UA66076A - Method of complex diagnostics of organism resistance - Google Patents

Method of complex diagnostics of organism resistance Download PDF

Info

Publication number
UA66076A
UA66076A UA2003076849A UA2003076849A UA66076A UA 66076 A UA66076 A UA 66076A UA 2003076849 A UA2003076849 A UA 2003076849A UA 2003076849 A UA2003076849 A UA 2003076849A UA 66076 A UA66076 A UA 66076A
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
apoptosis
spontaneous
induced
indication
indications
Prior art date
Application number
UA2003076849A
Other languages
Ukrainian (uk)
Inventor
Kseniia Mykolaivna Igrunova
Original Assignee
Kyiv P Shupyk Medical Academy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyiv P Shupyk Medical Academy filed Critical Kyiv P Shupyk Medical Academy
Priority to UA2003076849A priority Critical patent/UA66076A/en
Publication of UA66076A publication Critical patent/UA66076A/en

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

The proposed method of complex diagnostics of organism resistance implies isolating mononuclear blood cells, incubating the isolated blood cells together with dexametazone, staining the incubated cells with dye, and determining the spontaneous apoptosis indication and the induced apoptosis indication. The method consists in determining indications of peroxidation of lipides, catalase, and thrombocyte aggregations, the indications of spontaneous and induced, for example by lipopolysaccharide, tumor necrosis indications, as well as the apoptosis induction indication as the ratio of the spontaneous apoptosis indication to the induced, for example by dexametazone, apoptosis indication. If the apoptosis induction indication is 0.6106 ... 0.6301 and the indications of peroxidation of lipides, catalase, and thrombocyte aggregations, as well as the indications of spontaneous and induced tumor necrosis indication are normal, the organism resistance would be diagnosed as normal. If all the indications, excluding the apoptosis induction indication, are decreased, decrease of the organism resistance, as the result of exhaustion, would be diagnosed. If the apoptosis induction indication exceeds0.6301 while all the other indications are increased, organism resistance with the sufficient reserve would be diagnosed.

Description

Винахід відноситься до галузі медицини та біології, а саме до галузі цитології та імунології та може бути використаний для комплексної оцінки резистентності організму.The invention relates to the field of medicine and biology, namely to the field of cytology and immunology and can be used for comprehensive assessment of the body's resistance.

Відомий "Спосіб визначення та/або кількісного виявлення та/або відділення апоптичних клітин у зразку або частині зразка" (патент на винахід УУО 9527903 АТ, від 19.10.95, Изобретения стран мира (1996).- Вьіпуск 084,The well-known "Method of determination and/or quantitative detection and/or separation of apoptotic cells in a sample or part of a sample" (patent for invention UUO 9527903 JSC, dated 10.19.95, Izobreteniya stran mira (1996). - Vyipusk 084,

Мо17.- С.48) передбачає контакт досліджуваного зразка клітин або тканини з реагентом - поліпептидом або білком з класу анексинів, який має спорідненість до фосфатиділсеріну плазматичної мембрани апоптичних клітин.Мо17.- С.48) involves the contact of the studied sample of cells or tissue with a reagent - a polypeptide or protein from the class of annexins, which has an affinity for phosphatidylserine of the plasma membrane of apoptotic cells.

Виявлення та/або кількісна оцінка апоптичних клітин прямим способом здійснюється детекцією мітки, яка зв'язана з анексином. Такими мітками можуть бути радіоактивні маркери, флуоресцентні, ензимні, протеїнові, окремі барвники, імуноглобуліни. Для виявлення наявності або відсутності мітки використовують, наприклад, проточну цитометрію, цитометрію зображення або аналіз зображення. При непрямому способі детекції зразок контактує з неміченим реагентом з високою спорідненістю до фосфатидилсеріну та кількість зв'язаного агента визначають за допомогою специфічних до реагенту антитіл. В цьому випадку може бути використана будь-яка техніка імуноаналіза. Запропоновано визначати якісно та кількісно апоптичні клітини після інкубації проби з субстанціями, що можуть індукувати або гальмувати апоптоз. Запропонований спосіб використовується для діагностики.Detection and/or quantification of apoptotic cells is carried out directly by detection of a label that is connected to annexin. Such labels can be radioactive markers, fluorescent, enzyme, protein, individual dyes, and immunoglobulins. For example, flow cytometry, image cytometry or image analysis is used to detect the presence or absence of a label. In the indirect method of detection, the sample comes into contact with an unlabeled reagent with a high affinity for phosphatidylserine, and the amount of bound agent is determined using reagent-specific antibodies. In this case, any immunoassay technique can be used. It is proposed to qualitatively and quantitatively determine apoptotic cells after incubation of the sample with substances that can induce or inhibit apoptosis. The proposed method is used for diagnostics.

