UA72180C2 - Модифікована ацил-апб-десатураза - Google Patents
Модифікована ацил-апб-десатураза Download PDFInfo
- Publication number
- UA72180C2 UA72180C2 UA99020833A UA99020833A UA72180C2 UA 72180 C2 UA72180 C2 UA 72180C2 UA 99020833 A UA99020833 A UA 99020833A UA 99020833 A UA99020833 A UA 99020833A UA 72180 C2 UA72180 C2 UA 72180C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- desaturase
- apb
- acyl
- residues
- amino acid
- Prior art date
Links
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 71
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 65
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 55
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 54
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 54
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 20
- -1 fatty acids acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 69
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 69
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 38
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 27
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 20
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- CNVZJPUDSLNTQU-SEYXRHQNSA-N petroselinic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C/CCCCC(O)=O CNVZJPUDSLNTQU-SEYXRHQNSA-N 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 235000021281 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101000911019 Homo sapiens Zinc finger protein castor homolog 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100026655 Zinc finger protein castor homolog 1 Human genes 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 5
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 5
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 4
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 4
- OXEDXHIBHVMDST-UHFFFAOYSA-N 12Z-octadecenoic acid Natural products CCCCCC=CCCCCCCCCCCC(O)=O OXEDXHIBHVMDST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 3
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004230 Fast Yellow AB Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 3
- 238000004813 Moessbauer spectroscopy Methods 0.000 description 3
- CNVZJPUDSLNTQU-UHFFFAOYSA-N Petroselaidic acid Natural products CCCCCCCCCCCC=CCCCCC(O)=O CNVZJPUDSLNTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 3
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- AQWHMKSIVLSRNY-UHFFFAOYSA-N trans-Octadec-5-ensaeure Natural products CCCCCCCCCCCCC=CCCCC(O)=O AQWHMKSIVLSRNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004066 1-hydroxyethyl group Chemical group [H]OC([H])([*])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- REAWNMHCBIUKLZ-ZYHUDNBSSA-N (3R,4R)-4-(hydroxymethyl)-3-(6-methylheptanoyl)oxolan-2-one Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)[C@H]1[C@H](CO)COC1=O REAWNMHCBIUKLZ-ZYHUDNBSSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- VQTZGUYEOZNKQH-UHFFFAOYSA-N 5-[(2,4,6-trioxo-1,3-diazinan-5-yl)imino]-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound O=C1NC(=O)NC(=O)C1N=C1C(=O)NC(=O)NC1=O VQTZGUYEOZNKQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100454194 Caenorhabditis elegans mei-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000018436 Coriandrum sativum Species 0.000 description 1
- 235000002787 Coriandrum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N Dimethyl ether Chemical class COC LCGLNKUTAGEVQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical class CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100036300 Golgi-associated olfactory signaling regulator Human genes 0.000 description 1
- 101710204059 Golgi-associated olfactory signaling regulator Proteins 0.000 description 1
- 108010044394 Hemerythrin Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700020476 Rubrerythrin Proteins 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108091032917 Transfer-messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000021394 Veia Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- NJFMNPFATSYWHB-UHFFFAOYSA-N ac1l9hgr Chemical compound [Fe].[Fe] NJFMNPFATSYWHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004308 accommodation Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- RSKPLCGMBWEANE-UHFFFAOYSA-N cacodyl Chemical group C[As](C)[As](C)C RSKPLCGMBWEANE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 238000012926 crystallographic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108010009977 methane monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 108010053118 myohemerythrin Proteins 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001945 resonance Rayleigh scattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003813 safflower oil Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Описано спосіб модифікування довжини ланцюга і специфічності розташування подвійних зв'язків розчинної десатурази рослинних жирних кислот. Більш конкретно, спосіб містить модифікування амінокислотних контактових залишків у каналі зв'язування субстрату розчинної десатурази жирних кислот, які контактують з жирними кислотами. Окремо описано модифікування ацил-АПБ-десатурази. Амінокислотні контактові залишки, які знаходяться усередині каналу зв'язування субстрату, ідентифікують, і у подальшому заміняють на різні залишки для того, щоб викликати зміну активності.
Description
Біологічний синтез жирних кислот у вищих рослинах нещодавно став притягати пристальну увагу у зв'язку з можливістю використання рослинних масел як поновлюємих джерел відновленого вуглецю. Біологічний синтез жирних кислот у рослинах відбувається у хлоропластах зеленої тканини або у пластидах тканин, що не ведуть фотосинтез. В більшості рослин основними продуктами є складні ефіри ацил-переносівного білка (АПЕ) насичених кислот - пальмітинової і стеаринової.
АЗ-стеароіл-ацил-переносівний білок-десатураза (А?-десатураза) є пластидолокалізованим, немембранно пов'язаним, розчиненим ферментом, який вводить перший подвійний зв'язок у молекулу насиченої жирної кислоти (що приводить до відповідних моно-ненасичених жирних кислот). Нещодавно у тканинах насіння різних рослин було ідентифіковано декілька родинних розчинених десатураз, які містять жирні кислоти з незвичним розташуванням подвійних зв'язків. Ферменти цього класу розчинених десатураз є специфічними для конкретної довжини ланцюга субстрату і вводять подвійний зв'язок між визначеними атомами вуглецю, рахуючи від карбоксильного кінця жирної кислоти; наприклад, А?-десатураза є специфічною для стеароил-
АПБ, і вона вводить подвійний зв'язок між дев'ятим і десятим атомами вуглецю. Початкові реакції введення подвійного зв'язку у тварин і грибків і подальші реакції введення подвійного зв'язку у рослинах передаються визначеним класом десатураз жирних кислот, які є інтегральними мембранними білками. Оскільки у більшості рослин відсутні інші десатурази, які діють на рівні 18:0, співвідношення насичених жирних кислот до ненасичених жирних кислот у вищих рослинах регулюється толовим чином ферментами, які каталізують перетворення насичених жирних кислот у моно-ненасичені жирні кислоти.
КДНК А?-десатурази кодують білки - попередники, що містять М-термінальний транзитний пептід, для націлювання у пластиду. Для сафлорового і касторового масел залишковий транзитний пептід 33 залишку транзитного пептіда відщдеплюється, утворюючи зрілу десатуразу, що складається з 363 амінокислот з уявною молекулярною масою 37000 одиниць Дальтона (37кДа) на субодиницю по методу 505-РАСЕ. Цей фермент виникає у вигляді димерів з приблизною молекулярною масою 7ОкДа. Для цієї ферментативної реакції потрібен молекулярний кисень, МАО (Р) Н-ферредоксиноксидо-редуктаза і ферредоксин.
В попередніх дослідженнях було показано, що для каталітичної активності як розчинених, так і пов'язаних з мембраною А?-десатураз необхідно негемне залізо. Порівняно нещодавно при спектроскопічному аналізі і зіставленні амінокислотної послідовності було встановлено, що А?-десатураза містить кластер з двох атомів заліза. Цей клас білків з двома атомами заліза відрізняється двома місцезнаходженнями мотиву послідовності
Е-Х-Х-Н, які поділені приблизно ста амінокислотами, і містять К2 субодиницу рибонуклеотидної редуктази і гідроксилазний компонент монооксигенази метана. Краще розуміння механізму каталіза ферментами ацил-
АПБ-десатурази може дати можливість застосування таких ферментів у виробництві масла з насіння рослин.
Цей винахід відноситься до способу модифікування довжини ланцюга і специфічності розташування подвійних зв'язків розчинної десатурази рослинних жирних кислот. Більш конкретно, цей спосіб містить модифікування амінокислотних контактових залишків у каналі зв'язування субстрату у розчинній десатуразі жирних кислот, яка контактує з жирними кислотами. В переважних варіантах втілення розчинна десатураза рослинних жирних кислот представляє собою ацил-АПБ-десатуразу.
Амінокислотні контактові залишки, які знаходяться усередині каналу зв'язування субстрату, ідентифікують, наприклад, спочатку показуючи головну послідовність амінокислот ацил-АПБ-десатурази. Відомо багато таких послідовностей, а інші можуть бути визначені з використанням звичайного експериментування. Потім такі амінокислотні послідовності вирівнюють з головною амінокислотною послідовністю А?-десатурази Вісіпи5 соттипі5 для максимального збереження послідовності. Потім трьохрозмірну модель ацил-АПБ-десатурази конструюють на основі послідовності консервативної з послідовністю лЗ-десатурази Вісіпиз соттипів. Потім ідентифікують амінокислотні контактові залишки усередині каналу зв'язування субстрату модельованої структури. Потім, шляхом заміщення одного або декількох амінокислотних контактових залишків на інший амінокислотний залишок генерують мутантну ацил-АПБ-десатуразу, що має модифіковану довжину ланцюга і особливості розташування подвійних зв'язків.
В іншому аспекті цей винахід відноситься до мутантній ацил-АПБ-десатурази, яка характеризується здатністю каталізувати створення подвійного зв'язку у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті, причому перша і друга жирні кислоти відрізняються довжиною ланцюга. Цей мутант додатково характеризується здатністю до створення подвійних зв'язків у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті з швидкостями, які розрізняються не більш, ніж приблизно у 4 рази.
Цей винахід також відноситься до композицій, таким як послідовності нуклеїнових кислот і вектори експресії, які кодують мутантну ацил-АПБ-десатуразу описаного вище типу. Інші композиції цього винаходу містять клітини, трансформовані такими векторами експресії. В іншому аспекті цей винахід відноситься до химерних ацил-АПБ-десатураз, що мають модифіковану довжину ланцюга і особливості розташування подвійних зв'язків.
На Фігурі 1 узагальнені значення питомих активностей десатураз природного типу і мутантних ацил-АПБ- десатураз.
Цей винахід частково засновано на ідентифікації жолобка, що зв'язує субстрат, і критичних контактних залишків, які встановлюють западину у ацил-АПБ-десатуразі. Крім того, цей винахід містить аналіз впливу логічно обгрунтованих, сайт-направлених мутацій. До цього винаходу були невідомі відносне місцерозташування каналів, що зв'язують субстрат у ацил-АПБ-десатуразах, і критичні залишки, що контактують з субстратом.
Ацил-АПБ-десатурази є вельми консервативними, причому знайдено більш 70905 гомологичності амінокислотної послідовності між ферментами різних сімейств, такими як А", АЄ ії А? ацил-АПБ-десатурази.
Відомо, що кожна з цих десатураз каталізує створення подвійних зв'язків між атомами вуглецю того ж самого або аналогічного субстрату - жирних кислот. Основне відрізнення між активністю різних ацил-АПБ-десатураз є у розташуванні атомів вуглецю усередині субстратних жирних кислот, які стануть ненасиченими.
Збереження амінокислотної послідовності є навіть більш значним у конкретному сімействі ацил-АПБ-
десатураз, такому як ЛУ. На основі цього опису фахівець у цій області хімії зможе завбачати, які контактові залишки усередині каналу, що зв'язує субстрат, з усіх ферментів А?-ацил-АПБ-десатураз є практично подібними, якщо не ідентичними до тих, що ідентифіковані у А"ацил-АПБ-десатуразі, яку описано нижче у
Прикладі 1.
Висока ступінь гомологичності амінокислотної послідовності між сімействами ацил-АПБ-десатураз, які каталізують ті ж самі ферментативні реакції, і гомологичності амінокислотної послідовності між сімействами ацил-АПБ-десатураз, які каталізують інші ферментативні реакції, дозволяє припустити, що визначені частини ферментів можуть мати аналогічні третинні структури. Це узгоджується з спостереженнями для інших молекул, таких як антитіла, у яких збереження гомологичності амінокислотного залишку звичайно є найбільшим для тих амінокислот, які залучені у підтримання функціональної структури молекули, що розглядається.
Одною такою областю структури у ацил-АПБ-десатуразах, яка зберігається між різними ацил-АПБ- десатуразами, є канал, що зв'язує субстрат, описаний у подальшому розділі Прикладів. Описаний нижче канал, що зв'язує субстрат, має архітектуру, яка забезпечує майже чудову аккомодацію для субстрату - жирної кислоти. Подібна досконала відповідність є вельми незвичною, якщо не є безпрецедентною.
