприклад, власне 1 с або будь-якої з його ізоформ) як з клітинних екстрактів, так і з ліній трансформованих клітин, що продукують білок 51 або його аналоги чи фрагменти. Крім того, ці антитіла можуть використовуватись для діагностичних де цілей для ідентифікації розладів, пов'язаних з аномальним функціонуванням систем ліганду ЕАБ-К або ТМЕ,

Ге) наприклад, надлишкового або недостатнього клітинного впливу, що індукується лігандом РГА5Б-К або ТМЕ. Таким чином, при тому, що такі захворювання пов'язані з порушенням функціонування системи внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, яка залучає білок МОКТ-1 або будь-які інші, наприклад, названі вище МОКТ1-зв'язні білки або власне білок С1, то такі антитіла будуть служити важливим діагностичним засобом.

Також необхідно відзначити, що виділення, ідентифікація і охарактеризування білка 1 відповідно до цього іФ) винаходу може здійснюватись з використанням будь-якої з відомих стандартних процедур скринінгу. Наприклад, ко в якості однієї з таких процедур скринінгу дигібридний дріжджовий тест, описаний в даному тексті, використовувався для ідентифікації білела МОКТ-1 і в подальшому різних МОКТ1-зв'язних білків і білка 1 бо Відповідно до цього винаходу. Також, як описано вище і буде описано далі, можуть застосовуватись і інші підходи, такі як афінна хроматографія, методики гібридизації ДНК тощо, які добре відомі у цій галузі техніки в зв'язку з виділенням, ідентифікацією і охарактеризуванням білка 51 відповідно до цього винаходу або з виділенням, ідентифікацією і охарактеризуванням інших білків, факторів, рецепторів і подібного, що здатні зв'язуватися з білком 1 відповідно до цього винаходу. 65 Як вже вказувалося вище, білок 51 може використовуватись для продукування антитіл, специфічних відносно до білків 51, наприклад, відносно до (31 та його ізоформ. Ці антитіла або їх фрагменти можуть використовуватись так, як це докладніше буде описане нижче, і повинно бути зрозуміло, що в таких випадках ці антитіла або їх фрагменти - ті, які є специфічними відносно до білків 1.

Грунтуючись на даних цього винаходу про те, що принаймні деякі з білків 51 або їх можливі ізоформи є протеазами, подібними до протеаз сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ, для цих білків 1 і їх ізоформ подається таке спеціальне медичне застосування: було виявлено, що вже існують специфічні інгібітори інших протеаз СЕЮОЗ/СЕ, які здатні проникати в клітину і можуть ефективно блокувати запрограмовану загибель клітин. Отже, згідно з цим винаходом можна сформувати такі інгібітори, що зможуть запобігати загибелі клітин, що індукується лігандом

ЕАБ-К або ТМЕ - тобто той механізм, в якому бере участь протеаза С1. Далі, з точки зору унікальних параметрів 70 послідовностей цих нових протеаз 251, представляється можливим конструювати такі інгібітори, які були б високоспецифічними щодо впливу ТМЕ і ліганду ГАБ-К на клітини. Дані цього винаходу також подають шлях вивчення механізму, в якому "протеаза, що знищує клітини" активується у відповідь на ліганд ЕАБ-К і ТМЕ: відповідно, це дозволяє розробляти лікарські препарати, які змогли б контролювати міру такої активації. Існує досить багато захворювань, при лікуванні яких такі ліки могли б надати значну допомогу. Серед таких /5 захворювань - гострий гепатит, при якому гострі ураження тканини печінки, по-видимому, відбивають загибель печінкових клітин, опосередковану лігандом рецептора БАЗБ-К; індукована автоїмунною відповіддю загибель клітин, така як загибель р-клітин островків Лангерганса підшлункової залози, що веде до діабету; загибель клітин в ході відторгнення пересадженої тканини (наприклад, нирок, серця і печінки); загибель олігодендроцитів головного мозку при розсіяному склерозі; і пригнічувана при СНІДІі самозагибель Т-лімфоцитів, внаслідок чого забезпечується розмноження вірусу СНІДУ і, отже, розвиток власне СНІДУ.

Як зазначалось вище, цілюом можливо, що 1 або одна чи більше число його можливих ізоформ (наприклад, ізоформа С1р) може служити в якості "природного" інгібітору протеази С1 або ізоформ протеази С1, і це також можна використати так, як вище зазначалось для специфічних інгібіторів таких протеаз 1. Також інші сполуки, такі як пептиди, органічні сполуки, антитіла тощо, можуть бути піддаватись скринінгу з метою одержання Га специфічних лікарських засобів, здатних інгібувати протеази 1.

Не обмежуючий такого застосування приклад того, як пептидні інгібітори протеаз 51 могли б бути одержані і і) скриновані, грунтується на раніше проведених дослідженнях пептидних інгібіторів протеази ІСЕ або ІСЕ-подібних протеаз, субстратної специфічності ІСЕ і стратегій аналізу епітопів з використанням синтезу пептидів.

Мінімальною умовою для ефективного розщеплення пептиду протеазою ІСЕ, як було встановлено, є наявність Ге»)

Чотирьох амінокислот ліворуч від сайта розщеплення при жорсткій більшій прийнятності наявності залишку аспарагінової кислоти в положенні Ру і достатності наявності метиламіну праворуч від залишку Р |Зіеай еї с аі,, 1990; Номагйа еї аїЇ.,, 1991; Трогпреггу еї аїЇ., 1992). Більш того, було встановлено, що флуорогенний юю пептидний субстрат (що є тетрапептидом) - ацетил-Азр-сСІШ-МаІ-Азр-а-(4-метилкумарил-7-амід) - скорочено

Ас-ОЕМО-АМС, який відповідає послідовності АДФ-рибозополімерази (РАКР), розщепляється в клітинах через З

Короткий час після стимуляції рецептора ГАЗБ-К, так само як і інших апоптотичних процесів (Каштапп, 1989; ч-

Каштапп еї аї., 1993; І агерпік еї аІ., 1994), і ефективно розщепляється протеазою СРРЗ2 (яка є членом сімейства протеаз СЕЮОЗ/СЕ) і протеазами МАСН (а також, ймовірно, протеазами с1).

З урахуванням важливості наявності залишку Азр в положенні Р - в складі субстрату, тетрапептиди, що « мають аспарагінову кислоту в четвертому положенні та різне поєднання амінокислот в перших трьох положеннях, можуть бути швидко скриновані за зв'язуванням з активним сайтом протеаз 01 з використанням, - с наприклад, методу, розробленого Гейзеном |Сеузеп, 1985; Сеузеп еї аї., 1987), в якому велике число пептидів, ц прикріплених на твердому носії, скринують на специфічну взаємодію з антитілами. Зв'язування протеаз МАСН з "» специфічними пептидами може бути виявлене за допомогою різних добре відомих фахівцям у цій галузі техніки методів, таких як ізотопне мічення протеаз 31 тощо. Було показано, що з застосуванням цього методу за

Гейзеном можна протестувати принаймні 4000 пептидів за один робочий день. -І Оскільки певні переваги може мати конструювання пепти-дних інгібіторів, які вибірково пригнічують протеази 1 без будь-яких завад фізіологічним процесам, пов'язаним з загибеллю клітин, в яких беруть участь е інші члени сімейства протеаз СЕЮОЗ/ЛСЕ, пул пептидів, що зв'язуються з протеазами С1, для аналізу в такому 1 тесті, що був описаний вище, може бути синтезовано далі у вигляді флуорогенного пептидного субстрату, призначеного для тестування вибіркового розщеплення протеазами 1 за відсутності розщеплення іншими о протеазами сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ. Пептиди, для яких визначене вибіркове розщеплення протеазами С1, можуть (Че) потім бути модифіковані з метою підсилення внутрішньоклітинної проникності і інгібувальної активності відносно до (з1-опосередковуваної загибелі клітин, як в оборотному, так і в необоротному режимі дії. Торнбері з співавт. ПППогпбеїту ег аї., 1994) повідомили, що тетрапептид-(ацилокси)-метилкетон

Ас-Туг-МаІ-АІа-Азр-СНЬОС(О)-(2,6-(СЕ3)2)| РА є сильним інактиватором протеази ІСЕ. У подібний спосіб Міліген з співавт. (Мійїдап еї аї., 1995) повідомили, що тетрапептидні інгібітори, які включають хлорметилкетонову о або альдегідну групи, відповідно, необоротно і оборотно інгібують протеазу ІСЕ. Крім того, було показано ко інгібування ІСЕ бензилоксикарбоксил-Азр-СН 50С(0)-2,6-дихлорбензолом (0ОСВ) |Мазпіта еї аї., 1995).

Відповідно, тетрапептиди, які селективно зв'язуються з протеазами (31, можуть бути модифіковані з бо використанням, наприклад, альдегідної групи, хлорметилкетонової, (ацилокси)-метилкетонової або сСнНЬОС(О)-ОСВ-груп при вирішенні задачі створення пептидного інгібітору активності протеази 1.

Оскільки деякі специфічні інгібітори інших протеаз сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ характеризуються внутрішньоклітинною проникністю, то внутрішньоклітинна проникність пептидних інгібіторів потребує підсилення.

Наприклад, пептиди можуть бути модифіковані або перетворені на свої похідні хімічним шляхом з метою 65 Підсилення їх проникності через клітинну мембрану і полегшення транспортування таких пептидів через мембрану в цитоплазму. Мураніші з співавт. (Мигапізпі еї аї., 1991| повідомили про одержання похідного тиротропінового рилізинг-гормону з використанням лауринової кислоти з утворенням ліпофільного лауроїльного похідного, що має гарні характеристики проходження через клітинні мембрани. Закарія з співавт. І(/аснагіа еї аІ., 1991) також повідомили, що окислення метіоніну в сульфоксид і заміщення пептидного зв'язку його Кетометиленовим ізоефіром (СОСН») веде до полегшення транспорту пептиду через клітинну мембрану. Є ряд модифікацій похідних, які добре відомі фахівцям у цій галузі техніки.

Крім того, ліки або пептидні інгібітори, що здатні пригнічувати активність 01 відносно до загибелі клітин, або їх можливі ізоформи можуть бути з'єднані або включені в комплекси разом з молекулами, які забезпечать більш легке проникнення всередину клітини. 70 (Патент США 5149782) представляє з'єднання молекули, призначеної для транспортування через клітинну мембрану, з мембрано-сполучним агентом, таким як слітогенні поліпептиди, поліпептиди, які утворюють іонні канали, інші мембранні поліпептиди і жирні кислоти з довгим ланцюгом, наприклад, міристинова кислота і пальмітинова кислота. Ці агенти, які сполучаються з мембраною, вбудовують молекулярний кон'югат всередину ліпідного бішару плазмалеми і полегшують його проникнення в цитоплазму.

Лоу з співавт. (ом ей аі-) в патенті США 5108921) розглядають прийнятні способи трансмембранної доставки молекул, таких як (не обмежуючись цим) білки і нуклеїнові кислоти, основані на механізмі опосередкованої рецепторами ендоцитозної активності. Ці рецепторні системи є системами, що розпізнають галактозу, манозу, манозо-б6-фосфат, трансферин, асіалог-лікопротеїн, транскобаламін (вітамін В»),

А-2-макроглобуліни, інсулін та інші пептидні фактори росту, такі як епідермальний фактор росту (ЕСЕ). Лоу з 2о співавт. вказує, що харчові рецептори, такі як рецептори біотину і фолатів, можуть здебільшого використовуватися для інтенсифікації транспорту через клітинну мембрану, завдяки особливостям локалізації і численності біотинових і фолатних рецепторів на поверхні більшості клітин і пов'язаних з цими рецепторами процесами трансмембранного транспорту. Таким чином, комплекс, утворений сполукою, призначеною для транспортування в цитоплазму, і лігандом, таким як біотин чи фолат, контактують з клітинною мембраною, що с ов Несе біотинові або фолатні рецептори з метою ініціації механізму трансмембранного транспорту, опосередкованого цими рецепторами, завдяки цьому, забезпечуючи входження бажаної сполуки в клітину. і)

Для протеази ІСЕ відома здатність до толерантності відносно до вільного заміщення по положенню Р »5», і така толерантність до вільних заміщень використовувалась при розробці ефективної, високовибірної афінної мітки, що містить біотин |Ппогпреггу еї аї., 1994). Відповідно, положення Р 5, так само як і, по-видимому, Ге!

М-кінець тетрапептидного інгібітору можуть бути модифіковані або використані для одержання похідних сполук, наприклад, шляхом приєднання молекули біотину, з метою підсилення проникності цих пептидних інгібіторів с через клітинну мембрану. ю

Крім того, у цій галузі техніки відомо, що злиття бажаної пептидної послідовності з сигнальною (лідерною) пептидною послідовністю з одержанням "химерного поліпептиду" може використовуватись для транспортування -

Зв Такого "химерного поліпептиду" через клітинну мембрану в цитоплазму цієї клітини. ї-

Як повинно бути добре зрозуміло фахівцям, що вивчають пептиди, вважається, що пептидні інгібітори протеолітичної активності згідно з цим винаходом повинні включати пептидоміметичні лікарські засоби або інгібітори, які можуть піддаватись швидкому скринінгу по зв'язуванню з протеазою (31 з метою одержання по можливості найбільш стабільних інгібіторів. «

Також повинно бути зрозуміло, що такі ж способи полегшення або підсилення транспорту пептидних в с інгібіторів через клітинні мембрани, що обговорювалися вище, також є застосовними відносно до самого білка

О1 або самих його ізоформ, так само як і інших білків та пептидів, що справляють свій вплив всередині клітин. ;» Що стосується антитіл, про які говориться у цьому тексті, термін "антитіло" включає в себе поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (тАбрз), химерні антитіла, антиідіопатичні (анти-Іа4) антитіла до антитіл, що

Можуть бути помічені в розчинній або зв'язаній формі, так само як і їх фрагменти, одержані у будь-який з -І відомих способів, таких як (не обмежуючись цим) ферментне розщеплення, пептид-ний синтез або рекомбінантні технології. ве Поліклональні антитіла - це гетерогенні популяції молекул антитіл, виділених з сироватки тварин, с імунізованих якимось антигеном. Моноклональне антитіло включає по суті гомогенну популяцію антитіл, 5о специфічних відносно до антигенів, при тому, що ці популяції включають по суті схожі епітопи сайтів ю зв'язування. Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням методів, відомих фахівцям у цій

Ге) галузі техніки: |див., наприклад, Копіег 5 Міївівіїп, 1975, Маїшге, 256, 495-497; патент США 4376110; А!йзивеї еї аіІ., едв. Нагом/ 5 Іапе 1988, Апііродіез: А І арогаїгу Мапиаї, Со Зргіпд Нагрог ар. та Соїйдап еї аї.,

Ситепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду, едв. Стгеепе Рирі. Аввос. 5 УМПеу Іпіегесіепсе, МУ (1992-96)), повний зміст ов яких подано в даному тексті у вигляді посилань. Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів - Ід, ДМ, І9ЗЕ, ІЗА, СІ - і будь-якого їх підкласу. Гібридоми, що продукують моноклональні (Ф) антитіла відповідно до цього винаходу, можуть культивуватись іп міїго, іп зйи або іп мімо. Одержання високих ка титрів моноклональних антитіл іп міго або іп зйи робить такий підхід ще більш прийнятним для їх одержання.

Химерні антитіла є молекулами, в складі яких різні частини походять від різних видів тварин, наприклад, во такі як антитіла, що включають варіабельні домени, виділені з моноклональних антитіл миші, і константні домени імуноглобулінів людини. Химерні антитіла в першу чергу використовуються для зниження імуногенності при їх застосуванні і для збільшення виходу продукту, наприклад, коли мишачі моноклональні антитіла характеризуються більш високим виходом з гібридом, але більш високою імуногенністю в клітинах людини, тому химерні "людсько-мишачі" моноклональні антитіла і можуть використовуватись. Химерні антитіла і способи їх 65 одержання добре відомі в науці: І(Сабійу еї аіІ., 1984, Ргос. Май. Асад. Зеї. ОБА, 81, 3273-3277; Моггтізоп еї аі., 1984, Ргос. Май. Асай. Зеї. ОБА, 81, 6851-6855; Вошіаппе еї аїЇ., 1984, Майшге, 312, 643-646; Сабрійу еї аі.,, заявка на європейський патент Мо125023 (опублікована 14 листопада 1984р.); Мецбрегдег еї аї., 1985,

Маїйге, 314, 268-270; Тапідиспі еї аІ. заявка на європейський патент Мо171496 (опублікована 19 лютого 1985р.); Могтізоп еї аІ., заявка на європейський патент Мо173494 (опублікована 5 березня 1986бр.); Меибрегдег еї аі.,, заявка РСТ УУО 8601533 (опублікована 13 березня 1986р.); Кидо еї аІЇ., заявка на європейський патент

Мо184187 (опублікована 11 червня 1986р.); Западап еї аї., 1986, 9. Іттипої, 137, 1066-1074; Кобіпзоп еї аї., заявка на міжнародний патент МО 8702671 (опублікована 7 травня 1987р.); Пи еї аІ., 1987, Ргос. Май). Асавд.

Зеім. ОБА, 84, 3439-3443; Зиуп еї аіЇ.,, 1987. Ргос. Май. Асай. беї. ОБА, 84, 214-218; ВеЦег еї аї., 1988,

Зсіепсе, 240: 1041-1043; і Напому/ 8. І апе, Апіїбодіез: А І арогаїогу Мапиаї|, цитовано вище. Ці роботи повністю 7/0 Включені до даного тексту у вигляді посилань.

Антиідіотипове (анти-І4) антитіло - це антитіло, що розпізнає унікальні детермінанти, в принципі зв'язані з антиген-зв'язним сайтом антитіла. Антиідіотипове антитіло може бути приготоване шляхом імунізації тварини того же виду й генетичного типу (наприклад, інбредної лінії мишей) в якості джерела моноклонального антитіла, по відношенню до якого одержують антиідіотипове антитіло. Імунізована тварина має розпізнавати та реагувати /5 на ідіотипові детермінанти імунізуючого антитіла шляхом продукування антитіла відносно до цих ідіотипових детермінантів (анти-Іа антитіло). |(Див., наприклад, патент США 4699880), що включений у вигляді посилання.

Антиідіотипове антитіло також може бути одержане у вигляді "імуногену" з метою індукції імунної відповіді ще в одній тварині, що продукує т. зв. анти-антиідіотипове антитіло. Анти-антиідіотипове антитіло може бути за параметрами епітопу ідентичним до вихідного моноклонального антитіла, яке індукувало анти-ід. Таким го чином, за допомогою використання антитіл до ідіотипових детермінантів моноклонального антитіла можна ідентифікувати інші клони, що екс-пресують антитіла, які мають ідентичну специфічність.

Відповідно, моноклональні антитіла, які було сформовано до білків 1, їх аналогів, фрагментів або похідних відповідно до цього винаходу, можуть використовуватись для індукції антиідіотипових антитіл в підхожих тваринах, таких як миші лінії ВА! В/с. Клітини селезінки таких імунізованих мишей використовують для сч об одержання анти-І4 гібридом, які секретують антиідіотипові моноклональні антитіла. Далі, антиідіотипові моноклональні антитіла можуть бути з'єднані з носієм, таким як гемоціанін слизовика (КІ Н), і використані для і) імунізації нових мишей лінії ВАЇІ В/с. Сироватка цих мишей міститиме анти-антиідіотпичні антитіла, що мають властивості зв'язуватися з вихідним моноклональним антитілом, специфічним відносно до епітопу описаного вище білка 31 або його аналогів, фрагментів чи похідних. б зо Антиідіотипові моноклональні антитіла, таким чином, мають свої власні ідіотипові епітопи, тобто "Ідіотопи", подібні за структурою до епітопу, що його оцінювали, такого як КВ білка-а. с

Термін "антитіло" також означає як інтактні молекули, так і їх фрагменти, такі як, наприклад, Раб і ю

К(іав)2, які здатні зв'язуватися з антигеном. Фрагменти Рар і Е(абБ)2 позбавлені Ес-домену інтактного антитіла, легше вивільнюються з циркуляції і можуть мати менший рівень неспецифічного тканинного « зв'язування порівняно з інтактним антитілом (Умані еї аї., 1983, 9. Мисі. Меад., 24, 316-325). ї-

Повинно бути зрозуміло, що Раб і Е(ар)2 та інші фрагменти антитіл, які є застосовними відповідно до цього винаходу, можуть використовуватись для виявлення і кількісного аналізу білка 1 згідно з способами, описаними тут для інтактних молекул антитіл. Такі фрагменти зазвичай одержують шляхом протеолітичного розщеплення, використовуючи такі ферменти, як папаїн (при одержанні фрагментів Бар) або пепсин (при « одержанні фрагментів Р(аб)2). з с Якщо говориться, що антитіло є "здатним до зв'язування", це означає здатність специфічно реагувати з молекулою таким чином, що відбувається зв'язування цієї молекули з антитілом. Термін "епітоп" означає ту ;» частину будь-якої молекули, що може бути зв'язана антитілом і яка також може розпізнаватись цим антитілом.

Епітопи або "антигенні детермінанти" як правило складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як бокові ланцюги амінокислот чи цукрів, і мають специфічні тривимірні структурні -І характеристики, так само як і специфічні параметри заряду. "Антиген"' - це молекула або частина молекули, здатна бути зв'язаною з антитілом і до того ж здатна о індукувати у тварини продукування антитіла, здатного зв'язуватися з епітопом цього антигену. Антиген може с мати або один, або більше число епітопів. Специфічна реакція, названа вище, означає, що антиген буде 5р реагувати при додержанні високого рівня розпізнавання з відповідним йому антитілом і з одним з множини інших о антитіл, які можуть зв'язуватися іншими антигенами.

Ге) Антитіла, включаючи фрагменти антитіл, що є застосовними відповідно до цього винаходу, можуть використовуватись для якісного і кількісного іншого виявлення білка 1 в пробі або для виявлення присутності клітин, що експресують білок (31 відповідно до цього винаходу. Це може супроводжуватися дв імунофлуоресцентними методиками, які використовують помічене у флуоресцентний спосіб антитіло (див. нижче), сполучене з застосуванням світлової мікроскопії, протокової цитометрії або флуорометрії для такого (Ф, виявлення. ка Антитіла (або їх фрагменти), застосовні відповідно до цього винаходу, можуть використовуватись на гістологічному рівні з застосуванням імунофлуоресцентного або імуно-електронного мікроскопів для виявлення во іп зйи білка (31 відповідно до цього винаходу. Виявлення іп зи може супроводжуватися виділенням гістологічного зразка у пацієнта і переносу поміченого у флуоресцентний спосіб антитіла на такий зразок.

Більш прийнятним є перенос антитіла (або фрагменту) шляхом внесення поміченого антитіла (або фрагменту) в біологічний зразок. З використанням такої процедури стає можливим визначити не лише присутність білка 1, але й оцінити його розподіл в досліджуваній тканині. З використанням цього винаходу фахівці у цій галузі 65 техніки можуть легко зрозуміти, що будь-який з великої групи гістологічних методів (таких як методики забарвлення тканин) можуть бути модифіковані з метою проведення подібного виявлення іп ві.

Такі тести на виявлення білка С1 відповідно до цього винаходу зазвичай включають інкубацію біологічного зразка, такого як біологічна рідина, тканинний екстракт, свіжоодержані клітини, такі як лімфоцити чи лейкоцити, або клітини, які інкубувались в тканинній культурі, в присутності поміченого антитіла, що маркується, здатного ідентифікувати білок (31 і виявлення антитіла будь-яким з ряду методів, добре відомих у цій галузі техніки.

Біологічний зразок може оброблятись за допомогою твердої підкладки або носієм, таким як нітроцелюлоза, або іншою твердою підкладкою чи носієм, що здатні імобілізовувати клітини, клітинні частинки або розчинні білки. Підкладка або носій можуть потім промиватись підхожими буферами з подальшою обробкою поміченим /о антитілом, що виявляється, згідно з цим винаходом, так, як це було описано вище. Твердофазна підкладка або носій можуть потім бути промиті буфером в другий раз з метою вилучення антитіла, яке не зв'язалось. Кількість зв'язаної мітки на зазначених твердій підкладці або носії може потім визначатись за допомогою стандартних методик. "Твердофазною підкладкою", "твердофазним носієм", "твердою підкладкою", "твердим носієм", "підкладкою" або "носієм" називаються будь-які підкладки чи носії, здатні зв'язувати антиген або антитіла. Добре відомі підкладки або носії включають скло, полістирен, поліпропілен, поліетилен, декстран, нейлон-амілази, природні й синтетичні целюлози, поліакриламіди, габро та магнетит. Природа носія може бути або частково розчинною, або він може бути нерозчинним, виходячи з цілей даного винаходу. Матеріал підкладки візуально може мати будь-яку можливу структурну конфігурацію, доки приєднана молекула здатна зв'язувати антиген або антитіло.

Таким чином, конфігурація підкладки або носія може бути сферичною, кулеподібною, циліндричною, як внутрішня поверхня тест-пробірки, або зовнішня поверхня палички. З іншого боку, поверхня може бути плоскою, такою як у пластинки, тест-стрічки тощо. Більш прийнятними підкладками або носіями є полістиренові гранули (кульки). Фахівці у цій галузі техніки можуть підібрати інші підхожі носії для зв'язування антигену або антитіла, або ж можуть це встановити за допомогою рутинних експериментів. с

Активність щодо зв'язування даного набору антитіл, згідно з викладеним вище у цьому винаході, може бути визначена з використанням добре відомих методів. Фахівці у цій галузі техніки можуть визначити умови і) проведення швидких і оптимальних тестів для кожного з визначень виходячи з проведення рутинних експериментів.

Інші етапи, такі як промивання, перемішування, струшування, фільтрування і подібне можуть додаватись в Ге! зо тести так, як рекомендується виробниками або вимагається конкретною ситуацією.