Недоліком використання абсолютної величини спонтанного та індукованого апоптозу для діагностики є оцінка лише кінцевого результату апоптичного процесу без урахування численних факторів, які можуть призводити до апоптозу (стан оксидантної та антиоксидантної систем, рівня фактору некрозу пухлин, стан клітинних мембран, оцінюваний за величиною агрегації тромбоцитів).The disadvantage of using the absolute value of spontaneous and induced apoptosis for diagnosis is the assessment of only the final result of the apoptotic process without taking into account numerous factors that can lead to apoptosis (the state of oxidant and antioxidant systems, the level of tumor necrosis factor, the state of cell membranes, estimated by the amount of platelet aggregation).

Задачею заявляємого способу є збільшення інформативності та достовірності способу за рахунок визначення рівней спонтанного та індукованого модулятором, наприклад, дексаметазоном, апоптозу та індексу індукції апоптозу, а саме відношення спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном, апоптозу, одночасно з комплексною оцінкою стану оксидантно-антиоксидантної системи, клітинних мембран за величиною агрегаційних властивостей тромбоцитів та рівня спонтанного та індукованого, наприклад, ліпополісахаридом, фактору некрозу пухлин.The purpose of the proposed method is to increase the informativeness and reliability of the method by determining the levels of spontaneous and modulator-induced, for example, dexamethasone, apoptosis and the apoptosis induction index, namely the ratio of spontaneous and induced, for example, dexamethasone, apoptosis, simultaneously with a comprehensive assessment of the state of the oxidant-antioxidant system , cell membranes by the value of the aggregation properties of platelets and the level of spontaneous and tumor necrosis factor induced, for example, by lipopolysaccharide.

Задача досягається тим, що резистентність організму, яку визначають у відомому способі шляхом виділення мононуклеарних клітин, інкубацією їх з дексаметазоном, забарвленням барвником з наступним визначенням індексів спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном, апоптозу, згідно з методом, що пропонується, вимірюють величини перекисного окислення ліпідів, каталази, агрегації тромбоцитів та рівнів спонтанного та індукованого, наприклад, ліпополісахаридом, фактору некрозу пухлин та визначають індекс індукції апоптозу, а саме, відношення апоптичних індексів спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном, апоптозу і при значеннях індексу індукції апоптозу в межах від 0,6106 до 0,6301 і величинах спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном, апоптозу, перекисного окислення ліпідів, каталази, агрегації тромбоцитів та спонтанного і індукованого, наприклад, ліпополісахаридом, фактору некрозу пухлин в межах норми діагностують, що реактивність організму в межах норми, при зниженні рівня всіх визначених показників, крім індексу індукції апоптозу, діагностують зниження резистентності організму внаслідок виснаження, при підвищенні рівня індексу індукції апоптозу вище 0,301 та зростанні всіх інших показників, що вивчалися, діагностують напруження резистентності організму з достатніми компенсаторними можливостями.The task is achieved by the fact that the resistance of the organism, which is determined in a known way by isolating mononuclear cells, incubating them with dexamethasone, staining with a dye, followed by determining the indices of spontaneous and induced, for example, dexamethasone, apoptosis, according to the proposed method, the values of peroxidation are measured lipids, catalase, platelet aggregation and levels of spontaneous and induced, for example, lipopolysaccharide, tumor necrosis factor and determine the apoptosis induction index, namely, the ratio of apoptotic indices of spontaneous and induced, for example, dexamethasone, apoptosis and at values of the apoptosis induction index ranging from 0 .6106 to 0.6301 and values of spontaneous and induced, for example, by dexamethasone, apoptosis, lipid peroxidation, catalase, platelet aggregation and spontaneous and induced, for example, by lipopolysaccharide, tumor necrosis factor within the normal range diagnose that the body's reactivity is within the normal range, p A decrease in the level of all determined indicators, except for the apoptosis induction index, diagnoses a decrease in the body's resistance due to exhaustion, with an increase in the level of the apoptosis induction index above 0.301 and an increase in all other studied indicators, a diagnosis is made of stressing the body's resistance with sufficient compensatory capabilities.

