UA53146C2 - A process for separation of a high-purity a2 antiplasmine from the human blood plasma - Google Patents

Description

Винахід відноситься до біотехнології, біохімії медицини та являє собою спосіб виділення високоочищеного аг2-антиплазміну з донорської плазми. д2-Антиплазмін може бути використаний у біохімії для дослідження механізмів регуляції фібринолізу та позаклітинного протеолізу, в медичній біохімії для вивчення впливу на процеси інвазії та метастазування пухлинних клітин, а також у клінічній практиці для кількісного визначення окремих білкових компонентів фібринолітичної системи. д2-Антиплазмін - основний плазменний швидкодіючий високоспецифічний інгібітор плазміну з молекулярною масою 7ОкдДа. Фізіологічна роль ого-антиплазміну полягає в інактивації плазміну, що утворився в кровотоці, і запобіганні неспецифічного протеолізу білків плазми. В той час як активатори плазміногена є важливими фармакологічними засобами для лікування судинних захворювань, аг2-антиплазмін як селективний інгібітор плазміну може бути ефективним засобом контролю за міграцією пухлинних клітин та деградацією міжклітинного матриксу. Плазміноген/ллазмінова система бере участь у багатьох фізіологічних та патофізіологічних процесах в організмі людини: підтриманні рідкого стану крові, загоєнні ран, овуляції та заплідненні яйцеклітин, трансформації тканин, у запальних, алергійних, інфекційних процесах, метастазуванні пухлин (1-3).

Визначення ролі основного інгібітору плазміну в цих процесах та можливість застосування його в клінічній практиці є актуальною проблемою сучасної біохімії та медицини.

Різні способи виділення аг-антиплазміну базуються на його здатності з високою спорідненістю взаємодіяти з певними структурами в М-кінцевій частині молекули плазміногена, так званими лізин-зв'язуючими ділянками.

Подібна здатність властива плазменним білкам: фібриногену та гістидинбагатому білку. Одержання препаратів аг-антиплазміну без домішок цих білків потребує додаткових трудомістких етапів очистки.

Особливо це стосується гістидинбагатого білка, який має дуже близьку до оо-антиплазміну молекулярну масу - бакДа. Гістидинбагатий білок знижує швидкість інгібування плазміну аго-антиплазміном (4) і має однакову з со- антиплазміном здатність пригнічувати зв'язування плазміногена з фібрином (5).

Для виділення аг-антиплазміну використовують комбінацію традиційних методів одержання білків, іонообмінну та афінну хроматографію (6). Процедура включає в себе афінну хроматографію на лізин- сефарозі, фракціонування плазми сульфатом амонію, хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі, афінну хроматографію на плазміноген-сефарозі та хроматографію на гідроксиапатиті. Описаний спосіб має низький вихід інгібітору з невисокою питомою активністю.

Запропонований іншими авторами метод дозволяє отримати білок з більш високим ступенем очистки та високою питомою активністю. На першому етапі з цитратної плазми видаляють плазміноген на лізин-сефарозі, потім проводять хроматографію на плазміноген-сефарозі, ДЕАЕ-сефадексі А-50, конканавалін А-сефарозі (7).

Недоліком даної процедури є її багатоетапність, що вимагає значних витрат часу та праці.

Встановлено, що взаємодія с2-антиплазміну з плазміногеном опосередкована лізин-зв'язуючими ділянками останнього, що розташовані в перших трьох М-кінцевих кринглових доменах (К1-3) (8). Плазма містить дві ізоформи плазміногена, що різняться за кількістю вуглеводних компонентів. Форма гликозильована в положеннях Азп288 та Тпг345, форма І! - тільки в положенні ТПг345. дг-Антиплазмін виявляє високу спорідненість саме до Ії форми плазміногена (9). Отримані дані дозволили створити новий афінний сорбент, в якому високо специфічним лігандом для о2-антиплазміну був фрагмент ІІ форми плазміногена К1-3 (Туг79-МаІ337), іммобілізований на бромцианактивованій-сефарозі (10). КІ-3 одержували з еластазного гідролізату І форми плазміногена (11). І ії Ії форми плазміногена розділяли на лізин-сефарозі за різної концентрації 6б-аміногексанової кислоти (9). Запропонований сорбент дозволяє підвищити вихід інгібітору (5).