Той факт, що цей канал, що зв'язує субстрат, є конче консервативним, може бути підтверджений шляхом вирівнювання по максимальної ідентичності (по загальноприйнятих методиках) амінокислотних послідовностей представників інших сімейств ацил-АПБ-десатураз з амінокислотною послідовністю касторової (тобто, Вісіпиз соттипів) А?-ацил-АПБ-десатурази, яку описано нижче у Прикладі 1. Виведена амінокислотна послідовність цього касторового білка була опублікована Шанкліном і Сомервіллем (у Ргос. Маї). Асай. 5соі.
ЗА, т.88, с.2510 (1991)). Згідно з цим вирівнюванням може бути створена трьохрозмірна модель, у якій буде виявлений характерний канал, що зв'язує субстрат. Серед встановлених до цього часу послідовностей ацил-
АПБ-десатурази з різних рослинних джерел, доступних з Генетичного банку, є такі у у квадратних дужках вказані коди доступу): ІВК5АСРІ В. гара; |(САНЗАСРО)Ї С. (псіогпи5; |(ЗММЗАСРОЇ біттопавіа спіпепвів;
ІЗОАССРОБІ 5. оІегасеа; (З3МЗАСРОЇ рослинне джерело - кунжут; |(ТГТАОО7597| Тпипрегдіа аїасга (клон ртАОгАУ); (ІТАШОО7605| Тпипрегодіа аіаїа (клон ртАОЗА»У); |(АТЗТАСРОЗБІ А. Шаїїапа; |ІВМААСРОЕЗ)І В. парив;
ІЗМ5АСРОЇ В. париє; (ЗНЗБАСРОЕВ) С. Ніпешшт; | О5БАСРОЕЇ| ЇМ. изігайввзітит; |(АВС5ЗТЕА) А. соттипів;
ІЗОУЗАСРОЇ Сіусіпе тах; (ЗЗМ5ЗАСРОА)| рослина - кунжут; (ЗЗМЗАСРОВІ рослина - кунжут; (ТАОО7552
Тпипрегоіа аїага (клон рТАбІАУ).
При вивченні результатів молекулярного моделювання для будь-якої з ацил-АПБ-десатураз, що проведено нижче у зв'язку з касторовою л?-ацил-АПБ-десатуразою, можуть бути ідентифіковані амінокислотні залишки усередині каналу, що зв'язує субстрат, які орієнтовані таким чином, що можуть знаходитись у безпосередній близькості до субстрату - жирній кислоті. Такі залишки називаються "контактовими залишками".
Як виявлено нижче у результаті опису експериментального дослідження, модифікація контактового залишку (а у деяких випадках - інших залишків, як наприклад химерних з Прикладу 2) може змінювати довжину ланцюга і особливості розташування подвійних зв'язків адил-АПБ-десатурази.
Наприклад, як показано нижче у Прикладі 2, був одержаний химерний фермент, у якому амінокислоти 172- 202 у Ае-16:0-АПБ-десатуразі були замінені амінокислотами 178-207 А»-18:0-АПВ-десатурази. Це приводить до введення 9 нових амінокислот у канал, що зв'язує субстрат, Аб-16:0-АПБ-десатурази, які відрізняються від амінокислот у відповідних положеннях у Аб-16:0-АПБ-десатуразі природного типу. Ця химера не тільки була здатна утворити подвійний зв'язок у жирній кислоті 16:0, яка краще всього перетворюється на ферменті природного типу, але також здатна утворити подвійний зв'язок у кислоті 18:0 у обох положеннях, Ас і АЗ, і у однаковій мірі.
Той факт, що амінокислотні контактові залишки у каналі ацил-АПБ-десатурази, що зв'язує субстрат, грають таку важливу роль при визначенні довжини ланцюга і позиційній специфічності подвійних зв'язків, забезпечує можливість для розумного конструювання мутантних ацил-АПБ-десатураз, які мають унікальні і корисні властивості.
Такі нові мутантні молекули можуть бути створені, наприклад, шляхом початкової ідентифікації контактових залишків усередині каналу, що зв'язує субстрат (як описано вище, шляхом вирівнювання по касторовій А?-амінокислотній послідовності з подальшим трьохрозмірним моделюванням). Потім у молекулу ацил-АПБ-десатурази, що розглядається, можуть бути введені специфічні точкові мутації. Найбільш зручно це виконується на генетичному рівні з використанням загальноприйнятих методик, таких як сайт - направлений мутагенез.
Для введення специфічного змінення (тобто заміщення) амінокислотного кодону усередині таких ДНК можна використати численні методики сайт - направленого мутагенезу. Необхідно проявляти обережність у виборі залишку, що підлягає введенню замість існуючого контактового залишку у каналі, що зв'язує субстрат, у ацил-АПБ-десатуразі природного типу. Це особливо важливо на початку дослідження, наприклад для вибору заміщуючих залишків, які істотно не відрізняються по розміру бокового ланцюга або заряду. Наприклад, якщо усередині каналу, що зв'язує субстрат, ідентифікується гліциновий контактовий залишок (відрізняється компактністю власного аліфатичного ланцюга), то заміщення його таким амінокислотним залишком, як аргінін (відрізняється наявністю об'ємного основного бокового ланцюга), може привести до блокування надходження субстратної жирної кислоти у канал, що зв'язує субстрат, за рахунок стеричних ускладнень. Загалом, початкові заміщення амінокислот у контактових залишках мають бути здійснені з використанням амінокислот, що мають аналогічні зарядові характеристики при відносно невеликих розбіжностях у значеннях об'єму бокового ланцюга. Проте при обумовлених обмеженнях цілюоюм можливо, що при заміщенні амінокислотою, що має абсолютно інші властивості, ніж контактовий залишок природного типу, можна одержати особливо ефективну мутантну ацил-АЛБ-десатуразу. Така молекула буде охоплена цім винаходом. Приведене вище коротке обговорення стратегії заміщення призначається тільки для того, щоб служити проводом для послідовного модифікування ацил-АПБ-десатурази.
Таким чином, саме знання ідентичності контактових залишків у межах ацил-АПБ-десатурази дозволяє фахівцеві у цій області хімії здійснити такі модифікації ферменту, які можуть змінити довжину ланцюга і особливості розташування подвійних зв'язків ферменту без інгібування його здатності вести процес ферментативного каталіза. В свою чергу, ці знання залежать від здатності фахівця у цій області хімії ідентифікувати канал, що зв'язує субстрат, і створити трьохрозмірну модель.
Як вже обговорювалось, описані нуклеотидні послідовності багатьох ацил-АПБ-десатураз. Більш того, приведені їх високі ступені консервативності, рутинні експерименти по гібридизації нуклеїнових кислот, проведені з використанням ДНК, яку виділено з рослин, що розглядаються, які, імовірно, могли б дати ДНК, що кодує додаткові ацил-АПБ-десатурази.
Крім того, як вказано вище, фахівець у цій області хімії зможе передбачити, що у межах сімейства лУ- ацил-АПБ-десатурази амінокислотні контактові залишки усередині жолобка, що зв'язує субстрат, можуть бути практично подібними, якщо не ідентичними. Амінокислотні контактові залишки, ідентифіковані методом рентгенівської кристалографії, як описано у Прикладі 1, є залишками М114, 1115, 7117, 1118, Р179, Т181, с188 і 189. Те, що модифікація цих залишків у А?-ацил-АПБ-десатуразі дійсно змінює довжину ланцюга і особливості розташування подвійних зв'язків ферменту, підтверджено у експериментах, описаних у Прикладі 2. Більш конкретно, у попередньому експериментальному дослідженні було виявлено, що єдине заміщення амінокислоти у положенні 118 (лейцин на фенілаланін) у касторовій /АЗ-ацил-АПБ-десатуразі приводить приблизно до десятикратного збільшення її активності з 16:0-АПБ. Таким чином, одне амінокислотне заміщення у положенні контактового залишку може створити ацил-АПБ-десатуразу з новими і корисними властивостями.
До цього винаходу єдиним джерелом варіантних ацил-АПБ-десатураз була тканина рослин, які синтезують незвичні ізомери моно-ненасичених жирних кислот. Наприклад, А"-16:0-АПБ-десатуразу одержували з насіннєвої ендосперми кориандра - тканини, яка продукує великі кількості петроселінової кислоти (18:14), незвичної ненасиченої жирної кислоти. Цей винахід забезпечує конструювання і виробництво нових типів ацил-АПБ-десатураз без необхідності виділення КДНК для цих ферментів з рослинних джерел.
Крім того, цей винахід забезпечує конструювання ацил-АПБ-десатураз, які можуть каталізувати синтез економічно цінних мононенасичених жирних кислот, які не зустрічаються у природі.
В більш конкретному прикладі цей винахід надає альтернативний засіб для одержання петроселінової кислоти у рослинах. Ця жирна кислота має ряд можливих промислових і харчових галузях застосувань.
Єдиний відомий шлях створення петроселінової кислоти у рослинах містить введення А"-ненасищенности 16:0-АПБ з подальшим подовженням, що утворилась 16:1/47-АПБ, щоб одержати 18:14? (або петроселіноіл)-
АЛЕ. Для цього шляху потрібна, поруч з іншими засобами, нова ацил-АПБ-десатураза і специфічна система подовження ацил-АПБ. Серед описаних нижче мутантних десату-раз існують ферменти, які можуть каталізувати введення А? нена-сиченості 18:0-АПБ, щоб утворити петроселіноіїл-АПБ. Такі ферменти корисні для одержання петроселінової кислоти у трансгенних культурних рослинах без необхідності у передачі додаткових генів для шляху подовження 16:14-АПБ. Цей шлях представляє собою у теперішній час обмеження можливостей одержання петро-селінової кислоти у трансгенних культурних рослинах шляхом введення гену для А"-16:0-АПБ-десатурази.
Таким чином, мутанти, створені шляхом змінення ідентичності одного або декількох контактових залишків у каналі, що зв'язує субстрат, можуть бути використані для створення ацил-АПБ-десатураз, що мають унікальні функціональні характеристики. Такі ферменти можуть бути використані, наприклад, для створення рослинних масел, збагачених моно-ненасиченими жирними кислотами. Такі рослинні масла важливі для харчування людей і можуть бути використані як поновлюємих джерел промислових хімічних реагентів. Крім того, можливість маніпулювання перевагами довжини ланцюга і положень подвійних зв'язків цих молекул забезпечує спосіб управління фізичними властивостями і промисловим застосуванням традиційних рослинних масел. До того ж, на основі цього опису можна експлуатувати розробку трансгенних культур, здатних продукувати незвичні типи мононенасичених жирних кислот.
Мутанти, описані нижче у Прикладі 2, проявляють певно унікальні властивості. Наприклад, у ацил-АПБ- десатураз природного типу існує тенденція до прояву дуже сильної переваги до жирних кислот з визначеною довжиною ланцюга і розташуванням зв'язків. Проте у описаних нижче експериментах було показано, що амінокислотні заміщення у контактових залишках усередині каналу, що зв'язує субстрат, модифікують цю перевагу. Наприклад, описано химерні мутанти, які мають здатність каталізувати створення ненасиченості у субстратах різної довжини (наприклад 16:0 і 18:0) з швидкостями, що розрізнюються не більш, ніж у 4 рази.
Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують ці мутантні ацдцил-АПБ-десатурази, можуть бути використані для експресії мутантного ферменту з використанням методик рекомбінантної ДНК. Наприклад, при клонуванні у придатному векторі експресії мутантна ацил-АПБ-десатураза може бути піддана експресії у різноманітних типах клітин, включаючих, наприклад, прокаріотичні і еукаріотині клітини.
Вектори прокаріотиної експресії застосовуються, наприклад, для приготування великих кількостей білка, кодованого послідовністю ДНК, що розглядається. Після очищення традиційними методами цей білок може бути використаний для введення ненасиченості у жирні кислоти. Крім того, у деяких галузях застосування можна використати неочищений продукт лізиса такої культури прокаріотичних клітин.