Заявлений спосіб виконують наступним чином. З гепаринізованої крові виділяють мононуклеарні клітини за допомогою центрифугування з прискоренням 4009 протягом 25-35 хвилин у градієнті щільності фікол-верографіну (р-1077 -1078), знімають кільце мононуклеарів. Отримані клітини піпетують та двічі центрифугують по 8-12 хвилин з прискоренням 2009 у розчині нейтрального буфера, наприклад рпозрнаїє римбег зоїшіоп з рН 7,2. З відмитих клітин в концентрації 5-бх106 клітин/мл готують подвійні культури, які поміщають у живильне середовище, що містить 1095 ембріональної телячої сироватки, у співвідношенні 1:1. До однієї з подвійних культур додають розчин дексаметазону в кінцевій концентрації 1075-1077М. Культури клітин інкубують протягом 12- 24 годин при температурі 37"С. Після інкубації клітини піпетують у розчині нейтрального буфера, наприклад рпозрпаге рибег зоїшіоп з рН 7,2, центрифугують 3-7 хвилин з прискоренням 4009. Підраховують відсоткове співвідношення живих та мертвих клітин за допомогою стандартного теста з трипановим синім. Відмиті клітини інкубують 25-35 хвилин при температурі 37"С з розчином барвника Ноеснвзі 33342 в концентрації 0,05-0,15мкг/мл у співвідношенні суспензія клітин/розчин барвника - 1:1-2:1, потім центрифугують з додаванням розчину нейтрального буферу, наприклад рпозрпаїє рийег зоїшіоп з рН 7,2, протягом 3-7 хвилин з прискоренням 4009.The claimed method is performed as follows. Mononuclear cells are isolated from heparinized blood by centrifugation with an acceleration of 4009 for 25-35 minutes in a density gradient of ficol-verografin (p-1077-1078), a ring of mononuclear cells is removed. The obtained cells are pipetted and centrifuged twice for 8-12 minutes with an acceleration of 2009 in a neutral buffer solution, for example, rpozrnaiye rimbeg zooshiop with pH 7.2. Double cultures are prepared from the washed cells at a concentration of 5-x106 cells/ml, which are placed in a nutrient medium containing 1095 fetal calf serum in a 1:1 ratio. A solution of dexamethasone with a final concentration of 1075-1077M is added to one of the double cultures. Cell cultures are incubated for 12-24 hours at a temperature of 37"C. After incubation, the cells are pipetted into a solution of a neutral buffer, for example, rpozrpage ribeg zoishiop with a pH of 7.2, centrifuged for 3-7 minutes at an acceleration of 4009. The percentage ratio of live and dead cells is calculated by using a standard test with trypan blue. Washed cells are incubated for 25-35 minutes at a temperature of 37"C with a solution of Noesnvzi 33342 dye at a concentration of 0.05-0.15 μg/ml in a ratio of cell suspension/dye solution - 1:1-2:1 , then centrifuged with the addition of a neutral buffer solution, for example, a buffer solution with a pH of 7.2, for 3-7 minutes with an acceleration of 4009.