Цитратну плазму послідовно наносять на лізин-сефарозу, К1-3 (Ії форма)-сефарозу та отримують матеріал, що містить близько 8095 од2-антиплазміну та домішки фібриногену й гістидинбагатого білка. Фібриноген видаляють гель-фільтрацією на Шігоде! АСА 44. Для отримання аг-антиплазміну без домішок гістидинбагатого білка використовують додатковий етап очистки - іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі А-50 (12).

Дана процедура також тривала й трудомістка. Крім того, етапи гель-фільтрації, іонообмінної хроматографії, що призводять до багаторазового розбавлення аг-антиплазміну, і його наступне концентрування негативно впливають на вихід та активність кінцевого препарату.

Як прототип обрано метод одержання о2-антиплазміну, що складається з чотирьох етапів: видалення плазміногена з цитратної донорської плазми на лізин-сефарозі, осадження спиртом фібриногена, одержання одг-антиплазміну афінною хроматографією на К1-3-сефарозі та очистка препарату на ДЕАЕ-сефадексі А-50 від домішок гістидинбагатого білка (13). Описаний спосіб дозволяє видалити етап гель-фільтрації і таким чином підвищити вихід та отримати аог-антиплазмін з високою інгібіторною активністю. Однак, цей метод також вимагає значних витрат часу, праці і для видалення гістидинбагатого білка потребує додаткового етапу очистки з наступним концентруванням після іонообмінної хроматографії.

Таким чином, виділення аг-антиплазміну з донорської плазми - багатоетапний процес, пов'язаний зі значними витратами часу, праці, а отриманий білок містить домішки фібриногену та гістидинбагатого білка, що потребує додаткових етапів очистки та концентрування, внаслідок чого значно зменшується вихід та активність інгібітору.

Задачею даного винаходу є розробка простого та швидкого способу виділення ог2-антиплазміду з використанням послідовної афінної хроматографії на лізин-, К1-3 (І форма) та К1-3 (Ії форма)-сефарозі без застосування додаткових методів очистки - гель-фільтрації та іонообмінної хроматографії. Це дозволяє в один етап одержати ог-антиплазмін з високою інгібіторною активністю без домішок фібриногену та гістидинбагатого білка. Паралельним завданням є більш повна утилізація донорської плазми.

Для вирішення задачі донорську плазму наносять на три послідовно з'єднані афінно-хроматографічні колонки: перша з лізин-сефарозою; друга з К1-3-сефарозою (Туг79-МаІ353,І форма), третя з К1-3-сефарозою (Туг79-МаІ337, Ії форма). І та Ії форми кринглів розділяли на конканавалін А-сефарозі (14).

На лізин-сефарозі плазму виснажують на плазміноген, тим самим вивільняючи частку ог-антиплазміну, що в плазмі крові циркулює в комплексі з плазміногеном. На К1-3 (І форма)-сефарозі плазму виснажують на фібриноген та гістидинбагатий білок. На К1-3 (Ії форма)-сефарозі специфічно сорбується оо-антиплазмін.

Після нанесення плазми колонки промивають робочим буфером з високою іонною силою для видалення неспецифічно сорбованих білків. Елюцію оо-антиплазміну з третьої колонки проводять робочим буфером, що містить б-аміногексанову кислоту.

Одержаний аг-антиплазмін за даними електрофорезу має молекулярну масу 70кДа і є гомогенним (без домішок фібриногену і гістидинбагатого білка). Виділений с2-антиплазмін проявляє високу |інгібіторну активність, яку визначають за здатністю інгібувати гідроліз плазміном специфічного хромогенного субстрату О-

Ма!І-І-Гецш-І-Гув-п-нітроаниліду (15). Отримані препарати аг-антиплазміну зберігають при -40"С або ліофілізують.