Вектори еукаріотичної експресії використовуються тоді, коли важливим є додавання вуглеводних бокових ланцюгів (тобто глікозилування) до білка. Бокові вуглеводні ланцюги впливають на активність білка різним чином. Наприклад відомо, що деякі білюи є неактивними у неглікозилованому стані. Крім того, здатність негликозилованого білка створювати комплекс з іншими білками (наприклад антитілами або регуляторними молекулами) може бути сильно подавлена у відсутності гликозилування. Після очищення традиційними методами мутант ацил-АПБ-десатурази, експрессований у еукаріотичній системі (наприклад, у системі експресії бакуловіруса), може бути використаний для модифікування довжини ланцюга і положення подвійного зв'язку у жирній кислоті. У багатьох випадках цей білок також можна використати як частину неочищеного продукту лізиса.
Мутантні ацил-АПБ-десатурази також можна клонувати у векторі експресії рослини. Ці вектори дозволяють одержати цільовий білковий продукт, наприклад мутантну ацил-АПБ-десатуразу, усередині середовища рослинної клітини, у межах якої залишається субстратна жирна кислота. При одержанні ферменту іп 5йи модифікація продукту може відбуватись до збору клітин, що забезпечує швидке очищення цільової жирної кислоти, що має придатне розташування подвійного зв'язку, і без необхідності у коштовних стадіях виробництва. В деяких випадках, у конкретній трансгенній рослині, цільовими можуть бути декілька мутантних ацил-АПБ-десатураз, для того щоб одержати жирні кислоти, що мають подвійні зв'язки у декількох положеннях. Рослини також можна легко культивувати і вирощувати у великих кількостях. У багатьох випадках цей білок також можна використати як частину неочищеного продукту лізиса.
ПОЯСНЕННЯ ПРИКЛАДАМИ.
Приклад 1
Результати і їх обговорення
Карта електронної густини і якість моделі
Трьохрозмірну структуру рекомбінатної гомодимерної АЗ-стеароіл-ацилнесучої білкової десатурази, архетип розчинених десатураз рослинних жирних кислот, які перетворюють насичені жирні кислоти у ненасичені, визначають методами кристалографії білка з розрізнювальністю 2,4 Ангстрема (А). Шестикратно усереднена густина електронів для основного ланцюга і бокових ланцюгів добре розрізнюється для більшої частини поліпептидного ланцюга. Винятком є перші 18 залишків на М-кінці ланцюга, які не розрізнюються по електронній густини і, можливо, згинаються у кристалічній решітці. Залишки 336-347, розташовані у області петлі, досить погано розрізнені у картах електронної густини, і також саме у цій частині білкової структури були знайдені найбільші відхилення від некристалографічної симетрії. Сумарний реальний фактор просторової кореляції по залишках (субодиниця Вг і карта шестикратно усередненої густини електронів 2го-Ес) дорівнює 0,76. Такі критерії, як кристалографічний Б-фактор (К-22,095, Ксвоб-28,590 з обмеженнями некристалографічної симетрії), добра стереохімія моделі (середньоквадратична помилка довжини зв'язку 0,008 А), графік Рамачандрана (тільки одна стороння область з можливих областей у субодиниці, за вийнятком гліцинових залишків) і характер водневих зв'язків, що спостерігається, все це вказує, що прослідковування ланцюга для десатурази жирних кислот є вірним. Існує дуже ясна картина для пептидного атому кисню лізина 262, залишку з недозволеного конформацією основного ланцюга. Високе середнє значення бета-фактору дозволяє припустити, що ця молекула є гнучкою. Найбільш упорядковані частини молекули представляють собою області, залучені у взаємодію димера і гексамера, у той час як поверхові петлі часто мають дуже високі значення бета-фактору.
Знайдено, що головні зв'язуючи центри для іонів диціаніду золота (Ац(СМ)2| у кристалах дериватизованої десатурази близькі до бокових ланцюгів Кб і С61 на поверхні молекули. Одним з другорядних центрів є внутрішній центр, між боковими ланцюгами Н2г0О3 ії С222, причому другий другорядний центр знаходиться у області, у якій імовірно розташований М-кінець ланцюга.
Загальна форма субодиници А?-десатурази представляє собою компактний циліндр з розмірами 35х35х50 і з доступною площею поверхні 16773. Окрім петлі візирної осі на самому С-кінці ланцюгу, ця субодиниця у основному складається з спіральних вторинних структур, укладених усередині одного великого домена.
Дев'ять із загальних одинадцяти с-спіралей створюють антипаралельний пучок спіралей.
Частина ланцюга при М-кінці розупорядкована, причому для перших 18 залишків не спостерігається картина електронної густини. В наступних 15 залишках відсутня повторна структура, і вони створюють довгий ланцюг, упакований уздовж спірального пучка з слабими специфічними взаємодіями, які стабілізують цю структуру. Перша спіраль с1, що складається з 23 залишків, починається і закінчується у конфигурации-3о і є настільки гнучкою, що її перша половина створює ковпачок на одному кінці пучка, а її друга частина представляє собою першу спіраль пучка. Ланцюжок продовжується в тому ж напрямку, утворюючи витки, зв'язані водневим зв'язком, і спіраль-31о. Ковпачок на другому кінці пучка створюється з спіралей о2 і о? і б- термінальної візирної осі. Чотири з цих спіралей, о3, с4, об і «7, які є дуже довгими і мають відповідно 28, 29, і 31 залишків, надають ліганди для центру з двох атомів заліза. Хоч о3 має злом у спіральній структурі у середині залишку 107-108, спіралі о3 і с4 є симетричними по відношенню до сб і «7 І можуть бути суміщені з середньоквадратичною помилкою 1,39 А для 44 залишків. При такому суміщенні також вирівнюються атоми заліза у межах 1А. Вирівнювання відповідних послідовностей показує, що існує незначне збереження послідовностей, окрім залишків, залучених у зв'язування з кластером заліза. Це суміщення також орієнтує частина ковпачка с1 на с2. Зв'язки між цими спіралями також приблизно суміщуються, хоч і відсутня детальна структурна подібність. Між «Зб і с4 існує виступаюча петельна структура, стабілізована декількома витками з водневими зв'язками. Пучок завершується спіралями сб, «8, 010 і о11, які дуже викривлені.
Існує велике число сольових містків, 26, за винятком тих, що взаємодіють з іонами заліза у межах субодиниці. Це відповідає 0,069 іонної пари на 1 залишок, що вище середнього числа іонних пар на залишок (0,04), виведеного з огляду 38 білкових структур високої розрізнювальності. Сім таких сольових містків у ЛУ- десатуразі залучаються у взаємодії між спіралями у межах пучка, забезпечуючи правильну взаємну упаковку і, у деяких випадках, правильну орієнтацію лігандів заліза. Вісім пар здійснюють контакти між спіралями, а три інші залучені у маятникове зв'язування витків між спіралями пучка. Три пари залучені у контакти зі спіраллю-
Зіо і петлею після с8.
Специфічною рисою субодиниці А?-десатурази є досить плоска поверхня, яку створюють спіралі о, сб, о7, 010 і с11. Ця поверхня не залучена у контакти між субодиницами у димері, але доступна з розчину.
Димер
Поверхня розділу між субодиницами у димері займає площу поверхні 5826А2? на димер, тобто 17,49 поверхні димера. Ці двократні взаємодії містять простяжні контакти між спіралями у пучці; від «ЗБ до тієї ж спіралі у другий субодиниці, між с 4 Ї ох 5, і зверху ос 2 і о 4 до відповідних спіралей у другій субодиниці. Також існує множина контактів між виступаючою петлею між «Зб і ох 4 і М-кінцем «Зб і о 5. Крім того, залишки у зв'язці між о1 і ох 2 здійснюють контакти з о. 4 і о 5 у другій субодиниці. Існують три зарядових взаємодії у контактовій ділянці димера, у дві з яких залучені залишки з с; 5. Центри з двох атомів заліза ізольовані у димері на відстані більше, ніж 23А, і між ними відсутні прямі контакти.
Некристалографічна симетрія і кристалична упаковка
Кристалична асиметрична комірка містить три димера ЛО-десатурази. В цих димерах субодиниці співвідносяться по некристалографічних вісях другого порядку, які для одного з димерів паралельні одній з кристалографічних осей другого порядку. Під прямим вуглом до неї, паралельно "а", існує некристалографічна гвинтова вісь третього порядку, що відноситься до трьох димерів. Трансляція становить одну третину довжини "а", тобто вона є локальною віссю 31. Контакти між димерами не є простяжними і мають той ж порядок величини, що і інші контакти кристала, і, мабуть, вплив контактів кристала на його структуру є незначним, що підтверджується спостережуваними малими відхиленнями від не-кристалографічної симетрії. Найбільш великі відхилення одержані для залишків 336-347, де 336, Е347 і/або К346 здійснюють контакти кристала, включаючи сольові містки, у деяких субодиницях. Як відзначалось вище, у цій області електронна густина є малою. Інша область з відхиленнями від некристалографічної симетрії містить залишки від 19 до 50, які намотувані навколо субодиници, і також здійснюють різні контакти вільних кристалів у субодиниці. Упаковка субодиниць, що відповідають одній асиметричній комірці, розглядається уздовж осі третього порядку і однієї з осей другого порядку.
Центр з двох атомів заліза
В попередніх дослідженнях було показано, що А?-десатураза містить чотири атома заліза в одному димері, причому методами оптичної і Мессбауровської спектроскопії було встановлено, що ці іони заліза складають кластери оксо-дизаліза. Тепер ці кластери оксо-дизаліза виявлені у великій множині білків, які здійснюють як каталітичні, так і некаталітичні функції. Вони містить два атому заліза, пов'язаних містковими або ооксо-, або гидрокси-лігандами, причому їх класифікують на основі різних мотивів первинних послідовностей, що надають кластерні ліганди, і на основі структурних розбіжностей, виявлених методом рентгенівської кристалографії. Було описано чотири класу: один містить гемеритрин і міогемеритрин, другий містить субодиницю К2 рибонуклеотидної редуктази, бактеріальні вуглеводневі гідроксилази і А?-десатуразу, третій містить рубреритрин і четвертий містить Бе(11)-2п(ІІ) фосфатазу пурпурової кислоти (Ре(11І)-2п(ІЇ) кислу фосфатазу Бігтаїтаїйап). Окрім цих розчинених білків, існує окремий клас функціонально родинних інтегральних мембранних білків, включаючих десатурази жирних кислот і вуглеводневі гідроксилази, які містять центри негемного заліза, активованого киснем, які ще мають бути структурно охарактеризовані.
З кристалічної структури А?-десатурази випливає, що цей фермент належить до класу І! білків з двома атомами заліза і що він містить металевий кластер. Відстань між іонами заліза становить 42А, а координаційною геометрією цих іонів заліза є спотворений октаеєдр, у якому одна позиція ліганда є незайнятою. Структура кластера має високу симетрію. Роль місткових лігандів виконують обидва залишку
Е143 з спіралі со 4 і Е229 з о. 7. Е105 з ох За є бідентатним лігандом для одного іона заліза і відповідно Е196 з об є бідентатним лігандом для другого іона заліза. Кожен іон заліза також пов'язується атомом азоту, МО1 у
НІ46 з с4 і Н2г32 з 7 відповідно. Орієнтація лігандів заліза у деяких випадках підтримується водневими зв'язками з боковими ланцюгами; Е105 взаємодіє з Н2ОЗ, Е143 з атомом Меї1 у М/139, Ме2 у НІ1І46 з боковим ланцюжком 0228, який, в свою чергу, взаємодіє з боковими ланцюгами К145 і УМб2, Меє2 у Н232 з боковим ланцюжком Е143, який, в свою чергу, взаємодіє з боковим ланцюжком К231. Ще далі від одного з іонів заліза виявлений атом Ме! у М/139, який можна розглядати як ліганд другої оболонки. Біля кластера заліза електронна густина відповідає молекулі розчинника. Вона знаходиться на відстані від іонів заліза відповідно 3,2 і 3,4А, і тому вона не є частиною першої координаційної оболонки кластерного центру.