Одним з способів, у який антитіла згідно з цим винаходом можуть бути помічені, є з'єднання антитіла з с ферментом з використанням в ферментативному імуноте-стуванні (ЕХ). Цей фермент, в свою чергу, коли ю згодом піддається впливу відповідного субстрату, буде реагувати з цим субстратом таким чином, щоб утворювати хімічний компонент, який може бути виявлений, наприклад, спектрофотометрично, флуорометрично - або візуально. Ферменти, які можуть використовуватись для виявлення помічених антитіл, включають, не ча обмежуючись цим, малатдегідрогеназу, нуклеазу стафілококу, ізомеразу д5-стероїдів, алкогольдегідрогеназу дріжджів, А-гліцерофосфатдегідрогеназу, триозофосфатізомеразу, пероксидазу редьки, лужну фосфатазу, аспарагіназу, глюкозооксидазу, р-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, « глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу, глюкоамілазу та ацетилхолінестеразу. Виявлення може супроводжуватися Колориметричним методом, що грунтується на використанні субстрату, хромогенного для даного ферменту. - с Виявлення також може супроводжуватися візуальним порівнянням міри ферментної реакції субстрату порівняно ц з стандартами, приготованими в аналогічний спосіб. "» Виявлення може супроводжуватися використанням будь-якого з ряду інших імунотестів. Наприклад, шляхом застосування ізотопного мічення антитіл або фрагментів антитіл стає можливим виявляти К-РТРазу з застосуванням КІіІА |(радіоїмуноаналізу). Якісний опис методу КІА можна знайти в посібнику "І арогагу -І Тесппідцез 5 Віоспептівігу іп Моіесціаг Віоіоду" (МуУогк, Т. 5. еї аїЇ.,, 1978, Мопй НоМйапа Рибрі. Со., ММ) з конкретною увагою до розділу, що має заголовок "Введення в радіоіїмунний аналіз і схожі методики", написаному е Т. Чардом (Т. Сага), який включено сюди у вигляді посилання. Радіоактивні ізотопи можуть бути виявлені у 1 такі способи, як використання лічильника Гейгера або сцинтиляційного лічильника, або за допомогою авторадіографічного аналізу. о Також можливим є помітити антитіло згідно з цим винаходом за допомогою флуоресцентної сполуки. Коли (Че) помічене у флуоресцентний спосіб антитіло піддають впливу світла з підхожою довжиною хвилі, його присутність може бути виявлена за флуоресценцією. Серед найбільш часто застосовуваних для мічення флуоресцентних сполук - флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, фікоеритрин, пікоціанін, алоцикоціанін, о-фтальдегід і флуорескамін.

Антитіло також може бути виявлене шляхом мічення з використанням флуоресціюючих металів-емітентів, о таких як 122Е або інших з групи лантаноїдів. Ці метали можуть приєднуватись до антитіла з використанням таких груп, що хелатують метали, як діетилентриамінпентаоцтова кислота (ЕТРА). іме) Антитіло також може бути одержане шляхом його з'єднання з хемолюмінісцентною речовиною. Потім присутність поміченого за хемолюмінісцентним типом антитіла визначають шляхом виявлення наявності 60 люмінісценції, що виникає в процесі проходження хімічної реакції. Прикладами конкретно застосовуваних для мічення хемолюмінісціюючих сполук є, люмінол, ізолюмінол, тероматичний акридиновий ефір, імідазол, акридинова сіль і щавлевий ефір.

Також для мічення антитіла відповідно до цього винаходу можуть використовуватись біолюмінісцентні сполуки. Біолюмінісценція є варіантом хемолюмінісценції, що виявляється в біологічних системах, в яких білок, 65 що має каталітичну активність, підвищує ефективність хемолюмінісцентної реакції. Присутність біолюмінісцентного білка визначають виявленням наявності люмінісценції. Важливими біолюмінісцентними сполуками для цілей мічення є люоциферин, люцифераза та екворин.

Молекула антитіла відповідно до цього винаходу може бути адаптована для використання в імунометричному тестуванні, також відомому як "двосайтове" або "сендвіч"--естування. В типовому імунометричному тесті деяку кількість непоміченого антитіла (або фрагменту антитіла) зв'язують з твердою підкладкою чи носієм і деяку кількість поміченого розчинного антитіла додають таким чином, щоб було можливо виявляти і (або) кількісно оцінювати потрійний комплекс між антитілом на твердій фазі, антигеном та поміченим антитілом.

Звичайно і більш прийнятно імунометричні тести включають "форвард"-тести, в яких антитіло, зв'язане з /о твердою фазою, в першу чергу контактує з тестованим зразком з метою виділення антигену з зразка і утворення бінарного комплексу "антиген-антитіло" в твердій фазі. Після підхожого періоду інкубації тверду підкладку або носій промивають з метою вилучення залишку рідкої проби, включаючи антиген, який не прореагував, якщо він залишився, і потім контактують з розчином, що містить невідому кількість поміченого антитіла (яке функціонує в якості "репортерної молекули"). Після періоду другої інкубації, необхідної для формування комплексу поміченого антитіла і антигену, зв'язаного з твердою підкладкою чи носієм через непомічене антитіло, потім тверду підкладку або носій промивають в другий раз з метою вилучення поміченого антитіла, яке не прореагувало.

Інший тип "сендвіч"-методу, що також може використовуватись з антигенами відповідно до цього винаходу, - це застосування так званих "одночасних" і "зворотних" тестів. "Одночасний" тест включає однократний етап інкубації, в якому і антитіло, зв'язане з твердою підкладкою або носієм, і помічене антитіло додають до тестованого зразка в один і той самий час. По закінченні інкубації тверду підкладку або носій промивають з метою вилучення залишку рідкого зразка і поміченого антитіла, що не увійшло до складу комплексу. Присутність поміченого антитіла, зв'язаного з твердою підкладкою або носієм, потім визначають так, як це здійснюється в стандартному "форвард-сендвіч"-тесті. сч

В "зворотному" тесті використовується поступове додання спочатку розчину поміченого антитіла до рідкого зразка з подальшим доданням непоміченого антитіла, зв'язаного з твердою підкладкою або носієм після і) підхожого періоду інкубації. Після другої інкубації тверду підкладку промивають у стандартний спосіб до звільнення її від залишків тестованого зразка і розчину поміченого антитіла, що не прореагувало. Визначення поміченого антитіла, зв'язаного з твердою підкладкою або носієм, потім здійснюють так само, як і в Ге! зо "одночасному" і "форвард"-тестах.

Білки 51 відповідно до цього винаходу можуть бути одержані з застосуванням будь-якої з існуючих с стандартних процедур рекомбінантної ДНК |див., наприклад, ЗатбгоокК еї аї!., 1989 і А!йзибеї еї аї., 1987-95, ю цитовано вище), в яких підхожі еукаріотичні і прокаріотичні клітини-хазяї, добре відомі у цій галузі техніки, трансформують з використанням підхожих еукаріотичних і прокаріотичних векторів, які включають послідовності, « зв що кодують дані білки. Відповідно, цей винахід також стосується таких експресувальних векторів і ї- трансформованих організмів-хазяїв, призначених для продукування цих білків відповідно до цього винаходу. Як зазначалося вище, ці білки також включають їх активні аналоги, фрагменти та похідні, і, таким чином, вектори, що їх кодують, також включають вектори, які кожують аналоги і фрагменти цих білків, а трансформовані організми-хазяї включають такі, що продукують ці аналоги і фрагменти. Похідні цих білків, що продукуються « такими трансформованими організмами-хазяїнами, є похідними, одержаними шляхом стандартної модифікації з с цих білків або їх аналогів чи фрагментів.

Цей винахід також стосується фармацевтичних композицій, що включають рекомбінантні вектори на основі ;» вірусів тварин, які кодують білки С1, так, що такий вектор також кодує поверхневий вірусний антиген, здатний зв'язуватися на специфічній клітині-мішені (наприклад, на пухлинних клітинах) з поверхневими білками з метою бпрямування внесення послідовностей білків 51 всередину клітин. Додатково фармацевтичні композиції -І відповідно до цього винаходу включають в якості активного компонента (а) олігонуклеоти-дну послідовність, що кодує антисмислову послідовність відносно до послідовності, що кодує білок 1, або (Б) ліки, що блокують ве протеолітичну активність білка 1 чи його ізоформ. с Фармацевтичні композиції згідно з цим винаходом включає кількість активного компонента, достатню для 5р досягнення поставленої перед ним мети. Додатково фармацевтичні композиції можуть включати підхожі, ю фармацевтично прийнятні носії, що включають наповнювачі і підхожі компоненти, які полегшують процесинг

Ге) активних компонентів в складі препаратів, що можуть використовуватись у фармацевтичні способи і які можуть стабілізувати такі препарати, призначені для введення пацієнтам, що їх потребують, згідно з добре відомими фахівцям у цій галузі техніки прийомами.

Білок 1 і його ізоформи або ізотипи, як припускається, повинні експресуватися в різних тканинах на чітко неоднаковому рівні і, по-видимому, при різних параметрах ізотипів аналогічно експресії білюа МАСН і його

Ф) різних ізотипів, як це описано в зазначених вище спільних, перебуваючих на стадії розгляду заявках. Ці ка відмінності можуть, по-видимому, зумовлювати тканиноспецифічні параметри відповіді на ліганд РАБ/АРО1 та

ТМЕ. Як і у випадку з іншими гомологами СЕЮОЗЛСЕ |М/апо еї аї., 1994; АІпетгі еї а!., 1995), заявники раніше бо вже показали (згідно з згаданими вище патентними заявками), що у ізоформ МАСН, які включають неповні сегменти гомології з СЕОЗ/ЛСЕ (наприклад, МАСНАЗ), виявляється ефект інгібування активності молекул МАСНА і МАСНАЗ, які одночасно експресуються; для них теж було встановлено блокування індукції загибелі за участю

ЕАБ/АРОЇ і р55-К. Експресія таких інгібіторних ізоформ в клітинах може визначати механізм клітинного самозахисту від цитотоксичності, опосередковуваної РГАБ/АРО1 і ТМЕ. Аналогічний інгібувальний ефект також 65 припускається принаймні у однієї з ізоформ білка С1. Високий рівень гетерогенності ізоформ МАСН і також передбачувана аналогічна гетерогенність ізоформ С1, яка за рівнем істотно переважає гетерогенність ізоформ будь-яких інших протеаз сімейства СЕОЗ/СЕ, повинні дозволяти здійснення тонкої настройки функцій активних ізоформ МАСН, а, по аналогії, також і у активних ізоформ С1, згідно з цим винаходом.

Також можливим є те, що деякі з ймовірних ізоформ С1 виявляють інші функції. Наприклад, раніше виявлена заявниками, (що зазначалося вище) здатність МАСН р1 зв'язуватися і з МОКТ-1, і МАСНА! підтверджує, що ця ізоформа може дійсно посилювати активність каталітично активних ізоформ. Середня цитотоксичність, що спостерігається в культурах ліній 293-ЕВМА і МСЕ7, трансфікованих цією ізоформою, і більш істотний цитотоксичний ефект, що виявляється в клітинах Не! а, мабуть відбиває активацію молекул МАСНА, що ендогенно експресуються, із зв'язування з трансфікованими молекулами МАСН р1, Можливо, деякі з ізоформ 70 МАСН також можуть діяти як "депо-сайти" для молекул, що беруть участь в інших, не пов'язаних з цитотоксичністю, проявах рецепторів ЕАБ/АРОТ1 і ТМЕ. Отже, в аналогічний спосіб білок-С1 і (або) його ізоформи також можуть мати таку ж посилювальну активність або служити в якості "депо-сайтів" для інших таких молекул.

Завдяки унікальній здатності рецепторів РГАБ/АРОЇ і ТМЕ зумовлювати загибель клітин, так само як і здатності рецепторів ТМЕ опосередковувати інші типи активності, пов'язані з пошкодженнями тканин, порушення 75 функцій цих рецепторів можуть бути негативними для організму. Проте, і для надлишкової, і для недостатньої функцій цих рецепторів було продемонстровано участь в патогенезі деяких захворювань |Магззаїйї, 1992;

Мадайа 8: (Сзоївівіїп, 1995). Ідентифікація молекул, що беруть участь в сигнальній функції рецепторів і відкриття шляхів модуляції активності таких молекул можуть привести до нових лікувальних підходів. З точки зору передбачуваної ключової ролі білка 51 в токсичності, опосередковуваній РАБ/АРОЇ і ТМЕ, здається 2о важливим створювати лікарські засоби, які б блокували можливу протеолітичну функцію білка 51, що раніше було вже зроблене для інших білків з складу сімейства СЕОЗЛСЕ |Ппогпрегту еї а!., 1994; МійПег еї аї., 1995;

Мазпіта еї аї., 1995; Мійдап еї аїЇ.,, 1995; ЄЕпагі еї аїЇ.,, 1995; 105 еї аї., 1995). Унікальні параметри послідовності гомолога СЕОЗ/ЛСЕ, по-видимому, присутнього в молекулах 01, можуть дати змогу приготувати лікарські засоби, які у специфічний спосіб подавляли б їх активність. Такі ліки можуть забезпечувати захист Га

Від надлишкової, пов'язаної з імунітетом цитотоксичності за участю 1 без будь-яких завад фізіологічним процесам клітинної загибелі, в яких беруть участь інші протеази сімейства СЕОЗЛСЕ. і)

Інші аспекти цього винаходу будуть видні з наведених нижче прикладів.

Тепер винахід буде більш докладно описувати наведені далі приклади, що не є його обмеженням, і супутні ним креслення. Ге»!

Також треба зазначити, що такі процедури: (І) дигібридний скринінг і дигібридний тест на експресію р-галактозидази; с (і) індукована експресія, метаболічне мічення та імунопреципітація білків; юю (ії) зв'язування іп міго; (ім) оцінка цитотоксичності; і З (М) Нозерн-блотинг і секвенування, названі нижче в прикладах-посиланнях 1 |див. також Воїаїйп еї аї., ч- 199561, 2 їі З Ідив. також Воїіаіп еї а!., 1996), відносно до МОКТ-1 і МОКТ1-зв'язних білків (наприклад, МАСН), відповідно, рівною мірою застосовні (з деякими модифікаціями) до відповідного виділення, клонування і охарактеризування 1 і його ймовірних ізоформ відповідно до цього винаходу. Ці процедури, таким чином, « повинні бути прийняті як повне подання таких процедур, що використовувались для виділення, клонування і охарактеризування 1 згідно з цим винаходом, що детально розглянуте нижче в прикладі 1. (Наведені нижче - с приклади-посилання 1-3 також подані в формі, схожій або еквівалентній тій, що характерна для спільних, а перебуваючих на стадії розгляду |заявок на ізраїльський патент МоМо114615, 114986, 115319, 116588 і 1179321, "» так само як і для відповідної |РСТ-заявки МОРСТ/О5О96/105211). Більше того, у вище поданому розділі "Стислий опис креслень" вже були включені деякі подробиці експериментальних процедур, здійснених згідно з цим винаходом, і вони утворюють частину нижче наведеного прикладу 1 з точки зору повного подання цього -| винаходу, відповідно, і повинні розглядатися разом з тим, що викладено в прикладі 1.

Приклад-посилання 1.

Клонування та виділення білка МОКТ-1, що зв'язується з внутрішньоклітинним доменом рецептора ЕА5-К (9) (1) Дигібридний скринінг та дигібридний тест на експресію р-галактозидази 7 50 З метою виділення білків, що взаємодіють з внутрішньоклітинним доменом рецептора ЕАБ-К, використовувалась дигі-бридна дріжджова система (|Ріеідз 5 опо, 19891). Коротко, ця дигібридна система є (Че) основаним на дріжджах генетичним тестом, призначеним для виявлення специфічних міжбілкових взаємодій іп мімо шляхом відновлення еукаріотичного активатору транскрипції, такого як ЗА/ 4, що включає два поділені домени - ДНК-зв'язувального і активаторного доменів: ці домени у випадку експресії взаємозв'язування утворюють відновлений білок ОА 4 і здатні зв'язуватися з вищерозташованою активаторною послідовністю, яка, о в свою чергу, активує промотор, що контролює експресію гена-репортера, такого як Іас/ або НІ5З, експресія якого може бути легко виявлена в клітинах, що культивуються. В цій системі гени, які кодують передбачувані їмо) взаємодіючі білки, клонують в окремі експресувальні вектори. В складі одного експресу-вального вектору послідовність гена одного з передбачуваних білків клонована поряд з послідовністю, що кодує 60 /ДНК-зв'язувальний домен АГ 4 з метою утворення гібридного білка, який має в складі ДНК-зв'язувальний домен

СА14; до складу іншого вектору входиться послідовність, яка кодує другий передбачуваний білок поряд з послідовністю, що кодує активаторний домен САЇ4 з метою одержання гібридного білка, що включає активаторний домен СА14. Два гібридні вектори потім одночасно трансформують в клітини-хазяї дріжджів штаму, що несуть ген-репортер - Іас7 або НІЗЗ, який перебуває під контролем промоторного сегменту, що має 65 сайти зв'язування СА 4. Лише ті трансформовані клітини-хазяї (ко-трансформанти), в яких два гібридні білки експресовані та здатні взаємодіяти один з одним, виявляються здатними експресувати ген-репортер. У разі використання гена-репортера Іас/ клітини-хазяї, які експресують цей ген, забарвлюються в синій колір при доданні в культуральне середовище Х-даіЇ. Отже, сині колонії є індикаторами того факту, що два клоновані білки--"кандидати" здатні взаємодіяти один з одним.

З використанням дигібридної системи внутрішньоклітинний домен ЕАЗ-ІЇС був окремо клонований до складу вектору рОоВТ9 (що несе послідовність, яка кодує ДНК-зв'язувальний домен СА 4, надану Сіопіесп, США: див. нижче) з метою одержання злитого білка, що включає ДНК-зв'язувальний домен СА 4. Для клонування ГА5Б-К до складу рОВТО застосовували клон, який кодує повнорозмірну послідовність КДНК БАБ-К |М/О 95/31544), з складу якого внутрішньоклітинний домен (1С) було вирізано із застосуванням стандартних процедур з використанням 7/о різних рестриктаз, потім виділено з застосуванням стандартних процедур і вбудовано у вектор рОоВТ9, відкритий по своїм множинним сайтам клонування (МС5) з використанням відповідних підхожих рестриктаз. Слід зазначити, що домен ЕРА5-ІС займає амінокислотні залишки 175-319 інтактного ЕАБ-К: цей сегмент, що включає амінокислоти 175-319, які є доменом ЕАЗ-ІС, і були вбудовані до складу вектору ровт9.

Описаний вище гібридний (химерний) вектор потім ко-трансфікували разом з елементами бібліотеки КДНК клітин Неа людини, клонованими у вектор рОАЮ-ОН, що несе актива-торний домен САІ14, в клітини-хазяї дріжджів штаму НЕ?7с (всі названі вище вектори - роВТт9 і роАб-СН, що включає частини бібліотеки кДНК клітин

Нега, а також штам дріжджів придбали в фірмі Сіопіесп І ар. Іпс., США. у вигляді компонентів дигібридної системи МаїсптакКег МоР'Т1265-1). Ко-трансфіковані дріжджі вибирали за їх здатністю рости в середовищі без гістидилу (НІЗ середовище), вирощені колонії виявлялися позитивними трансформантами. Вибрані дріжджові Клони потім тестували за їх здатністю експресувати ген ас, тобто за активністю ГАС у них, яку визначали доданням Х-да! в культуральне середовище, що катаболізувався р-галактозидазою (ферментом, що кодується геном Іас/7) в забарвлений у синій колір продукт. Таким чином, сині колонії є індикатором активного гену ас.

Для забезпечення активності гену Іас7 необхідним є те, щоб активатор транскрипції (ЗА! 4 був наявним в активній формі в складі трансформованих клонів, а саме, щоб ДНК-зв'язувальний домен АГ 4, який кодується с вище зазначеним гібридним вектором, точно сполучався з активаторним доменом САГ4, що кодується іншим гібридним вектором. Таке поєднання можливо лише тоді, коли два білки, злиті з кожним з доменів ОА 4, здатні і) стабільно взаємодіяти (зв'язуватися) один з одним. Таким чином, гістидин-позитивні і сині (ГАС ") колонії, які були виділені, - це колонії, що були ко-трансфіковані вектором, що кодує домен ЕРАЗ-ІС, і вектором, який кодує білковий продукт, зв'язаний походженням з клітинами Неї а людини, здатний стабільно зв'язуватися з РА5-ІС. Ге»)

Плазмідна ДНК з названих вище дріжджових колоній з Нів", ГАС" була виділена і елекропорована в сч клітини Е. соїї штаму НВІ101 за допомогою стандартних процедур з подальшим відбором трансформантів Ге" і ампіцилін-резистентних: ці трансформанти є тими, що несуть гібридний вектор РОАО-ОН, який включає кодуючі МУ послідовності і Атр" ії Гец2. Такі трансформанти, таким чином, є клонами, що несуть послідовності, які « кодують нові ідентифіковані білки, здатні зв'язуватися з РА5Б-ІС. Потім плазмідну ДНК виділяли з цих

Зо трансформованих клітин Е. сої і повторно тестували шляхом: в. (а) їх ретрансформації з використанням вихідної гібридної плазміди, що включає внутрішньоклітинний домен

ЕАЗБ-К (гібридна плазміда роВТт9, що несе ЕГАЗ-ІС) штаму дріжджів НЕ? так, як це було описано вище. В якості контролю вектори, що несуть сторонню білок-кодуючу послідовність, наприклад, рОоВТ9 або рАСТ-ламін, « використовували для ко-трансформації разом з плазмідою, що кодує РА5-ІС-зв'язний білок (тобто МОКТ-1).

Потім ко-трансформовані клітини дріжджів тестували по росту в безгістидиновому середовищі без або з різним о) с вмістом З-амінотріазолу; та з» (Б) ретрансформації плазмідної ДНК і вихідної гібридної плазміди з РАЗ-ЇС і контрольних плазмід, описаних в па) , в дріжджові клітини-хазяї штаму 5ЗЕМ526 і аналіз активності ГАС " ефективність утворення р-галактозидазни, тобто забарвлення в синій колір). -1 15 Результати описаних вище тестів показали, що параметри зростання колоній на середовищі без гістидину були ідентичними параметрами активності ГАС, що оцінювалися за появою забарвленості колоній: тобто т» колонії Нів' виявлялися теж ГАС ". Далі, активність (АС в рідкій культурі (як більш прийнятних умовах сл вирощування) оцінювали після трансфекції гібридами, що кодують ДНК-зв'язувальний і активаторний домени

САЇ4, клітин-хазяїв дріжджів штаму ЗЕУ526, які характеризуються кращою індукованістю ГАС при участі іме) транскрипційного активатору САЇ 4 порівняно з таким процесом в клітинах-хазяїнах дріжджів штаму НЕ7. с З використанням описаної вище процедури був ідентифікований, виділений і охарактеризований білок, спочатку названий НЕТ, а тепер який позначається як МОКТ-1 "Меаіаюг ої гесеріог-іпдисейд іохісйу" ("медіатор індукованої рецепторами токсичності").

Більше того, також слід зазначити, що в ряді описаних вище дигібридних тестів на експресію р-галактозидази ця експресія також оцінювалася в фільтраційному тесті, що є більш прийнятним. Проведений скринінг показав, (Ф) що п'ять з З мільйонів КДНК містили вставку МОКТ-1. Потім спільно виділені клоновані вставки КДНК МОКТ-1 ко секвенували з використанням стандартних процедур секвенування ДНК. Амінокислотна послідовність МОКТ-1 була розшифрована по послідовності ДНК (для ознайомлення з нуклеотидною і амінокислотною во послідовностями МОКТ-1 див. спільні, перебуваючі на стадії розгляду |заявки на ізраїльський патент

МоМо112022, 112692 і 114615 та відповідну їм заявку РСТ Мо М/О 96/186411). Нумерація амінокислотних залишків в складі білків, які кодуються вставками кДНК, подана згідно з базою даних Зм/ізз-Ргої. Делеційні мутанти були одержані з застосуванням ПЛР, а точкові мутанти - за допомогою техніки олігонуклеотид-спрямованого мутагенезу |Ситепі Ргоїосоїв іп МоЇІесшіаг Віоіоду, 1994). в5 (ії) Індукована експресія, метаболічне мічення та імунопрецюхітація білків

Зчеплений по М-кінцю з РІ Ас-октопептидом МОКТ-1 ІРГАС-МОКТІ, Еазітап Кодак, Мем Намеп, СТ, СШАЇ,

ЕАЗ-ІС, РАБ-К р5бБ-К, химера, що включає позаклітинний домен робБ-К (амінокислоти 1-168), злитий з трансмембранним і внутрішньоклітинним доменами РАЗ-К (амінокислоти 153-319), ії КкКДНК люциферази, що є контролем, були експресовані в клітинах Не а. Експресію було здійснено з використанням контрольованого тетрацикліном експресувального вектору в клоні клітин Неїа (НЕТА-1), який експресує контрольований тетрацикліном трансактиватор |(Соззеп 8 Вціага, 1992; також див. Воїаїп еї а!., 1995). Метаболічне мічення з використанням ( 3551-метіоніну і (3981-цистеїну (Оиропі, Уміїтіпдюп, ОЕ, США і Атегзпат, Вискіпопатвпіге,

Великобританія) було проведено Через 18 годин після трансфекції шляхом додаткової 4-годинної інкубації при 372 в модифікованому за Дальбеко середовищі Ігла, без метіоніну та цистеїну, але з доданням 295 діалізованої 70 плодової телячої сироватки. Потім клітини лізували буфером КІРА (10мМ Трис-НСЇ - рН-7,5, 150мММ Масі, 195

МР-40, 195 дезоксихолату, 0,195 ЗО і 1їмММ ЕОТА), а лізат попередньо освітлювали шляхом інкубації з сторонньою кролячою антисироваткою (Змкл/мл) і шариками сефарози з білком-с (РНагтасіа, Оррзаїа, Швеція; бОмкл/мл). Імуноп-реципітацію проводили шляхом годинної інкубації при 42С аліквот лізату по О,Змл з мишачими моноклональними антитілами (мкл на аліквоту) до октопептиду ГГ Ас (М2; Еавітап Кодак), до ро5-К (|Мо18 і 75. Мо20; ЕпдеІтапп еї а!., 19901) або до ГАБ-К (284; Катіуа Зоційапа ОСакз, СА, США) або застосовуваними в якості контролю радіоактивними антитілами миші з подальшою інкубацією ще протягом години з шариками сефарози з білком-О (ЗОмкл на аліквоту). (іїї) Зв'язування іп мйго

Глутатіон-З-трансферазні (351) злиття з БАЗБ-ІС дикого типу або мутантного ЕРА5-ІС, були одержані і адсорбовані глутатіон-агарозними шариками |див. Воїдіп еї аї., 1995; Сицпепі Ргоїосоїв іп Моїесшціаг Віоіоду, 1994; Ргапдіопі 8: Мееї, 1993). Зв'язування метаболічно поміченого злитого білка Р АС-МОКТІ1 з З5Т-ЕА5-ІС оцінювали шляхом інкубації шариків протягом 2 годин при 42С з екстрактами клітин НегГ а, метаболічно помічених

І3581|-метіоніном (бОмкКи/мл), що експресують ЕІ АС-МОРВТ. Ці екстракти були приготовані в буфері, що містить 5ОММ Трис-НСІ - рН-7,5, 150мМ Масі, 0,195 МР-40, мМ дитіотрейтолу, 1мМ ЕОТА, 1мМ с фенілметилсульфонілфториду, 2Омкг/мл апротоніну, 20мкг/мл лейпеп-тину, 10ММ фториду натрію і 01мММ о ванадату натрію (1мл на 5х109 клітин). (м) Оцінка цитотоксичності, що опосередковується індукованою експресію МОКТ-1

КДНК МОКТ-1, РАЗ-ІС р55-ІС і люциферази були вбудовані в контрольований тетрацикліном експресований вектор і трансфіковані в клітини НІТА-1 (сублінія клітин Не а) (боззеп 5 Вціага, 1992)| разом з кДНК, що о секретується плацентарною лужною фосфатазою, приміщеною під контроль промотору 5М40, вектор реВо-2; с

ІОітке еї аї!., 1993). Загибель клітин оцінювали через 40 годин після трансфекції або з застосуванням тесту на поглинання нейтрального червоного (УмМаїїаси, 1984), або, у випадку специфічної оцінки загибелі тих клітин, що о експресують трансфіковані кДНК, за допомогою визначення кількості плацентарної лужної фосфатази |Вегдегеї «КЕ а!І., 1988), що секретується в культуральне середовище в останні 5 годин інкубації. 3о В інший серії експериментів, які мають проаналізувати ділянку білка МОКТ-1, яка втягнута в зв'язування з в

ЕАЗ-ІС, подані далі білки були експресовані по переміжному типу з контрольованого тетрацикліном експресувального вектору РОНО10-3 в клітинах Нега, які несуть контрольований тетрацикліном трансактиватор (НІТА-1): лише ГА5Б-К людини; ЕА5Б-К людини разом з М-кінцевою частиною МОКТ-1 (амінокислоти 1-117 - т. зв. « "голова МОКТ-1"); БАБ-К людини разом з С-кінцевою частиною МОКТ-1, що включає ділянку гомології з З "загибель-доменом" (амінокислоти 130-245 - "МОКТ-1 00") ; РГАС-55.11 (амінокислоти 309-900 білка 55.11, с з'єднані з М-кінцем октопептиду РАС, при тому, що білок 55.11 є білком, який специфічно зв'язуються з

Із» роб-ІС). Через 12 годин після трансфекції клітини обробляли трипсином і пересіювали в концентрації 30 тисяч клітин на лунку. Після 24-годинної інкубації клітини обробляли протягом 6 годин моноклональним антитілом до позаклітинного домену ГАБ-К (моноклональне антитіло СН-11: Опсог, (зайпегзрига, МО, США) при різних його концентраціях (0,001-1О0мкг/мл моноклонального антитіла) в присутності 1Омкг/мл циклогексиміду. Потім 7 визначали життєздатність клітин з використанням тесту на поглинання нейтрального червоного, а результати «» подавали у відсотках клітин, що вижили, порівняно з загальним числом клітин, що були проінкубовані тільки з циклогексимідом (тобто за відсутності моноклонального антитіла СН-11 до ЕАЗ5-К). і-й (М) Нозерн-блотинг і секвенування ка 20 Поліаденільовану РНК було виділено з повної РНК клітин Неї а (набір реактивів Оіїдоїех-4ї тКкМА КІії.