Можливість здійснення способу підтверджується прикладами.

Приклад 1. 200мл цитратної донорської плазми, до якої додавали детергент тритон Х-100 до 0,0195 кінцевої концентрації, наносили зі швидкістю 15-20мл/год при 4"С на три послідовно з'єднані афінно-хроматографічні колонки : - лізин-сефарозу 48, 50мл гелю сефарози, попередньо зрівноваженою 0.05М натрій-фосфатним буфером, рн 74; - К1І-3 (І форма)-сефарозу 48, 20мл гелю сефарози, що містить 2мг К1!-3 на їмл гелю, попередньо зрівноваженою 0,04М натрій-фосфатним буфером, ріН7,0; - К1-3 (Ії форма)-сефарозу 48, 20мл гелю сефарози, що містить 2мг К!-3 на Імл гелю, попередньо зрівноваженою 0,04М натрій-фосфатним буфером, рін7,0.

Після нанесення плазми третю колонку промивають 0,04М натрій-фосфатним буфером, ріН7,0, що містить 0О,5М хлорид натрію до 0-0,02 значень екстинкції розчину при 280нм. Специфічну елюцію аг-антиплазміну проводять 0,04М натрій-фосфатним буфером, рнН7,0, що містить 0,05М б-аміногексанову кислоту. Збирають фракції об'ємом 1,25мл. Фракції, екстинкція яких становить 0,5-2,0 при 280нм, об'єднують. а2-Антиплазмін діалізують проти охолодженої дистильованої води, в яку додають бікарбонат амонію до слабо лужної реакції.

Концентрацію інгібітору визначають, вимірюючи оптичне поглинання за 280нм і віднімаючи значення поглинання за 320нм. Концентрацію розраховують за значенням коефіцієнта екстинкції (195, 1см) с5- антиплазміну, що дорівнює 6,7. Активність аг-антиплазміну визначають за інгібуванням амідолітичної активності плазміну з відомим відсотком активних центрів. Молярне співвідношення со2-антиплазміну до плазміну дорівнює 1:1. Активність одержаних препаратів перевищує 9095.

Приклад 2.

Виділення оо-антиплазміну проводять, як показано в прикладі 1, але донорську плазму розбавляють вдвічі для зменшення в'язкості. Розбавлення плазми збільшує тривалість виділення ог-антиплазміну, внаслідок чого його інгібіторна активність дещо знижується.

Приклад 3. о»-антиплазмін виділяють, як описано у прикладі 1, але в плазму не додають тритон Х-100. Відсутність детергенту не впливає на концентрацію та активність отриманого інгібітору, але не дозволяє використовувати плазму з високим вмістом ліпідів.

Таким чином, запропоновано простий та швидкий спосіб виділення високоочищеного інгібітору плазміну з плазми крові людини. Спосіб дозволяє в один етап без застосування додаткових методів очистки - гель- фільтрації та іонообмінної хроматографії одержати йо-антиплазмін без домішок фібриногену та гістидинбагатого білка з високою інгібіторною активністю.

Список посилань. 1. бапо К., Ападегзеп Р.А., Стопаапі-Напзеп .., Киізієпзеп Р., Меїзеп І.5., ЗКимег І. Ріазтіподеп асіїмацог, їв5це дедгадайоп апа сапсег. Аду.Сапсег.Нев.-1985.-44, Ме1 .-р.139-226. 2. Спартап Н.А. Ріазтіподеп асіїмайг, іпієдгіп5, апа (пе соогаїпаїей гедшайоп ої сеїЇ аанезіоп апа тідгайоп.

Сигт.Орт.Сеї| ВіоіІ.-1997.-9.-р.714-724.