Клітини фіксують фіксуючою сумішшю, поміщають на предметне скельце, покривають покривним скельцем та запаюють. Препарати переглядають при освітленні люмінісцентною лампою при збільшенні 7х90. Визначають апоптичний індекс як відсоткове співвідношення кількості клітин з ознаками апоптозу та 2000 клітин, виявлених у полях зору мікроскопу. Апоптичний індекс визначають як в клітинах, які інкубувались тільки у живильному середовищі - індекс спонтанного апоптозу, так і в клітинах, які інкубувались в живильному середовищі в присутності дексаметазону - індекс індукованого апоптозу. Індекс індукції апоптозу визначався як співвідношення індексів спонтанного та індукованого апоптозу у даного хворого. Величини перекисного окислення ліпідів та рівень каталази крові, рівні спонтанного та індукованого, наприклад, ліпополісахаридом, фактору некрозу пухлин, величину агрегації тромбоцитів визначали за загальноприйнятими методиками. При значеннях індексу індукції апоптозу в межах від 0,6106 до 0,6301 і величинах спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном, апоптозу, перекисного окислення ліпідів, каталази, агрегації тромбоцитів та спонтанного і індукованого, наприклад, ліпополісахаридом, фактору некрозу пухлин в межах норми діагностують, що реактивність організму в межах норми, при зниженні рівня всіх визначених показників, крім індексу індукції апоптозу, діагностують зниження резистентності організму внаслідок виснаження, при підвищенні рівня індексу індукції апоптозу вище 0,6301 та зростанні всіх інших показників, що вивчалися, діагностують напруження резистентності організму з достатніми компенсаторними можливостями. Зниження антиоксидантної активності при підвищенні прооксидантної системи та індексу індукції апоптозу діагностували як початок декомпенсації резистентності організму. Зниження рівня індукції фактору некрозу пухлин при підвищенні його спонтанного рівня діагностували як свідчення про наявність в організмі інфекційного процесу або гіпоксії, при останній спостерігали зниження антиоксидантної системи. Значне підвищення агрегаційної здатності тромбоцитів діагностували як можливість виникнення критичного стану у хворого.Cells are fixed with a fixing mixture, placed on a glass slide, covered with a coverslip and sealed. The preparations are viewed under the illumination of a fluorescent lamp at a magnification of 7x90. The apoptotic index is defined as the percentage ratio of the number of cells with signs of apoptosis and 2000 cells detected in the field of view of the microscope. The apoptotic index is determined both in cells that were incubated only in the nutrient medium - the index of spontaneous apoptosis, and in cells that were incubated in the nutrient medium in the presence of dexamethasone - the index of induced apoptosis. The apoptosis induction index was determined as the ratio of spontaneous and induced apoptosis indices in this patient. Values of lipid peroxidation and the level of blood catalase, levels of spontaneous and induced, for example, lipopolysaccharide, tumor necrosis factor, the value of platelet aggregation were determined according to generally accepted methods. With the values of the apoptosis induction index ranging from 0.6106 to 0.6301 and the values of spontaneous and induced, for example, dexamethasone, apoptosis, lipid peroxidation, catalase, platelet aggregation and spontaneous and induced, for example, lipopolysaccharide, tumor necrosis factor within the normal range it is diagnosed that the body's reactivity is within the normal range, with a decrease in the level of all determined indicators, except for the apoptosis induction index, a decrease in the body's resistance due to exhaustion is diagnosed, with an increase in the level of the apoptosis induction index above 0.6301 and an increase in all other studied indicators, resistance stress is diagnosed body with sufficient compensatory capabilities. A decrease in antioxidant activity with an increase in the pro-oxidant system and apoptosis induction index was diagnosed as the beginning of decompensation of the body's resistance. A decrease in the level of induction of tumor necrosis factor with an increase in its spontaneous level was diagnosed as evidence of the presence of an infectious process or hypoxia in the body, with the latter a decrease in the antioxidant system was observed. A significant increase in the aggregation ability of platelets was diagnosed as the possibility of a critical condition in the patient.

Експериментально-клінічне впровадження заявляеємого способу проведено в експерименті у 34 щурів та 18 кролів, а також при лабораторному обстеженні у 15 донорів та 66 хворих з серцево-судинними захворюваннями, у 13 хворих з хронічним лімфолейкозом та у 32 хворих на туберкульоз легень на базі ЦНДЛ КМАПО ім. П.Л.The experimental and clinical implementation of the claimed method was carried out in an experiment in 34 rats and 18 rabbits, as well as during laboratory examination in 15 donors and 66 patients with cardiovascular diseases, in 13 patients with chronic lymphocytic leukemia and in 32 patients with pulmonary tuberculosis on the basis of the National Center of the National Academy of Medical Sciences of KMAPO named after P.L.

Шупика.Shupyka

Таким чином, використання запропонованого методу для оцінки схильності мононуклеарних клітин крові до апоптозу у хворих, у донорів та в експериментальних тварин дозволило збільшити достовірність та інформативність методу визначення реактивності організму.Thus, the use of the proposed method for assessing the propensity of blood mononuclear cells to apoptosis in patients, donors, and experimental animals made it possible to increase the reliability and informativeness of the method for determining the body's reactivity.

Claims (1)