Оіадеп, Ніїдеп, Німеччина). Нозерн-блотинг з використанням кКДНК МОКТ-1 в якості зонда здійснювали за с допомогою стандартних процедур |див. Воїаїп еї а!., 1995). Нуклеотидна послідовність МОКТ-1 була визначена в обох напрямках у спосіб дидеокси ланцюгової термінації.

Дані проведеного секвенування КДНК МОКТ-1, клонованої в дигібридному тесті, показали, що ця кКДНК кодує 22 новий білок. Подальше застосування дигібридного тесту з метою оцінки специфічності зв'язування цього білка

ГФ) (МОКТ-1 - "Меадіаюг ої Кесеріог-іпдисед Тохісйу") с ЕА5-ЇС і виявлення конкретного сегменту в складі ЕАЗ-ІС, з яким він зв'язується, привело до одержання таких результатів: (а) білок МОКТ-1 зв'язується з ЕА5-ІС і о людини, і миші, але не з рядом інших тестованих білків, включаючи три рецептори сімейства рецепторів

ТМЕ/МОЕ (рецептори р55-ТМЕ і р75-ТМЕ та СО40); (5) мутації по заміщення амінокислоти-225 (ізолейцин) в 60 складі "загибель-домена" БАБЗ-К призводили до зникнення сигналу і іп омйго, і іп мімо (мутація

Ірг-9 Му/агапаре-Рикипада єї аї!., 1992; Мой 5 Мадаїйа, 19931), що також запобігає зв'язуванню МОКТ-1 з ЕАЗ-ІС; (с) сайт зв'язування з білюм МОКТ-1 в складі ЕАБ-К припадає на "загибель-домен" цього рецептора; і (4)

МОКТ-1 здатний зв'язуватися сам з собою. Таке самозв'язування і зв'язування МОКТ-1 з РГА5Б-К залучає різні ділянки даного білка: фрагмент МОКТ-1, що відповідає амінокислотним залишкам 1-117, зв'язується з бо повнорозмірним МОКТ-1, але не зв'язується ані сам з собою, ані з РА5Б-ІС. З іншого боку, фрагмент, що відповідає амінокислотним залишкам 130-245, зв'язується з ЕА5Б-К, але притому не зв'язується з МОКТ-1.

Більше того, з одержаних результатів ясно, що ділянка "загибель-домена" в складі РЕАБ-К є критичною за самозв'язуванням ЕАЗ-ІС, що характерно і для "загибель-домена" в складі ро5-К по самозв'язуванню у р5б5-ІсС.

Делеції обабіч від цих "загибель-доменів" ні в якій мірі не порушують їх здатності щодо самозв'язування, в той час як, однак, делеція в межах "загибель-доменів" пригнічує самозв'язування. У випадку з МОКТ-1 зв'язування МОКТ-1 з ЕРА5-ІС також виявляється залежним від повноти "загибель-домена" ГАЗ5-К, у той час як він також не залежить від сегментів за межами "загибель-домена" ГА5-К по зв'язуванню з ГА5-ІС.

Взаємодія білків, які кодуються конструкціями, що несуть ДНК-зв'язувальний домен і активаторний домен 7/0 ЗАГА4 (роВТЗ і роАО-ОН), в трансфікованих клітинах дріжджів штаму ЗЕУ526, оцінювали в фільтраційному тесті з р-галактозидазною експресією. Конструкції з ДНК-зв'язувальним доменом включали 4 конструкції з БАЗ5-ЇІС людини, чотири конструкції з РА5Б-ІС миші, включаючи дві повнорозмірні конструкції, які несуть мутації, що заміщають, "ізолейцин -- лейцин" та "ізолейцин -2 аланін" в 225-му положенні (відповідно, 1225М і 1225А) і три конструкції з МОКТ-1. Конструкції, що несуть активаторний домен, включали три конструкції МОКТ-1, при 7/5 тому, що частина МОКТ-1 була такою ж, як і в конструкції, що несе послідовність, яка кодує ДНК-зв'язувальний домен і повнорозмірну конструкцію РА5Б-ІС людини, частина ЕРА5-ІС була такою ж, як і в попередній конструкції, що несе ДНК-зв'язувальний домен. Внутрішньоклітинні домени рецептора р55-ТМЕ людини (р5Б5-ІС: залишки 206-426), Ср40 людини (СО40-ІС: залишки 216-277) і рецептора р7/5-ТМЕ людини (р75-ІС: залишки 287-461), так само як і ламіну, цикліну-О і "порожні" ЗАГ 4 (роВт9) вектори були взяті в якості негативного контролю в формі конструкцій, що несуть ДНК-зв'язний домен. В якості позитивного контролю служили ЗМЕ1 і ЗМРЕ4, взяті в формі конструкція з ДНК-зв'язувальним доменом (у випадку з ЗМЕТ1) і з активаторним доменом (ЗМЕ4). "Порожні" СА 4 вектори (РОАЮ-ОН) також служили в якості негативного контролю в формі конструкцій, що несуть активаторний домен. Символи "в" і "ж", які використовувались в поданні одержаних результатів описаного вище аналізу, означають появу чіткого забарвлення протягом 30 і 90 хвилин тесту, відповідно; знак "-" означає відсутність с

Забарвлення протягом 24 годин.

Експресія молекул МОКТ-1, з'єднаних по їх М-кінцю з октопептидом БІГ АС (РІГ АС-МОКТ-1), веде до виходу в і) клітинах Неї а чотирьох білків певного розміру - приблизно 27, 28, 32 і З4кД. Взаємодія МОКТ-1 з ЕРА5-ІС іп міго була виявлена шляхом проведення імунопреципітації білків з екстрактів клітин Не а, трансфікованих злитим білком РГАС-МОКТ-1 або кДНК люциферази в якості контролю: імунопреципітацію проводили з Ге») використанням антитіла до РГАС (аг Ас). Взаємодію іп мйго також було продемонстровано між МОКТ-1 і

ЕАЗ-ЇС, при тому, що МОБТ-1 знаходився в формі метаболічно помічених З9З-метіоніном злитих білків сч

ЕГАС-МОКТ-1, виділених з екстрактів трансфікованих клітин Не а, а ГА5-ІС перебуває в формі злитих білків.

О5Т-ЕА5-ЇС людини і миші, включаючи один з варіантів, що несе мутацію по положенню 225 поліпептиду ЕАЗ-ЇІС, а всі злиті білки З5Т-РА5Б-ІС були одержані в клітинах Е. соїї. Злиті по 5 білки були приєднані до т глутатіонових шариків перед взаємодією з екстрактами, що містять злитий білок Р АС-МОКТ-1, а після їч- здійснення такої взаємодії був проведений 5О5-електрофорез в ПААГ. Таким чином, взаємодія іп мйго була оцінена автора-діографічно з подальшим ЗОБ-електрофорезом в ПААГ, як зв'язування метаболічно поміченого З55-метіоніном. МОВТ-1, виробленого в клітинах Не а у вигляді злить з октопептидом РГАС « (РГАО-МОКТ-1) з О5Т, що входить в злиття на ряді з ЕАЗ-ІС людини або миші (З5Т-ПЕАЗ-ЇС або з5Т-тЕАЗ-ІС), або з 51 в злитті з ЕА5-ІС, що включає заміщення ізолейцину на аланін в 225-м положенні поліпептиду. Було т с показано, що всі чотири білки РІГ АС-МОКТ-1 виявляли здатність зв'язуватися з РА5-ІС в умовах інкубації з ч» злитим білком З5Т-РАБ-ІС. Як і в дріжджовому дигібридному тесті, МОКТ-1 не зв'язувався з злитим білком " О5Т-ЕАЗ-ІС, що характеризується заміщенням по мутантному сайту Ірг-9 (1225А).

Білкию, що кодуються кКДНК РГАС-МОКТ-1, також продемонстрували здатність зв'язуватися з внутрішньоклітинним доменом рецептора ЕА5-Е, так само як і з внутрішньоклітинним доменом химери ЕАЗ-В, в ш- якій позаклітинний домен заміщений рецептором р55-К (рбо55-РА5), у випадку ко-експресії з цими рецепторами в їх клітинах Неї! а. В цьому випадку взаємодія МОКТ-1 з ЕАЗ-ІС в трансфікованих клітинах Не! а, тобто іп мімо, була продемонстрована з застосуванням імунопреципі-тації різних варіантів трансфікованих клітин Неї! а, як взаємодія о іп мімо і специфічність взаємодії між МОКТ-1 і РАЗ-ІС в клітинах, ко-трансфікованих конструкціями, кодуючими ка 20 ці білки. Таким чином, злитий білок РГАС-МОРВТ-1 було експресовано і метаболічно помічено З355-цистеїном с (20мкКи/мл) і 358-метіоніном (40мкКи/мл) в клітинах Не! а окремо або разом з ЕАЗ-В людини, химерою ЕАЗ-К, в якій позаклітинний домен ЕА5Б-К був заміщений відповідною ділянкою рецептора ро55-К людини (р5о5-РА5) , або роб-К людини, взятого в якості негативного контролю. Перехресна імунопреципітація МОКТ-1 з спільно експресованим рецептором була проведена з використанням різних специфічних антитіл. Одержані результати 59 показали, що РГАС-МОКТ-1 здатний зв'язуватися з внутрішньоклітинним доменом ЕАЗ5Б-К, так само як і з

ГФ) внутрішньоклітинним доменом химери ЕБАБ-К-р55-К, що включає позаклітинний домен рецептора р5ббБ-К і 7 внутрішньоклітинний домен БАБЗ-К, у випадку ко-експресії з цими рецепторами в клітинах Неї а. Далі, імунопреципітація РІ АО-МОКТ-1 з екстрактів трансфікованих клітин також веде до осадження ко-експресованого рецептора ГА5Б-К або ко-експресованої химери р5о5-ЕА5. З іншого боку, імунопреципітація цих рецепторів веде 60 до одночасної преципітації Р АС-МОКТ-1.

Нозерн-блотинг з використанням КДНК МОКТ-1 в якості зонда вказує на наявність в клітинах Неї а єдиного гібридизувального транскрипту. В Нозерн-блоті, в якому поліадені-льована РНК (0,Змкг) з трансфікованих клітин гібридизувала з КДНК МОКТ-1, розмір РНК-транскрипту (приблизно 1800 нуклеотидів) був встановлений, як дуже близький до такого у КДНК МОКТ-1 (приблизно 1702 нуклеотиди). бо При проведенні секвенування було встановлене, що кКДНК включає відкриту рамку зчитування, яка кодує приблизно 250 амінокислот. Нуклеотидна і амінокислотна послідовності МОКТ-1 були показані в спільній, перебуваючій на стадії розгляду, заявці |див. МУО 96/18641|. В цих послідовностях мотив "загибель-домена" підкреслений, як і ймовірні старт-кодон метіоніну (49-е положення: жирна, підкреслена літера М) і стоп-код трансляції (зірочка під кодоном в положенні 769-771). Цей "загибель-домен" мотив виявляє схожість з відомими "загибель-доменами" мотивами в складі ро5-К і РЕА5Б-К (ро55ОрО і ЕАБЗ-0О). З метою визначення точного С-кінця в складі МОКТ-1 і одержання переконливих доказів точності визначення М-кінця (вихідного залишку метіоніну) в

МОКТ-1 додаткові експерименти проводили так:

З використанням описаних вище методів ряд конструкцій, які кодують молекули МОКТ-1, злитий по своєму 7/0. М-кінцю з октопептидом РІАО (РІ АС-МОКТ-1), були сформовані і експресовані в клітинах Неї! а з застосуванням метаболічного мічення експресованих білків з використанням З585-цистеїну і З55-метіоніну. Молекули

ЕГАС-МОКТ-1 кодувались такими кКДНК, що включають різні частини послідовності, яка кодує МОКТ-1: (Ї) КДНК октопептиду РГ АС, з'єднана з 5--кінцем КДНК МОКТ-1, з складу якої делетовані нуклеотиди 1-145; (ії) КДНК октопептиду РІ АС, з'єднана з 5-кінцем пов-норозмірної КДНК МОКТ-1; (ії) кКДНК октопептиду ЕГАС, з'єднана з 5-кінцем кКДНК МОКТ-1, з складу якої нуклеотиди 1-145, а також нуклеотиди 832-1701 були делетовані, а кодон ЗСС в положенні 142-144 мутований в кодон ТСС з метою запобігання початку трансляції по цьому сайту.

Після експресії описаних вище злитих продуктів Р АС-МОКТ-1 імунопреципітацію здійснювали так само, як було описано вище, використовуючи або моноклональні антитіла до РІ АС, або, в якості контролю, антитіла до ртТ5-ТМЕ-К, з подальшими ЗЮОЗ-електрофорезом в 1090о-ному ПААГ і авторадіографією. Результати аналізу описаних вище злитих продуктів РІГ АС-МОЇ Т-1 підтвердили положення С-кінця МОКТ-1 і дали докази того, що

М-кінець поліпептиду МОКТ-1 може знаходитися в положенні 49 даної послідовності.

Крім того, шляхом додаткових експериментів з експресії білка МОКТ-1 без приєднання октопептиду БІГ Ас по

Б'-кінцю, було показано, що залишок Мей"? служить в якості ефективного сайта ініціації трансляції. с

Проведений пошук в базах даних СепеВапкК і Ргоїеіпй Вапк показав, що до цього часу в них відсутні о послідовності, які б відповідали описаній вище виділеній послідовності МОКТ-1. Таким чином, МОКТ-1 являє собою новий білок, специфічний по зв'язуванню з ГА5-ІС.

Інтенсивна експресія ро5-ІС веде до опосередкування згубного ефекту на клітини (Воїдіп еї аї., 1995).

Експресія ЕАЗ-1ІС в клітинах Неї! а також має такий ефект, хоча і виражений меншою мірою, який може бути через 0) це виявлений лише при застосуванні чутливого тесту. Таким чином, незалежне від лігандів опосередкування згубного ефекту при трансфекції клітин МОКТ-1, а також р55-ІС і РА5-ІС, піддавалось аналізу. Вплив переміжної см експресії МОКТ-1, РА5-ІС людини, ро55-ІС людини або взятої в якості контролю люциферази на життєздатність ІС о) клітин Неїа оцінювався з використанням контрольованого тетрацикліном експресувального вектору.

Життєздатність клітин оцінювали Через 40 хвилин після трансфекції цими кКДНК або в присутності, або у З відсутності тетрацикліну (їІмкг/мл, з метою блокування експресії), разом з кКДНК, що кодує секретовану ї- плацентарну лужну фосфатазу. Життєздатність клітин визначали або з використанням тесту на поглинання нейтрального червоного, або, при спеціальному визначенні життєздатності тих конкретних клітин, що експресують трансфіковану ДНК, шляхом вимірювання кількості плацентарної лужної фосфатази, яка « секре-тується в культуральне середовище.

Описаний вище аналіз показав, що експресія МОКТ-1 в клітинах Не а в результаті зумовлює істотну - с загибель клітин, більш значну, ніж та, що зумовлюється експресією ЕАЗ-ІС. Ці цитотоксичні прояви всіх а факторів - р55-ІС, ЕАЗ-ІС ії МОКТ-1, - по-видимому, пов'язані з сегментами "загибель-доменів", присутніх в ,» складі всіх цих білків, при тому, що "загибель-домени" мають властивість самозв'язування і таким чином, певно, спричинюють прояв цитотоксичних ефектів.

З точки зору описаних вище характеристик МОКТ-1, а саме специфічного зв'язування МОКТ-1 з конкретним -і сегментом РАЗ-К, який втягнутий в індукцію клітинної загибелі, і того факту, що навіть слабка зміна структури їз цього сегменту, яка припиняє сигнал (мутація Ірг 99) і також відвертає зв'язування з МОКТ-1, визначає те, що цей білок відіграє якусь роль в передачі сигналу про або ж прямому опосередкуванні ним загибелі клітин. Це о міркування також підтверджується виявленою здатністю самого МОКТ-1 опосередковувати згубний ефект на з 50 клітини. Таким чином, біллк МОКТ-1 може функціонувати як (1) модулятор самозв'язування ЕА5-К за рахунок його власної здатності зв'язуватися з РГА5Б-К так само, як він може зв'язуватися сам з собою, або (2) служити

Ме) "депо-сайтом" для додаткових білків, що беруть участь у сигнальному механізмі за участю РА5-К, тобто МОКТ-1 може бути "білком-депо" і завдяки цьому може зв'язувати інші рецептори, окрім ЕАЗ-К, або (3) складати частину окремої сигнальної системи, що взаємодіє з сигнальною системою ЕА5-К. 22 З метою подальшого аналізу ділянок МОКТ-1, втягнутих в зв'язування з РА5-ЇС і модуляцію клітинних

Ге! проявів, що опосередковуються РА5Б-К (цитотоксичності), описані вище експерименти були проведені з використанням векторів, які кюдують частини МОКТ-1 ("голова МОКТ-1" - амінокислоти 1-117, і "ЖМОКТ-1 Юр" - де амінокислоти 130-245) (окремо), і вектора, що кодує ЕАБ-К людини, призначеного для ко-трансфекції клітин

Нега. В цих експериментах різні білки і поєднання білків експресувались по переміжному типу в клітинах Нега, 60 які включали контрольований тетрацикліном трансактиватор (лінія НЕТа-ї) шляхом вбудовування послідовностей, які кодують білки, в контрольований тетрацикліном експресувальний вектор. рИиноО1о-3.

Контрольну трансфекцію проводили з використанням векторів, які кодують лише ГАЗ-К, і векторів, які кодують злитий білок РІ Ас-55.11 (білок 55.11 є специфічним по зв'язуванню з ро55-ІС білком, частина якого, що включає амінокислоти 309-900 була злита по його М-кінцю з октопептидом РІ Ас). 65 Після етапів трансфекції і інкубації трансфіковані клітини оброблялись різними концентраціями моноклонального антитіла СН-11 до РГА5Б-К, що специфічно зв'язується з позаклітинним доменом рецептора

ЕАБ-К, експресованого цими клітинами. Таке зв'язування антитіла до РАБ-К індукує агрегацію БА5Б-К на клітинній поверхні (з більшою імовірністю, ніж з лігандом РА5Б-К) та індукує включення внутрішньоклітинного сигнального механізму, опосередковуваного ЕАЗ-ІС, що, врешті-решт, призводить до загибелі клітин (тобто рпосередкованої ЕА5-К клітинної цитотоксичності). Застосовувані концентрації моноклонального антитіла СН-11 до ЕГАБ-К знаходились в межах від 0,01 до 1Омкг/мл: як правило концентрації були такими - 0,005, 0,05, 0,5 і

Ббмкг/мл. Клітини оброблялись антитілом до ЕА5-К в присутності 1Омкг/мл циклогексиміду.

Результати описаного вище аналізу показують, що експресія рецептора РГАБ-К в трансфікованих клітинах зумовлює підвищену чутливість до цитотоксичного прояву антитіл до РАБ-К. Далі, ко-експресія сегменту 7/0. МОКТ-1, що включає ділянку гомології з "загибель-доменом", і РЕА5-К вступає в жорсткі протиріччя з індукованою

ЕАБЗ (тобто опосередковуваною ЕАБ-К) клітинною загибеллю, чого і можна очікувати, виходячи з здатності "загибель-домена" (00) МОКТ-1 зв'язуватися з "загибель-доменом" (ГАБ-ОЮ) ГАЗ-К. Більше того, ко-експресія

М-кінцевої частини МОЖКТ-1 і РГАБ-К не порушує опосередковану БАБ-К загибель клітин і, якщо таке і відбувається, деякою мірою посилює цитотоксичність (тобто спостерігається слабке підсилення клітинної /5 Загибелі).

Таким чином, наведені вище результати чітко вказують на те, що білок МОКТ-1 має два різні сегменти, що функціонують по зв'язуванню з ГАЗ-1ІС і опосередкуванні цитотоксичної активності ЕАЗ-ІС.

Ці результати, таким чином, також надають основу для використання різних частин (тобто активних фрагментів або аналогів) білюа МОКТ-1 для різних фармацевтичних застосувань. Наприклад, аналоги чи фрагменти, або похідні білка МОКТ-1, що включають по суті тільки С-кінцневу частину МОКТ-1, що містить його "загибель-домен", можуть використовуватись для інгібування цитотоксичного впливу, опосередковуваного ЕА5-К в клітинах або тканинах, що несуть рецептор РГА5Б-К, і завдяки цьому захисту цих клітин або тканин від дії ліганду ЕА5Б-К, що пошкоджує, в таких випадках, як при гострому гепатиті. З іншого боку, аналоги чи фрагменти, або похідні білка МОКТ-1, які по суті включають лише М-кінцеву частину МОКТ-1, можуть використовуватись для сч в Підсилення опосередкованої рецептором ГА5-К цитотоксичної дії в клітинах або тканинах, які несуть ЕА5-К, що таким чином веде до підсилення руйнування таких клітин або тканин, коли це є бажаним, наприклад, в таких і) випадках, як пухлинні клітини і автореактивні Т- і В-клітини. Як було докладно описано вище, таке застосування різних сегментів МОКТ-1 може здійснюватись з використанням різних рекомбінантних вірусів (наприклад, Массіпіа) з метою внесення послідовностей, які кодують сегменти МОКТ-1, в специфічні клітини або Ге! зо тканини, що їх бажано піддати такій обробці.

Крім того, також можливим є одержання і використання різних молекул, таких як антитіла, пептиди і с органічні сполуки, що включають послідовності або молекулярні структури, які відповідають описаним вище ю сегментам МОКТ-1 з метою досягнення того ж бажаного ефекту, що опосередковується цими сегментами

МОВт-1. в

Більше того, білок МОЖКТ-1 може використовуватись для специфічної ідентифікації, виділення і ї- охарактеризування інших білків, які здатні зв'язуватися з МОКТ-1 (тобто МОКТІ1-зв'язними білками): див. приклади-посилання 2 і 3.

Приклад-посилання 2.

Виділення МОКТ1-зв'язного білка « (І) Дигібридняй скринінг і дигібридний тест з експресією р-глактозидази в с Аналогічно до процедур, описаних в прикладі-посиланні 1, використовуючи внутрішньоклітинний домен й рецептора роБ5-ТМЕ-К (р55-ІС) і МОКТ-1 в якості "принади" і здійснюючи скринінг бібліотеки В-лімфоцитів и? людини, були виділені два клони кДНК, що кодують білковий продукт, здатний зв'язуватися і з МОКТ-1, і з роб-ІС. Для обох клонів була показана наявність ідентичних з 5-кінця нуклеотидних послідовностей (див. спільні, перебуваючі на стадії заявки (МО 96/18641 і РСТ/О596/105211). -і (ї) Параметри зв'язування нових клоновамих кДНК при дигібридному скринінгу

З використанням описаного вище дигібридного дріжджового тесту конструкція, яка включає кКДНК нового ть МОКТ1-зв'язного білка, використовувалась в якості "жертви", до якої додавали конструкції кількох "принад" в с різних реакціях, з метою визначення специфічності по зв'язуванню МОКТ1-зв'язного білка, що кодується цією

КДНК. Ці "принади" включали конструкції, які кодують білок МОКТІ, частини білка МОКТ-1 ("голова МОКТ-1" - де амінокислоти 1-117; "хвіст МОКТ-1" - амінокислоти 130-245), р55-ІС (амінокислоти 206-426 р55-К) або його

Ге) частину амінокислоти 326-426 - "загибель-домен' в складі р55-К; або інші домени, розташовані вище "загибель-домену" - амінокислоти 206-326). Одержані результати подані нижче в таблиці 2. св о ю васптмояти во ваговзжр вагових 0 заговір: де вввізімо

ЕАВ-ІС -

зага вес 001 вмоє 010 вто 01003 спиш нин чно 1 демно 111 70 Наведені вище дані дигібридного тесту з експресією р-галактозидази із зв'язування клону з більшим набором "принад" підтвердили, що білок, який кодується цим клоном, специфічно зв'язується з "загибель-доменами" і рецептора ро5-ТМЕ-К, і білка МОКТ-1.

В цілому, МОКТ1-зв'язний білок може використовуватись прямо з метою модулювання або опосередкування пов'язаного з МОКТ-1 впливу на клітини, або непрямо з метою модулювання або опосередкування впливу 7/5 Лліганду рецептора ГА5-К на клітини, коли такий вплив модулюється або опосередковується білююм МОКТ-1. Те ж саме залишається справедливим і відносно до інших внутрішньоклітинних білків або внутрішньоклітинних доменів трансмембранних білків, що спеціально було продемонстровано тут для рецептора р55-ТМЕ-К.