Форма десатурази у кристаличній структурі
Наявність в А?-десатуразі кластера з двох атомів заліза, пов'язаних д-оксо-містком у стані дизалізо(І!), було однозначно продемонстровано з використанням Мессбауеровської і Рамановскої резонансної спектроскопії. Тому дивно, що н-окКсо-місток не був виявлений на карті електронної густини А?-десатурази, оскільки використаний у експериментах фермент знаходився у окисленому стані і у маточний розчин не додавали відновлюючі агенти. Крім того, відстань між іонами заліза (4,2А) більше очікуваного для кластера з двох атомів заліза з непошкодженим рн-оксо-містком. В окисленій формі рибонуклеотидної редуктази, що містить д-оксо-місток, відстань залізо-залізо становить 3,3А. Геометрія, що спостерігається для А?-десатурази разюче аналогічна тій, що спостерігається у відновленій формі рибонуклеотидної редуктази, у якій, при хімічному відновленні К2, відстань між іонами заліза зростає до З3,8А, д-оксо-місток видаляється, і лігандне оточення стає вельми симетричним, що видно з кристалографії білка і Мессбауеровської спектроскопії. Можна припустити, що при впливі рентгенівського випромінювання на десатуразу відбувається фотохімічне відновлення металевого центру, яке супроводжується втратою цд-оксо-містка і перебудовою лігандів. Таким чином, представлена тут структура А?-десатурази найбільш імовірно відбиває відновлену форму ферменту. В кристаличній структурі А?-десатурази виявлено високосиметричне лігандне оточення залізного кластера у дизалізній формі ферменту, згідно з дослідженнями резонансної Рамановскої спектроскопії. Відхилення у симетрії лігандного оточення у відновленому стані ферменту, як було припущено раніше з температурної залежності даних Мессбауєровскої спектроскопії, можливо, обумовлені зміненнями довжини і кутів зв'язків у двох металевих центрах, які надто малі, щоб їх можна було спостерігати у картах електронної густині при існуючій розрізнювальній здатності.
Активний центр і взаємодії з іншими білками
Описана тут структура А?-десатурази дуже імовірно представляє собою структуру дизалізної форми ферменту, яка є результатом взаємодії А?-десатурази і ферредоксина у рослині. З трьохрозмірної структури можна припустити два можливих шляху перенесення електронів від поверхні до залізного центру. Один шлях простирається уздовж осі пучка спіралей і містить структурно послідовні кластери ароматичних бокових ланцюгів М/139, М/135, 236, Е189, М/132. Атом Ме1 у МУ139 знаходиться на досить близькій відстані до одного з атомів заліза, а атом Ме1 у УМ132 є направленим до поверхні субодиниці, близької до виступаючої петлі між оЗр і со4. Ця петля і ковпачкова частина с1 потім можуть утворити поверхню для взаємодії молекули ферредоксина. Другий можливий шлях перенесення електронів від поверхні до залізного центру містить залишки М/62, 0228 і НІ146, аналогічні тим, що запропоновані для К2. Цей шлях приводить до створення плоскої поверхні, що створена спіралями с, об, «7, 010 та с11.
Молекула розчинника, зв'язана коло залізного центру, розташована у невеликому гідрофобному кармані, і найбільш близькими амінокислотними боковими ланцюгами до цієї молекули розчинника є Т199 і М/39.
Аналогічна порожнина з треоніновим боковим ланцюгом у еквівалентному положенні була виявлена у ММО, і було припущено, що ця порожнина може забезпечити придатне місце для зв'язування молекули кисню.
Розуміється, що боковий ланцюг Т213 у МАО залучений у активацію кисню таким ж чином, як залишок Т252 у цитохромі Р450.
Оскільки залізний центр занурений у внутрішню частину А?-десатурази, можна очікувати, що буде ідентифікована западина для субстрату, облицьована гідрофобними залишками, що з'єднує поверхню ферменту з активним центром. Дійсно, можна виявити вузький, дуже глибокий канал, що простирається від поверхні далеко всередину білка. Цей канал підходить до дизалізного центру з тієї ж самої сторони, що і передбачуване місце зв'язування кисню. На дні цього каналу виявлений боковий ланцюг 1115 і стінки, що складаються з залишків М/139, 71192, М111, М114, М191, 9195, Р26б, 799 і Т104. Потім цей канал проходить залізний кластер і продовжується по напрямку до поверхні, причому у вузькому вході у цю западину знаходяться залишки 292, М265, 279 і 5283. Загальна форма субстратного каналу, який зігнутий у місці залізного кластера, сприяє зв'язуванню продукту, олеоіїл-АПБ, що має цис-конфігурацію при подвійному зв'язку.
Після очищення, у карті усередненої густини електронів 2Б0о-Ес у цьому каналі була виявлена сильно розтягнута електронна густина, яку не можна приписати розчиннику або атомам білка. На основі форми цієї густини і гідрофобного характеру кармана, можна зробити висновок, що ця електронна густина може представляти гідрофобний ацильний кінець молекули бета-октилглюкозиду. Вуглеводневий кінець октилглюкозиду міг б добре відповідати цій густині, але густина, що відповідає функціональній групі цукру, погано визначена. Ця передбачувана молекула октилглюкозиду орієнтована своїм кінцем глибоко униз у гідрофобний канал, коло дизалізного кластера, а вуглеводна функція простирається по напрямку до поверхні.
Низька електронна густина у цій частині молекули можливо вказує на локальне розвпорядкування, яке є результатом менш специфічних взаємодій з ферментом.
При моделюванні стеаринової кислоти у передбачуваному суб-страт-зв'язуючому кармані атом вуглецю
С9 зображається на відстані приблизно 5,5А від одного з іонів заліза. Цей атом вуглецю, при якому буде формуватись подвійний зв'язок, також близький до малого карману з пов'язаною молекулою розчинника.
Дійсно, молекула води є зв'язуючим містком на відстані між атомом СУ субстрата і найближчим іоном заліза.
Імовірно, що у активному ферменті цей карман зайнято молекулою кисню, що пов'язана з одним або обома атомами заліза. В ході каталіза може створюватись пероксидний радикал, який здатний видаляти один з атомів водню у положенні СУ жирної кислоти.
Зіставлення з іншими білками з двома атомами заліза
Накладення структури А?-десатурази на трьохрозмірні структури двох інших білків з двома атомами заліза субодиниці К2 рибонуклеотидної редуктази з Еб5сПпегіспіа соїї і о-субодиниці ММО з Меїпуіососси5 сарзшаїе показує, що їх загальні структури досить подібні і узгоджуються з середньоквадратичною помилкою 1,90А для 144 Се-атомів (А"-десатураза відносно Р2) і 1,98А для 117 еквівалентних Сео-атомів (А?-десатураза відносно
ММО). Дуже подібні їх складки, що складаються головним чином з со-спіралей, від «1 до с8 і є10 дають свій внесок у К2 і ММО. Існує мало збережених амінокислот, окрім лігандів заліза, проте не може бути сумнівів, що ці ферменти є еволюційно пов'язаними. Існують значні розбіжності у структурі залізних центрів цих трьох білків. Загалом, металевий центр у А?-десатуразі є значно більш симетрічний, ніж у двох інших білках. Проте, при зіставленні з структурою відновленої форми К2 координаційна геометрія диядерних центрів заліза у ДУ- десатуразі і 22 стає більш подібною. Найбільш значне відрізнення у тому, що у А?-десатуразі кінцеві карбоксилати Е105 і Е196 відповідно діють як бідентатні ліганди, тоді як у К2 еквівалентні бокові ланцюги є монодентатними лігандами для іонів заліза.
Серед цих ферментів К2 є унікальним у тому смислі, що він створює сталий радикал у положенні М122.
Відповідний залишок у А?-десатуразі представляє собою 1150, який розташований у гідрофобному кластері, здійснюючи взаємодії упаковці у чотириспіральному пучці, що зв'язує кластер заліза, причому відсутні дані, які могли б вказати, що цей залишок необхідний для каталітичної активності.
Існує мало амінокислотних залишків, які зберігаються у всіх трьох ферментах. Серед них є ліганди до іонів металу, за винятком Е105, який заміщений аспарагіновою кислотою у К2. Єдиними іншими незмінними залишками є 1225 і 0228. Залишок 1225 знаходиться коло дизалізного кластера (найближча відстань 4,6А) на протилежній стороні субстратного каналу. Боковий ланцюжок упакований між Н203, НІ46 і М/62 у трьохрозмірній структурі, і для більш докладного дослідження його функції необхідно чекати результатів вивчення локально направленого мутагенезу. Інший незмінний білковий залишок у трьох ферментах, 0228, є частиною шляху перенесення електрона від двоядерного залізного центру до поверхні білка, який запропонований для К2. Цей шлях у К2 проходить від одного з іонів заліза через боковий ланцюг НІ118, від 0237 до Уу48, який розташований на поверхні білка. Ці залишки зберігаються у А?-десатуразі, і може бути постульованим аналогічний шлях для перенесення електрона, включаючий структурно еквівалентні залишки
НІ46, 0228 і М/62, як згадувалось раніше. Більш того, для ММО також можна припустити злегка модифікований шлях для перенесення електрона. У цьому випадку зберігаються ліганд заліза (Н147) і залишки аспарагінової кислоти (0242), проте структура на поверхні є різною. Проте ароматичний боковий ланцюжок (у67) на поверхні знаходиться близько від бокового ланцюга 0242.
Більша частина інших залишків, збережених між А?-десатуразою і 2, з одного боку, і А?-десатуразою і
ММО, з іншого боку, розташована на поверхні білка або залучена у взаємодії упаковки. Консервативні залишки, спільні між 2 і А?-десатуразою біля центру з двох атомів заліза, представляють собою залишки
МИ35 і М/139. Хоч УМ135 і ММ139 точно зберігаються у десатуразах, відповідні залишки М/107 і М/111 у К2 не є точно консервативними. За винятком ТА і білка Е.соїї, М/135 заміщається фенілаланіновим або тирозиновим боковим ланцюжком. Аналогічно, М/139 заміщається глутаміновим залишком.
Матеріали і методи
Очищення і кристалізація ферменту
Рекомбінантну А?-десатуразу експресують у клітинах Е.соїї і очищають, як описано раніше (Фокс і ін.,
Віоспетівігу, 33:127766 (1993)). Кристалізацію ферменту здійснюють згідно публікації (Шнайдер і ін., У. Мо.
ВіоІ.,, 225:561 (1992)) з невеликими зміненнями. Зразки ферменту концентрують до вмісту 12-18мг/мл.
Аликвоту білкового розчину (7,5мл) змішують з такою ж кількістю резервуарного розчину, поміщують на накрівне скло і при 207"С доводять до рівноваги з їмл розчину джерела. Резервуарний розчин містить
О,Овмоль/л какодилового буфера з рН 5,4, 200ммоль/л ацетата магнію, 75ммоль/л сульфата амонію, 2ммоль/л хлориду літію, їІммоль/л хлоріда калію, 0,295 бета-октилглюкозиду і 12-1595 поліетиленгліколю (ПЕГ) 400 у якості осадника. Кристали були орторомбічними, просторова група Р212121 з розмірами комірки а-82,2, р-147,8 і с-198,2А.
