UA53146C2

UA53146C2 - A process for separation of a high-purity a2 antiplasmine from the human blood plasma

Info

Publication number: UA53146C2
Application number: UA2002032305A
Authority: UA
Inventors: Tetiana Viktorivna Hrynenko; Yevhen Mytrofanovy Makohonenko; Olena Ivanivna Yusova; Maryna Borysivna Zadorozhna; Heorhii Leonidovych Volkov
Original assignee: O V Palladin Inst Of Biochemis; Kombio Ltd Liability Company
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2005-01-17

Abstract

A process for separation of a high-purity - antiplasmine from the human blood plasma including an affinity chromatography. - antiplasmine is obtained using a sequential chromatography for lysine -, K 1-3 (I form)sepharose and K 1-3 (II form) sepharose.

Description

Винахід відноситься до біотехнології, біохімії медицини та являє собою спосіб виділення високоочищеного аг2-антиплазміну з донорської плазми. д2-Антиплазмін може бути використаний у біохімії для дослідження механізмів регуляції фібринолізу та позаклітинного протеолізу, в медичній біохімії для вивчення впливу на процеси інвазії та метастазування пухлинних клітин, а також у клінічній практиці для кількісного визначення окремих білкових компонентів фібринолітичної системи. д2-Антиплазмін - основний плазменний швидкодіючий високоспецифічний інгібітор плазміну з молекулярною масою 7ОкдДа. Фізіологічна роль ого-антиплазміну полягає в інактивації плазміну, що утворився в кровотоці, і запобіганні неспецифічного протеолізу білків плазми. В той час як активатори плазміногена є важливими фармакологічними засобами для лікування судинних захворювань, аг2-антиплазмін як селективний інгібітор плазміну може бути ефективним засобом контролю за міграцією пухлинних клітин та деградацією міжклітинного матриксу. Плазміноген/ллазмінова система бере участь у багатьох фізіологічних та патофізіологічних процесах в організмі людини: підтриманні рідкого стану крові, загоєнні ран, овуляції та заплідненні яйцеклітин, трансформації тканин, у запальних, алергійних, інфекційних процесах, метастазуванні пухлин (1-3).The invention relates to biotechnology, medical biochemistry and is a method of isolating highly purified Ag2-antiplasmin from donor plasma. d2-Antiplasmin can be used in biochemistry to study the mechanisms of regulation of fibrinolysis and extracellular proteolysis, in medical biochemistry to study the influence on the processes of invasion and metastasis of tumor cells, as well as in clinical practice for the quantitative determination of individual protein components of the fibrinolytic system. d2-Antiplasmin is the main plasma fast-acting highly specific inhibitor of plasmin with a molecular weight of 7 OkdDa. The physiological role of ogo-antiplasmin is to inactivate plasmin formed in the bloodstream and prevent non-specific proteolysis of plasma proteins. While plasminogen activators are important pharmacological agents for the treatment of vascular diseases, Ag2-antiplasmin as a selective plasmin inhibitor may be an effective means of controlling tumor cell migration and degradation of the intercellular matrix. The plasminogen/lasmin system is involved in many physiological and pathophysiological processes in the human body: maintenance of the liquid state of blood, wound healing, ovulation and fertilization of eggs, tissue transformation, inflammatory, allergic, infectious processes, tumor metastasis (1-3).

Визначення ролі основного інгібітору плазміну в цих процесах та можливість застосування його в клінічній практиці є актуальною проблемою сучасної біохімії та медицини.Determining the role of the main plasmin inhibitor in these processes and the possibility of its use in clinical practice is an urgent problem of modern biochemistry and medicine.

Різні способи виділення аг-антиплазміну базуються на його здатності з високою спорідненістю взаємодіяти з певними структурами в М-кінцевій частині молекули плазміногена, так званими лізин-зв'язуючими ділянками.Different methods of isolating Ag-antiplasmin are based on its ability to interact with high affinity with certain structures in the M-terminal part of the plasminogen molecule, the so-called lysine-binding sites.

Подібна здатність властива плазменним білкам: фібриногену та гістидинбагатому білку. Одержання препаратів аг-антиплазміну без домішок цих білків потребує додаткових трудомістких етапів очистки.A similar ability is characteristic of plasma proteins: fibrinogen and histidine-rich protein. The production of Ag-antiplasmin preparations without impurities of these proteins requires additional time-consuming purification steps.