МОКТ1-зв'язні білки включають ті білки, які специфічно зв'язуються з повним білком МОКТ-1, або ті білки, що зв'язуються з різними сегментами білка МОКТ-1, наприклад, з описаними вище М- і С-кінцевим сегментами білка М.ОКТ-1. МОКТ1-зв'язні білки, які специфічно зв'язуються з такими сегментами, можуть використовуватись для модулювання активності цих сегментів і, отже, специфічної активності МОКТ-1, що детермінована цими сегментами.

Приклад-посилання 3.

Виділення і характеристика білка МАСН, іншого МОКТ1-зв'язного білка с (Ї) Дигібридний скринінг, дигібридний тест з експресією р-галактозидази, секвенування та аналіз послідовності

З використанням процедури, описаної вище в прикладах-посиланнях 1 і 2, повнорозмірна конструкція, яка о кодує білк МОКТ-1 людини, використовувалась в якості "принади" в дигібридній дріжджовій системі з метою виділення клону кКДНК, що кодує додатковий новий МОКТ1-зв'язний білок. Цей новий білок був спочатку позначений МОКТ-2, а потім перейменований і позначений як МАСН (абревіатура "МОКТ1-аззосіаїей СЕЮОЗ Ге») потоод" --омолог СЕЮОЗ, який зв'язується з МОКТ-1"), виходячи з його характеристик, які докладно розглядаються нижче. с

Цей клон кДНК було секвеновано за допомогою стандартних процедур, що були вище описані в юю прикладах-посиланнях 1 і 2. Аналіз даних секвенування за допомогою стандартних методик і комп'ютерного моделювання (див. приклади-посилання 1 і 2) показали, що ця кКДНК включає нову послідовність і кодує новий З білок (ані ДНК, ані амінокислотна послідовності в базах даних СепВапк або РгоїеіпвВапк не виявлені). Далі, ча

КДНК, яка кодує МАСН, включає відкриту рамку зчитування ОКЕ-В, яка виявляє істотну міру гомології з сегментом, що передує (тобто фланкує з 5-боку) "загибель-домен' в складі білюка МОКТ-1 (див. приклад-посилання 1). В спільних, перебуваючих на стадії розгляду |заявках на ізраїльський патент МоМо114615, 114986, 115319, 116588 і 117932), а також (у РСТ-заявці МоРСТ/ЛІБО6/10521)|, що їм відповідає, показана « структура тієї частини клону кКДНК МАСН, що включає ОКЕ-В (кодує 235 амінокислотних залишків), й с розшифрована амінокислотна послідовність МАСН ОКРЕ-В і нуклеотидна послідовність молекули кКДНК МАСН. й Ділянка, що відповідає ОКЕ-В, виявляє високий рівень гомології з сегментом МОКТ-1, розташованим вище и"? "загибель-доменного" мотиву МОКТ-1.

Додатково дигібридний дріжджовий тест був проведений з метою оцінки специфічності зв'язування МАСН з МОКТ-1, зокрема, з метою встановлення того сегменту в складі МОКТ-1, до якого приєднується МАСН, а також з -І метою визначення того, яка з відкритих рамок МАСН взаємодіє з МОКТ-1: відповідні процедури були описані вище в прикладах-посиланнях 1 і 2. Коротко, різні конструкції МОКТ-1 і МАСН були одержані для тестування т- взаємодії білків, які кодуються конструкціями, що включають послідовності, які кодують ДНК-зв'язувальний і сл активаторний домени транскрипційного активатора ЗАЇ4, в межах трансфікованих клітинах дріжджів штаму

ЗЕУ52 6 з оцінкою в фільтраційному тесті по експресії р-галактозидази. Конструкції з ДНК-зв'язувальним о доменом були одержані на основі векторів рОВТтО9, а конструкції з активаторним доменом були одержані на «с основі векторів рРОАЮ-ОМ. Для конструкції з активаторним доменом використовувалась повнорозмірна кКДНК

МАСН, що стало конструкцією, яка кодує тільки сегмент, що відповідає ОКЕ-В (МАСН-В). Контрольні конструкції з активаторним доменом були тими конструкціями, що включали повнорозмірну кодуючу послідовність МОКТ-1 (МОКТ-1 - позитивний контроль), а також тими, що не мали вставок, тобто були "порожніми" векторами (рРСАО-ОМ). Для конструкцій з ДНК-зв'язувальним доменом використовувалась повнорозмірна КДНК (МОКТ-1), і) тобто вони були конструкціями, які кодують тільки верхній сегмент МОКТ-1 (тобто МОКТ-1 БО: амінокислоти ко 130-245). Контрольні конструкції з ДНК-зв'язувальним доменом, що були сформовані з метою визначення специфічності МАСН-зв'язування, включали конструкції, які кодують ламін, амінокислотні залишки 287-461 60 внутрішньоклітинного домену рецептора р75-ТМЕ-К людини (р75-ІС людини), циклічний-О (сусб), ЗМЕ1, амінокислотні залишки 206-42 6 внутрішньоклітинного домену рецептора ро55-ТМЕ-К людини (р55-ІС людини), сегмент "загибель-домену" у внутрішньоклітинному домені ЕАБ-К людину (РГАБ-ОЮ людини), амінокислотні залишки 216-277 внутрішньоклітинного домену СО40 людини (С0О40 ІС людини), вектори без вставки або "порожні" вектори рОвтТ9 (рОВТО - негативний контроль) і конструкція, яка кодує сегмент ОКЕ-В МАСН 65 («МАСН-В). В цьому тесті визначали прояв забарвлення: при цьому, чим інтенсивніше виявлялося забарвлення, тим більш сильною є взаємодія між конструкціями, як кодують ДНК-зв'язувальний домен і активаторний домен.

Прояв забарвлення позначали символами, серед яких "ні "ж- визначають прояв чіткого забарвлення через 30 і 90 хвилин тесту, відповідно, а знак "--- визначає відсутність прояву забарвлення протягом 24 годин тесту.

У випадках, коли взаємодія не була протестована, символи не проставлялись. Одержані результати оцінки різних взаємодій описаних вище тестів наведені нижче в таблиці 3, а результати різних взаємодій ізоформ МАСН показані в названих вище спільних, перебуваючих на стадії розгляду заявці |РСТ/І596/10521) і відповідних заявках, поданих в Ізраїлі. а днкзвяхувальийдомен | | 11 11101011 МАсНІМАснвІМовти РоАосН пу НН ПО ПОН ННЯ НАННЯ моя 018 нн

Звяувальнийсетмент моти 0001 ів мовтет 00000011

Мовтібоіатюте 5030

Тест настцифчнть 301 лм 0111-11 втслюдни 0011

Фе

ЕХо2 НИ ПИННИ НОЯ НАННЯ ПА

БИ людини 11111

ВАВ Орлюдим 1-11 срадієлюдим 01-11 сч

Ровя 11-11 о масня 11111

Таким чином, як випливає з результатів таблиці 3, зрозуміло, що: (а) МАСН зв'язується з МОКТ-1 дуже жорстко і по специфічному типу; Ге»! (Б) МАСН-зв'язувальний сайт в МОКТ-1 знаходиться перед (тобто вище по послідовності) "загибель-доменного" мотиву МОКТ-1, тобто він потрапляє в сегмент МОКТ-1, що відповідає амінокислотам с 1-117 в складі МОКТ-1; ою (с) сегмент ОКЕ-В в складі МАСН є ділянкою взаємодії з МОКТ-1 білка МАСН; (4) сегмент ОКЕ-В в МАСН здатний до самозв'язування. З (ії) Цитотоксична дія, що опосередковується здатністю білка МАСН до самозв'язування ча

Виявлення того, що білок МАСН здатний самозв' язуватись, зокрема, що самозв'язується сегмент, який відповідає ОКЕ-В, і враховуючи, що раніше виявлені кореляції між самозв'язуваністю і цитотоксичністю, встановлені для внутрішньоклітинних доменів рецепторів ро5-ТМЕ-К і ЕА5-К, а також тієї, яка була виявлена для

МОКТ-1 (див. приклад-посилання 1) - все це підтверджує, що самозв'язування у МАСН також може залучатись « до прояву цитотоксичності. - с З метою тестування такої можливості конструкції які кодують МАСН, були одержані на основі й контрольованого тетрацикліном вектора (подробиці див. в прикладі-посиланні 1) М. Ці конструкції "» використовувались для трансфекції клітин Нег/ а, в яких ці вектори експресувались по переміжному типу. Окрім

МАСсН-несучих конструкцій, інші контрольні конструкції використовувались для оцінки впливу переміжної експресії на життєздатність клітин Не а, вплив на які МАСН-несучих конструкцій може визначатись з метою -І порівняння. Ці інші конструкції включають МОЖКТ-1, РАБ-1С людини і Гис (люцифераза). Додатково ко-трансфекція клітин Неї а була також протестована з використанням конструкцій, що несуть МОКТ-1 і МАСН, з шк метою визначення того, що ефект може зумовлювати взаємодію між цими білками. Після трансфекції клітини сл Нега інкубували і життєздатність клітин оцінювали через 4 8 годин після трансфекції або в присутності, або за

Відсутності тетрацикліну (мкг/мл), призначеного для блокування експресії. Життєздатність клітин визначали за ді допомогою тесту на поглинання нейтрального червоного.

Ге) Виходячи з результатів описаного вище аналізу стало ясно, що білок МАСН індукує дуже потужний цитотоксичний ефект щодо клітин Нег/ а, тобто індукована надекспресія КДНК МАСН в клітинах Неї! а в результаті зумовлює потужний цитотоксичний прояв. По-видимому, даний прояв цитотоксичності зумовлений здатністю МАСН до самозв'язування. (ії) Нозерн-блотинг іФ) З використанням добре відомих процедур (див. приклад-посилання 1), аналіз ряду клітинних ліній методом ко Нозерн-блотинг проводився з використанням кКДНК МАСН в якості зонда. Результати цього аналізу показують, що велике число клітинних ліній, зокрема, клітинні лінії СЕМ, Каїї, БОацаї, Нега, АІехапаег, Одигткаї і Аб7З, бо виявляють по два гібридизуючих транскрипти завдовжки приблизно по 3200 нуклеотидів.

З точки зору сказаного вище, білок МАСН, зокрема, МАСНрІ (тобто ОКЕ-В як частина МАСН) може використовуватись прямо для модулювання або опосередкування пов'язаного з МОКТ-1 впливу на клітини, або непрямо для модулювання чи опосередкування впливу ліганду рецептора ГА5-К на клітини тоді, коли цей вплив модулюється або опосередковується білюм МОКТ-1. Той факт, що МАСН специфічно зв'язується з верхнім 65 сегментом МОКТ-1 і виявляє гомологію з МОКТ-1, визначає специфічний шлях, згідно з яким МАСН або МАСН

ОКЕ-В можуть використовуватись для модулювання цього специфічного сегменту в складі МОКТ-1 і, отже,

специфічної активності МОКТ-1, що визначається цим верхнім сегментом. Далі, МАСН або МАСН ОКЕ-В можуть використовуватись в якості модулятора або медіатора внутрішньоклітинних проявів аналогічно тому шляху, що характерний і для самого МОКТ-1 (див. вище), виходячи з здатності білка МАСН до самозв'язування і індукції

Ним самим прояву цитотоксичності.

Подальший аналіз білка МАСН і послідовностей ДНК, які його кодують, проводився згідно з описаним нижче.

Крім того, було показано, що ОКЕ-В з складу МАСН представляє не тільки одну з серії ізоформ МАСН. Отже, білок МАСН і послідовності ДНК, які кодують його, тепер перейменовані, причини чого стануть зрозумілими з викладеного нижче. 70 (а) Дигібридний скринінг білків, які зв'язуються з МОКЖКТ-1, визначає новий білок, що має мотив послідовності, подібний до МОКТ-1:

Як зазначалося вище, для ідентифікації білків, які беруть участь в індукції білюм МОКТ-1 клітинної загибелі, дигібридний тест застосовували для скринінгу бібліотек КДНК з метою пошуку білків, що зв'язуються з

МОКТ-1. Дигібридний скринінг бібліотеки В-лімфоцитів людини (Оипее еї аІ., 1993)| з використанням кКДдНК

МОКТ-1 в якості "принади" привів до виділення клонів кКДНК, що відповідають самому білку МОКТ-1, що відбиває здатність цього білка до самозв'язування, а також клонів, які відповідають білюу ТКАОО, з яким МОКТ-1 ефективно зв'язується (див. приклад-посилання 2). Також проведений скринінг привів до виділення клонів КДНК з новою послідовністю, що кодує продукт, який специфічно зв'язується з білюоюом МОКТ-1. Цей білок, спочатку позначений МАСН, а потім, після відкриття того, що він трапляється у вигляді множинних ізоформ (див. нижче), перейменований в МАСНВІ1, також продемонстрував в дигібридному тесті здатність зв'язуватися сам з собою, але при цьому не був здатний зв'язуватися з рецептором ЕА5-К (див. названу вище спільну, перебуваючу на стадії розгляду заявку РСТ/О596/10521, яка також включає всі подальші аналізи та одержані в них результати).

МОКТ-1 і МАСНВІ і їх делеційні конструкції, так само як і ізоформа МАСНАТ (МАСНАТ є мутантним варіантом, в якому каталітичний цистеїн-360 заміщений серином - МАСНАТ1 (С3605)), і внутрішньоклітинний Га домен ЕАБ-К (ГА5-ІС) людини були експресовані в трансфікованих клітинах дріжджів штаму ЗЕУ526 в складі конструкцій, що включають послідовності, які кодують ДНК-зв'язувальний та активаторний домени і) трансактиватора транскрипції АГ 4 (відповідно, рОоВТтТе9 і рдАО-ОН). їх взаємодію оцінювали в фільтраційному тесті з експресією В-галактозидази згідно з описаним у Болдина з співавт. (Воїдіп еї аї., 19950). Результати подаються у вигляді періодів часу, необхідних для утворення тривкого забарвлення. Жодна з тестованих вставок. ФУ не взаємодіяла з серією варіантів негативного контролю, включаючи вектори, що несуть внутрішньоклітинні домени рецептора ро5-ТМЕ-К людини, рецептора р75-ТМЕ і СО40, а також ламін, циклін-О, і "порожній" вектор з с

САЇ4. МАСНВІ був клонований за допомогою дигібиридного скринінгу СА 4-АЮ-поміченої бібліотеки

В-лімфоцитів людини |Оипее еї а!., 1993) з метою виявлення білків, що зв'язуються з МОКТ-1, використовуючи репортерний штам дріжджів НЕ7с. За винятком спеціально зазначених випадків, всі експериментальні процедури З з5 такого пошуку були описані вище (також див. Воїдіп еї аІ., 1995). Делеційний аналіз показав, що МАСНВІ1 ч- зв'язується з М-кінцевою частиною МОКТ-1, яка залучена в індукцію клітинної загибелі (Спіппаїуап еї аї., 1995). Також МАСНВІ здатний самозв'язуватись в трансфікованих клітинах дріжджів. Однак він не зв'язується з деякими контрольними білками і, на відміну від білка МОКТ-1, він не здатний зв'язуватися з рецептором ЕАЗ-К. «

Експресія молекул МАСНВІ в клітинах ссавців веде до одержання білка з молекулярною масою З4кД, що зв'язується з молекулами МОКТ-1, які водночас з ним експресуються. Він також був здатний зв'язуватися з - с злитим білюом 55Т-МОКТ-1 іп міїго. ц Порівняння амінокислотних послідовностей МАСНВІ і МОКТ-1 показало загальний для цих двох білків мотив "» послідовності (позначений як "МОКТ-модуль"), який відрізняється від "загибель-доменного" мотиву, опосередковано через який білок МОКТ-1 зв'язується з рецептором РАЗ-К. Цей мотив є в єдиній копії в складі МОКТ-1 і в двох копіях в послідовності МАСНВІ. Такий самий мотив також виявляється в складі РЕА-15 - -І фосфопротеїну астроцитів, функції якого досі невідомі. Попередні дані підтверджують, що мотив "МОКТ-модуля" втягнутий в зв'язування МАСНВУІ (та інших ізоформ білків МАСН) з білюоом МОКТ-1. е Розшифрована амінокислотна послідовність МАСНВІ подана у вище названій заявці РСТ/О596/10521 та (9! відповідних їй заявках на ізраїльський патент, зокрема, заявці ІЇ 117932. Два "ШОКТ-модулі" показані, а також визначені С-кінці двох використовуваних делеційних мутантів МАСНВІ. Гомологія послідовностей модулів у о складі МАСНВ1, МОКТ-1 і гену РЕА-15 (депозитарний МоХ86809) також була подана у зазначених вище спільних, (Че) перебуваючих на стадії розгляду заявках, в яких ідентичні і схожі амінокислотні залишки були помічені приміщенням в замкнуті лінії та затінені, відповідно.

Також в спільних заявках, що зазначались вище, подані у вигляді діаграм "загибель-домен" і "МОКТ-модулі" та ділянки ЕАБ/АРОТ, МАСНВІ і МАСНАТ, які виявляють гомологію з протеазами СЕОЗЛСЕ.

Для сегменту МОКТ-1, що включає такий "МОКТ-модуль", була показана участь в індукції клітинної загибелі і) за участю цього білка (див. наведений вище приклад-посилання 1). Також була показана його участь в ко самозв'язуванні білка МОКТ-1, хоча він і недостатній для цього (див. приклад-посилання 1). Аналіз параметрів зв'язування у делеційних конструкцій МАСНВІ в трансфікованих клітинах дріжджів показав схожу участь 6о "МОКТ-модулів" в самозв'язуванні МАСНВІ, так само як і в його зв'язуванні з білюоюом МОКТ-1: делецій-ні конструкції, в яких був відсутній сегмент, розташований після (тобто нижче по послідовності) "МОКТ-модуля", були неспроможні зв'язуватися один з одним, але підтримували здатність зв'язуватися з повнорозмірним білком

МОКТ-1 і з повнорозмірним МАСНВІ. Подальше укорочення, при якому також була делегована частина послідовності "МОКТ-модуля", привело в результаті до втрати здатності зв'язуватися з цими білками. Для 65 подальшої оцінки участі "МОКТ-модулів" у цих взаємодіях делеційні мутантні МАСНВУІ, злиті з октопептидом

ЕГАС (РГАС-МОКТ-1) , були експресовані в клітинах Неї! а з подальшою оцінкою їх зв'язування іп міїго із злитим білком, що продукується бактеріями, який складається з глутатіон-З-трансферази і білка МОКТ-1 (55Т-МОКТ-1).

У подібний спосіб із зв'язуванням, що виявляється в дигібридному дріжджовому тесті, було виявлено, що таке зв'язування іп міго виявляється залежним від взаємодії сегменту в межах модулів МАСНВІ1. Метаболічно помічені з використанням 355 МАСНВІ, МАСНВІ, злитий по його М-кінцю з октопептидом РІГ Ас (РІ АО-МАСНВІ), мутантні по укороченню С-кіндцю РГАС-МАСНВІ і люцифераза в якості контролю були одержані в трансфікованих клітинах Не! а. Експресія здійснювалась з використанням контрольованого тетрацикліном експресувального вектора в клітинному клоні НЕТА-1 клітин НегГ а, який експресує контрольований тетрацикліном трансактиватор. 70 Оцінка експресії білків і визначення їх молекулярних мас були проведені за допомогою імунопреципітації клітинних лізатів з використанням антитіл до РГАС. Використовувані антитіла були такими: кроляча антисироватка до МАСНВІ і до МОКТІ була сформована проти злитих білків ЗЗТ-МАСНВІ і з5Т-МОКТ-1.

Мишачі моноклональні антитіла до октопептиду РІГ Ас (М2) і до ЕАБЗ/АРОТ1 (СНІ11) |(Мопепага еї а/!., 1989) придбали в фірмах Еазітап Кодак і Опсог |Сайнпегзриго, МО, США), відповідно. Мишачі моноклональні антитіла до епітопу 75 НА МП12САБ: Рівйа еї аї., 1988) і антитіла до ТМЕ були одержані в лабораторії заявників згідно з стандартними методиками, добре відомими у цій галузі техніки. Результати, які показують афінне зв'язування білків з о5Т-МОКТ-1, адсорбованою на глутатіонагарозних шариках (або, в якості контролю, з 51 або злитих О51 і внутрішньоклітинним доменом РА5/-АРОТ) та дані імунопреципітації різних злитих конструкцій за участю МОКТ-1

Її МАСН з використанням різних специфічних антитіл подані в названих вище спільних, перебуваючих на стадії розгляду заявках, зокрема, в заявках РСТ/О5З96/10521 і І 117932. (Б) Існування МАСН у вигляді множинних ізоформ:

Застосування методу Нозерн-блотинга з використанням кКДНК МАСНВУІ в якості зонда показало невелику кількість транскрипта (транскриптів) завдовжки приблизно 3000 нуклеотидів в ряді різних клітинних ліній.

Коротко, метод Нозерн-блотинга тотального пула РНК (14мкг на лінію) або поліаденільованої РНК (2мкг), с

Виділених з деяких клітинних ліній застосовували з використанням КДНК МАСНВУІ в якості зонда. Всі тестовані клітинні лінії - ТА7О, СЕМ, Каїї, Оацаї, Неї а, АІехапаег, дигкаї і Аб7З - походять від тканин людини і були о сформовані, відповідно, на матеріалі карциноми молочної залози, гострого лімфобластоїдного Т-клітинного лейкозу, лімфоми Беркіта, епітеліоїдної карциноми, гепатоми людини, гострого Т-клітинного лейкозу і рабдоміосаркоми. Достатньо розмита форма бендів гібридизації на Нозерн-блотах свідчить про те, що ці «Ф) транскрипти характеризуються гетерогенністю розмірів в межах від 2,85 до 3,5 тисяч пар нуклеотидів. Ознаки і кількості, і розмірів транскриптів варіюються при порівнянні різних тканин людини і притому не корелюють з с рівнями експресії білків МОКТ-1 або РАБ/АРО1 |МУаїапаре еї а, 1992). В сіменниках і скелетних м'язах, ю наприклад, транскрипти МАСН слабо виявлялися, навіть при тому, що ці тканини експресують істотні кількості білка МОКТ-1. З іншого боку, в спочиваючих моноядерних лейкоцитах периферійної крові, в яких рівень експресії М МОКТ-1 надзвичайно низький, був виявлений дуже високий рівень експресії МАСН. Активація лейкоцитів ча лектином приводить в результаті до істотної зміни розмірних параметрів транскриптів МАСН разом з індукцією

МОТ-1.

Враховуючи природу такої розмірної гетерогенності, бібліотеки кДНК піддавались скринінгу на виявлення « транскриптів, які б гібридизували з зондом КДНК МАСНВІ1. МАСНА! і МАСНА? були клоновані з бібліотеки КДНК 70 Спагоп-В5, похідної від МРНК, виділеної з тимусу людини. Бібліотеку скринували в жорстких умовах з зондом 8 с КДНК. МАСНВІ, поміченим з використанням набору реактивів для випадкового праймінгу Капдот-Ргітіпа Кії ц (Воепгіпдег МаппПеїт). Інші ізоформи МАСН клонували із застосуванням ПЛР з ревертуванням, яку проводили и"? на основі тотальної РНК, виділеної з клітин лінії Ка) (МАСНА, А2, АЗ, ВЗ та В4) і клітин лінії Оацаї (МАСНА?2, 82, ВЗ, В4 та В5), які є лімфобластоїдними клітинами людини. Реакція зворотної транскриптази

Здійснювалась з використанням оліго-дї адапторної затравки - 5-САСТООАСТСТАСАСТСОАСІТ) 47-3 - і -І зворотної транскриптази Зирегзосгірі-! (Сбібсо-ВКІ) на основі рекомендацій, викладених в інструкції виробників. Перший раунд ПЛР проводили з використанням реактивів Ехрапа Гопд Тетріаїе РСК Зувіет е (Воепгіпдег Мапппеійт) і таких смислової і антисмислової затравок: 5-ААСТОАССАСАТСАСААТТОАО-5 ос (відповідає нуклеотидам 530-551 в складі КДНК МАСНВІ) і 5-САСТООАСТСТАСАСТСОАС-3, - відповідно.

Другий раунд здійснювали з використанням Мепі-полімерази (МЕВ) і таких смислової і антисмислової затравок: - о 5-СВАОСАТССССААДАТОСАААСТОСАТОАТОАС-3 і 5-ВССАССАССТААААДАСАТТСТСАА-3, - похідних від (Че) послідовності КДНК МАСНВІ, відповідно. Для підтвердження наявності в складі МАСНВЗ і МАСНВА кодонів, що ініціюють трансляцію, здійснювали клонування більш довгих 5'-ділянок цих ізоформ з складу пулів РНК клітин

Каїї. Реакція ПЛР з ревертуванням, проведена з використанням адапторної оліго-дТ затравки, описаної вище, була завершена двома раундами ПЛР з використанням Мепі-полімерази (МЕВ) і таких смислової і не-смислової затравок: 5-ТТГІОСАТССАСАТОСАСТТСАССАСАААТСТТ-3 і У-АТТІСТСАААСССТОСАТССААСТО-3, - похідних іФ) від послідовності МАСНВІ. Останній з олігонуклеотидів є специфічним для В-ізоформ. Серед клонів, одержаних ко таким шляхом, ті що включають нуклеотиди, які кодують амінокислоти "другого блоку" (за присутності-відсутності якого МАСНВЗ і МАСНВ відрізняються від МАСНВІ і МАСНВ2), були повністю бо секвеновані. Нуклеотидні послідовності всіх клонованих ізоформ були визначені в обох напрямках з застосуванням методу Сейнджера. Були одержані тільки часткові клони кКДНК, які відповідають МАСНАЗ і

МАСНВЗ. В цілому, проведений скринінг підтвердив існування множинних ізоформ білка МАСН. Амінокислотні послідовності семи з цих ізоформ були досліджені в деталях. Результати цього аналізу у вигляді діаграм і ілюстративних прикладів наведені в згаданих вище спільних, перебуваючих на стадії розгляду заявках 65 РСТ/ОБО96/10521 та І 117932, де амінокислотні послідовності трьох цих ізоформ порівнюються з відомими гомологами.