Спосіб комплексної діагностики резистентності організму, який включає виділення мононуклеарних клітин крові, інкубацію їх з дексаметазоном, забарвлення барвником з наступним визначенням індексів спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном, апоптозу, який відрізняється тим, що вимірюють величини перекисного окислення ліпідів, каталази, агрегації тромбоцитів та рівнів спонтанного та індукованого, наприклад, ліпополісахаридом фактора некрозу пухлин та визначають індекс індукції апоптозу, а саме відношення апоптичних індексів спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном апоптозу і при значеннях індексу індукції апоптозу в межах від 0,6106 до 0,6301 і при величинах спонтанного та індукованого, наприклад, дексаметазоном апоптозу, перекисного окислення ліпідів, каталази, агрегації тромбоцитів та спонтанного і індукованого, наприклад, ліпополісахаридом фактора некрозу пухлин в межах норми діагностують, що реактивність організму в межах норми, при зниженні рівня всіх визначених показників, крім індексу індукції апоптозу, діагностують зниження резистентності організму внаслідок виснаження, при підвищенні рівня індексу індукції апоптозу вище 0,6301 та зростанні всіх інших показників, що вивчалися, діагностують напруження резистентності організму з достатніми компенсаторними можливостями.The method of comprehensive diagnostics of the resistance of the organism, which includes the isolation of blood mononuclear cells, their incubation with dexamethasone, staining with a dye followed by the determination of the indices of spontaneous and induced, for example, dexamethasone, apoptosis, which is distinguished by measuring the values of lipid peroxidation, catalase, platelet aggregation and levels of spontaneous and induced, for example, tumor necrosis factor lipopolysaccharide and determine the apoptosis induction index, namely the ratio of apoptotic indices of spontaneous and induced, for example, dexamethasone apoptosis and at values of the apoptosis induction index in the range from 0.6106 to 0.6301 and at values of spontaneous and induced, for example, dexamethasone apoptosis, lipid peroxidation, catalase, platelet aggregation and spontaneous and induced, for example, lipopolysaccharide tumor necrosis factor within the normal range, it is diagnosed that the reactivity of the organism is within the normal range, with a decrease in the level of all parameters of these indicators, except for the apoptosis induction index, diagnose a decrease in the body's resistance due to exhaustion, with an increase in the apoptosis induction index above 0.6301 and an increase in all other studied indicators, a stress on the body's resistance with sufficient compensatory capabilities is diagnosed.
UA2003076849A 2003-07-21 2003-07-21 Method of complex diagnostics of organism resistance UA66076A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UA2003076849A UA66076A (en) 2003-07-21 2003-07-21 Method of complex diagnostics of organism resistance

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UA2003076849A UA66076A (en) 2003-07-21 2003-07-21 Method of complex diagnostics of organism resistance

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA66076A true UA66076A (en) 2004-04-15

Family

ID=34517638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2003076849A UA66076A (en) 2003-07-21 2003-07-21 Method of complex diagnostics of organism resistance

Country Status (1)

Country Link
UA (1) UA66076A (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9395365B2 (en) Detection of infectious disease in a human or animal by measuring specific phagocytosis in a thin film sample of their anticoagulated blood
JP2824155B2 (en) Method for detecting and / or optionally quantifying and / or separating apoptotic cells in or from a sample
US6916626B1 (en) Detection of Candida
AU621310B2 (en) Immunometric assay kit and method applicable to whole cells
RU2061241C1 (en) Method of determining specific sensitization of lymphocytes
RU2116068C1 (en) Marker particle modifying specific gravity and a method of biological fluid assay
US5919633A (en) Liposome immunoassay
US6461825B1 (en) Immunometric assay kit and method applicable to whole cells
US5260186A (en) Provision of density specific blood cells for the structuredness of the cytoplasmic matrix (SCM) test
EP3602070B1 (en) A rapid, on-demand heparin-induced thrombocytopenia functional assay
RU2426130C2 (en) Instant diagnostic test for alzheimer's disease
UA66076A (en) Method of complex diagnostics of organism resistance
JPS6281567A (en) Quantification method using particle agglutination reaction
EP0260315B1 (en) Separation and method of use of density specific blood cells
RU2179316C2 (en) Method of diagnosis of immunodeficiency state
CA2486119A1 (en) Method of isolating an endothelial cell and method of donor specific crossmatching
AU638220B2 (en) Provision of density specific blood cells for the structuredness of the cytoplasmic matrix (scm) test
RU2817215C2 (en) Method for diagnosing alloimmune thrombocytopenia of newborns
CN113238061B (en) Kit for indicating myasthenia gravis by CD180 negative B cells and application
JPS6281566A (en) Quantification method by measurement of fluorescent intensity of fine particle
CN108226469B (en) Kit for rapidly diagnosing familial hemophagocytic syndrome type 3 and application thereof
CN116859037A (en) CD14 antigen detection reagent and preparation method and application thereof
Rotman Changes in the membrane permeability of human leukocytes measured by fluorochromasia in a rapid flow fluorometer
SU1380732A1 (en) Method of determining the reaction of patient ill with allergic disease to nonspecific irritants
Ch IDENTIFICATION METHODS AND COMPLICATIONS OF BLOOD GROUPS