Особливо це стосується гістидинбагатого білка, який має дуже близьку до оо-антиплазміну молекулярну масу - бакДа. Гістидинбагатий білок знижує швидкість інгібування плазміну аго-антиплазміном (4) і має однакову з со- антиплазміном здатність пригнічувати зв'язування плазміногена з фібрином (5).This especially applies to the histidine-rich protein, which has a molecular weight very close to oo-antiplasmin - bacDa. Histidine-rich protein reduces the rate of inhibition of plasmin by ago-antiplasmin (4) and has the same ability as co-antiplasmin to inhibit the binding of plasminogen to fibrin (5).

Для виділення аг-антиплазміну використовують комбінацію традиційних методів одержання білків, іонообмінну та афінну хроматографію (6). Процедура включає в себе афінну хроматографію на лізин- сефарозі, фракціонування плазми сульфатом амонію, хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі, афінну хроматографію на плазміноген-сефарозі та хроматографію на гідроксиапатиті. Описаний спосіб має низький вихід інгібітору з невисокою питомою активністю.A combination of traditional methods of obtaining proteins, ion exchange and affinity chromatography (6) is used to isolate Ag-antiplasmin. The procedure includes affinity chromatography on lysine sepharose, fractionation of plasma with ammonium sulfate, chromatography on DEAE-Sephadex, affinity chromatography on plasminogen-sepharose, and chromatography on hydroxyapatite. The described method has a low yield of the inhibitor with a low specific activity.

Запропонований іншими авторами метод дозволяє отримати білок з більш високим ступенем очистки та високою питомою активністю. На першому етапі з цитратної плазми видаляють плазміноген на лізин-сефарозі, потім проводять хроматографію на плазміноген-сефарозі, ДЕАЕ-сефадексі А-50, конканавалін А-сефарозі (7).The method proposed by other authors allows obtaining a protein with a higher degree of purification and high specific activity. At the first stage, plasminogen is removed from citrate plasma on lysine-sepharose, then chromatography is performed on plasminogen-sepharose, DEAE-sephadex A-50, concanavalin A-sepharose (7).

Недоліком даної процедури є її багатоетапність, що вимагає значних витрат часу та праці.The disadvantage of this procedure is its multi-step process, which requires considerable time and effort.

Встановлено, що взаємодія с2-антиплазміну з плазміногеном опосередкована лізин-зв'язуючими ділянками останнього, що розташовані в перших трьох М-кінцевих кринглових доменах (К1-3) (8). Плазма містить дві ізоформи плазміногена, що різняться за кількістю вуглеводних компонентів. Форма гликозильована в положеннях Азп288 та Тпг345, форма І! - тільки в положенні ТПг345. дг-Антиплазмін виявляє високу спорідненість саме до Ії форми плазміногена (9). Отримані дані дозволили створити новий афінний сорбент, в якому високо специфічним лігандом для о2-антиплазміну був фрагмент ІІ форми плазміногена К1-3 (Туг79-МаІ337), іммобілізований на бромцианактивованій-сефарозі (10). КІ-3 одержували з еластазного гідролізату І форми плазміногена (11). І ії Ії форми плазміногена розділяли на лізин-сефарозі за різної концентрації 6б-аміногексанової кислоти (9). Запропонований сорбент дозволяє підвищити вихід інгібітору (5).It was established that the interaction of c2-antiplasmin with plasminogen is mediated by the lysine-binding sites of the latter located in the first three M-terminal kringle domains (K1-3) (8). Plasma contains two isoforms of plasminogen, which differ in the number of carbohydrate components. The form is glycosylated at positions Azp288 and Tpg345, form I! - only in the TPg345 position. dg-Antiplasmin shows a high affinity for the 1st form of plasminogen (9). The obtained data made it possible to create a new affinity sorbent, in which the highly specific ligand for o2-antiplasmin was a fragment of the II form of plasminogen K1-3 (Tug79-MaI337), immobilized on bromine-activated sepharose (10). KI-3 was obtained from elastase hydrolyzate of the I form of plasminogen (11). I and II forms of plasminogen were separated on lysine-Sepharose at different concentrations of 6β-aminohexanoic acid (9). The proposed sorbent allows to increase the yield of the inhibitor (5).