Втрата 65 нуклеотидів, які в складі МАСНАТ кодують "другий блок", зумовлює зміну нуклеотидів, які кодують "третій блок" в складі МАСНВІ та МАСНВ2. Таким чином, в цих ізоформах ці нуклеотиди кодують інші амінокислоти, що разом складають їх унікальну С-кінцеву ділянку. З іншого боку, в складі відкритих рамок

МАСНВЗ ії МАСНВА "третій блок" зберігається, але при цьому відсутність нуклеотидів, що кодують сегмент гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ, і частини 3З'і-некодуючого сегменту, в результаті приводять до зміни в складі відкритої рамки нуклеотидів, розташованих нижче. Внаслідок такої зміни більша 5'-частина цього некодуючого нижче розташованого сегменту кодує 10 амінокислот, які перетворюють С-кінцеву частину цих двох ізоформ на унікальну. 70 Ізоформи були клоновані з бібліотеки кКДНК В-лімфоцитів людини (МАСНВІ), з бібліотеки КкКДНК тимусу людини (МАСНАТ та А2) із мРНК лімфобластоїдних клітин Каї і (МАСНАТ, А2, АЗ, ВЗ, В4 і ВБ5) і клітин лінії

Бацаї людини (МАСНАЗ2, 82, В3, В4 і В5) . Клонування мРНК з клітин Каїї і Сацаї здійснювали з застосуванням

ПЛР з ревертуванням з використанням олігонуклеотидів, що відповідають З-некодуючому сегменту і послідовності в межах другого "МОКТ-модуля" в складі МАСНВІ. Таким чином старт-кодон у виділених таким /5 чином клонах локалізований в межах другого "МОКТ-модуля".

Послідовності різних ізоформ співвідносяться одна з одною так: (а) всі ізоформи МАСН характеризуються загальним 182-амінокислотним М-кінцевим сегментом, що включає "МОКТ-модулі", при тому, що розташовані ближче до С-кінця (тобто з З'кінця "нижче") до цих модулів, так само як і некодуючі сегменти варіюються; (Б) за параметрами їх С-кінцевих послідовностей ці ізоформи поділяються на дві підгрупи - чотири ізоформи, що 2о визначаються як підгрупа В, мають відмінні С-кінці через зміну кодувальної рамки; дві ізоформи (МАСНВІ і

МАСНВЗ2) мають спільний С-кінець, виявлений в ізоформі, спочатку клонованій в ході дигібридного скринінгу, а ще дві ізоформи (МАСНВЗ і МАСНВА) мають спільний відмінний С-кінець; три ізоформи, визначені як підгрупа А, мають більш довгий С-кінцевий сегмент, який значною мірою нагадує параметри сімейства протеаз СЕОЗИЛСЕ (див. нижче); (с) сегменти, розташовані між ділянкою "МОКТ-модуля" і С-кінцевим сегментом, по якому сч об визначаються підгрупи, варіюється від однієї ізоформи до іншої. Однак, аналогічне тестування показало, що ці проміжні ділянки включають різні поєднання одних і тих самих трьох амінокислотних блоків (блоки 1, 2 і 3). і)

Мінливість амінокислотних послідовностей серед різних клонів відбиває два типи мінливості нуклеотидних послідовностей, які, що найбільш ймовірно, відбуваються внаслідок альтернативного сплайсинга: (а) вставка або відсутність або будь-якої з двох нуклеотидних послідовностей - одна довжиною 45 нуклеотидів і інша довжиною Ге! зо 65 нуклеотидів, - або їх обох, розташованих нижче нуклеотидів, які кодують залишок лизину-184; (Б) присутність додаткової вставки в межах ділянки, яка в складі МАСНВІ1 представляє 3'--некодуючий сегмент. Ця с мінливість впливає як на склад відкритої рамки, так і довжину поліпептиду, що кодується. ю

Частина ізоформ МАСН включає ділянку гомолог з СЕЮОЗ/ЛСЕ. Аналіз банків даних показав, що С-кінцевий сегмент ізоформ підгрупи МАСНА, що включає "третій блок" і послідовність, яка йде вниз від нього, значною « мірою нагадує протеази сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ. Було проведене порівняння послідовностей цього сегменту в ї- складі МАСН і різних відомих членів цього сімейства, які представляють організм людини, так само як і білка сейЗз нематоди Саепогпарайів еіедапв |ЕПЙв8 5 Ногмії7, 1986; Мицап еї аїЇ.,, 1993), а також відомих протеаз людини з протеазного сімейства СЕОЗЛСЕ: СРРЗ2 |ГРетападез-АІпетгі еї а, 1994), що також називається апопаїном (|МіспоЇївоп еї аї.,, 1995| і Мата |Темагі еї аїЇ.,, 19955), Меп2А (Регпапдез-АІпетгі еї аї., 1995), « 40. 1сп-1 (Мапо еї аї., 19941), білок людини, гомологічний білку Меда?2 миші (Китаг еї аї!., 19941), ІСЕ 611 (Мипдау еї шу) с аі!., 1995), що також називається ТХ і Існ2 |Раиспеи еї а|Ї., 1995; Катепз еї аї., 19951), ії ІСЕ |Прогпрегту еї а!., 1992; Сеїтеці еї аї., 19921). ;» Зазначений вище С-кінцевий сегмент МАСН найбільш подібний до СРРЗ2 (при 4195 ідентичності і 6290 гомології) і СЕОЗ (при 34905 ідентичності і 5695 гомології). Показана істотно менша схожість з ІСЕ (при 2890 їдентичності і 50905 гомології) з його найбільш близькоспорідненими гомологами ІСЕ,е(11 (що також називається -І ТХ і сн) та ІСЕ е(11. Схожість була виявлена практично по всьому сегменту, що починається від тирозину-226 в межах "третього блоку" аж до С-кінця ізоформи МАСНА. ве Звертають на себе увагу дві конкретні особливості такої схожості: с (а) Всі відомі протеази сімейства СЕОЗ/ЛСЕ розщепляють білки по сайтам, що визначаються наявністю в них 5о Залишку Авр в положенні РІ ї наявністю невеликого гідрофобного амінокислотного залишку в положенні Р". ю Однак їх специфічність розрізняється у зв'язку з іншими структурними особливостями субстрату, включаючи

Ге) природу залишків, які знаходяться в положеннях Р2-Р4. Відповідно, залишки активних сайтів, втягнуті в каталіз (що відповідають залишкам гістидину-237, гліцину-238 і цистеїну-285 в складі ІСЕ), і залишки, що утворюють "зв'язувальний карман для карбоксилатного бокового ланцюга Рі-Агр (аргінін-179, глутамін-283, аргінін-341 і, дв по-видимому, серин-347), є у цих протеаз консервативними. Ці залишки також зберігаються в МАСНАТ. Є єдиний виняток, хоча і пов'язаний з консервативною заміною серину на треонін в сайті, що відповідає сери-ну-347 в (Ф) складі ІСЕ. Іншим невеликою, але потенційно важливою відмінністю послідовностей між ізоформами МАСНА та ка іншими членами протеазного сімейства, є заміна аргініну на глутамін в сайті, що відповідає залишку аргініну-286 в складі ІСЕ. Цей залишок, що є сусіднім до потенційного каталітичного цистеїнового залишку, бо Характеризується повною інваріантністю у всіх інших представників сімейства СЕОЗ/ЛСЕ. Також частина залишків в сайтах, локалізованих поблизу субстратних залишків Р2-Р4, відрізняється у ізоформ МАСНА від таких, виявлених у інших членів сімейства СЕОЗ/ЛСЕ. (Б) Протеази сімейства СЕЮОЗЛСЕ включають сайти авто-розщеплення. Для деяких протеаз дійсно відоме проходження етапу самопроцесингу, а у інших - залежність цього процесингу на прояви максимальної 65 каталітичної активності. їх повна по біологічній активності форма складається з двох зв'язаних у нековалентний спосіб продуктів розщеплення, що розрізняються за розмірами (р2О0ї р17 у ІСЕ; р17 і р12 у

СРРЗ2). Присутність потенційних сайтів авторозщеплення у інших членів даного сімейства підтверджує, що вони є суб'єктами для схожого процесингу, і у подібний спосіб є залежність прояву максимальної каталітичної активності від такого процесингу. Такі потенційні сайти авторозщеплення є в складі МАСНАТ майже в тих же положеннях, що і в складі СРРЗ2. Сайт, що відповідає М-кінцю субодиниці р1!7 СРРЗ2, розташований у другому консервативному блоці амінокислот, лише в кількох амінокислотних залишках вище від М-кінця ділянки гомології з СЕОЗЛ/ЛСЕ (нижче від залишку аспарагінової кислоти-216). Сайт, що відповідає точці розщеплення між двома субодиницями СРРЗ2, розташований, як і в усіх інших членах сімейства СЕОЗ/СЕ, у яких відоме розщеплення, в кількох амінокислотних залишках нижче від каталітичного цистеїнового залишку (нижче аспарагінової 7/0 Кислоти-374). Цей консерватизм підтверджує, що ділянка гомології СЕОЗЛСЕ в складі МАСНАТ1 є суб'єктом протеолітичного процесингу. Розмір двох передбачуваних продуктів такого розщеплення дуже близький до такого у двох субодиниц процесованої молекули СРРЗ2. (с) Наявність протеолітичної активності у ділянки гомології з СЕОЗ/ЛСЕ в складі МАСН

Для з'ясування того, чи виявляє протеолітичну активність сегмент гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ в складі МАСНА, /5 заявниками були проведені експерименти з експресії сегменту, який проходить від сайта потенційного розщеплення вверх до цієї ділянки, між залишками Азвр-216 і бЗег-217, аж до С-кінця цього білка, в клітинах бактерії у вигляді злитого білка, ЗТ. Бактеріальні лізати були протестовані щодо здатності розщепляти флуорогенні пептидні субстрати, для яких раніше було показане розщеплення іншими гомологами СЕЮОЗ/ЛСЕ.

Використовувались два пептидні субстрати. По-перше, це ацетил-Азр-сІШ-МаІ-Азр-а--4-метилкумарил-7-амід) (АС-ОЕМО-АМС), що відповідає послідовності АДФ-рибозополімерази (РАКР) - ядерного білка, для якого встановлена його розщеплюваність в клітинах майже відразу після стимуляції РА5-К |Темагі еї аї., 199551, так само як і при інших апоптопічних процесах (Кашїтапп, 1989; Кашїтапп еї аї., 1993; І агерпік еї аї., 1994). Цей флуорогенний субстрат ефективно розщепляється протеазою СРРЗ2. Другий флуорогенний субстрат - ацетил-Туг-МаІ-АІа-Азр-АМС (Ас-ЖМАЮБ-АМС), - який відповідає субстратному сайту для протеази ІСЕ в сч ов послідовності попередника 1-18. Цей флуорогенний субстрат розщепляється протеазою ІСЕ. Лізати бактерій, що експресують сегмент гомології з СЕЮОЗЛСЕ з складу МАСНАТ, ефективно розщепляє похідний від РАКР і) флуорогенний субстрат. Однак, у них не спостерігалося видимої протеолітичної активності відносно до похідної від попередника інтерлейкіну-1В послідовності як флуорогенного субстрату (контроль) Ас-УМАО-АМС, яка є сайтом розщеплення для протеази ІСЕ в складі ПРО-ІІ.-18 |Погпрегтгу еї аї., 1992). Протеолітична активність Ге! зо блокувалася йодоцтовою кислотою (5мММ): це підтверджує, що вона опосередковується тіоловою протеазою. Не спостерігалося розщеплення при тестуванні лізатів, що містять з 5Т-злиту ділянку МАСН, гомологічну с протеазам СЕОЗ/ЛСЕ, в якій каталітичний залишок цистеїну-360 було заміщено серином. Також бактеріальні ю лізати, які експресу-вали повнорозмірний білок МАСНАТ!Т у вигляді з5Т-злитого білка не розщепляють субстрат

Ас-ОЕМО-АМС, по-видимому, через відсутність бактеріальних ферментів, здатних процесувати повнорозмірну « з5 Молекулу. Не відбувалося розщеплення при тестуванні лізатів, що включають будь-який з двох потенційних ча продуктів розщеплення сегменту гомології з протеазами СЕЮЗ/-ІСЕ.

Кінетика розщеплення похідного від послідовності РАКР флуорогенного субстрату Ас-ОЕМО-АМС (50мМкМ) екстрактом Е. соїї, експресуючих З5Т-злитий білок сегменту гомології СЕОЗЛСЕ МАСНАТ (від серину-217 до

С-кінця цього поліпептиду) , була виявлена порівняно з відсутністю такого розщеплення екстрактом бактерій, « які експресують ОЗТ-злиті білки, повнорозмірної молекули МАСНАТ або будь-який один з двох продуктів з с протеолітичного розщеплення сегменту гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ (від серину-217 до аспарагінової кислоти-374 і від аспарагінової кислоти-374 до С-кінця цього поліпептиду). ;» Далі, була продемонстрована залежність розщеплення субстрату Ас-ЮОЕМО-АМС від його концентрації, інкубованого протягом 180 хвилин з екстрактом бактерій, які експресують сегмент гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ з складу МАСНА1, злитий з О5Т. Не виявлено розщеплення у разі присутності йодоцтової кислоти (5ММ) . Екстракти не -І виявляли активності відносно до Ас-УХМАЮБ-АМС - флуорогенного субстрату, який відповідає сайту в складі попередника І! -Іб, що є субстратом для протеази ІСЕ. ве Коротко, 55Т-злиті білки були одержані в Хі І-синіх бактеріях з використанням експресувального вектора с рРОЕХЗ. Бактерії лізували ультразвуком в буфері що містить 25мММ НЕРЕБ |(рН-7,5), 0,195 бо 0 З-ІЗ-(холамідо-пропілудиметиламіно|-І-пропансульфонату, 5мММ ЕОТА її 2мММ О0О0Т з подальшим ю центрифугуванням при 160009 протягом 10 хвилин. Аналіз за допомогою ЗЮОБЗ-електрофорезу в ПААГ

Ге) підтвердив присутність схожого вмісту різних злитих білків в лізатах. Аліквоти екстрактів по 5Омкл (4мг/мл загального білка) інкубували при кімнатній температурі протягом певного періоду при загальному об'ємі реакційної суміші 50Омкл з флуорогенним субстратом при певних концентраціях. Вихід АМС визначали дв бспектрофлуорометрично при довжинах хвиль ЗВОнм (збудження) і 46Онм (емісія). Концентрацію АМС визначали за калібрувальним кривим. Обидва пептиди, що використовувались в якості флуорогенних субстратів, були

Ф) одержані від Реріїде Іпзійше Іпс. (ОзаКа, Японія). Для інших протеаз СЕЮОЗ/ЛСЕ був показаний прояв повної ка активності тільки після протеолітичного процесингу, що відбувається або за механізмом саморозщеплення, або шляхом розщеплення іншими протеазами |див. огляд Китаг, 1995; Непкагі, 1996). Одержані заявниками дані про бо те, що лізати бактерій, які експресують молекули з5Т-МАСНАТ, не виявляють ферментативної активності на протилежність активності, що виявляється лізатами бактерій, які експресують сегмент гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ, підтверджують, що для активності МАСНА також необхідний процесинг. Шлях, по якому процесинг МАСНА відбувається в клітинах ссавців і те, як цей процесинг може опосередковуватися рецепторами ГА5Б-К або р55-К, доки неясно. Для МОКТ-1 було показане зв'язування в клітинах з активованим ЕРАЗ-К як і з деякими іншими 65 білками ЦКізснкеї еї аї!., 1995). Ці білки, по-видимому, включають МАСНА! та інші ізоформи МАСН. Здається досить ймовірним, що зв'язування МОКТ-1 з ЕА5Б-К в комплексі з МАСНА утримує разом деякі молекули МАСН або індукує їх конформаційні перетворення і що ці зміни або опосередковують автолітичний процесинг МАСНА, або роблять МАСНА сприйнятливим до розщеплення іншими протеазами. Стимуляція рецептора р55-К може опосередковувати саморозщеплення МАСНА у подібний, хоча і меншою мірою спрямований спосіб за рахунок утримування разом кількох молекул ТКАЮО або індукування їх конформаційних перетворень, які, в свою чергу, індукують зміну в формуванні або статусі, або агрегованості білка МОКТ-1 і зв'язаної з ним молекули.

Субстратна специфічність МАСНА здається вельми "орієнтованою на загибель". Хоча він міг би розщепляти пептидний субстрат, який відповідає сайту розщеплення в складі "загибель-субстрату" РАКР (Ас-ЮВЕМО-АМС),

МАСНА не виявляє протеолітичної активності щодо пептиду, який відповідає сайту процесингу попередника 7/0 інтерлейкіну-18 протеазой ІСЕ (Ас-УМА0-АМС). Ідентифікація клітинних білків, які б служили субстратами для розщеплення білюм МАСНА, дозволить визначити більш віддалені події в процесі індукції цією протеазою загибелі клітин. Ймовірними субстратами для розщеплення білком МАСНА є інші члени сімейства СЕОЗ/СЕ, такі як СРРЗ2 і ІСЕ. Деякі з цих протеаз дійсно процесуються після опосередкування рецепторами ЕАБ-К або ТМЕ-К

ІЇМішга еї аї.,, 1995; ЗспІеде! еї аїЇ.,, 1996; СНіппаіїуап еї аіЇ, 1996Ї. Не виключено, що і протеази, які не 7/5 ВХОДЯТЬ До складу сімейства СЕОЗ/ЛСЕ, також активуються білююм МАСНА або прямо, або опосередковано через активність інших протеаз СЕОЗ/ЛСЕ. Втягнення численних протеаз в процеси клітинної загибелі погоджується з відомою здатністю інгібіторів різних протеаз, включаючи інгібітори серинових протеаз і інгібітор розщеплення

ІСЕ, так само як і антисмислової КДНК ІСЕ, захищати клітини від прояву токсичності, що індукується рецепторами ЕАБ-К і ТМЕ-К |Мейгеп 5 Сгапдег, 1980; Киддіего еї а!., 1987; Епагі еї аі., 1995; І ов еї аї., 1995).

Різні групи інших ферментів, включаючи фосфоліпази, сфінгомієлази і протеїнкінази, можуть брати участь в індукції загибелі клітин, опосередковуваній рецепторами ТМЕ і РА5Б-К див. Еїзспеп еї аї., 1994; Мапдепабрееїе еї аі.,, 1995; Спопе еї аї!., 1995 і бібліографія в цих статтях). Деякі з цих ферментів можуть бути активовані шляхом протеолітичного розщеплення, що ініціюється білююм МАСНА. Також здається можливим, однак, що принаймні частина цих інших "загибель-пов'язаних" активностей стимулюється окремими сигнальними сч механізмами, які не залежать від стимуляції за участю МАСНА. Втягнення більше ніж одного сигнального каскаду в індукцію загибелі клітин - деяких звичайних для р55-К і РАЗ/АРОТ1 і деяких, що індукуються лише (8) одним з них, - повинно погоджуватися з повідомленням про існування як загальних, так і відмінних характеристик процесів загибелі клітин, що індукуються цими двома типами рецепторів |(ОгеїЇ еї аї., 1994;

Зспціге-Овійоїї еї аї., 1994; М/опд « Соедавеї, 1994; Сіетепі 5 (атепкоміс, 1994). Ге! зо (4) МАСНА! зв'язується і з МОКТ-1, і з МАСНВІ1:

Для виявлення того, чи може МАСНАТ1 зв'язуватися з МОКТ-1 так, як він зв'язується з МАСНВІ, спочатку с досліджували взаємодію цих білків в трансфікованих клітинах дріжджів. Даний ефект виявлявся в істотному ю зменшенні виходу колоній дріжджів, які б експресували білок, що кодується вектором, який включає активаторний домен (АЮ) (рівень експресії якого вищий, ніж рівень експресії вектора, що включає «

ДНК-зв'язувальний домен - ОВО). З іншого боку, МАСНВІ, в складі якого каталітичний залишок цистеїну-360 був ї- заміщений на серин (МАСНАТ |СЗ605)), не виявляв цитотоксичності ані відносно до клітин ссавців (див. нижче), ані відносно до дріжджів. Як і МАСНІ, МАСНАТ |СЗ605) зв'язувався в трансфікованих клітинах дріжджів з

МОКТ-1 і сам з собою. Він також зв'язувався з МАСНВІ1. Також клітини дріжджів, які експресують МАСНАТ1 дикого типу разом з МОКТ-1 або МАСНВІ, виявляли взаємодію трансфікованих білків. Однак, інтенсивність кольору, « Зумовленого Іас2-продуктом, варіювалася між колоніями дріжджів: у дріжджів, трансфікованих МАСНАТ в складі Ше) с обох векторів (АС і ОВО) забарвлений продукт не виявлявся зовсім, певно, через цитотоксичний прояв МАСНА1 . дикого типу. До того ж, незважаючи на таку варіабельність, дріжджі, які експресували МАСНА! або в комбінації и?» з МОКТ-1, або в комбінації з МАСНВІ, виявляли чітку позитивну реакцію із взаємодії трансфікованих білків.

На відміну від МАСНВІ, МАСНАТ не виявив в дигібридному тесті взаємодію по типу "сам з собою".

Ї МАСНАТ1 |СЗ3605), і МАСНВІ імунопреципітувались водночас з МОКТ-1 з лізатів ембріональних ниркових -І клітин 293-ЕВМА людини, що вказує на їх зв'язування з МОКТ-1 також і в клітинах ссавців. Проводили подальше тестування МАСНАААТ на можливість зв'язування з МОКТ-1 також в клітинах ссавців, здійснювали експресію пи МАСНА!Т або МАСНВТІ, злитих з октопептидом БІГ АС, поряд з молекулами МОКТ-1, поміченими епітопом НА. ос Метаболічно помічені за допомогою 355 МАСНА! і МАСНВЯІ, злиті по своїм М-кінцям з октопептидом БГАС «БАС-МАСНА! і ВІ), і МОКТ-1, злитий по своєму М-кінцю з епітопом НА ЦРіеїа еї аї., 1988), були експресовані ді в клітинах Нег а. Імунопреципітацію білків з лізатів цих клітин здійснювали з використанням моноклональних (Че) антитіл миші до октопептиду ГАС (М2: Еавітап КоаакК), епітопу НА (12С5: Рівїд еї аї., 1988) або рецептору р7Б5-ТМЕ-К |Мо9: Відда еї аї., 1994), взятому в якості контролю. Білки були проаналізовані з застосуванням зО5-електрофорезу в 1296-поліакриламідному гелі з подальшою авторадіографією. | МАСНА!Т, і МАСНВ1 імунопреципітувались разом з МОКТ-1 з лізатів клітин, що підтверджує їх зв'язування з білюм МОКТ-1.

Ефективність взаємодії МАСНАТ з білююом МОКТ-1 здається меншою порівняно з такою у МАСНВІ1.

Ф, (е) Здатність опосередковувати клітинну загибель молекулами МАСН, що містять сегмент гомології з іме) СЕОЗЛСЕ

З метою оцінки участі МАСН в індукції клітинної загибелі досліджували вплив надекспресії різних ізоформ бо МАСН на життєздатність клітин. Аналіз був проведений шляхом трансфекції експресуючих МАСН векторів разом з вектором, який експресує В-галактозидазу, взятим в якості маркера трансфекції, в ембріональні ниркові клітини 293-ЕВМА людини і клітини карциноми молочної залози МСЕ7 людини.

Коротко, клітини 293-ЕВМА, клітини карциноми молочної залози МСЕ7 людини і клітини Нега НІТА-1 вирощували в модифікованому по Дальбекко мінімальному середовищі Ігла з доданням 1095 плодової телячої 65 сироватки, замінних амінокислот, ТО0бод./мл пеніциліну і 1ООмкг/мг стрептоміцину. Чашки з клітинними культурами (5х109 клітин 293-ЕВМА, 3х109 клітин МСЕ7 або 3Х109 клітин Не! а на 6-см чашках) трансфікували по переміжному типу з використанням методу осадження з фосфатом кальцію, використовуючи кДНК визначеного білка разом з вектором, що експресує В-галактозидазу. В одній групі експериментів кожну чашку трансфікували З,5мкг конструкції МАСН і 1,5мкг раМ-В-СаІЇ, а в іншій групі експериментів кожну чашку трансфікували 2,5мкг зазначеного варіанту МАСН і конструкцією МОКТ-1 (або, в якості контролю, "порожнім" вектором) і 1,5мкг рем-В-Саї. Клітини промивали через 6-10 годин після трансфекції. Клітини 293-ЕВМА і МСЕ7 потім інкубували ще протягом 18 годин без додаткової обробки. Клітини Неї! а інкубували після трансфекції протягом 26 годин і потім ще 5 годин в присутності або антитіла до ЕАБ/АРО1 (СНІ1: О,5мкг/мл) , або до ТМЕ (10Онг/мл), в обох випадках з доданням циклогексиміду (1Омкг/мл). Інтенсивність загибелі клітин по закінченні /о періоду інкубації оцінювали за рівним експресії В-галактозидази згідно з описаним у (Киптаг еї аї!., 19941.

Культури, трансфіковані векторами, які екс пресують МАСНАТ1Т або МАСНА2, демонстрували масову загибель клітин, що виявлялося в округленні, зсиханні клітин, утворенні шорсткості їх поверхні і врешті-решт відриві клітин від поверхні чашки. Через 20 годин після трансфекції більшість трансфікованих клітин, яких ідентифікували за В-галактозидазному забарвленню (Х-СаЇ), виявляли чітку морфологічну конденсованість, /5 типову для процесу апоптозу. З іншого боку, клітини, що експресують "порожній" вектор, виживали.