Збір даних і приготування похідних тяжких металів
Спроби приготування похідних тяжких металів шляхом просочення природних кристалів ферменту розчинами різних солей тяжких металів у маточному розчині були не зовсім успішними. Здебільшого експерименти з просоченням приводили до розщеплення кристалів або до неізоморфних кристалів, і тільки одна корисна похідна тяжкого металу може бути приготовлена просоченням кристалів десатурази у маточному розчині, вміщуючому 5ммоль/л КАщ(СМ)»2, протягом 1 тижня. Дані рентгенографії для природних і дериватизованих кристалів збирали на багатожильній зонній детекторній системі ОС50О (див. Хемлін, Мешйоа5
Еплутої., 114:416 (1985)) при відділі молекулярної біології у м.Уппсала (Швеція). Виміряні кадри були оброблені за допомогою системи зонного детектора МАЮОМЕ5 (Мипісп агеа деїесіог МЕ зузіет, Пфлю-грат,
Довідник користувача. Лабораторія фірми "Соїа Єргіпд Нагрог", Нью-Йорк, США (1987)). Другий набір даних для природних кристалів збирали на спектральній лінії ХІ2-3 при М5І 5, відділ молекулярної біології у
Брукхевенської національної лабораторії. Кадри даних збирали у вигляді 10 осциляцій, використовуючи плату зображення МАК Кезеагсп. Кадри даних були оброблені за допомогою ОЕМ2О і масштабовані, використовуючи ЗСАГЕРАСК.
Визначення фаз, побудова моделі і кристалографічне вдосконалення
Більшу частку кристалографічних обчислень здійснюють, використовуючи комплект програм ССРА (Проект комп'ютерної співпраці, Ме4, Асіа СгузіаІодг., 050:760 (1994)). Початковий кристалографічний аналіз проводять з набором даних, зібраних на багатожильному детекторі при розрізнювальній здатності до ЗА.
Різністну карту Паттерсона для похідної золота аналізують, використовуючи К5РО5 (Кнайт, докторська дисертація. Шведський університет сільськогосподарських наук, Уппсала, 1989). Для розрахунку різністних карт Фур'є були використані два центру, пов'язані з сильним перехресним піком у різністній карті Паттерсона, і були ідентифіковані два нових центра. Остаточно були виявлені б головних центрів і 12 другорядних центрів, причому параметри тяжкого металу вдосконалили, використовуючи МІРНАКЕ. З результатів розрахунків обертальної функції і положень іонів металу, можна визначити напрямок і положення операторів локальної симетрії, віднесених до шести субодиниць А?-десатурази у асиметричній комірці. Потім застосовують шестикратне усереднення некристалографічної симетрії з використанням програми КАМЕ (Джонс, на
Вихідному семінарі по ССРА, 1992: Молекулярне заміщення, під ред. Додсона, Гоувера і Вольфа, с.91-105,
Дейрсбюрська лабораторія, Дєйрсбюрі, Великобританія (1992)) і сферичної оболонки з центром у передбачуваному положенні однієї субодиниці А?-десатурази, для того щоб уточнити початкові фази 5ІВ. З карти електронної густини при низькій розрізнювальній здатності, на основі цих фаз, можна ідентифікувати частину центрального чотириспірального пучка, координуючого центр з двох атомів заліза і атоми заліза.
Координати атомів заліза були уточнені з аномальних нативних даних, а нові фази були розраховані на основі похідної золота і аномального внеска від атомів заліза. Нова оболонка для субодиниці була виконана з використанням методу МАМА (Клейвегт і Джоне, Асіа Сгузі. 050:178 (1994)) шляхом приблизної орієнтації субодиниці К2 у правильному положенні для пучка спіралей.
Після некристалографічного усереднення стала можливою побудова вихідної моделі десатурази по карті електронної густини. Були здійснені цикли побудови моделі, її вдосконалення у ХРІ ОК (Брюнгер А., Асіа
Сгузі. А45:50 (1989)), (Брюнгер А., Довідник по Х-РІ ОВ, Йельський університет, Нью Хевен, шт. Коннектікут (1990)), повторне визначення оболонки, вдосконалення операторів симетрії з використанням ІМР (Клейве"г |і
Джоне, Асіа Сгубі. 050: 171 (1994)) і усереднення, доти поки у усереднених картах не з'являлась нова електронна густина. На цій стадії з карт 2Бб0-Ес була побудована ще одна петля, яка, мабуть, має іншу структуру у субодиницях.
Кристалографічне вдосконалення здійснювали у ХРІ ОК, використовуючи силове поле Енга і Хубера (Енгіі
Хубер, Асіа Сгувзі. А47: 392 (1991)) і обмеження некристалографічної симетрії. 3-за низької розрізнювальної здатності (3,1А) набору даних використали сумарне В-значення. На цій стадії модель мала кристалографічний
А-фактор рівний 26,795 при обмеженнях шестикратної некристалографічної симетрії, накладених цим вдосконаленням. На цій стадії уточнення став доступним новий нативний набор з розрізнювальностю до 2,4А, зібраний на М5І 5, і уточнення продовжувалось з цим набором даних. Процес вдосконалення слідкувався по 2,595 відображенням, які не були включені у уточнення, але були використані для розрахунку вільного значення фактору Ксв (А. Машге, 355:472 (1992)).
Навіть при розрізнювальності 2,4А спостереження до параметричного відношення становить тільки близько одиниці, і проблема уточнення погано виконується. Тому у ході всього процесу вдосконалення були використані обмеження некристалографічної симетрії, для того щоб уникнути пере-апроксимації даних по дифракції. Обмеженням не піддавались тільки ті частини структури, для яких з карт усередненої електронної густини було підтверджено, що вони не підпорядковуються некристалографічної симетрії. Ці частини містять залишки 19-50, 121-122, 127-129, 208-212, 241-253, 259-260, 308-319, 336-348 і деякі бокові ланцюги.
Електронна густина для деяких залишків у області 336-347 настільки низька, що їх положення слід розглядати умовно, і тому зайнятість для цих атомів встановлена рівною нулю. Сумарне анізотропне вдосконалення знижує вільне значення фактору Ксв приблизно на 295. На цій стадії у модель були введені молекули води.
Крім того, були уточнені індивідуальні значення В-факторів, але при обмеженні некристалографічної симетрії.
Остаточна модель мала кристалографічний фактор ЕК, який дорівнював 22,095 (Ксв-28,595).
Середньоквадратичні відхилення для обмежених положень Со (263 атома) субодиниці А до відповідних частин інших субодиниць становлять 0,06 і для всіх атомів Со (345 атомів) - 0,26; 0,23; 0,24; 0,32; 0,25, відповідно.
Цю білкову модель аналізували, використовуючи варіанти РЕРЕГІР і Е5РІТ у О (Джоне та ін. Асіа сгувзі.
А47:100 (1991)) і програму РКОСНЕСК (Ласковській та ін. У. Аррі. Сгуві. 26:282 (1993)). Координати атомів будуть депоновані у Брукхевенській банк даних білків.
Порівняння структур
Всі структурні суперпозиції були здійснені по методу найменших квадратів, використовуючи О (Джонс та ін. Асіа сгузі. А47: 100 (1991)), причому вони були виконані попарно. Суміщення було виконано шляхом вибору початкового набору атомів Со, вміщуючих чотири відрізка поліпептидного ланцюга (у кожному приблизно по залишків) від чотирьох спіралей, вміщуючих ліганди для центру з двома атомами заліза. Цю початкову орієнтацію послідовно максимізували шляхом включення всіх атомів Со з атомних моделей. Залишки вважались структурно еквівалентними, якщо вони були у межах 3,8 один від одного і у межах послідовного відрізка більше ніж від трьох еквівалентних залишків.
Приклад 2
Результати і їх обговорення
Підхід поєднання елементів амінокислотної послідовності з структурно родинних ферментів з різними властивостями виявилея ефективним при одержанні характеристики субстрату і позиційних особливостей ферментів, модифікуючих жирні кислоти, таких як ліпоксигенази ссавців і рослинні ацил-АПБ-тіоестерази. Цей підхід був використаний тут для ідентифікації залишків, які відповідальні за розбіжності у властивостях Л?-18:0-
АПБ-десатурази і Ае-16:0-АПБ-десатурази, кодуємих кКДНК Т.аїага ртАО і рТАА" відповідно. Зрілі поліпептіди, кодовані цими кКДНК, розподіляють 6595 ідентичності амінокислотної послідовності. Початково були створені два химерних мутанта: а) Химера 1, вміщуюча перші 171 амінокислот зрілої Ле-16:0-АПБ-десатурази, пов'язаної з іншими 185 амінокислотами АЗ-18:0-АПБ-десатурази, і б) Химера 2, вміщуюча перші 227 амінокислот зрілої А?-18:0-АПБ-десатурази, пов'язаної з іншими 134 амінокислотами Ае-16:0-АПБ-десатурази.
Обидва ферменту проявляють тільки детектуєму активність А?-18:0-АПБ-десатурази. Окрім аналогічної каталітичної активності, ці мутанти розподіляють область перекривання 50 залишків (залишки 178-227) АЗ- 18:0-АПБ-десатурази.
Це дозволяє припустити, що детермінанти довжини ланцюга і особливостей розташування подвійного зв'язку присутні у цій частині А?-18:0-АПБ-десатурази. Таким чином, була створена Химера 3, у якій залишки 172-221 Ае-16:0-АПБ-десатурази були замінені відповідною ділянкою з 50 амінокислот з ЛЗ-18:0-АПБ- десатурази. Одержаний фермент каталізував створення ненасиче-ності АЄ або А? як у 16:0-АПБ, так і 18:0-
АПБ. Майже ідентична активність була одержана для Химери 4, у якій підгрупа з 30 амінокислот цього домена (залишки 178-207 А?-18:0-АПБ-десатурази) була переміщена у Ае-16:0-АПБ-десатуразу. Як показано на фіг.1, у різкому відрізненні від активності АЄ-16:0-АПБ-десатурази природного типу, цей фермент каталізує створення ненасиченості А? і А? в співвідношенні майже 3:1 і 1:11 відповідно у 16:0-АПБ і 18:0-АПБ. Більш того, питома активність для субстрату 18:0-АПБ була майже вдвічі більше, ніж вимірена для 16:0-АПБ. Ці результати знаходяться у сильному контрасті з активністю Аб-16:0-АПБ-десатурази природного типу. Хоч цей химерний фермент здатний каталізувати введення подвійного зв'язку більше ніж в одне положення 18:0-АПБ, у той самий час ле-16:0-АПБ-десатураза природного типу має помітну активність тільки у створенні ненасиченості Ае у 16:0-АПБ. Крім того, фермент природного типу має у 6 раз більшу активність відносно 16:0-АПБ, ніж з 18:0-
АПБ.
Для додаткової характеристики області 50 амінокислот А?-18:0-АПБ-десатурази меншу частину цієї послідовності переміщали у Аб-16:0-АПБ-десатуразу (Химера 5). На відміну від питомої активності Аб-16:0-
АПБ-десатурази природного типу, питома активність одержаного ферменту була майже однаковою, як для 16:0-АПБ, так і для 18:0-АПБ. Окрім розширеної специфічності довжини ланцюга жирних кислот, мутантна десатураза каталізує введення подвійного зв'язку майже винятково у Аб-положенні 16:0-АПБ і 18.-0-АПБ.
Більш того, питома активність цього ферменту була більш, ніж у два рази вище активності Аб-16:0-АПБ- десатурази природного типу. Частково це може бути наслідком підвищеної сталості мутантного ферменту у
Е.соїї (тобто, мутантна десатураза має більш високі рівні експресії і проявляє підвищену розчинюваність, ніж де-16:0-АПБ-десатураза природного типу).
Область 178-207 АЗ-18:0-АПБ-десатурази містить дев'ять амінокислот, які відрізняються від амінокислот, виявлених у аналогічній частині Аб-16:0-АПБ-десатурази. Шляхом сайт - направленого мутагенезу Аб-16:0-
АПБ-десатурази кожен з цих залишків, або індивідуально, або у сполученні, був перетворений у той, що присутній у АЗ-18:0-АПБ-десатуразі. Була одержана активність, якісно аналогічна активності Химери 4 у результаті такої мутації Аб-16:0-АПБ-десатурази: А181Т/А1880/и189Р/5205М/.2067/5207А (Примітка: нумерація амінокислот дана згідно з АЗ-18:0-АПБ-десатуразою). Крім того, фенотип Химери 5 (тобто, розширена специфічність довжини ланцюга) був якісно реалізований шляхом мутації А1880/и189Е у Але-16:0-
АПБ-десатуразі. В цих експериментах також були одержані мутантні десатурази з неочевидними значеннями активності. Наприклад мутація А181Т/А200Е у Ае-16:0-АПБ-десатуразі привела до одержання ферменту, який каталізує толовим чином введення А?-ненасиченості у 18:0-АПБ, але з 16:0-АПБ працює як ЛА?-десатураза.