З. Гоцепрегу Н.А поме! арргоасп (0 ехріоге Ше гоЇїє ої ріавтіподеп іп Басієга! раодепевів. Тгепав

Місгобіо!.-1997.-5.-р.466-468. 4. Цпеп Н.8., Вуїай О.В., СоПеп 0. Рпузісоспетісаї, іттипоспетіса! апа псіопа! сотрагізоп ої питап

Півіаїіпе-псн діусоргоїєїп апа ашогозеце іппіріюг Гасюг. Віоспіт.Віорпуз.Асіа.-1983.-742, Мо1. -р.109-115. 5. МП|пеп Н.В., НоуїЇаєет: М., СоїІеп 0. Ізоїайоп апа спагасієгігайноп ої а питап ріазта ргоїєїп мйй айіпісу гг

Ше Іузіпе Біпаїпд 5ігез іп ріазтіподеп. У.8.С.-1980.-255, Мо21.-р.10214-10222. 6. Могої М., Аокі М. ІвоЇайоп апа спагасіегігайноп ої со-ріазтіп іппіріог їот питап ріазта. А помеї! ргоївіїпазе іппіріог міс іпнібіїз асімацог-іпдисеа сіої увів. У.Віої.Спет.-1976.-251, Ме19.-р.5956-5965. 7. Мітап В., СоПеп 0. Рипійсайоп апа сНагасіегіганоп ої питап апіїріазтіп, (пе Таві-асіїпду ріазтіп іппіріюг їп ріазта. Ешиг.уУ.Віоспет.-1977.-78, Ме1.-р.19-26. 8. Мітап В., І пеп Н.В., СоПеп О. Оп їйе 5ресійс іпіегасйіоп рейуєеп Ше Іузіпе-ріпаїпоу 5іез іп ріазтіп апа сотріетепіагу 5і(ев іп оі2-апіїріаєтіп апа іп йргіподеп. Віоспіт.Віорпуз.Асіа.-1979.-579, Ме1.-р.142-154. 9. Науевз М.Г., Савієїїйпо Е.). Сагропуагаїе ої Ше питап ріазтіподеп мапапів. 9.ВіоІ.СНпет.-І979.-254, Мо.- р.8768-8771. 10. Магсп 5.0., Рапкп І., Сцаїгесазав Р. А взітрійвєа теїтоа юг суаподепе5 Бготіаде асіїмайоп ої адагоб5е г аніпйу спготайодгарну. Апаї Віоспет.-1974.-60, Ме1.-р.149-152. 11. бошир-Уепзеп ІГ., 7аїде! М., Сіаєуз Н єї аІ. Тпе рпітагу вігисішге ої питап ріазтіподеп: ізоїайоп ої мо

Іузіпе-ріпаіпд їадтепів апа опе "тіпі-ріаєтіподеп" (М.М/.38000) ру еіазіазе сагаіулеа зресіїйс Ітйеа ргоїеоувів.

Ргодгевв іп спетісаї! йрііпоїузіз апа (пготброїувів. М.У. Вамеп Ргевг5.-1978.-3.-р.І91-209. 12. Мітап В. Айтійу-спготайюдгарніс ригісайноп ої питап 012-апііріаєтіп. Віоспет..).-1980.-191, Ме1.-р.229- 232. 13. ЦП)пеп Н.В., СоПеп 0. АІрна-2-апіїріазтіп. У.Меа.-1985.-16, Ме1-3.-р.225-283. 14 Апав М., 5оїїв О., Оіа2-Машцтіпо Т. Іпмометепі ої пе Іузіпе-ріпаїпо зе ої ріазтіподеп оп її іпЇегасбйоп мн сопсапамаїїп А. Тпготбр. Невз.-1989.-56, Меб.-р.709-718.

15. М/ітап В.

Нитап аг-апіїріаєтіп.

Меїтодвз іп Епгупої.-1981.-80.-р.395-408.

Claims (1)

1. Спосіб одержання високоочищеного о2-антиплазміну з плазми крові людини шляхом афінної хроматографії, який відрізняється тим, що афінну хроматографію проводять послідовно на лізин-сефарозі, К1-3-сефарозі (Туг79- Ма!Із353, І форма) та К1-3-сефарозі (Туг79-МаІ337, ІІ форма).