Для оцінки участі сегменту гомології з СЕОЗ/ЛСЕ в складі ізоформ МАСНА в прояві такого апоптотичного ефекту клітини були трансфіковані вектором, що експресує ізоформу МАСНВІ, позбавлену сегменту гомології з

СЕОЗЛСЕ, так само як і вектором, що експресує ізоформу МАСНАЗ, позбавлену М-кінцевої частини цього сегменту, і вектором, що експресує МАСНАТ1 |СЗ6О051), і вектором, що експресує укорочену по С-кінцю мутантну форму МАСНАТ |МАСНАТ (1-415)), які позбавлені одного з амінокислотних залишків, що вважається критичним щодо забезпечення СЕЮЗ/ЛСЕ-протеазної функції (Відповідає серину-347 в складі ІСЕ). Ніякої загибелі (за винятком дуже низького її рівня, виявленого при трансфекції "порожнім" експресувальним вектором) не виявлялось в клітинах 293-ЕВМА або МСЕ7, трансфікованих векторами, які експресують МАСНАЗ, МАСНА1 (1-415) або МАСНАТ1 |СЗ360О5). Більше того, клітини, трансфіковані МАСНАТ водночас з цими векторами, сч ов виявляли дуже слабку клітинну загибель: це вказує на прояв молекулами МАСН, які включають неповний сегмент гомології з СЕЮОЗ/ЛСЕ, негативного домінантного ефекту відносно до активності молекул дикого типу. (8)

Культури, що експресують МАСНВІ, які взагалі позбавлені сегменту гомології з СЕОЗ/ЛСЕ, демонстрували слабкий степінь клітинної загибелі. Такий прояв МАСНВІ, який, що найбільш ймовірно, є результатом активації ендогенних молекул МАСНАТ, був з ряду причин більш вираженим в трансфікованих клітинах Не! а. Більше того, Ге! зо В клітинах НеГа варіанти МАСНАЗ, МАСНАТ (1-415) або МАСНАТ |С36051 також деякою мірою були цитотоксичНниМИи. с

Активність МАСНА, по-видимому, становить найбільш ранній каталітичний етап в каскаді сигналів ю цитотоксичного прояву ГАБ/АРОТ і р55-К. Здатність МАСНВІ зв'язуватися з МОКТ-1 і МАСНАТ підтверджує, що ця ізоформа посилює активність каталітично активних ізоформ. Цілком ймовірно, що деякі ізоформи МАСН «

Зв мають додаткові функції. Здатність МАСНВІ зв'язуватися і з МОКТ-1, і з МАСНАТ підтверджує те, що ця ї- ізоформа повинна посилювати активність каталітично активних ізоформ. Середня цитотоксичність, що спостерігається в культурах клітин 293-ЕВМА і МСЕ7, трансфікованих цією ізоформою, і достатньо більш виражений цитотоксичний ефект, який вона виявляє в клітинах Неї! а, певно, відбиває активацію ендогенно експресованих молекул МАСНА по їх зв'язуванню з трансфікованими молекулами МАСНВІ. Як припускають, « деякі з ізоформ МАСН можуть також діяти в якості "депо-сайтів" для молекул, що втягнуті в інші, не пов'язані з с з цитотоксичністю прояви рецепторів РАБ/АРОТ1 і ТМЕ. . (9 Блокування функції МАСНА перешкоджають індукції клітинної загибелі рецепторами ЕАЗ/АРОТ1 і р55-К и?» Для оцінки внеску МАСНА в цитотоксичність, опосередковувану РГАБ/АРОЇ і р55-К, МАСНАЗ, а також нефункціональні мутанти МАСНАТ (1-415) або МАСНА ІС36051 були експресовані в клітинах, в яких індукували прояв цитотоксичності. Цитотоксичність, що індукується р55-К, включалася в клітинах 293-ЕВМА внаслідок -І переміжної надекспресії цього рецептора (|Воїдіп еї аіІ., 19958), а цитотоксичність, зумовлена ЕГАЗ/АРО1, надекспресією химерних молекул, що включають позаклітинний домен ро5б-К і трансмембранний та ве внутрішньоклітинний домени РАБ/АРО1. Ця химера мала істотно більш сильну цитотоксичну дію порівняно з с нормальним рецептором РАБ/АРО1. Цитотоксична активність в клітинах Неї! а також індукувалась обробкою їх 5о МЕ або антитілом до РАЗ/АРОТ1 в присутності циклогексиміду, що є блокатором білкового синтезу. Клітини Неї! а ю ставали сприйнятливими до РГАБ/АРО1 внаслідок переміжної експресії цього рецептора. В усіх протестованих

Ге) системах МАСНАЗ ії нефункціональні мутанти МАСНАТ1 забезпечували ефективний захист від цитотоксичності, що індукується дією РЕАБ/АРО1 або р55-К. Такий захист також виявлявся, як і раніше було описано |Нзи еї аї., 1996; СВіппаіуап еї аїЇ.,, 1996), в клітинах, трансфікованих делеційним по М-кінцевій частині мутантним ов варіантом МОКТ-1, позбавленим МАСН-зв'язувального сегменту - МОКТ-1 (92-208). Ці захисні прояви вказують на те, що МАСНА є необхідним компонентом для сигнальних каскадів з індукції клітинної загибелі за участю і

Ф) ЕАЗВ/АРО!, і рБ5Б-В. ка Білок МАСН експресований в різних тканинах на значно відмінних рівнях і, по-видимому, при значно диференційованому ізотиповому складі. Ймовірно, ці відмінності зумовлюють тканиноспецифічні параметри бо реакції на ліганд РАЗ/АРОТ1 і на ТМЕ. Як і у випадках з іншими гомологами СЕОЗ/АСЕ (Мапа еї а!., 1994; АІпеттгі еї а!І., 19951, ізоформи МАСН, які містять неповний сегмент гомології з СЕОЗЛСЕ (наприклад, МАСНАЗ), як виявлено, пригнічують активність молекул МАСНА1 або МАСНА?2, що експресуються водночас: для них також було виявлене блокування індукції клітинної загибелі факторами РАЗ/АРОТ1 і р55-К. Експресія таких інгібіторних ізоформ в клітинах може являти собою механізм клітинного самозахисту від цитотоксичності, опосередковуваної 65 ЕАЗ/АРОТ1 і ТМЕ. Широкий спектр гетерогенності ізоформ МАСН, істотно більший порівняно з будь-якими іншими протеазами сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ, повинен зумовлювати наявність більш вузьких функціональних спеціалізацій у конкретних ізоформ МАСН.

Приклад 1.

Клонування і виділення білка (1, який зв'язується з МОКТ1-зв'язним білком Меп4 (Ї) Дигібридний скринінг і дигібридний тест з експресією В-галактозидази

З використанням процедур, описаних в даному тексті вище у прикладах-посиланнях 1-3, виділили новий білок, позначений С1, який, по-видимому, гомологічний і, отже, ймовірно, є членом сімейства протеаз СЕОЗЛСЕ.

Білок 51 включає два модулі, що виявляють гомологію з модулями в складі МОКТ, а саме гомологію з

М-кінцевою частиною МОКТ-1, модулями МОКТ білків МАСН (див. описані вище приклади-посилання 1-3 і Воїдіп 70 еї аІ.,, 1996) та з модулями МОКТ іншого спорідненого МОКТ1-зв'язного білка Меп |див. Регпапаев-АІпетгі еї аІ,, 1996; Згіпімазцша еї аїЇ., 1996). Крім того, білок СІ включає каталітичний (протеазо-подібний) сегмент, який виявляється гомологічним до каталітичних (протеазних) сегментів протеаз сімейства СЕОЗ/ЛСЕ (наприклад, протеазних сегментів білків МАСН і Мена та інших).

Коротко, клон білка С ("клон (31") одержали після дигі-бридного скринінгу бібліотеки КДНК Т-клітин дигкаї /5 людини з використанням білка Мей в якості "принади". Використовувалась бібліотека КДНК Т-клітин дигкаї людини, помічена активаторним доменом САГ4; скринінг здійснювали з використанням репортерного штаму дріжджів НЕ7с (Сіопіесі, Раю А, СА, США) за відсутності З-амінотриазолу згідно з протоколом МаїсптакКегтм

Тмжо-Нубгій Зузіет Ргоїосо! (Сіопіесп). Послідовність Мсп4 взяли з бази даних ЕМВІ. Використовуючи цю виділену послідовність, затравки для ПЛР були сформовані на основі програми ОГ ІбОм, а фрагмент ДНК, який

Відповідає кодуючій частини Мепй4, був виділений з застосуванням ПЛР з ревертуванням (КТ-РСК) на матеріалі тотальної РНК, одержаної у стандартні методи з лінії первинних клітин ендотелію пупкової вени людини (НОМЕ).

Кодуючу частину Меп4 потім клонували до складу вектора рОАЮСнН (Сіопіесі) і використали в якості "принади" так, як це описано вище, для процедури дигібридного скринінгу. В ході цього дигібридного скринінгу були одержані 11 клонів: всі вони кодували білок, який, по-видимому, є сплайсинговим варіантом білка, що включає Га два мотиви гомології з МОКТ-1. Аналіз попередньої часткової послідовності 31 послідовностей бази даних "аВевзі" і бази даних геном людини (рівень 1) дозволив виявити кілька ЕЗзТ-послідовностей (неідентифіковані о мітки, що транскрибуються), які включають фрагменти послідовності "клону (31". Секвенування цих Е5Т показало, що, можливо, є серія сплайсингових варіантів білка 51, які включають послідовність, що кодує поліпептидний мотив, гомологічний ІСЕ-подібним протеазам, і що ця послідовність розташована з 3'-боку від Ге») послідовності С1, виявленої в ході дигібридного скринінгу.

Для виділення повної послідовності ізоформи 1, що включає протеазо-подібний каталітичний сегмент, с реакція зворотної транскрипції проводилась на основі тотальної РНК, виділеної з різних клітинних ліній, з юю використанням в якості затравки олігонуклеотиду, який включає мотив дТт 15 і адапторну послідовність з метою формування молекул кКДНК. Ці молекули кКДНК потім використовувались в якості матриць для ПЛР, в якій З 3з5 затравки були підібрані і синтезовані в формі олігонуклеотидів, що включають послідовність, одержану від /|ч« 5-нкодуючої частини 1, і адапторну послідовність: ці затравки використовувались в першому раунді реакції

ПЛР. Після цього в другому раунді ПЛР використовувались додаткові олігонуклеотидні затравки, які включають послідовність 5-кодуючої частини 51, включаючи старт-кодон АТО, так само як і адапторну послідовність. В « цьому випадку було можливим одержати повну послідовність передбачуваного сплайсингового варіанту білка 40. 51, що включає каталітичний (протеазо-подібний) сегмент. Він представляє всі окрім однієї з передбачуваних /-- с ізоформ 1. ц Попередньо визначена послідовність однієї такої ізо-форми 1 - сплайсингового варіанту 1 - зображена на "» Фіг.1: в ній верхня послідовність - це нуклеотидна послідовність, а нижня - розшифрована амінокислотна послідовність по ОКЕ, що починається з кодона АТО (482-й нуклеотид) і закінчується ТАА (нуклеотид 1921) - ці початковий і кінцевий нуклеотиди в наведеній нуклеотидній послідовності помічені зірочками ("). Сплайсинговий -І варіант 1, поданий на Фіг.1, також попередньо позначений як "іа".

На Фіг.2 схематично зображена попередньо визначена послідовність іншої ізоформи (31 - короткий е сплайсинговий варіант 1, що включає два "МОКТ-модулі", попередньо позначений як "з18В", - на якому верхня (9! послідовність є нуклеотидною послідовністю, а нижня - розшифрованою амінокислотною послідовністю по ОКЕ, що починається з 482-го нуклеотиду (старт-кодон АТО) і закінчується 1145-м нуклеотидом (стоп-кодон ТОА): о старт- і стоп-кодони в нуклеотидній послідовності помічені зірочками (7). (Че) Крім того, слід зазначити, що первісно виділений "С1 клон", одержаний за допомогою послідовності Мейа4, взятої в якості "принади", був принаймні частиною короткого варіанту (31, названого 518 (див. Фіг.2). Цей первісно виділений "1 клон" є частиною клону нової КкКДНК, яка, як ії МАСН (САБ5Р-8), і Меп4 (СА5БР-10), включає два загибель-доменних мотиви - МОКТ-модулі (або "загибель-ефекторні домени" ОЕБ), розташовані відразу нижче від його М-кінця (див. також Фіг.3). З використанням вихідного клону було можливим потім виділити і о охарактеризувати клони кКДНК, що відповідають більш великому сплайсинговому варіанту - СА, і більш ко короткому сплайсинговому варіанту 518. Більш великий сплайсинговий варіант включає С-кінцевий сегмент, гомологічний протеазному сегменту каспаз, і, отже, він є ймовірним новим членом сімейства каспаз. Тому 01 бо було також позначено абревіатурою САЗН, що використовується для позначення "каспазних гомологів". Було проведено порівняння послідовностей СТА (САЗНА) і 518 (СА5НВ) з послідовностями інших каспаз (для більших подробиць, особливо щодо виділення послідовності 31 миші, див. нижче, а також вище розділ опису креслень в частині коментарів до Фіг.3). Результати такого порівняння схематично подані на Фіг.3: всі подробиці, зокрема, ключ для визначення приналежності послідовностей на цій фігурі, включені в розділ 65 "Стислий опис креслень".

Після описаного вище вихідного клонування і секвенува-ния С1, зокрема його ізоформ ОА і 518, проводили подальший аналіз цих білків. (ії) Аналіз за допомогою Нозерн-блотинга і додаткове секвенування

Аналіз методом Нозерн-блотинга показав, що білок (31 існує принаймні в трьох розмірних варіантах транскриптів - 2000, 2400 і 4400 нуклеотидів, співвідношення яких в різних тканинах варіюється значною мірою (Фіг.4). Для одержання повнорозмірної КДНК білка 1 (САЗН), для скринінгу використовували бібліотеку КДНК фібробластів шкіри людини (Сіопіесі) з зондом у вигляді КДНК, що відповідає послідовності (31. Були виявлені два типи кДНК, які відповідають двом сплайсинговим варіантам 1 (також див. вище). Білки, що кодуються цими

КДНК, мають спільну М-кінцеву ділянку, що включає "загибель-ефекторний домен", однак їх С-кінцеві ділянки 7/0 розрізнялися. Один з них (БС18-САЗНВ) має короткий С-кінець, який відповідає тому, що є в складі вихідної клонованої кКДНК. Інший варіант (ЗІА-САЗНА) мав довгий С-кінець.

Амінокислотна послідовність цього довгого С-кінцевого сегменту СТА показала достатньо високий рівень гомології з таким у сегментах в складі МАСН (САБР-8) і Месп4 (САБР-10), що є попередніми для протеазних доменів (Фіг.3). Однак СТА втратив деякі амінокислоти, що вважаються критичними для протеазної активності: /5 Че підтверджує те, що цей білок може бути позбавлений активності цистеїнової протеази. Вважається цікавим, що СТА включає каспазо-субстратну послідовність в сайті, який відповідає сайту протеолітичного процесингу в складі протеазного сегменту МАСН (САБР-8). | Месп4 (САБР-10) (затінені на Фіг.3). Попередні дані підтверджують, що С1А дійсно може бути розщеплений по цьому сайту за участю МАСН (дані не показані).

Грунтуючись на нуклеотидній послідовності клону Е5Т, для якої була виявлена відповідність гомологу миші в го частини ділянки "загибель-домену" (0ЕО) в складі 21, кКДНК обох сплайсингових варіантів миші - САЗНА і

САЗНВ - були клоновані з бібліотеки мРНК клітин печінки миші з застосуванням ПЛР з ревертуванням. Клон ЕЗТ (депозитарний МоАА198928 бази даних СепВапкК) був ідентифікований, як гомолог миші відносно до частини сегменту ОЕО з складу 51. Грунтуючись на цій послідовності, сплайсингові варіанти СТА (САЗНА) і 18 (САЗНВ) миші були клоновані з бібліотеки мРНК клітин печінки з застосуванням ПЛР з ревертуванням. Реакція сч ов Зворотної транскриптази проводилась з використанням олігодезокситимідинової адапторної затравки 5-САСТСОАСТСТАСАСТСОАС-(Т) 17-3 і зворотної транскриптази АММ (Рготеда), використовуючи і) рекомендації виробників. Перший раунд ПЛР здійснили з використанням Ехрапа Гопд Тетріаїе РСК бувіет (Воепгіпдег Маппйпеїійт) і таких смислової і анти-смислової затравок: 5-СОСТСТООТООТТСССАСАСС-3 і 5-САСТООАСТСТАСАСТОСОАС-3 (адаптер), відповідно. Другий раунд проводили з використанням полімерази Ге! зо Меп (МЕВ) і смислової "концентрованої" затравки 5-ТОСТСТТОСТОТОТАСАСАТО-З і адаптеру.

Порівняння послідовностей показало високий рівень консерватизму по довжині молекули СТА (САЗНА (7190 с ідентичності по сегменту ОБО і 5995 по сегменту протеазної гомології): це підтверджує, що і домен ОБО, Її ду сегмент протеазної гомології цього білка істотні по визначенню його функцій (див. Фіг.3). (ії) Дигібридний аналіз специфічності зв'язування ізоформ 1 «

Дигібридний аналіз параметрів взаємодії варіантів СТА (САЗНА) і С1В8 (САЗНВ) (Фіг.5) показав, що обидва ці ї- варіанти взаємодіють з МОКТ-1/РАБО і МАСН (СА5Р-8), найбільш ймовірно опосередковано через їх спільний домен ОЕО. Хоча первісно клоновані за допомогою дигібридного скринінгу білки, зв'язуються з Меп4 (САБР-10), 18 (СА5РВ) , було виявлено, що в цьому тесті зв'язок з Меп4 (САБР-10) виявився неміцним, а також СТА (САЗНА), також неміцно зв'язувався з Меп4. Однак слід зазначити, що вихідний дигібридний скринінг привів до «

Клонування білків 1, які відрізняються за специфічністю їх зв'язування при дигібридному скринінгу: отже, з с насправді можна припустити, що і СТА, і 51В зв'язуються з МАСН і Меп так само, як це показало і вихідне . клонування. Два варіанти 01 також виявляють самозв'язуваність і зв'язуються один з одним, але при цьому не и? зв'язуються з КІР або ТКАЮО (адапторні білки, які, подібно до МОКТ-1/ЕАОО, включають "загибель-домени", але позбавлені ОЕЮО) і не зв'язуються з рядом не стосовних до справи білків (наприклад, з ламіном), які Використовувались в якості специфічного контролю. -І Для подальшого аналізу функцій (31 два його варіанти експресували по переміжному типу в клітинах Неї а і 293-Т, і в них проводили оцінку впливу трансфікованих білків на сигнальний механізм, що індукується р55-К ве (СО120а) і втягнутий в прояв цитотоксичності, що включається участю ТМЕ або надекспресією цього рецептора, с так само як на сигнальний механізм, що індукується ГЕАБ-К (СО95) і втягнутий в прояв цитотоксичності, що 5р Включається антитілом, яке перехресно зв'язуються з ГА5-К, або надекспресією химерного рецептора, що ю включає позаклітинний домен р55-К (СО120а) і внутрішньоклітинний домен БАБ-К (СО95) (див. Фіг.б). В обох

Ге) клітинних лініях експресія 518 (САЗНВ) сама по собі не впливає на життєздатність клітин, але значною сірою пригнічує індукцію клітинної загибелі за участю рбо5-К (СО120а), а також рецептором ГАБ-К (СО95). Експресія варіанту СТА (САБНА) впливає на дві тестовані клітинні лінії значною мірою неоднаково. В клітинах Нег а він інгібує цитотоксичний вплив р55-К (СО120а) і ЕАБ-К (С0О95), схожу з такою у С1В (САЗНВ). Однак, в клітинах 293-- він зумовлює істотну цитотоксичність. Схожа цитотоксичність була виявлена тоді, коли білок СТА

Ф) експресували в клітинах 293-ЕВМА (не показано). Цей цитотоксичний ефект міг бути повністю заблокований ка шляхом ко-експресії р35 - інгібітору каспаз, похідного від бакуловірусів, про р35 |див. також Сіет еї аї., 1991;

Хце 5 Ногміїг, 19951). во Для оцінки внеску ділянки протеазної гомології в складі СТА (САБНА) в згубний для клітин ефект, що справляється ним, досліджували функції двох мутантних варіантів цього білка. Ці мутанти такі: (зЗИСАЗНА(1-385) ї СИСАЗНА(1-408) - тобто вони мають С-кінцеві делеції в сегменті, що відповідає частині протеазного домену, від якого є похідною мала субодиниця зрілої протеази. Обидва мутанти не справляли якогось цитотоксичного ефекту. Більше того, як і 518 (САЗНВ), вони захищали клітини лінії 293 від індукції загибелі рецепторами в рЗО-К (СО120а) і РАБ-К (СО95) (Фіг.6С і 60).

Слід зазначити, що для проведення описаних вище процедур використовувались такі методи і матеріали:

(1) Делеційні мутанти СТА (САЗНА) і химера р5о55-К/РАБ-К (СО120а/С095) були одержані за допомогою методу ПЛР і (або) стандартного клонування. Сплайсингові варіанти 1 (САЗН), білки сигнального каскаду

ЕАБ-К (СО095) і рб55-К (СО120а) (всі походять з тканин людини) і бакуловірусний білок рЗ35 були експресовані в клітинах ссавців з використанням експресувального вектора рсОМАЗ (Іпийгодеп). В-Галактозидазу експресували з використанням вектора РСММУ-В-СА1 (Рготеда). (2) Клітини ембріональної нирки людини 293-Т і 293-ЕВМА і клітини карциноми шийки матки людини Неї а (Не а-РАБ: клон НІНА-1), які стабільно експресують трансфікований РА5Б-К (СО95) людини (розроблені в лабораторії заявників), вирощували в модифікованому за Дальбекко мінімальному середовищі Ігла з доданням 70 1090 плодової телячої сироватки, замінних амінокислот, 10бод./мл пеніциліну та 100мг/мл стрептоміцину.

Описані вище результати показують, що білок (31 може взаємодіяти з компонентами сигнальних комплексів роб-К і РГАБ-К і що він пригнічує індукцію загибелі по такому шляху, який може бути різним залежно від типу сплайсингового варіанту 1 і від типу клітин, в якому він експресується.

Пригнічення варіантом С18 індукції цитотоксичності, а у випадку з клітинами Нега - також і варіантом СТА, 7/5 по-видимому, опосередковується сегментом "загибель-домену" (ОЕО) цього білка. Це, можливо, відбиває наявність конкуренції ОЕО в складі С1 з відповідними сегментами в складі МАСН (САБР-8) і Мена (САБР-10) по зв'язуванню з МОКТ-1/єА0О.

З точки зору шляху, по якому САБНА зумовлює загибель клітин 293, здатність білка р35 блокувати цитотоксичний ефект визначає, що цитотоксичність опосередковується активністю каспаз. Однак, СА, навіть при прояві істотної гомології з послідовностями каспаз, дійсно може втрачати цистеїно-протеазну активність через те, що в його складі відсутні кілька консервативних для каспази амінокислот в складі активного сайта.

Таким чином, СТА може діяти шляхом активування інших молекул, що мають каспазну активність.

Інша можливість пов'язана з тим, що С1А, хоча і не здатний сам діяти в якості протеази, може, проте, складати частину активної протеазної молекули. Кристалографічний аналіз структури САБР-1 і САБР-3 вказує на сч об те, що мала і більша субодиниці протеази в складі кожного процесованого ферменту є похідними від різних про-ферментних молекул-попередників (МУаїЇКег еї аї., 1994; МУйївоп еї аїЇ., 1994; МІН еї аїЇ., 1997; Кофопда еї (8) аі!., 1996). В зв'язку з виявленою залежністю цитотоксичної активності СТА від інтактності сегменту, що відповідає малій субодиниці протеази (Фіг.6С) , може бути таке, що даний сегмент в складі СТА (САЗНА) здатний зв'язуватися з великою субодиницею деяких каспаз (каспази) по такому шляху, що в результаті веде до б зо перебудови каталітично активної молекули. Активний гетеро-тетрамер, що утворюється в результаті, повинен в подальшому бути здатним активувати інші каспази, таким чином включаючи механізм клітинної загибелі. с

Далі, також було встановлено (результати не показані), що білок 51 має, принаймні, певний рівень ю гомології з іншим білком, названим МУЮО88, який втягнутий в сигнальний механізм, опосередковуваний інтерлейкіном-ї. Таким чином, білок (31 також може бути втягнутий в інші механізми, які « ініціюються/опосередковуються іншими цитокінами. ї-

З точки зору сказаного вище щодо клонування і виділення білка (31 (принаймні, двох його ізоформ), відзначаються такі характеристики і можливості використання 1: (1) Білок 21 клонували із застосуванням дигібридного скринінгу у вигляді молекули, що зв'язується з

МОКТІ-зв'язним білком Мена і, отже, можливою є його участь в модулюванні активності білків Месп4 і МОКТ-1: « відповідно, по визначеним вище механізмам, білок (31 очевидно втягнутий в модулювання клітинних процесів, з с що ініціюються рецепторами ЕА5-К і р55-К. Оскільки Меп здатний зв'язуватися з МОКТ-1 і прямо бере участь в . прояві цитотоксичності та, врешті-решт, індукції загибелі клітин і оскільки деякі ізоформи Мей4 відомі як и?» інгібітори клітинної загибелі, відзначається, що білок С1, включаючи його різні ізоформи, може бути прямо або опосередковано втягнутий і в прояв цитотоксичності і клітинної загибелі, та, однаково, у пригнічення загибелі

КЛІТИН. -І (2) Очевидно, що білок 51 характеризується М-кінцем, що включає два "МОКТ-модулі", гомологічні двом "МОКТ-модулям" в складі МАСН (див. описані вище приклади-посилання 1-3) і Меп4. Присутність цих пи "МОКкТ-модулів" у складі 21 свідчить, таким чином, про його здатність зв'язуватися з Мей4, а також, можливо, с про зв'язування С1 (або принаймні деяких з його ізоформ) з МАСН (або деякими його ізоформами), так само як і 5о З МОКТ-1 прямо. Відповідно, 51 може бути здатним модулювати активність МОКТ-1 (і, в свою чергу, активність ю рецепторів ГА5Б-К і р55-К) прямо, шляхом прямого зв'язування з МОКТ-1, або ж непрямо шляхом зв'язування з

Ге) Мена і (або) з МАСН, які, в свою чергу, відомі завдяки своїй здатності зв'язуватися з МОКТ-1. (3) Аналіз послідовності 01 по описаним вище базам даних і їх скринінг показав, що ген, який кодує білок

О1, очевидно локалізований в безпосередній близькості від локусів Мсп4 і МАСН на хромосомі 2 людини: це дв визначає тісну спорідненість між генами, які кодують вої ці білки також і на хромосомному рівні. (4) Принаймні деякі з ізоформ (31 (наприклад, ізоформа Сіої - показана на Фіг.1) включає сегмент, (Ф) розташований нижче від "МОКТ-модулів", що виявляє схожість з каталітичною, тобто протеазною ділянкою ка МАСН і Мена, а оскільки це так, білок 51 може бути членом протеазного сімейства СЕЮОЗ/ЛСЕ. (5) Присутність протеазо-подібного сегменту, принаймні, в деяких ізоформах білка 31 (наприклад, СТА) бо визначає, що 51 або такі його ізоформи можуть бути прямо втягнуті в прояв цитотоксичності і запальні процеси, що зумовлюються різними стимулами, включаючи рецептори з сімейства рецепторів ТМЕ/МОЕ (наприклад,

ЕАЗ-К і р55-К) та іншими факторами, що діють прямо або непрямо опосередковано через активність клітинних протеаз по індукції цитотоксичності і запалення. (6) Білок С1 може діяти як підсилювач або зумовлювач активності інших білків, таких як, наприклад, білки 65 МАСН ї Мена (включаючи різні їх ізоформи), в об'ємі внутрішньоклітинних механізмів, що забезпечують прояв цитотоксичності, розвитку запального процесу і інших близьких ефектів, що опосередковуються рецепторами з сімейства рецепторів ТМЕ/МОЕ та іншими факторами, що мають спільні внутрішньоклітинні ефектори.

Посилюючий або зумовлюючий ефект білка (31 (або принаймні деяких з його ізоформ) може визначати його зв'язування з такими іншими білками (за типом зв'язування, що зазначалося вище, 01 з Мей. і також можливого зв'язування з білками МАСН і МОКТ-1), завдяки цьому забезпечуючи його зв'язування з МОКТ-1 (включаючи самозв'язування МОКТ-1) або його дію незалежно від МОКТ-1. (7) Білок 51 також може діяти в якості інгібітору активності інших білків, і це може стати шляхом входження 51 частиною в комплекс інших білків, з яким він зв'язується (наприклад, Мепй4 і, можливо, також

МАСН і МОКТ-1), завдяки цьому порушуючи їх цитотоксичний ефект до ступеня, характерного для пригнічення 70 такої активності. Далі, в аналогічний спосіб, як було описано вище для деяких ізоформ МАСН, так само як і деяких ізоформ Месп4, також можуть існувати ізоформи білка С1, які специфічно виявляють |інгібіторну активність. Однією такою ізоформою (01 може бути ізоформа С18, показана на Фіг.2, що включає два "МОКкТ-модулі", але позбавлена чіткого протеазо-подібного сегменту, схожого з такими у інших відомих протеаз.