Цитратну плазму послідовно наносять на лізин-сефарозу, К1-3 (Ії форма)-сефарозу та отримують матеріал, що містить близько 8095 од2-антиплазміну та домішки фібриногену й гістидинбагатого білка. Фібриноген видаляють гель-фільтрацією на Шігоде! АСА 44. Для отримання аг-антиплазміну без домішок гістидинбагатого білка використовують додатковий етап очистки - іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ-сефадексі А-50 (12).Citrate plasma is sequentially applied to lysine-sepharose, K1-3 (II form)-sepharose and a material containing about 8095 od2-antiplasmin and impurities of fibrinogen and histidine-rich protein is obtained. Fibrinogen is removed by gel filtration on Shigode! АСА 44. To obtain antigen-antiplasmin without impurities of a histidine-rich protein, an additional stage of purification is used - ion exchange chromatography on DEAE-sefadex A-50 (12).

Дана процедура також тривала й трудомістка. Крім того, етапи гель-фільтрації, іонообмінної хроматографії, що призводять до багаторазового розбавлення аг-антиплазміну, і його наступне концентрування негативно впливають на вихід та активність кінцевого препарату.This procedure is also long and time-consuming. In addition, the stages of gel filtration, ion exchange chromatography, which lead to multiple dilutions of Ag-antiplasmin, and its subsequent concentration negatively affect the yield and activity of the final drug.

Як прототип обрано метод одержання о2-антиплазміну, що складається з чотирьох етапів: видалення плазміногена з цитратної донорської плазми на лізин-сефарозі, осадження спиртом фібриногена, одержання одг-антиплазміну афінною хроматографією на К1-3-сефарозі та очистка препарату на ДЕАЕ-сефадексі А-50 від домішок гістидинбагатого білка (13). Описаний спосіб дозволяє видалити етап гель-фільтрації і таким чином підвищити вихід та отримати аог-антиплазмін з високою інгібіторною активністю. Однак, цей метод також вимагає значних витрат часу, праці і для видалення гістидинбагатого білка потребує додаткового етапу очистки з наступним концентруванням після іонообмінної хроматографії.As a prototype, the method of obtaining o2-antiplasmin consisting of four stages was chosen: removal of plasminogen from citrated donor plasma on lysine-sepharose, precipitation of fibrinogen with alcohol, preparation of o2-antiplasmin by affinity chromatography on K1-3-sepharose, and purification of the drug on DEAE-Sephadex A -50 from impurities of histidine-rich protein (13). The described method makes it possible to remove the gel filtration step and thus increase the yield and obtain aog-antiplasmin with high inhibitory activity. However, this method also requires considerable time and effort, and to remove the histidine-rich protein requires an additional stage of purification followed by concentration after ion exchange chromatography.

Таким чином, виділення аг-антиплазміну з донорської плазми - багатоетапний процес, пов'язаний зі значними витратами часу, праці, а отриманий білок містить домішки фібриногену та гістидинбагатого білка, що потребує додаткових етапів очистки та концентрування, внаслідок чого значно зменшується вихід та активність інгібітору.Thus, the isolation of Ag-antiplasmin from donor plasma is a multi-stage process associated with significant time and labor costs, and the resulting protein contains impurities of fibrinogen and histidine-rich protein, which requires additional stages of purification and concentration, as a result of which the yield and activity of the inhibitor are significantly reduced .

Задачею даного винаходу є розробка простого та швидкого способу виділення ог2-антиплазміду з використанням послідовної афінної хроматографії на лізин-, К1-3 (І форма) та К1-3 (Ії форма)-сефарозі без застосування додаткових методів очистки - гель-фільтрації та іонообмінної хроматографії. Це дозволяє в один етап одержати ог-антиплазмін з високою інгібіторною активністю без домішок фібриногену та гістидинбагатого білка. Паралельним завданням є більш повна утилізація донорської плазми.The task of this invention is to develop a simple and fast method for the isolation of og2-antiplasmid using sequential affinity chromatography on lysine-, K1-3 (I form) and K1-3 (II form)-sepharose without the use of additional purification methods - gel filtration and ion exchange chromatography. This makes it possible to obtain og-antiplasmin with high inhibitory activity without impurities of fibrinogen and histidine-rich protein in one step. A parallel task is more complete utilization of donor plasma.