Проте питома активність цього ферменту з 18:0-АПБ була майже у З рази менше активності, виявленої для 16:0-АПБ. Більш того, мутація АТ181Т/А200Р/5205М/ 2067/5207А у ле-16:0-АПБ-десатуразі дає фермент, який має тільки вимірювану активність введення А?-подвійного зв'язку у 18:0-АПБ, і був майже у чотири рази активніше з цим субстратом, ніж з 16:0-АПБ. Подібно мутанту А181Т/А200Е, цей фермент зберігає активність введення Аб-подвійного зв'язку у 16:0-АПБ.
Змінення властивостей зв'язування субстратів цими ферментами можуть бути зменшені, як основна причина ефектів, що спостерігаються, оскільки їх значення незначно відрізняються від таких для ферменту природного типу. Були оцінені значення констант Михаєліса, Кт, для Ае-16:0-АПБ-десатурази природного типу, Химери 5 і мутанта А18 80/У189БЕ, які знаходяться у інтервалі від 0,2 до 0,бмкмоль/л, як для 16:0-, так і для 18:0-АПБ.
Як описано у Прикладі 1, була визначена кристалична структура касторової А?-18:0-АПБ-десатурази, що забезпечує можливість інтерпретації результатів, одержаних для химер і мутантів, в аспекті оточення активного центру. В структурі субодиниці міститься дуже глибокий і вузький канал, який, як виявилось, відповідає зв'язуючому центру для стеариновокислотної частини субстрату. Форма каналу нав'язуває зігнуту конформацію аліфатичного ланцюга в тому місці, де вводиться подвійний зв'язок (між дев'ятим і десятим атомами вуглецю), що відповідає цис-конфігурації продукту - олеїнової кислоти, причому можливий подвійний зв'язок розташовується досить близько до атому заліза каталітичного центру у субодиниці. Таким чином канал, зв'язуючий субстрат, накладає жорсткі обмеження на довжину аліфатичного ланцюга за межами введеного подвійного зв'язку, що може частково пояснити розбіжності специфічності дії ферментів цього сімейства. Як можна бачити, у варіантах ферменту, які можуть приймати субстрати з меншим числом атомів вуглецю поза подвійним зв'язком, зв'язуючи западини закриті шляхом заміщення амінокислотами з більш об'ємними боковими ланцюгами. Ці амінокислоти, залучені у визначення специфічності, у цій частині зв'язуючого центру представляють собою 114-115, 117-118, 179, 181 і 188-189.
У відсутності структурної моделі для комплексу фермент-субстрат-АПБ, важко безпосередньо прослідкувати за детермінантами особливостей довжини ланцюга по іншу сторону подвійного зв'язку, у напрямку до білка, що переносить ацил. Вважаючи, що АПБ у різних ферментах цього типу пов'язує аналогічним чином, розбіжності амінокислотних бокових ланцюгів у верхній частині субстратного каналу і при вході на поверхні субодиниці дозволили б ферментам пристосувати алкільні ланцюги різної довжини між подвійним зв'язком і фосфопантеїн-простетичною групою АПБ. Проте амінокислоти, оточуючі верхню частину центру зв'язування від подвійного зв'язку до поверхні білка, зберігаються у доступних послідовностях ферменту, і найбільш імовірно, що детермінанти специфічності знаходяться на вході у субстратний канал і на поверхні ферменту, яка взаємодіє з ацил-АПБ. Тут зв'язуючий карман розширюється, і неможливо змоделювати фосфопантеїнову частину стеароіїл-АПБ. Залишки 280, 283, 286 і 294 у цій області не зберігаються між різними ферментами, і вони можуть бути залучені у визначення специфічності субстрату.
З структури зв'язуючого центру у цій області можна дати раціональне пояснення деяким результатам по химерах і мутантах. Всі химери і мутанти містять детермінант 179-189 (фактично залишки 179, 181, 188-189), і таким чином, недивно виявити їх дію на специфічність. Як Химера 1, так і Химера 2 мають дуже низьку залишкову активність, імовірно, з-за деяких стеричних ускладнень при їх створенні. Химера 1 має цей детермінант А?-18:0-АПБ-десатурази у глибокому кармані, а також поверховий детермінант, специфічний для дЗ-18:0-АПБ-десатурази; тільки один детермінант, залишки 114-115 и 117-118, є специфічним для Аб-16:0-
АПБ-десатурази, і таким чином низька залишкова активність цієї химери представляє собою активність ДУ- 18:0-десатурази. Химера 2 має повний детермінант А?-18:0-десатурази у області прихованого кармана і відомого детермінанта Ае-16:0-АПБ-десатурази на поверховому кінці; ця химера також має Л-18:0-АПБ активність. Химери З і 4 зберігають свою активність, один з детермінантів у глибокому кармані є визначником для ЛЗ-18:0-АПБ, залишок А181 заміщається більш великим треоніновим боковим ланцюгом, але між тим А188 заміщається гліцином, а 189 - на фенілаланін, фактично створюючи більше вільного простору у глибині порожнини, і таким чином забезпечуючи активність навіть для Лб-18:0-АПБ-десатурази. Химера 5 відрізняється від химери 4 тільки тим, що в ній зберігається послідовність Ле-16:0-АПБ-десатурази для залишків 203-207. Ці залишки знаходяться у верхній частині субстратного каналу, але не здійснюють безпосереднього контакту з субстратами, і важко зрозуміти їх вплив на специфічність до субстрату. Ці залишки добре зберігаються між відомими десатуразами у цьому сімействі, тільки Ае-16:0-АПВ-десатураза має іншу послідовність для залишків від 205 до 207, і ця область, імовірно, не є частиною природнього детермінанта для специфічності до субстрату. На випадок мутанта А181Т/А200Е зниження АЄе-16:0 активності, в порівнянні з ферментом природного типу, узгоджується з структурними зміненнями у субстратному каналі 3- за зменшення розміру цієї порожнини при заміні АТ81 на треонін. Вплив А2ООЄ неможливо пояснити раціонально, цей залишок знаходиться на поверхні субодиниці і направлений у сторону від субстратного каналу. У всіх секвенованих десатуразах у цьому сімействі, за вийнятком Лб-16:0-АПВ цей залишок є фенілаланіном. З передуючого обговорення ясно, що активність мутанта А181Т/А200Р/5205М/ 2067/5207А неможливо пояснити у межах структури, ми не змогли знайти розумне пояснення впливу змінень у залишках 200 і 205-207.
Таким чином, було показано, що регіо-специфічність і специфічність довжини ланцюга десатурази жирних кислот можуть бути змінені шляхом спеціальних заміщень амінокислот. Детермінанти специфічності довжини ланцюга частково наносять на карту область трьохрозмірної структури, яка визначає форму і розмір каналу, що зв'язує субстрат. Проте деякі з цих залишків знаходяться за межами каналу, що зв'язує субстрат, і змінення у таких залишках можуть привести до нової і корисної активності. При доступності трьохрозмірної структури АПБ-десатурази жирних кислот, представлені тут успішні спроби змінення специфічності до субстратів тепер можуть бути розповсюджені на розумно сконструйовані варіанти ферментів, що мають іншу специфічність до довжини ланцюга, а також регіо-специфічність. Проте це може бути успішним тільки за умови, що на основі кристаличної структури субстратного комплексу і доступності множини амінокислотних послідовностей ферментів у цьому сімействі ми зможемо вирішити, що представляють собою детермінанти специфічності, розташовані на вході у субстратний канал.
Матеріали і методи
Назви жирних кислот скорочені у форматі хуй, де х це довжина ланцюга або число атомів вуглецю у жирній кислоті, у - число подвійних зв'язків і 7 - положення подвійного зв'язку у жирній кислоті відносно карбоксильного кінця молекули (наприклад, олеїнова кислота або 18:14? є вісімнадцативугллецевою жирною кислотою з одним подвійним зв'язком, яка розташована при дев'ятому атомі вуглецю відносно карбоксильного кінця молекули).
Одержання химерних мутантів
Химерні мутанти одержують шляхом зшиття частин кодувальної послідовності зрілих Аб-16:0- і Ае-18:0-
АПБ-десатураз Т.аіаїа через нативні ферментні сайти рестрікції або ферментні сайти рестрікції, створені за допомогою РСВ. Сайт-специфічні мутації у кодувальній послідовності амінокислот 178-202 у АЗ-18:0-АПБ- десатуразі (еквівалентні залишкам 172-196 у Аб-16:0-АПБ-десатуразі) вводять шляхом подовження і ампліфікації олігонуклеотидних праймерів, що перекриваються, з використанням РСК з Ріш-полімеразою (фірма Стратаген). Мутації А181Т/А1880/У189Е зроблені з такими олігонуклеотидами:
БАТОСАТССТООСАСОСАТААСААСССОТАСЗУ (Праймер 15А);
БАСОАООТОТАСАТАААТССОАООТАСООСТТОТТАТССО5 (Праймер 2А);
УТАТСТАСАССТООТАТСАССАСАСООССАСАЗ: (Праймер ЗА); 5УТТОААТТССАТООСАААТСОСТОТСОСССТоТОоСТОоЗ: (Праймер 4А).
Мутації А18 805/У18 9Е вводять, використовуючи такі олігонуклеотиди:
БАТОСАТССТООСОСОБАТААСААСССОСТАСУ (Праймер 18); Праймер 2А; Праймер ЗА; Праймер 4А.
Мутації А181Т/А200Е були створені таким чином: Праймер 1А;
БАСОАБОТОТАВАТАТАТОСОАООТАСОООСТТОТТАТОСОЗУ (Праймер 28); Праймер ЗА; 5УТТОААТТССАТООСАААТОААТОТСОСССТСТоСТОоУ (Праймер 48). Реакції РСК проводять без додавання матриці, використовуючи 12,5 піомолів Праймерів 1А або В і 4А або В і 6,25 пікомолів Праймерів 2А або В і ЗА. Для перших десяти циклів РОК використовують температуру відпалу 37"С і температуру подовження 72"С. Після цього слідують 20 додаткових циклів з підвищеною температурою відпалу, до 5570.
Продукти реакції РОК розщепляють з Ватні і ЕсокіІ і вбудовувають у відповідні сайти рВіцпезосгірі І К5(-) (Стратаген), з яких визначають нуклеотидну послідовність, використовуючи набір Секвенази 2.0 (фірма
Амершам). Потім цю плазміду розщепляють з Ватні і ЕЄсокіІ і виділену вставку легують послідовністю, що кодує амінокислоти 1-171 зрілої Ае-16:0-АПБ-десатурази у векторі експресії рЕТЗа (Новаген). Створену конструкцію (що містить тепер кодувальну послідовність амінокислот 1-196 мутантної або природної Ае-16:0-
АПБ-десатурази) піддають рестрікції дією Мсо! і ЕсокК!І і легують фрагментом МеоІ/ЕсоКІ, що містить кодувальну послідовність решти амінокислот (залишки 197-355) ДО-16: О-АПБ-десатурази і частиною плазміди рЕТЗа (нуклеотиди). Мутацію 5205М/Л.20671/5207А створюють шляхом РСК ампліфікації кодувальної послідовності амінокислот 197-355 у АЄ-16:0-АПБ-десатуразі, використовуючи як матрицю початкову кДНК для цього ферменту у рВішнезсгірі І ЗК(-). 5'-олігонуклеотид (БТІ ТССАТаСОСААСААСОТствастАасаАассСАсСААсоОЗ)), містив придатні мутантні кодони, а Т7-праймер був використаний як 3'-олігонуклеотид у реакціях РОК. Продукт ампліфікації розщепляють з Мсої і Веї! і вбудовувають у сайт Мсоі/ВатнНі плазміди рЕТЗа. Потім фрагмент Мсоі/ЕсовІ! з цієї конструкції легують кодувальною послідовністю амінокислот 1-196 придатної мутантної Аб-16:0-АПБ-десатурази (наприклад
А181Т/А200Р) , щоб створити повнорозмірну кодувальну послідовність. В продуктах реакцій РСЕК секвенують послідовності, щоб підтвердити наявність цільових мутацій.