Закінчивши повний опис цього винаходу, повинно стати ясним фахівцям у цій галузі техніки, що те ж саме /5 Може бути здійснено для широкого кола еквівалентних параметрів, концентрацій і умов без будь-якого відходу від духу і масштабу цього винаходу і без незапланованих експериментів.

Оскільки цей винахід був описаний у зв'язку з його специфічними варіантами, повинно бути зрозуміло, що він припускає його подальші модифікації. Дана заявка має охопити будь-які варіації, використання або втілення цього винаходу, в основному додержуючись принципів цього винаходу і включаючи такі відхилення від даного 2о подання, які знаходяться в рамках відомої або звичної практики даної галузі техніки, до якої належить винахід, і які можуть застосовуватись по суті згідно з широтою поданої нижче формули винаходу.

Всі матеріали, що цитувалися в даному тексті, включаючи журнальні статті і тези, опубліковані або відповідні американські чи іноземні заявки, видані американські або зарубіжні патенти включені до цієї заявки в якості посилань, що включають всі дані, таблиці, фігури і текст, наявні в публікаціях, що цитуються. Крім сч об того, повний зміст посилань, що цитувалися в межах цитованих робіт, також повністю включений до бібліографічного переліку. і)

Посилання на відомі методичні етапи, стандартні методичні етапи, відомі методи і стандартні методи ніяким чином не говорять про те, що будь-який аспект, що заявляється, опис і варіант цього винаходу вже був заявлений, поданий або підтриманий у цій галузі техніки. б зо Опис специфічних варіантів, що передує, мав настільки повно викласти основний зміст цього винаходу, щоб будь-хто міг, використовуючи знання у цій галузі техніки (включаючи інформацію, яка міститься в посиланнях), с легко модифікувати і (або) адаптувати його для різних типів застосування таких специфічних варіантів без ю незапланованих експериментів і без відхилення від базової концепції цього винаходу. Таким чином, такі адаптації й модифікації вважаються такими, що перебувають в межах суті і діапазону еквівалентів варіантів, що « з5 заявляються, основаних на наведених тут керівництвах і описах. Повинно бути зрозуміло, що фразеологія або ча термінологія даного тексту вжита з метою описання, але не якогось обмеження, тобто така термінологія або фразеологія даної специфікації повинна інтерпретуватись фахівцями в світлі наведених тут описів, що пояснюють і скеровують, в поєднанні з знаннями, якими володіє фахівець у цій галузі техніки.

Посилання «

Аптадсд, М. еї аї., (1997) Сапсег Кезеагсі 57, 615-620. з с АІпеттгі. Е.5. еї аї., (1995) 3). Віої. Спет. 270:4312-4317. . Вагіпада. М. (1993) Зсіепсе 262:1512-1514. и? Веїаїег, у. еї аї., (1995) 9. Вісі. Спет. 270:16526-16528.

Вегоег. У. еї аі., (1988) Сепе 66:1-10.

Вешйег, В. апа Сегаті, С (1987) МЕОМ: 316:379-385. -І Відда, 4. еї а!., (1994) 3. Ехр. Мед. 180:445-460.

Воїадіп, М.Р. еї а!., (1995а) у. Віої. Спет. 270:337-341. о Воїдіп, М.Р. еї а/ї., (19955) 9. Вісі. Спет. 270:7795-7798. с Воїдіп, М.Р. еї а/ї., (1996) Сеї! 85:803-815.

ВгаКкеризси, С. еї а. (1992) ЕМВО )3., 11:943-950. де ВгосКпацв, М. еї аї., (1990) Ргос. Май. Асайд. беї. ОБА, 87:3127-3131.

Ге) Сапіог, О.Н. еї аї., (1993) Ргос. Маїй|. Асад. бЗеї. ОБА 90:10932-6.

Сеїтеїї, О.Р. еї аї., (1992) Зсіепсе 256:97-100.

Спеп, С. у. ег аі., (1992) Апп. М. У. Асай. Зеї. 660:271-3.

СПіппаїуап еї а/ї., (1995) СеїЇ 81:505-512.

СПіппаїуап еї а/., (1996) 9. Вісі. Спет. 271:4961-4965. (Ф, Сіюопе, М. 0. еї аї., (1995) ЕМВО 3). 14:5859-5868. ка Сіет, МК... еї аї., (1991) Зсіепсе 254, 1388-1390.

Сіетепі, М.М. еї а!., (1994) 3. Ехр. Мед. 180:557-567. во Стівеї|, Р. еї аі., (1993) Мисіевїс Асіаз Кезв. (Епдіапа). 21 (22):5251-5.

Ситепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшіаг Віоіоду (А!йвиреї, Е.М., Вгепі, К., Кіповіоп, К.Е., Мооге, О0.О., Зеїдтап,

У.0., Зтій, У. А., БігийІ, К., АїІргідні, Г.М., Соеп, О.М. 5 Маїгкі, А., едв.), (1994) рр.8.1.1-8.1.6 апа 16.7-16.7.8,

Сгеепе Рибіїзпіпуд Авзосіа(ев, Іпс. апа УМіеу 5 Бопв, Іпс., Мем Могк.

ОігКкв, МУ., еї аї., (1993) Сепе 128:247-249. 65 Оиап, Н. апа біхії, М. М. (1997) Майшге 385. 86-89.

Бипее, Т. еї а!., (1993) Сепез Юеу. 7-555-569.

Еївспеп, СМ. еї аї., (1994) 9. Іттипої. 153:1947-1954.

Еїїв. Н.М. еї аї., (1986) СеїІ 44:817-829.

Епагі, М. еї аї., (1995) Майшге 325:78-81.

Епдеїтапп. Н. еї аї., (1990) 9. Віої. Спет., 265:1531-1536.

Еашйспеи, С. еї а!., (1995) ЕМВО .. 14:1914-1922.

ЕРегпападез-АІпетіі, Т. еї аї., (1994) 9. Вісі. Спет. 269:30761-30764.

ЕРегпападез-АІпетіі, Т. еї аі!., (1995) Сапсег Кев. 55:2737-2742.

ЕРегпападез-АІпетіі, Т. еї а!., (1996) Ргос. Маї)!. Асад. Зеї. ОБА 93:7464-7469. 70 Рід, у. еї а!., (1988) Мої. Сеї| Віої!. 8:2159-2165.

Рівідв, 5. апа опо, 0. (1989) Майшиге, 340:245-246.

Егапдіопі, У.М. апа Мее!, В.О. (1993) Апаї. Віоспет. 210:179-187.

Сеузеп, Н.М. (1985) Іттипої. Тодау 65:364-369.

Сеузеп, Н.М. еї а!., (1987) 9. Іттипої. Мей. 102:259-274. боззеп, М. апа Воціага, Н. (1992) Ргос. Май). Асад. беї. ОБА, 89:5547-5551.

Огеї, М. еї аї., (1994) Єиг. 9. Іттипої. 24:2563-2566.

Неїег, К.А. еї аї. (1990) Ргос. Маї!. Асад. Зеї. ОА, 82:6151-6155.

Непкагі, Р. А. (1996) Іттипку 4:195-201.

Ноптапп, Н.-Р. еї а/!., (1989) ). Вісі. Спет., 264:14927-14934.

Номага, А.О. еї а/ї., (1991) 9. Іттипої. 147:2964-2969.

Нзи, Н. еї аї., (1995) СеїІ 81:495-504.

Нзи, Н. еї аї., (1996) СеїІ 84:299-308.

МОН, М. еї аї., (1991) Сеї! 66:233.

ПОН, М. апа Мадаїа, 5. (1993) 3. Вісі. Снет. 268:10932-7. с

Чозери, 5. апа Вигке, -).М. (1993) 9. Віої. Спет. 268:24515-8.

Катепз, .. еї аї., (1995) 3. Вісі. Спет. 270:15250-15256. о

Каштапп, 5.Н. (1989) Сапсег Кев. 49:5870-5878.

Каштапп, 5.Н. (1993) Сапсег Кев. 53:3976-3985.

Ківзспкеї!, Р.С. еї аї., (1995) ЕМВО 3. 14:5579-5588. б зо Коі?2иті, М. еї а/!., (1993) ВіоІ. Рпагт. Виї! (дарап) 16 (9):879-83.

Киптаг, 5. еї аі., (1994) Сепез ЮОеу. 8:1613-1626. с

Киптаг, 5. (1995) Тгепаз Віоспет з5еї. 20:198-202. ю

Ї агерпік, М.А. еї а!., (1994) Майте 371:346-347.

Ї ейпацзег, РЕ. еї аї., (1993) І аб Іпмевзі. 69:415-429. «

Ї овівзсНег, Н. еї аї., (1990) Сеїї, 61:351-359. ї-

Ї ов, М. еї аї., (1995) Майшге 375:81-83.

Магій, 5.3. еї а!., (1995) 9. Вісі. Спет. 270:6425-6428.

Мазпіта, Т. еї а!., (1995) Віоспет. Віорпувз. Кев. Соігапип. 209:907-915.

МіШег, В.Е. еї аї., (1995) 9. Іттипої. 154:1331-1338. «

Міїїдап. С.Е. еї аї., (1995) Мешгоп 15:385-393. з с МІНІ, Р.К.Е, еї аї., (1997) 9. ВіоЇ. Спет. 272:6539-6547. . Місга, М. еї аї., (1995) Ргос. Маїй!. Асад. беї. ОБА 92:8318-8322. а Мипаау, М.А. еї аї., (1995) 9. Вісі. Снпет. 270:15870-15876.

Мигапізпії, 5. еї аї., (1991) Рпагт. Кезеагсі 8:649.

Ми?іо, М. еї а/!., (1996) Сеї| 8, 817-827. -І Мадаїа, 5. апа Соівіеїп, Р. (1995) 5сіепсе 267, 1449-1456.

Міспоїзоп, ЮО.МУ. еї а!., (1995) Маїшге 376:37-43. ве Морпаг, У. еї аї!., (1990) ЕМВО )3., 9:3269-3278. с Рідчсеї, Р.Р. еї аї., (1987) 9. Ехр. Меа., 166:1280-89.

Кау еї а. (1992) СеїІ 69:597-604. де Коюгпава, .). еї аі!., (1996) Маї-Бігисі-Віо!. 3, 619-25.

Ге) Киддіего, М. еї аї., (1987) СеїЇ Іттипої. 107:317-325. зЗатбгооК еї аї., (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїгу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагрог 20 І арогаїогу Ргезв,

Соа 5ргіпд Нагрог, МУ. 5Б зсепаї, Т.. еї аї., (1990) СеїІ, 61:361-370.

Зспіедеї, еї а!., (1996) 9. Вісі. Спет. 271:1841-1844.

Ф) Зспці2е-Овіної, К. еї аї!., (1994) ЕМВО 4). 13:4587-4596. ка Зпітауата, Т. еї а/ї., (1993) Мисівїс Асідз Зутр. Зег. 29:177-8

Зпоге, 5.К. еї аї., (1993) Опсодепе 8:3183-8. 60 Зіеайй, Р.М. еї аї., (1990) 3. Віої. Спет. 265:14526-14528.

Зтік, СА. еї аї., (1990) Зсіепсе, 248:1019-1023.

Зопа, Н.У. еї аї., (1994) 3). Віої. Спет. 269:22492-22495.

Згіпімазціа, 5.М. еї аї., (1996) Ргос. Маїй!. Асад. Зеї. ОБА 93:14486-14491.

Зіаподег, В.7. еї аї., (1995) СеїІ 81: 513-523. 65 Тападіїа, Г.А. еї аї., (1993) СеїЇ, 24:845-853.

Темагїі, М. еї аї., (1995) 9. ВіоЇ. Спет. 270:3255-3260.

Теумаїі, М. еї аї., (1995а) 9. Вісі. Спет. 270:18738-18741.

Теумагі. М. еї аї., (19956в) Сеї! 81: 1-20.

Трогпрегту, М.А. еї а!., (1992) Майте 356:768-774.

Трогпрегту, М.А. еї аї., (1994) Віоспетівігу 33:3934-3940.

Тгасеу, У.Т. еї аї., (1987) Макиге, 330:662-664.

Мап Спіекіпде, МУ. еї аї., (1996) 9. Вісі. Спет. 271, 27245-8.

Мападепарбееге, Р. еї а!., (1995) Тгепавз Сеї| Віої. 5:392-400.

Мазгзаїі, Р. (1992) Апп. Кему. Іттипої. 10:411-452. 70 Міпсепі, С. апа Оіхії, М.М. (1997) 9.8.0. 272, 6578-6583. уУмаїкег, М.Р. еї а/ї., (1994) Сеї! 78, 343-352.

УмаїІаси, 0. (1984) 9. Іттипої. 132:2464-9.

Умаїасни, 0. (1986) Іп: ІпЇепегоп 7 (Іоп Огеззег, ед.), рр.83-122, Асадетіс Ргезв, І опдоп.

УмУаїасни, 0. еї аї., (1994) СуюкКіпе 6:556.

Умапа, Г. еї аї., (1994) Сеї! 78:739-750.

УУагапаре-Гикипада, К. еї аї., (1992) Майшиге, 356:314-317.

УУагапабе, Р.К. еї аї., (1992) 9. Іттипої. 148:1274-1279.

Уеїйїгеп, М. еї а!., (1980) 9. Іттипої. 125:719-724.

УЛКв, А.Р. еї аї., (1989) Ргос. Май. Асаа. Зеї. ОБА, 86:1603-1607.

УМівоп, К.Р. еї аї., (1994) Майшге 370, 270-5. опа еї а!., (1994) У). Іттипої. 152:1751-1755.

Хие, 0. еї аї., (1995) Майшге 377:248-251.

Хопенага, 5. еї аі!., (1989) 3. Ехр. Меа. 169:1747-1756. чУчап, у. еї а!., (1993) СеїІ 75:641-652. с 7асснагіа, 5. еї аї., (1991) Еиг. 93. Рпагтасої. 203:353-357. 2пао, 9.3. апа Ріск, І. (1993) Майте (Епдіапа) 365:448-51. і)

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

(1) ЗАГАЛЬНА ІНФОРМАЦІЯ () ЗАЯВНИК: б зо (А) ІМ'Я: Хеда Кезеагсі 5 Оемеіортепі Со. | (а. (В) ВУЛИЦЯ: УУеігтапп Іпзійше ої 5сіепсе с (С) МІСТО: Р.О. Вох 95 ю (0) ШТАТ: Кепомої (Є) КРАЇНА: Ізраїль « (Р) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 76100 ча (б) ТЕЛЕФОН: (972-8) 934-4093 (Н) ФАКС: (972-8) 947-0739 (А) ІМ'Я: УМаїїасп, Юаміа (В) ВУЛИЦЯ: 24 Вогоспом зіг. « (С) МІСТО: Кепомої з с (Е) КРАЇНА: Ізраїль

Й (Р) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 7 6406 и?» (А) ІМ'Я: Соїівем, Мига (В) ВУЛИЦЯ: У/еі2тапп Іпвійше ої Зсіепсе, Веїї Сіоге (С) МІСТО: Кепомої -І (Е) КРАЇНА: Ізраїль (РЕ) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 76100 ве (А) ІМ'Я: Комаїепко, Апагеї с (В) ВУЛИЦЯ: У/еі2тапп Іпвійше ої Зсіепсе, Веїї Сіоге (С) МІСТО: Кепомої ю (Є) КРАЇНА: Ізраїль

Ге (Р) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 76100 (А) ІМ'Я: МапоЇотеем, Еидепе (В) ВУЛИЦЯ: У/еі2тапп Іпвійше ої Зсіепсе, Веїї Сіоге (С) МІСТО: Кепомої (Е) КРАЇНА: Ізраїль (Ф, (Р) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 76100 ка (А) ІМ'Я: Вгодіапекі, Мадіт (В) ВУЛИЦЯ: Кеспом Нама І цізКу 10/12 во (С) МІСТО: Кепомої (Е) КРАЇНА: Ізраїль (Р) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 76251 (її НАЗВА ВИНАХОДУ: САЗН (гомолог каспази) з "загибель-ефекторним" доменом, модулятори функцій

ЕАЗ-рецепторів 65 (КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 4 (м) ФОРМА, ПРИДАТНА ДЛЯ КОМП'ЮТЕРА

(А) ТИП ЗВ'ЯЗКУ: дискета (В) КОМП'ЮТЕР: ІВМ-сумісний (С) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: РО-БО5/М5-005 (0) ПРОГРАМА: Раїепіїп Кеїеазе 241.0, Мегвіоп 21.30 (ЕРО) (м) ПОТОЧНІ ПАРАМЕТРИ ЗАЯВКИ

НОМЕР ЗАЯВКИ: І РСТ/ЛІ 98/00098 (мії) ДАНІ ПРІОРИТЕТУ ЗАЯВКИ (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: І. 120367 70 (В) ДАТА ПОДАЧІ: З березня 1997р. (мії) ДАНІ ПРІОРИТЕТУ ЗАЯВКИ (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: І. 120759 (В) ДАТА ПОДАЧІ: 1 травня 1997р. (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО 1 () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (А) ДОВЖИНА: 2243 пари нуклеотидів (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) ЧИСЛО НИТОК: одноланцюжкова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО 1 с (8) (22) сч

ІС) « і - « ші с з -І щ» 1 з 50 3е)

Ф) іме) 60 б5

ССАСОТССАС ОСАТТАСААТ СОСбАААССА АБССАТАБСА ТСАдДАСЗОоСо АбСТТоСАСС во

СТСАСССАСО АОТСТСААСТ ААААСбОАСТІ СССОБАОСТА СоСоТОбббА СТССОССТСА 120 й САСЬСТОАСТ оССоОсСтТАТТ СОАСТТТІТОТ ССАСТОАСАС СТСАСАСААС ААОБАССАСо 180

СОАССАССТо ТАССАСАСАА ОСБССбСоАА САССОАТСОС ССАбСАССАА СбТоСоСТТеС 240 70 дОобСТТТСоС ТТТСстТтТоСс ТОСАТСТТоО ОТОСОССТТС ССбОСОТСТА СООБАСССАд 300 бОСТСАССТо ССАССОбСАС САСАСТССОС ССОССАСАбС АССААСТОСС ССАСТОСААА 360 /5 ОСАТТСТОАА АОДААТОААС ТСАОСССТСА САААТОААСТ ТоАСТОоССТОо СстТоОСТТТос 420

ТОТТОАСТОб СССОбАбСТО ТАСТОСААСА СОСТІоТолЛо СТТСССТАСТ СТААСАСТАо 480

САТОТСТОСТ ОААСТСАТОС АТСАССТТОА АСААССАСТТ САТАСАСАТО АСААССАбАТ 540 7 бСТоСТоТТтТ ТТоТОоССобо АТСТТОСТАТ АСАТСТОСТТ ССАССТААТО ТСАСОСАССТ 690

ТСТОбБАТАТТІ ТТАСООБАЛА САОСТААССТ ОТСТОоТСооб БАСТТООСТО ДАСТОСТСТА 6 29 САБАСТОАОС СОАТТТБАСС ТОСТСАААСО ТАТСТТОААС АТОБАСАСАА АдДОоСстТОоТовА 129 о

БАСССАССТО СТСАССААСС СТСАССТІСТ ТТСООАСТАТ АБАСТОСТСА ТОССАбАСАТ тво зо ТОБТБАБОАТ ТТОСАТААЛАТ СТОАТОТОТС СТСАТТААТТ ТТССТСАТОА АбСАТТАСАТ 849 ій соосссАсос ААСАТААССА АББАСАДСАС ТТТСТТОбБАС СТТОТОСТТо АСТТОБАБАА 300 ю

АСТАДАТТТО СТТСССССА АТСААСТОСА ТТТАТТАСАА АААТОССТАА АСЛАСАТОССА 960 З 7 САОААТАСАС СТОДАСАСАА АДАТССАСАА ОТАСААССАС ТСТОТТСААб САбСАССОпдС 1020 М

ААЛОТТАСАбОС ААТСТІСТСС ААССАССААТ ССААААСАОТ СТСААСОАТС СТТСАААТАд 1080 « с 40 СтТтСАСОСТО САТААТОСОСА СААСТАЛАСА АСАДАСАСТТІ ААСОСААСАСС ТТбОоСОСТСА 1140 не з» АСАВСААССА СТОААСАЛАТ ССАТТСАССА: АТСАСААССТ ТТТТІОССТо АСБАССАТАСС 1200

ТОААСАСАСА ТАСААСАТОА АСВОСААбСС ССТАБСААТС ТОССТОАТАА ТОСАТТОСАТ 1260

В ТООСААТОАб АСАСАССТТС ТТОСАБАСАС СТТСАСТТСС СТООССТАТС ААСТССАСЛА 1320 с АТТСТТОСАТ СТСАСТАТОС АТОСТАТАТС ССАСАТТСТІ БОССААТТТОо ССТОТАТОСС 1380 зо ССАССАСССА САСТАССОАСА ОСТІТОоТОоТОо ТОТОСТОбТо АоСССАбодо бСТОССАСВо 1440 т ТСТОТАТОСТ ОТОбАТСАСА СТСАСТСАбО бСТОССССТО САТСАСАТСА СОАОбАТОТІ 1509

Ф) ко 60 бо -АВ-

САТОСОАСАТ ТСАТОСОСТТ АТСТАССАОО СААОССАДАС АТОТТІТТТТА ТТСАСААСТА 1550

ТОТООТОТСА БАСБОССАСС ТОСАСААСАб САОССТОСТТО САСОТОобАТО ООССАСБССАТ 1520

ОААСААТОТО СААТТСААОС СТСАБААОСО АбООСТОоТОоС АСАОСТТСАСС бАбААССТОд 1580

СТТСТТСтТОб АОССТОТОТА СТОСОБАСАТ СТОССТОСТо САБСАСТСТС АСАОСТСАСС 1740 70 ОтТСССтТОТАС СТОСАСТОСС ТСТСССАБАА АСТСАСАСАА САААБААДАС ОСССАСТОСТ 1500

ССАТСТТСАС АТТОААСТСА АТОССТАСАТ СТАТОАТТОС ААСАбСАСАС ТТТСтТОССАА 195860 75 ББАСАААТАТ ТАТОоТСТоОС ТССАССАСАС ТСТОАСАДАС АААСТТАТСС ТСТОСТАСАС 1920

АТААСАААСС ААААСОоСТоОС ССоТАСТоОС ТСАСАССТОТ ААТСССАССА СТТТООБАСо 1980

ССААОСАбоо САСАТСАСТТ САбСТСАССА ПТТСБАБАСС АОССТООССА ДСАТОСТАААд 2040

СОСТОТСССТ АСТАААААТО СААДАААТТАС СстосбоТоТоо оТтоТоОоСтТАС СТОоТОоТТССС 2100

АОТТІАСТТСО БАОбСТоАба ТООСАбОАТС ТТТТОААССС АССАСТТСАб ОСБТСАТАвбСА 2160 с ТОСТОТОАТТ ОТОССТАСОА АТАБССАСТО САТАССААСС ТОБОСААТАТ АБСААОАТСС 2720 о

САТСТСТІТА АДАААДАДААА АЛЛА 2243 (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІЮ МО 2 () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ б» (А) ДОВЖИНА: 480 амінокислот сч (В) ТИП: амінокислота (С) ЧИСЛО НИТОК: одноланцюжкова о (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна «Е (ї) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: білок 3о (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО І МО 2 - « ші с ;» -І щ» 1 з 50 3е)

Ф) іме) 60 б5

Мес бег Аіа бій Ма1ї ї1е Ні бій Маї бій бі Аїз Без Абзо ТпПтг Ар 1 . 5 19 15 ? бій уз бі Мех Бец ре Рпе Пец Суз Аго Азр Маї А1іа їі Азр Уаї 20 25 30

Ма1 Рго Рго Азп о Маї Аг АзроПеіа Гей Азр о Ї1є Себ Ако 613 Ат9 б1Уу то 35 19 45

Був Беп бек Маї б01у Азр Пец діа бій Бей о Сец Туг Ага Уві Агоя Аго 50 55 бо

Рпе Ар Гец Ген о Буз Агу Те Пец Був Мес Ар Агу Туз А1а МУаї 01 65 70 . 75 8о 70 ТвЕ Ні Без їеч Азп Рго Ні Тез Узі бек Азр Тух Агу Маї Тез Мех 85 - 90 95

Аза бів тзе сіу бій д5о цез Азр Гуз Бек Авр Уа! бек бек Цей Іїе с що 100 ' 105 110 о

Рпе пбец Мебє Б0уз А5р Тух Меб б1у Ага Сбіу БУуз І1е бек Ббуз бій Гуз 115 120 125 о с

Зек Рпе їец Азр о Сеч Уаї Маї бі цен бій Дуб Без Азп Без Маї Аа ою « в. « т с з -І їх го з 50 с

Ф) о) бо б5

130 135 140

ТРІО Азр обіп Пец Азробеш без бій Пуз Суб цей Буз Азп І1е Ніз Агд 145 150 155 160

Ііїе А5р Ццеп пуз Тіг о буз Т1е б)іа Буз Тук Пуз біп Бех Уаї бій сіу 185 170 . 175 70 Аїа біу ТнІ бек Тур Аг Авп Уаі Пем біл Аїа Аза Ї1е сій Гуз бег 180 , 185 190 реч Гуз Азр о Рко Зак Азп Ап Рпе Акгу Ге Ні Азп біу Агуд бек Був 195 200 205 15 бі бів Аг Гей цуз бій біп цео біу Аїа біп біп бій Рко Маї Буз 210 215 220

Буз бех Іі бів бій бек біз Аза Рпее Пец Рко біп бБеї ЇТ1є Рго бір го 225 230 235 240 сіз Ака Тут Пуз Мес Пуз бек Пуз Рко бе біу І1ів Сує Пе) ї1е Ііє 245 250 255 с ов ВА5р о Суз І1є б1іу Азп бій тт бін бе пей Агу АзроТВпг Ре Тв бег 260 255 270 (8)

Тем біу Тук біш Уаї Сіп цПубє РБе Те Ні Пес Беї Мей Ніз Сіу 112

І 215 280 285 о 30 век біп І1е Бей біу біп Рпе Аза Суб Мек Рго біц Ніз Агч Ар Туг с 290 295 09 ою

Ар Бех Ре Уа1ї Суз Маї бе Уаї Бехт Акад Сіу б1іу Бек біп бек МУа1 «І 305 310 315 329 35 їч-