Для вирішення задачі донорську плазму наносять на три послідовно з'єднані афінно-хроматографічні колонки: перша з лізин-сефарозою; друга з К1-3-сефарозою (Туг79-МаІ353,І форма), третя з К1-3-сефарозою (Туг79-МаІ337, Ії форма). І та Ії форми кринглів розділяли на конканавалін А-сефарозі (14).To solve the problem, donor plasma is applied to three serially connected affinity chromatography columns: the first with lysine-sepharose; the second with K1-3-sepharose (Tug79-MaI353, I form), the third with K1-3-sepharose (Tug79-MaI337, Ii form). I and II forms of kringle were separated on concanavalin A-sepharose (14).

На лізин-сефарозі плазму виснажують на плазміноген, тим самим вивільняючи частку ог-антиплазміну, що в плазмі крові циркулює в комплексі з плазміногеном. На К1-3 (І форма)-сефарозі плазму виснажують на фібриноген та гістидинбагатий білок. На К1-3 (Ії форма)-сефарозі специфічно сорбується оо-антиплазмін.Plasma is depleted of plasminogen on lysine-sepharose, thereby releasing a portion of og-antiplasmin that circulates in the blood plasma in a complex with plasminogen. Plasma is depleted of fibrinogen and histidine-rich protein on K1-3 (I form) Sepharose. OO-antiplasmin is specifically adsorbed on K1-3 (II form) Sepharose.

Після нанесення плазми колонки промивають робочим буфером з високою іонною силою для видалення неспецифічно сорбованих білків. Елюцію оо-антиплазміну з третьої колонки проводять робочим буфером, що містить б-аміногексанову кислоту.After applying the plasma, the columns are washed with a working buffer with a high ionic strength to remove non-specifically adsorbed proteins. Elution of oo-antiplasmin from the third column is carried out with a working buffer containing b-aminohexanoic acid.

Одержаний аг-антиплазмін за даними електрофорезу має молекулярну масу 70кДа і є гомогенним (без домішок фібриногену і гістидинбагатого білка). Виділений с2-антиплазмін проявляє високу |інгібіторну активність, яку визначають за здатністю інгібувати гідроліз плазміном специфічного хромогенного субстрату О-According to the data of electrophoresis, the obtained Ag-antiplasmin has a molecular weight of 70 kDa and is homogeneous (without impurities of fibrinogen and histidine-rich protein). Isolated c2-antiplasmin exhibits high |inhibitory activity, which is determined by the ability to inhibit hydrolysis by plasmin of a specific chromogenic substrate O-

Ма!І-І-Гецш-І-Гув-п-нітроаниліду (15). Отримані препарати аг-антиплазміну зберігають при -40"С або ліофілізують.Ma!I-I-Getsch-I-Guv-p-nitroanilide (15). The obtained Ag-antiplasmin preparations are stored at -40"C or lyophilized.

Можливість здійснення способу підтверджується прикладами.The possibility of implementing the method is confirmed by examples.

Приклад 1. 200мл цитратної донорської плазми, до якої додавали детергент тритон Х-100 до 0,0195 кінцевої концентрації, наносили зі швидкістю 15-20мл/год при 4"С на три послідовно з'єднані афінно-хроматографічні колонки : - лізин-сефарозу 48, 50мл гелю сефарози, попередньо зрівноваженою 0.05М натрій-фосфатним буфером, рн 74; - К1І-3 (І форма)-сефарозу 48, 20мл гелю сефарози, що містить 2мг К1!-3 на їмл гелю, попередньо зрівноваженою 0,04М натрій-фосфатним буфером, ріН7,0; - К1-3 (Ії форма)-сефарозу 48, 20мл гелю сефарози, що містить 2мг К!-3 на Імл гелю, попередньо зрівноваженою 0,04М натрій-фосфатним буфером, рін7,0.Example 1. 200 ml of citrate donor plasma, to which Triton X-100 detergent was added to a final concentration of 0.0195, was applied at a rate of 15-20 ml/h at 4"C to three sequentially connected affinity chromatography columns: - lysine-Sepharose 48, 50 ml of sepharose gel pre-equilibrated with 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 74 - K1I-3 (I form)-Sepharose 48, 20 ml of sepharose gel containing 2 mg K1!-3 per ml of gel, pre-equilibrated with 0.04 M sodium-phosphate buffer, pH 7.0 - K1-3 (II form)-sepharose 48, 20 ml of sepharose gel containing 2 mg of K!-3 per Iml of gel, pre-equilibrated with 0.04 M sodium-phosphate buffer, pH 7.0.