Продукування ацил-АПБ-десатураз
Ацил-АПБ-десатурази природного типу і мутантні одержують шляхом експресії кодувальних послідовностей у Е.соїї ВГ21 (ОЕЗ) під контролем промотора Т7 РНК-полімерази з використанням векторів рЕТтТЗа або рЕТЗа. Рекомбінантні ферменти, активність яких описана на Ффіг.1, очищають з бактеріальних культур (об'ємом від 6 до 9 л), що культивуються при температурі від 20 до 25"С. Очищення білка здійснюють, використовуючи ОЕАЕ-аніонно-обмінну хроматографію з подальшою 20Н5 (фірма Персептив Байосистем3з) катіонно-обмінною хроматографією з використанням рідкісної хроматографії високого тиску Байокад Спрінт (фірма Персептив Байосистемз). Мутантні десатурази були одержані з чистотою г 9095, а Абе-16:0-АПБ- десатуразу природного типу виділяли з чистотою приблизно 8095. Після очищення ферменти піддають обміну у буфері, що складається з 40ммоль/л гідрохлоріда-Тріс (рн 7,5), 40ммоль/л хлоріда натрію і 1095 гліцеріну, і зберігають у аліквотах при -757С після миттєвого заморожування у рідкому азоті.
Випробування і аналіз ацил-АПБ-десатураз.
Випробування і аналіз продуктів реакції адил-АПБ-десатурази проводять, як описано раніше (Кейхун і ін.
Ргос. Маї. Асад. сі, БА. 89: 1184 (1994)) з такими зміненнями: використали рекомбінантний рослинний фередоксин Апаерепа (22 фем-то-г на 1 випробування) і корінь кукурудзи ЕМЕ (0,4од./випробування) замість фередоксина шпинату і ЕМЕ, причому кількості МАОРН і радіоактивної (1-12С116:0 або 18:0-АПБ, взятих на одне випробування, збільшили відповідно до 2,5ммоль/л і 178 пікомолів (або 1,2 фемто-моль/л). Використана у синтезі субстратів АПБ представляє собою рекомбінатну АПБ-! шпинату. Питома активність (1-12С116:0 або 18:0-АПБ (від фірми Амерікен Рейдіолейблд Кемікалз) становить 55мКюрі/ммоль. Активність ферментів виміряють шляхом визначення концентрації (90) моно-ненасиченого продукту, що утворився при випробуванні десатурази. Розподіл радіоактивності між продуктами і субстратом, що не прореагував, визначають за допомогою фосфоресціювальних зображень продуктів поділення на посрібленій платівці тонкошарової хроматографії (ТШХ) з використанням програмного забезпечення Імідж-Квант і методом рахунку рідкісних сцинциляцій для зскрібків ТШХ.
Визначення положення подвійних зв'язків
Положення подвійних зв'язків у продуктах - мононенасичених жирних кислотах визначають по рухомості метілефірних похідних на посріблених (1595) оплатівках ТШХ і з використанням хромато-мас- спектрометричного (Хромас) аналізу диметилсульфідних аддуктів цих похідних. Випробування створення подвійних зв'язків для Хромас-аналізів проводять з використанням немічених 16:0-, 17:0- і 18:0-АПБ як субстратів і очищених ферментів. На доповнення до результатів, що приведено у тексті, було виявлено близько 1595 ненасичених продуктів, що утворились у результаті реакції 17:0-АПБ з Ае-16:0-АПБ-десатуразой, у вигляді 17:1 А" ізомеру. Інша частина продукту представляє собою 17:1 ЛАЄ, також виявлені слідові кількості 177143,
Фіг.
МОДИФІКОВАНА АЦИЛ-АПБ-ДЕСАТУРАЗА // Питома активність, наномоль/хв/ме білка | загальної питомої .- а . а
Фермент ши я пли активності 16:0-АПБ/18:0-АПБ де-16:0-АПБ-десатураза 99,7 н/вб 10,6 5,3 6 (природний тип) (271)
Химера 4 13,4 4,0 14,7 17,1 12 (Аб/АЗ 178-207/А8) (17) (371) (17)
Химера 4 250 н/в 267 сліди" 17 (Аб/Ая 178-202/А6)
А181Т/А1880/У189Р/ 34,0 12,3 34,5 57,7 12 52ОБМ/Л 2067/3207 АХ (371) (1:2) 1880/1189 37,1 н/в 37,0 сліди 17
А181Т/А2О0Е 149 н/в 312 43,6 3 (1714)
А181Т/А200г/5205ІМ/ 18,7 119 н/в 72,6 1:4
І 20671/3207А 17:
Питомі активності десатурази природного типу і мутантних Ае-16:0-АПБ-десатураз а - Положення подвійних зв'язків визначали, як описано у Примітці 13. б - н/в - не визначали. в - Сху це відношення активностей Аб/А? для даного субстрату. г- Сліди - це «295 від загальної активності для даного субстрату. д - Нумерація амінокислот дана згідно з послідовністю АЗ-18:0-АСР десатурази. е - |дентифікація на основі рухомості метилефірної похідної на посріблених пластинах тонкошарової хроматографії.
Claims (35)
1. Спосіб модифікування довжини ланцюга і специфічності розташування подвійних зв'язків розчинної десатурази рослинних жирних кислот, що включає модифікування амінокислотних контактових залишків у каналі, що зв'язує субстрат, розчинної десатурази жирних кислот, які контактують з жирною кислотою.
2. Спосіб за п. 1, у якому розчинна десатураза рослинних жирних кислот являє собою ацил-АПБ-десатуразу.
3. Спосіб за п. 2, у якому ацил-АПБ-десатураза є А -десатуразою.
4. Спосіб за п. 3, у якому А -десатуразу одержують за допомогою рослин, вибраних з групи, що складається з Тпипрегоіа аїіага або Вісіпиз соттипів.
5. Спосіб за п. 4, у якому амінокислотні контактові залишки вибирають з групи, що складається з залишків 114, 115, 117, 118, 179, 181, 188 і 189.
б. Спосіб модифікування довжини ланцюга і специфічності розташування подвійних зв'язків ацил-АПБ- десатурази, що включає: а) приготування первинної амінокислотної послідовності ацил-АПБ-десатурази; р) вирівнювання первинної амінокислотної послідовності ацил-АПБ-десатурази з первинною амінокислотною послідовністю д? -десатурази Вісіпи5 соттипів для максимального збереження послідовності; с) побудову тривимірної моделі ацил-АПБ-десатурази на основі консервативної послідовності А -десатурази Вісіпи5 соттипів; а) ідентифікацію амінокислотних контактових залишків усередині каналу, що зв'язує субстрат, структури, яку змодельовано на стадії с); і е) створення мутантної ацил-АПБ-десатурази, що має модифіковану довжину ланцюга і особливості розташування подвійних зв'язків, шляхом заміщення одного або декількох амінокислотних контактових залишків, ідентифікованих на стадії 4), на інший амінокислотний залишок.
7. Мутантна ацил-АПБ-десатураза, яка характеризується здатністю каталізувати створення подвійного зв'язку у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті, причому перша і друга жирні кислоти відрізняються довжиною ланцюга, і швидкості створення подвійних зв'язків у першій і другій жирних кислотах розрізняються не більш ніж приблизно у 4 рази.
8. Мутантна ацил-АПБ-десатураза за п. 7, яка містить точкову мутацію у амінокислотному контактовому залишку у каналі, що зв'язує субстрат.
9. Мутантна ацил-АПБ-десатураза за п. 7, у якій перша жирна кислота має довжину ланцюга 16:0, а друга жирна кислота має довжину ланцюга 18:0.
10. Мутантна ацил-АПБ-десатураза, яка має амінокислотне заміщення у контактовому залишку усередині каналу, що зв'язує субстрат.
11. Мутантна ацил-АПБ-десатураза за п. 10, яка характеризується змінами у довжині ланцюга і специфічності розташування подвійних зв'язків в порівнянні з копією ацил-АПБ-десатурази природного типу.
12. Мутантна ацил-АПБ-десатураза за п. 11, у якій ацил-АПБ-десатураза є Аз -ацил-АПБ-десатуразою і контактові залишки у межах каналу, що зв'язує субстрат, вибирають з групи, що складається з 114, 115, 117, 118, 179, 181, 188 і 189.
13. Мутантна ацил-АПБ-десатураза за п. 12, у якій А -ацил-АПБ-десатуразу одержують шляхом мутагенезу нуклеїнової кислоти, яку клоновано з Тпшпрегодіа аїага або Вісіпи5 соттипів.
14. Послідовність нуклеїнових кислот, що кодує мутантну ацил-АПБ-десатуразу, яка характеризується здатністю каталізувати створення подвійного зв'язку у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті, причому перша і друга жирні кислоти відрізняються довжиною ланцюга, і швидкості створення подвійних зв'язків у першій і другій жирних кислотах розрізняються не більш ніж приблизно у 4 рази.
15. Послідовність нуклеїнових кислот за п. 14, у якій мутантна ацил-АПБ-десатураза містить точкову мутацію у амінокислотному контактовому залишку у каналі, що зв'язує субстрат.
16. Послідовність нуклеїнових кислот за п. 15, у якій мутантна ацил-АПБ-десатураза є Аз -десатуразою.
17. Послідовність нуклеїнових кислот за п. 16, у якій амінокислотні контактові залишки вибирають з групи, що складається з залишків 114, 115, 117, 118, 179, 181, 188 і 189.
18. Конструкція експресії ДНК, яка містить у експресованій формі послідовність нуклеїнових кислот, що кодує мутантну ацил-АПБ-десатуразу, яка характеризується здатністю каталізувати створення подвійного зв'язку у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті, причому перша і друга жирні кислоти відрізняються довжиною ланцюга, і швидкості створення подвійних зв'язків у першій і другій жирних кислотах розрізняються не більш ніж приблизно у 4 рази.
19. Конструкція експресії ДНК за п. 18, у якій мутантна ацил-АПБ-десатураза містить точкову мутацію у амінокислотному контактовому залишку у каналі, що зв'язує субстрат.
20. Конструкція експресії ДНК за п. 19, у якій ацил-АПБ-десатураза є А -десатуразою.
21. Конструкція експресії ДНК за п. 20, у якій амінокислотні контактові залишки вибирають з групи, що складається з залишків 114, 115, 117, 118, 179, 181, 188 і 189.
22. Клітина, трансформована конструкцією експресії ДНК, що містить у експресованій формі послідовність нуклеїнових кислот, що кодує мутантну ацил-АПБ-десатуразу, яка характеризується здатністю каталізувати створення подвійного зв'язку у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті, причому перша і друга жирні кислоти відрізняються довжиною ланцюга, і швидкості створення подвійних зв'язків у першій і другій жирних кислотах розрізняються не більш ніж приблизно у 4 рази.
23. Клітина за п. 22, у якій мутантна ацил-АПБ-десатураза містить точкову мутацію у амінокислотному контактовому залишку у каналі, що зв'язує субстрат.
24. Клітина за п. 23, у якій ацил-АПБ-десатураза є А -десатуразою.
25. Клітина за п. 24, у якій амінокислотні контактові залишки вибирають з групи, що складається з залишків 114, 115, 117, 118, 179, 181, 188 і 189.
26. Клітина за п. 22, яка є прокаріотичною клітиною.
21. Клітина за п. 22, яка є еукаріотичною клітиною.
28. Клітина за п. 27, яка є рослинною клітиною.
29. Химерна ацил-АПБ-десатураза, яка характеризується здатністю каталізувати створення подвійного зв'язку у першій жирній кислоті і у другій жирній кислоті, причому перша і друга жирні кислоти відрізняються довжиною ланцюга, і швидкості створення подвійних зв'язків у першій і другій жирних кислотах розрізняються не більш ніж приблизно у 4 рази.