Тух сСіу Уаї Азр біп ТБг Ні бет біу Бей Рго Бец Ні5 Ні Ї1е Аго9 , 325 330 335 «

Аг о Мес Рпе Меє біу Ар 5ег Су Ркго Тут Без А1а біу МДув Рко Гу З 340 345 350 с ч» Мес Ріе Ре І1їіе біп Д5п Тухк Маі1! Маї бек біз біу біп Гей 019 Азп " 355 360 365 бек бек йец Пец бій Уаі1і Авр біу Рго Аза Меє уз А5п Уа! бі Рпе і "370 375 зво ї І , цЦуз А1т1а Сіп бує Аг біу йец Суз Тих Маї Віз Аку бій Аза Азр Ре о з85 390 395 400 м)

Рпе Тер бЗеї Гей Сув ТпК Аїа дД5р Меї 5Зеї Пе) цес бі б1іп Бех Ні

І3е) 405 419 415 бЗеїх Беї Рго беї Пйем Туг цец біп Суз Бец бек біп цуз Бе Аку бій 420 125 430 о Сі Агу йуз Аг Рего Гей Бе Азр о Беч Ні Т1е бі Пе Абп б1у Туг іме) 435 "440 145 бо Мек Тук Ар ТЕр Азп бек Акд Уаї бек Аїа Буз біш Гуз Тук Тух Маї 450 455 460

Тер Пе біп Ніз Тйг Без Аг Буз Дуб5 Ппех І1є Пемз беї Туг Тпг біх 465 470 475 150 65 Й (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО З

() ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ (А) ДОВЖИНА: 1373 пари нуклеотидів (В) ТИП: нуклеїнова кислота (С) ЧИСЛО НИТОК: одноланцюжкова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: КДНК (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: 5ЕО І МО З

ССАСОТССАС ОСАТТАСАДТ СОССАЛАССА АСССАТАССА ТОАААСАССО ДОоСТТОСАоС БО

СТСАССБАСО АОТСТСААСТ ААААСОбБАСТ СССОБАССТА СОСОТОБОСА СТССбССТСА 120

САСАСТОАОоТ ОССООСТАТТ ООАСТТТТОТ ССАСТОАСАС СТСАСАСААС ДАОСАССАСО 1850 72 ОбБАбСАССТОо ТАббАБАСАд бСОоССОСОАА САОСОАТСОС ССАбСАССВА СТОСОСТТОС 240

АоОСтТТтСбо ТТІСТТТОСС ТССАТСТтТбо СІбССССТТС ССООСОТСТА БОбОАбССАд 300 ух востТбАоостТо ОСАБСОбСАб сАбАоТоСо0 ССОСБАСАСО АСОААСТОСС ССАСТОВААА 360

БОАТІСТОАА АБАДАТОААС ТОВОСССТСА САААТСАДОТ ТОАСтТОоССтТо сТобСстІтТоС 429

ТОТТОАСТОС СССбСАССТо ТАСТОСААСА СОСТТОТОАС СТТОСССТАСТ СТААСАСТАС 480 с

І бАТОТСТОСТ СААСТСАТСС АТСАбоТІСА АБАДОСАСІТ БАТАСАСАТО АБААСОАсСАТ 540 о бСтТОоСтТСТттТ тТтотТоССсобо АТОТТОСТАТ АБАТОТОСТІ ССАССТААТО ТСАбоСАССтТ во (22) зо ТтТСтТОСАтТАТТ ТТАССОбБАДА САССТАДОСТ отСТоТСобо САСТТООСТО ААСТОСТСТА бо с

САБАСТОАСО ССАТТТОАСС ТОСТСАААСо ТАТСТТОДАС АТОСАСАСАА АДОСТОТОоСА 729 о « зв ОАСССАССТО СТСАБСАдСС СТСАССТТОТ ТІСССАСТАТ АБАСТОСТОА ТООСАбБАбАТ 780 М

ТОСОТОСАбСАТ ТТООАТАААТ СТОАТОТОТС СТСАТТААТТ ТТОСТСАТСА АБОАТТАСАТ 9840 бОбСССАСОС ААСАТААССА АССАСААСАС ТІТСТТССАС СТІСТОСТТО АСТТОСАСАА за « ші с АСТАААТТТО СТТСССССАС АТСААСТОСА ТТТАТТАСАА АААТОССТАА АСААСАТССА 360 » САСААТАБАС СТОААСАСАА АААТССАСАА СТАСААОСАо ТСТОТІСАдДо САБСАбСоАС 1020 -1 45 ААСТТАСАСО ДАТОТТСТОС ААБСАбСАДТ ССАДААСАСТ СТСААбСАТС СТТСАЛАТАА 1080 їз СТІСАССАТО АТААСАСССТ АТОСССАТТО ТССТСАТСТО ААААТІСТТо БАААТТОТІС 1150 й 50 САТОТОАТТА АСАТОСААСТ ОССТСТАСТТ ААТСАТІСТО АДАТОАТТАЛА ТСОТТТСАТТ 1200 іме) с ТТСТАААТСТ СТТАТААТОТ СІТТАбСССТ ТІСТТОТТОС ТОТАТОТТТА САТОСТТІСС 1250

ААТСТІТТОТ ТАСТАСТААТ ДАТОСТАТАА ААТАААТАТС СТІОТАСТТС ТТАААДАДАд 1320

АААВААААВА АААЛААААВА ДАДЛАЛАЛААА ААААЛААААЛА ААЛАААДААА АДА 1373

Ф)

ГІ (2) ІНФОРМАЦІЯ ДЛЯ 5ЕО І МО 4 () ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛІДОВНОСТІ во (А) ДОВЖИНА: 222 амінокислоти (В) ТИП: амінокислота (С) ЧИСЛО НИТОК: одноланцюжкова (Б) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (ї) МОЛЕКУЛЯРНИЙ ТИП: білок 65 (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: ЕС ІЮ МО 4

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1. Послідовність ДНК, яка кодує поліпептид, що має активність білка С1, при тому, що зазначений поліпептид: 2 (ї) здатний зв'язуватися або взаємодіяти прямо або опосередковано з МОКТ-1 і/або з будь-якими білками, що зв'язуються з МОКТ-1, або з іншими внутрішньоклітинними білками-медіаторами/модуляторами; і (ї) здатний опосередковувати внутрішньоклітинний вплив, опосередкований ЕА5-К або р55-ТМЕ-К, або інших цитотоксичних медіаторів чи індукторів; при тому, що зазначена послідовність ДНК вибрана з групи, що включає: 70 (а) послідовність ДНК, що кодує ізоформу 1, що має амінокислотну послідовність, наведену у Фіг.1; (в) послідовність ДНК, що кодує ізоформу 1, що має амінокислотну послідовність, наведену у Фіг.2; (с) послідовність ДНК, що кодує принаймні частину поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, наведену у Фіг.1 або Фіг.2; (4) послідовність ДНК, що включає принаймні частину послідовності, наведеної у Фіг.1, і кодує принаймні 19 одну ізоформу білка 1 - ізоформу 1 5; (е) послідовність ДНК, що включає принаймні частину послідовності, наведеної у Фіг.2 і кодує принаймні одну ізоформу білка 1 - ізоформу О1 Б; (9 послідовність ДНК, похідну від сегмента, що кодує нативну ізоформу білка 1; (9) послідовність ДНК, що кодує фрагмент, аналог або похідну поліпептиду, що кодується послідовністю ДНК 720 за будь-яким з (а)-(ї); (п) послідовність ДНК, здатну гібридизуватися з послідовністю за будь-яким з (а)-(д) в умовах середньої жорсткості та яка кодує біологічно активну ізоформу білка 1; і (Ї) послідовність ДНК, яка є виродженою згідно з генетичним кодом відносно до послідовностей ДНК, за будь-яким з (а)-(Н), і яка кодує біологічно активну ізоформу білка 1. с 29 2. Послідовність ДНК за п.1, що використовується для приготування фармацевтичної композиції для Ге) модуляції впливу на клітини ліганду ЕАБ-К або ТМЕ чи інших білків для лікування септичного шоку, відторгнення трансплантата, гострого гепатиту, діабету, розсіяного склерозу або СНІДУ.

   З. Вектор, що включає послідовність ДНК за п.1.

   4. Вектор за п. 3, здатний експресуватися в еукаріотичній або в прокаріотичній клітині-хазяїні. Ф

   5. Вектор за пп. З або 4, що являє собою рекомбінантний вектор на основі вірусу тварини, що містить Ге послідовність ДНК, яка кодує поверхневий вірусний білок (ліганд), здатний зв'язуватися зі специфічним поверхнево-клітинним рецептором, що несе РГА5Б-К або р55-К і другу послідовність, що включає послідовність о ДНК за п. 1. «І

   6. Вектор за п. 5, який відрізняється тим, що поверхнево-клітинний рецептор є специфічним відносно до пухлинних клітин, ВІЛ-інфікованих клітин або інших хворих клітин. -

   7. Вектор за п. 5, що використовується для приготування фармацевтичної композиції для модуляції впливу на клітини ліганду ЕАБ-К або ТМЕ або інших білків для лікування септичного шоку, відторгнення трансплантата, гострого гепатиту, діабету, розсіяного склерозу або СНІДУ. « дю 8. Вектор за п. 6, що використовується для приготування фармацевтичної композиції для лікування пухлин, -о СНІДУ або інших захворювань, що проявляються у виробленні специфічних поверхнево-клітинних рецепторів.

   с 9. Клітина-хазяїн, що несе вектор за будь-яким з пп. 3-6, яка є еукаріотичною або прокаріотичною. :з» 10. Спосіб одержання поліпептиду, який має активність білка С1, що включає вирощування трансформованої клітини-хазяїна за п. 9 в умовах, придатних для експресії зазначеного поліпептиду, забезпечення посттрансляційних модифікацій, якщо вони необхідні, для одержання зазначеного поліпептиду і виділення -1 75 завначеного поліпептиду.

   11. Поліпептид, що має активність білка С1, при тому, що зазначений поліпептид: ЧК» (ї) здатний зв'язуватися або взаємодіяти прямо або опосередковано з МОКТ-1 і/або з будь-якими білками, що сл зв'язуються з МОКТ-1, або з іншими внутрішньоклітинними білками-медіаторами/модуляторами; і (ї) здатний опосередковувати внутрішньоклітинний вплив, опосередкований ЕА5-К або р55-ТМЕ-К, або інших ко 50 цитотоксичних медіаторів чи індукторів; с при тому, що зазначена послідовність ДНК вибрана з групи, що включає: (а) послідовність ДНК, що кодує ізоформу 1, що має амінокислотну послідовність, наведену у Фіг.1; (в) послідовність ДНК, що кодує ізоформу 1, що має амінокислотну послідовність, наведену у Фіг.2; (с) послідовність ДНК, що кодує принаймні частину поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, 99 наведену у Фіг.1 або Фіг.2; ГФ) (4) послідовність ДНК, що включає принаймні частину послідовності, наведеної у Фіг.1 і яка кодує 7 принаймні одну ізоформу білка 1 - ізоформу 01 Ж; (е) послідовність ДНК, що включає принаймні частину послідовності, наведеної у Фіг.2 і яка кодує принаймні одну ізоформу білка 1 - ізоформу С1 р; 60 (9 послідовність ДНК, похідну від сегмента, що кодує нативну ізоформу білка 1; (9) послідовність ДНК, що кодує фрагмент, аналог або похідну поліпептиду, що кодується послідовністю ДНК за будь-яким з (а)-(ї); (п) послідовність ДНК, здатну гібридизуватися з послідовністю за будь-яким з (а)-(д) в умовах середньої ве жорсткості та яка кодує біологічно активну ізоформу білка 1; і (Ї) послідовність ДНК, яка є виродженою згідно з генетичним кодом відносно до послідовностей ДНК, за будь-яким з (а)-(Н), і яка кодує біологічно активну ізоформу білка 1, або одержаний у спосіб за п.10.

   12. Поліпептид за п. 11, що використовується для приготування фармацевтичної композиції для модуляції Впливу на клітини ліганду РГАБ-К чи ТМЕ або інших білків для лікування септичного шоку, відторгнення трансплантата, гострого гепатиту, діабету, розсіяного склерозу або СНІДУ.

   13. Антитіло, специфічне відносно до поліпептиду за п. 11.

   14. Антитіло за п. 13, що використовується для приготування фармацевтичної композиції для модуляції впливу на клітини ліганду РГА5Б-К або ТМЕ або інших білків для лікування септичного шоку, відторгнення /о трансплантата, гострого гепатиту, діабету, розсіяного склерозу або СНІДУ.

   15. Спосіб модулювання загибелі клітин або запальних процесів іп міо, що включає обробку зазначених клітин одним або більшою кількістю поліпептидів за п. 11, при тому, що зазначена обробка вказаних клітин включає введення всередину вказаних клітин зазначеного одного чи більшої кількості поліпептидів у формі, придатній для їх внутрішньоклітинного введення або введення всередину зазначених клітин послідовності ДНК /5 за п.1 у формі придатного вектора, що містить зазначену послідовність, при тому, що зазначений вектор здатний забезпечувати введення зазначеної послідовності всередину вказаних клітин таким чином, що зазначена послідовність експресується у зазначених клітинах.

   16. Спосіб модулювання впливу ліганду ЕАБ-К або ТМЕ на клітини, що містять ЕАБ-К або р55Б-К, іп міго, який включає обробку зазначених клітин одним чи більшою кількістю поліпептидів за п. 11, при тому, що го Зазначена обробка зазначених клітин включає введення всередину зазначених клітин вказаних одного чи більшої кількості поліпептидів у формі, придатній для їх внутрішньоклітинного введення або введення всередину зазначених клітин послідовності ДНК за п. 1, що кодує зазначені один чи більшу кількість поліпептидів у формі придатного вектора, що містить зазначену послідовність, при тому, що зазначений вектор здатний забезпечувати введення зазначеної послідовності всередину зазначених клітин таким чином, що зазначена с послідовність експресується у зазначених клітинах.

   17. Спосіб модулювання впливу ліганду ГА5Б-К або ТМЕ на клітини, що містять ЕАЗ-К або р55-К, іп міо за і)

   п. 16, який відрізняється тим, що зазначена обробка клітин включає введення всередину зазначених клітин одного із зазначених поліпептидів, послідовності ДНК, що кодує один з значених поліпептидів у формі придатного вектора, що містить зазначену послідовність, при тому, що зазначений вектор здатний ду зо забезпечувати введення зазначеної послідовності всередину зазначених клітин таким чином, що зазначена послідовність експресується у зазначених клітинах. с

   18. Спосіб модулювання впливу ліганду ГА5Б-К або ТМЕ на клітини, що містять ЕАЗ-К або р55-К, іп міо за ю пп. 16 або 17, який відрізняється тим, що зазначена обробка зазначених клітин здійснюється шляхом трансфекції зазначених клітин рекомбінантним вектором на основі вірусу тварини за п. 5. «

   19. Спосіб модулювання загибелі клітин або запальних процесів іп міо, що включає обробку зазначених ї- клітин одним або більшою кількістю інгібіторів одного або більше кількості білків/ферментів, що опосередковують зазначену загибель клітин або запальні процеси, при тому, що зазначені інгібітори вибирають з групи, що включає: () один або більшу кількість поліпептидів за п. 11, що здатні пригнічувати зазначені клітинну загибель « або запальні процеси; і з с (її) інгібітори одного або більшої кількості поліпептидів за п. 11, коли зазначені один або більша кількість поліпептидів підсилюють/обумовлюють або опосередковують зазначені клітинну загибель або запальні ;» процеси.

   20. Спосіб модулювання впливу ліганду ГА5Б-К або ТМЕ на клітини, що містять РА5Б-К або р55Б-К, іп міо, який включає обробку зазначених клітин антитілом за п. 13, при тому, що зазначена обробка проводиться з -І використанням придатної композиції, що включає зазначене антитіло відносно до зазначених клітин, при тому, що, коли білок 51 чи його частини експозиційовані на зовнішній поверхні зазначених клітин, зазначена ве композиція створюється для позаклітинного застосування, а коли зазначені білки С1 є внутрішньоклітинними, то с зазначена композиція створюється для внутрішньоклітинного застосування.

   21. Спосіб модулювання впливу ліганду ЕА5-К або ТМЕ на клітини, що містять ЕА5Б-К або р55-К, іп мйго, що о включає обробку зазначених клітин олігонуклеотидною послідовністю, що кодує антисмислову послідовність Ге) відносно до принаймні частини послідовності ДНК, за п.1, при тому, що зазначена олігонуклеотидна послідовність здатна блокувати експресію білка 1.

   22. Спосіб модулювання впливу ліганду ЕАБ-К або ТМЕ на клітини, що містять ЕАБ-К або р55Б-К, іп міо за дв Л. 21, який відрізняється тим, що зазначена олігонуклеотидна послідовність вводиться у зазначені клітини за допомогою вектора за п.5, при тому, що зазначена друга послідовність зазначеного вірусу кодує зазначену (Ф) олігонуклеотидну послідовність. ка 23. Спосіб модулювання впливу ліганду ЕАБ-К або ТМЕ на клітини іп міго, який включає застосування рибозимної процедури, при якій вектор, що кодує рибозимну послідовність, здатну взаємодіяти з послідовністю бо Клітинної МРНК, що кодує поліпептид за п.11, вводять всередину зазначених клітин у формі, що забезпечує експресію зазначеної рибозимної послідовності у зазначених клітинах, і при тому, що, коли зазначена рибозимна послідовність експресується у зазначених клітинах, то вона взаємодіє з зазначеною послідовністю клітинної МРНК і розщеплює зазначену послідовність мРНК, що призводить до інгібування експресії зазначеного поліпептиду у зазначених клітинах. 65 24. Спосіб модулювання впливу ліганду ЕАЗ-К або ТМЕ на клітини іп міго за будь-яким з пп. 16-18, 20-23, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид здатний зв'язуватися прямо або опосередковано з МОКТ-1 -Б4-

   мМабо з будь-якими білками, що зв'язуються з МОКТ-1, при тому, що МОКТ-1, в свою чергу, специфічно зв'язується з РА5-ІС, або які здатні зв'язуватися прямо або опосередковано з МОКТ-1, і/або з будь-якими білками, що зв'язуються з МОКТ-1, при тому, що МОКТ-1, в свою чергу, зв'язується ТКАБО, який, в свою чергу, зв'язується з ро5-16.

   25. Спосіб модулювання загибелі клітин або запальних процесів іп міго за будь-яким з пп. 15 або 19, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид здатний зв'язуватися прямо або опосередковано з МОКТ-1 мМабо з будь-якими білками, що зв'язуються з МОКТ-1, при тому, що МОКТ-1, в свою чергу, специфічно зв'язується з ЕАЗ-ІС, або, які здатні зв'язуватися прямо або опосередковано з МОКТ-1, і/або з будь-якими 70 білками, що зв'язуються з МОКТ-1, при тому, що МОКТ-1, в свою чергу, зв'язується ТКАБО, який, в свою чергу, зв'язується з ро5-16.

   26. Спосіб виділення й ідентифікації поліпептиду за п.11, який включає застосування дигібридного дріжджового методу, в якому послідовність, що кодує зазначений білок МОКТ-1 і/або білок, що зв'язується з МОКТ-1, знаходиться в складі одного гібридного вектора, а послідовність з КДНК або з геномної бібліотеки ДНК /5 знаходиться у складі другого гібридного вектора, при тому, що вектори потім використовують для трансформації дріжджових клітин-хазяїнів, і позитивно трансформовані клітини виділяють шляхом наступної екстракції зазначеного другого гібридного вектора з метою одержання послідовності, що кодує білок, що зв'язується з зазначеним білком МОКТ-1 і/або з білками, що зв'язують МОКТ-1.

   27. Спосіб модулювання впливу ліганду ЕАЗ-К або ТМЕ на клітини іп міго за будь-яким з пп. 16-18, 20-23, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид є принаймні однією з ізоформ С1, одним з його аналогів, фрагментом або похідною.

   28. Спосіб модулювання загибелі клітин або запальних процесів іп міго за будь-яким з пп. 15 або 19, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид є принаймні однією з ізоформ С1, одним з його аналогів, фрагментом або похідною. сч

   29.Спосіб виділення й ідентифікації поліпептиду за п. 26, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид є принаймні однією з ізоформ 1, одним з його аналогів, фрагментом або похідною. (8)

   30. Спосіб модулювання індуковуваного МОКТ-1 впливу або впливу білка, що зв'язується з МОКТ-1, або індуковуваного іншими білками впливу на клітини іп міго, який включає обробку зазначених клітин у спосіб за будь-яким з пп. 15-29 послідовністю ДНК за п. 1 або поліпептидом за п. 11, при тому, що зазначена обробка Ге! зо призводить до посилення або пригнічення зазначеного впливу, опосередковуваного МОКТ-1 або білком, що зв'язується з МОКТ-1, або іншого впливу, опосередковуваного білками і тим самим також впливу ГАБ-К або с роб-К або інших цитотоксичних медіаторів або індукторів, що опосередковують цей вплив. ю

   31. Спосіб модулювання індуковуваного МОКТ-1 впливу або впливу білка, що зв'язується з МОКТ-1, або індуковуваного іншими білками впливу на клітини іп мйго за п. ЗО, який відрізняється тим, що зазначений « поліпептид є тією частиною поліпептиду, яка специфічно залучена у зв'язування з МОКТ-1 або з білком, що ї- зв'язується з МОКТ-1, або з іншим білком.

   32. Спосіб модулювання індуковуваного МОКТ-1 впливу або впливу білка, що зв'язується з МОКТ-1, або індуковуваного іншими білками впливу на клітини іп міїго за пп. ЗО або 31, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид є будь-якою з ізоформ С1, здатною підсилювати вплив, обумовлений МОКТ-1, або білком, що « зв'язується з МОКТ-1, або інший вплив на клітини, зв'язаний з білками, і тим самим вплив ГАЗ-К або ро5-К або пл») с інших цитотоксичних медіаторів або індукторів, що впливають на клітини.

   33. Спосіб модулювання апоптотичних процесів або процесів запрограмованої загибелі клітин іп міго, який ;» включає обробку зазначених клітин одним чи більшою кількістю поліпептидів за п. 11, при тому, що зазначена обробка зазначених клітин включає введення всередину зазначених клітин зазначених одного чи більшої Кількості поліпептидів у формі, придатній для їх внутрішньоклітинного введення або введення всередину -І зазначених клітин послідовності ДНК за п. 1 у формі придатного вектора, що містить зазначену послідовність, при тому, що зазначений вектор здатний забезпечувати введення зазначеної послідовності всередину о зазначених клітин таким чином, що зазначена послідовність експресується в зазначених клітинах. с 34. Спосіб скринінгу ліганду, здатного зв'язуватися з поліпептидом за п. 11, який включає контактування 5р афінного хроматографічного матрикса, до якого приєднаний зазначений поліпептид, із клітинним екстрактом так, ю що ліганд зв'язується зі зазначеним матриксом, з наступною елюцією, виділенням і аналізом зазначеного Ге) ліганду.

   35. Спосіб скринінгу послідовності ДНК, що кодує ліганд, здатний зв'язуватися з поліпептидом за п. 11, який включає застосування дигібридного дріжджового методу, в якому послідовність ДНК, що кодує зазначений поліпептид, входить до складу одного гібридного вектора, а послідовності з КДНК або з геномної бібліотеки ДНК входять до складу другого гібридного вектора, трансформація зазначеними векторами зазначених дріжджових Ф) клітин-хазяїв, виділення позитивно трансформованих клітин і екстракція зазначеного другого гібридного вектора ка з метою одержання послідовності ДНК, що кодує зазначений ліганд.

   36. Спосіб ідентифікації й одержання ліганду, здатного модулювати клітинну активність, що во модульована/опосередкована МОКТ-1 або білками, що зв'язуються з МОКТ-1, який включає: (а) скринінг ліганду, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що включає принаймні частину МОКТ-1 або білків, що зв'язуються з МОКТ-1, що вибираються з білків МАСН, білків Мена і інших білків, що зв'язуються з МОТ-1; (5) ідентифікацію та охарактеризування ліганду, іншого, ніж МОКТ-1, або зазначених білків, що зв'язуються 65 З МОКТ-1, або частин рецептора із сімейства рецепторів ТМЕ/ЧМОР, виявленого при проведенні зазначеного скринінгу по здатності до зазначеного зв'язування; і

   (с) одержання зазначеного ліганду в, по суті, виділеній і очищеній формі.

   37. Спосіб ідентифікації і одержання ліганду, здатного модулювати клітинну активність, що модулюється або опосередковується поліпептидом за п. 11, який включає: (а) скринінг ліганду, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що включає поліпептид, який кодується послідовністю ДНК за будь-яким з (а)-(с) за п.1; (5) ідентифікацію й охарактеризування ліганду, іншого, ніж МОКТ-1, або білків, що зв'язуються з МОКТ-1, або частин рецептора з сімейства рецепторів ТМЕ/МОР, виявлених при зазначеному скринінгу по здатності до зазначеного зв'язування; і 70 (с) одержання зазначеного ліганду в, по суті, виділеній і очищеній формі.

   38. Спосіб ідентифікації і одержання ліганду, здатного модулювати клітинну активність, що модулюється/опосередковується білком 1, що включає: (а) скринінг ліганду, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що включає поліпептид, який кодується послідовністю ДНК за будь-яким з (а)-(с) за п.1; р) ідентифікацію й охарактеризування ліганду, іншого, ніж МОКТ-1 або білків, що зв'язуються з МОКТ-1, ший й й й або частин рецептора з сімейства рецепторів ТМЕ/МОР, виявлених при зазначеному скринінгу по здатності до зазначеного зв'язування; і (с) одержання зазначеного ліганду в, по суті, виділеній і очищеній формі.

   39. Спосіб ідентифікації і одержання молекули, здатної прямо або опосередковано модулювати клітинну активність, що модулюється/опосередковується білком 1, який включає: (а) скринінг молекули, здатної модулювати активності, що модулюються/опосередковуються білком 1; (5) ідентифікацію й охарактеризування зазначеної молекули; і (с) одержання зазначеної молекули в, по суті, виділеній і очищеній формі.

   40. Спосіб ідентифікації і одержання молекули, здатної прямо або опосередковано модулювати клітинну сч ов активність, що модулюється/опосередковується поліпептидом за п. 11, який включає: (а) скринінг молекули, здатної модулювати активності, що модулюються/опосередковуються поліпептидом за і)

   п. 11; (5) ідентифікацію й охарактеризування зазначеної молекули; і (с) одержання зазначеної молекули в, по суті, виділеній і очищеній формі. Ге! зо 41. Фармацевтична композиція, що включає як активний інгредієнт речовину, вибрану з групи, яка складається з послідовності ДНК за п. 1, вектора за пп. 5 чи 6, поліпептиду за п. 11, або антитіла за п. 13 с і, необов'язково, фармацевтично придатного носія. ю

   42. Діагностична композиція, що включає антитіло за п. 13. « і -

   - . и? -і щ» 1 іме) іЧе) іме) 60 б5 -58в-