30. Химерна ацил-АПБ-десатураза за п. 29, що містить А -16:0. у якій амінокислоти 172-201 замінені амінокислотами 178-207 з А -18:0 -АПБ-десатурази.
31. Химерна ацил-АПБ-десатураза за п. 29, що містить А -16:0. у якій амінокислоти 172-196 замінені амінокислотами 178-202 з А -18:0 -АПБ-десатурази.
32. Химерна ацил-АПБ-десатураза за п. 29, що містить 2 -16:0, у якій амінокислоти 176, 183, 184, 200, 201 і 202 замінені, відповідно, амінокислотами 181, 188, 189, 205, 20612073 А -18:0 дПБ-десатурази.
33. Химерна ацил-АПБ-десатураза за п. 29, що містить м -16:0. у якій амінокислоти 183 і 184 замінені, відповідно, амінокислотами 188 і 189 з Аз -18:0 -АПБ-десатурази.
34. Химерна ацил-АПБ-десатураза за п. 32, що містить м -16:0. у якій амінокислоти 176 і 195 замінені, відповідно, амінокислотами 181 і 200 з Аз -18:0 -АПБ-десатурази.
35. Химерна ацил-АПБ-десатураза за п. 32, що містить 2. 716:0, у якій амінокислоти 176, 195, 200, 201 і 202 замінені, відповідно, амінокислотами 1821, 200, 205, 206 і 207 з А -18:0 -десатурази.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/689,823 US5705391A (en) | 1996-08-14 | 1996-08-14 | Modified acyl-ACP desaturase |
| PCT/US1997/013690 WO1998006735A1 (en) | 1996-08-14 | 1997-08-01 | Modified acyl-acp desaturase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA72180C2 true UA72180C2 (uk) | 2005-02-15 |
Family
ID=24770011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA99020833A UA72180C2 (uk) | 1996-08-14 | 1997-01-08 | Модифікована ацил-апб-десатураза |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5705391A (uk) |
| EP (1) | EP0934332A4 (uk) |
| JP (1) | JP2000516092A (uk) |
| AU (1) | AU718200B2 (uk) |
| BR (1) | BR9711078A (uk) |
| CA (1) | CA2263281C (uk) |
| EE (1) | EE04020B1 (uk) |
| HU (1) | HUP9904364A3 (uk) |
| IL (1) | IL128498A0 (uk) |
| NO (1) | NO990669L (uk) |
| NZ (1) | NZ334616A (uk) |
| PL (1) | PL331616A1 (uk) |
| RU (1) | RU2228356C2 (uk) |
| UA (1) | UA72180C2 (uk) |
| WO (1) | WO1998006735A1 (uk) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6310194B1 (en) | 1994-09-26 | 2001-10-30 | Carnegie Institution Of Washington | Plant fatty acid hydroxylases |
| US5705391A (en) * | 1996-08-14 | 1998-01-06 | Associated Universities, Inc. | Modified acyl-ACP desaturase |
| CA2326687A1 (en) * | 1998-04-16 | 1999-10-21 | Carnegie Institution Of Washington | Interconversion of plant fatty acid desaturases and hydroxylases |
| US6686186B2 (en) * | 1999-01-19 | 2004-02-03 | Brookhaven Science Associates Llc | Mutant fatty acid desaturase |
| US7323335B2 (en) * | 1999-01-19 | 2008-01-29 | Brookhaven Science Associates, Llc | Mutant fatty acid desaturase and methods for directed mutagenesis |
| WO2000075170A1 (en) * | 1999-06-09 | 2000-12-14 | Brookhaven Science Associates, Llc | Mutant fatty acid desaturase and methods for directed mutagenesis |
| US6200500B1 (en) | 1999-08-20 | 2001-03-13 | Streck Laboratories, Inc. | Hematology control and system for multi-parameter hematology measurements |
| US6221668B1 (en) | 1999-08-20 | 2001-04-24 | Streck Laboratories, Inc. | Hematology control and system for multi-parameter hematology measurements |
| US6780405B1 (en) | 2000-04-28 | 2004-08-24 | Avant Immunotherapeutics, Inc. | Regulated antigen delivery system (RADS) |
| US6872547B1 (en) | 2000-10-11 | 2005-03-29 | Washington University | Functional balanced-lethal host-vector systems |
| US20040137003A1 (en) * | 2001-04-30 | 2004-07-15 | Curtiss Iii Roy | Regulated antigen delivery system (rads) |
| US6653137B2 (en) | 2001-12-03 | 2003-11-25 | Streck Laboratories Inc. | Hematology reference control |
| US6723563B2 (en) | 2001-12-03 | 2004-04-20 | Streck Laboratories Inc. | Hematology reference control |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
| US7078234B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| BRPI0408896A (pt) | 2003-03-28 | 2006-04-25 | Monsanto Technology Llc | promotores de planta para uso no desenvolvimento precoce de sementes |
| CA2598307C (en) | 2005-02-26 | 2014-12-30 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| EP1874938B1 (en) * | 2005-04-19 | 2012-04-04 | BASF Plant Science GmbH | Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants |
| US7902423B2 (en) | 2005-04-20 | 2011-03-08 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression that utilize the promoter from a flax tonoplast intrinsic protein gene |
| US7790873B2 (en) | 2005-05-10 | 2010-09-07 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| EP1837397A1 (en) * | 2006-03-21 | 2007-09-26 | Monsanto S.A.S. | FAD-2 mutants and high oleic plants |
| CA2675926A1 (en) | 2007-02-16 | 2008-08-21 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
| CN102575257B (zh) | 2009-04-22 | 2014-11-05 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 全种子特异性启动子 |
| CN102471777B (zh) | 2009-07-10 | 2014-09-24 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 用于在植物中胚乳-特异性表达的表达盒 |
| EP2507375A4 (en) | 2009-12-03 | 2013-04-24 | Basf Plant Science Co Gmbh | EXPRESSION CASSETTES FOR EMBRYOSPECIFIC EXPRESSION IN PLANTS |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2083259C (en) * | 1990-05-25 | 2007-05-15 | William D. Hitz | Nucleotide sequence of soybean stearoyl-acp desaturase gene |
| EP0563191B2 (en) * | 1990-12-20 | 2000-01-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleotide sequences of soybean acyl-acp thioesterase genes |
| US5654402A (en) * | 1994-10-26 | 1997-08-05 | Michigan State University | Methods and compositions relating to plant Δ6 palmitoyl-acyl carrier protein desaturase |
| US5705391A (en) * | 1996-08-14 | 1998-01-06 | Associated Universities, Inc. | Modified acyl-ACP desaturase |
-
1996
- 1996-08-14 US US08/689,823 patent/US5705391A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-08 UA UA99020833A patent/UA72180C2/uk unknown
- 1997-05-09 US US08/853,979 patent/US5888790A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-01 AU AU38266/97A patent/AU718200B2/en not_active Ceased
- 1997-08-01 NZ NZ334616A patent/NZ334616A/en unknown
- 1997-08-01 CA CA002263281A patent/CA2263281C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-01 RU RU99104591/13A patent/RU2228356C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 WO PCT/US1997/013690 patent/WO1998006735A1/en not_active Application Discontinuation
- 1997-08-01 EP EP97935294A patent/EP0934332A4/en not_active Withdrawn
- 1997-08-01 HU HU9904364A patent/HUP9904364A3/hu unknown
- 1997-08-01 IL IL12849897A patent/IL128498A0/xx unknown
- 1997-08-01 EE EEP199900063A patent/EE04020B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-08-01 PL PL97331616A patent/PL331616A1/xx unknown
- 1997-08-01 JP JP10509813A patent/JP2000516092A/ja not_active Ceased
- 1997-08-01 BR BR9711078-7A patent/BR9711078A/pt not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-02-12 NO NO990669A patent/NO990669L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-03-25 US US09/276,295 patent/US6100091A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2263281A1 (en) | 1998-02-19 |
| EP0934332A1 (en) | 1999-08-11 |
| US5888790A (en) | 1999-03-30 |
| NO990669D0 (no) | 1999-02-12 |
| CA2263281C (en) | 2009-10-13 |
| WO1998006735A1 (en) | 1998-02-19 |
| IL128498A0 (en) | 2000-01-31 |
| HUP9904364A3 (en) | 2001-10-29 |
| EE9900063A (et) | 1999-10-15 |
| BR9711078A (pt) | 2000-01-11 |
| US6100091A (en) | 2000-08-08 |
| PL331616A1 (en) | 1999-08-02 |
| RU2228356C2 (ru) | 2004-05-10 |
| US5705391A (en) | 1998-01-06 |
| NZ334616A (en) | 1999-04-29 |
| EP0934332A4 (en) | 2001-11-21 |
| JP2000516092A (ja) | 2000-12-05 |
| EE04020B1 (et) | 2003-04-15 |
| NO990669L (no) | 1999-04-12 |
| HUP9904364A2 (hu) | 2000-04-28 |
| AU3826697A (en) | 1998-03-06 |
| AU718200B2 (en) | 2000-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA72180C2 (uk) | Модифікована ацил-апб-десатураза | |
| Ludwig et al. | Structure and redox properties of clostridial flavodoxin | |
| Ogata et al. | The crystal structure of the [NiFe] hydrogenase from the photosynthetic bacterium Allochromatium vinosum: characterization of the oxidized enzyme (Ni-A state) | |
| Katayanagi et al. | Structural details of ribonuclease H from Escherichia coli as refined to an atomic resolution | |
| Ha et al. | Crystal structure of bullfrog M ferritin at 2.8 Å resolution: analysis of subunit interactions and the binuclear metal center | |
| Verdecia et al. | Structural basis for phosphoserine-proline recognition by group IV WW domains | |
| Sundaramoorthy et al. | Crystal structures of substrate binding site mutants of manganese peroxidase | |
| Blindauer et al. | Metallothioneins: unparalleled diversity in structures and functions for metal ion homeostasis and more | |
| Vyas et al. | A novel calcium binding site in the galactose-binding protein of bacterial transport and chemotaxis | |
| US8050873B2 (en) | Crystal of hypoxia inducible factor 1 alpha prolyl hydroxylase | |
| Kazaz et al. | Plant monounsaturated fatty acids: Diversity, biosynthesis, functions and uses | |
| Guy et al. | The crystal structure of the ivy Δ4-16: 0-ACP desaturase reveals structural details of the oxidized active site and potential determinants of regioselectivity | |
| Motomura et al. | An alternative plant-like cyanobacterial ferredoxin with unprecedented structural and functional properties | |
| Yu et al. | The Crystal Structure of Calmodulin Bound to the Cardiac Ryanodine Receptor (RyR2) at Residues Phe4246–Val4271 Reveals a Fifth Calcium Binding Site | |
| Salter et al. | The apolar channel in Cerebratulus lacteus hemoglobin is the route for O2 entry and exit | |
| Otrusinová et al. | Conformational dynamics are a key factor in signaling mediated by the receiver domain of a sensor histidine kinase from Arabidopsis thaliana | |
| Guy et al. | Regioselectivity mechanism of the Thunbergia alata Δ6-16: 0-acyl carrier protein desaturase | |
| US20230235310A1 (en) | Synthetic santalene synthases | |
| Vladkova | Chlorophyll a is the crucial redox sensor and transmembrane signal transmitter in the cytochrome b 6 f complex. Components and mechanisms of state transitions from the hydrophobic mismatch viewpoint | |
| Lancaster | Structures of reaction centers in anoxygenic bacteria | |
| Griswold-Prenner et al. | G protein-effector coupling: interactions of recombinant inhibitory. gamma. subunit with transducin and phosphodiesterase | |
| MXPA99001544A (es) | Acil-acp desaturasa modificada | |
| Hann et al. | Crystal structure of the Schizosaccharomyces pombe U7BR E2-binding region in complex with Ubc7 | |
| Ulamec | How sequence specific changes in the N-terminus of synucleins control their aggregation | |
| Deisenhofer et al. | High-resolution crystal structures of bacterial photosynthetic reaction centers |