Після нанесення плазми третю колонку промивають 0,04М натрій-фосфатним буфером, ріН7,0, що містить 0О,5М хлорид натрію до 0-0,02 значень екстинкції розчину при 280нм. Специфічну елюцію аг-антиплазміну проводять 0,04М натрій-фосфатним буфером, рнН7,0, що містить 0,05М б-аміногексанову кислоту. Збирають фракції об'ємом 1,25мл. Фракції, екстинкція яких становить 0,5-2,0 при 280нм, об'єднують. а2-Антиплазмін діалізують проти охолодженої дистильованої води, в яку додають бікарбонат амонію до слабо лужної реакції.After applying the plasma, the third column is washed with 0.04 M sodium phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.5 M sodium chloride to 0-0.02 extinction values of the solution at 280 nm. Specific elution of Ag-antiplasmin is carried out with 0.04M sodium phosphate buffer, pH 7.0, containing 0.05M b-aminohexanoic acid. Collect fractions with a volume of 1.25 ml. Fractions whose extinction is 0.5-2.0 at 280 nm are combined. a2-Antiplasmin is dialyzed against chilled distilled water, to which ammonium bicarbonate is added to a slightly alkaline reaction.

Концентрацію інгібітору визначають, вимірюючи оптичне поглинання за 280нм і віднімаючи значення поглинання за 320нм. Концентрацію розраховують за значенням коефіцієнта екстинкції (195, 1см) с5- антиплазміну, що дорівнює 6,7. Активність аг-антиплазміну визначають за інгібуванням амідолітичної активності плазміну з відомим відсотком активних центрів. Молярне співвідношення со2-антиплазміну до плазміну дорівнює 1:1. Активність одержаних препаратів перевищує 9095.The inhibitor concentration is determined by measuring the optical absorbance at 280 nm and subtracting the absorbance value at 320 nm. The concentration is calculated based on the value of the extinction coefficient (195.1 cm) of c5-antiplasmin, which is equal to 6.7. Ag-antiplasmin activity is determined by inhibition of the amidolytic activity of plasmin with a known percentage of active centers. The molar ratio of co2-antiplasmin to plasmin is 1:1. The activity of the obtained drugs exceeds 9095.

Приклад 2.Example 2.

Виділення оо-антиплазміну проводять, як показано в прикладі 1, але донорську плазму розбавляють вдвічі для зменшення в'язкості. Розбавлення плазми збільшує тривалість виділення ог-антиплазміну, внаслідок чого його інгібіторна активність дещо знижується.Isolation of oo-antiplasmin is carried out as shown in example 1, but the donor plasma is diluted in half to reduce viscosity. Dilution of plasma increases the duration of release of og-antiplasmin, as a result of which its inhibitory activity is slightly reduced.

Приклад 3. о»-антиплазмін виділяють, як описано у прикладі 1, але в плазму не додають тритон Х-100. Відсутність детергенту не впливає на концентрацію та активність отриманого інгібітору, але не дозволяє використовувати плазму з високим вмістом ліпідів.Example 3. o"-antiplasmin is isolated as described in example 1, but triton X-100 is not added to the plasma. The absence of detergent does not affect the concentration and activity of the obtained inhibitor, but does not allow the use of plasma with a high lipid content.

Таким чином, запропоновано простий та швидкий спосіб виділення високоочищеного інгібітору плазміну з плазми крові людини. Спосіб дозволяє в один етап без застосування додаткових методів очистки - гель- фільтрації та іонообмінної хроматографії одержати йо-антиплазмін без домішок фібриногену та гістидинбагатого білка з високою інгібіторною активністю.Thus, a simple and fast method of isolating a highly purified plasmin inhibitor from human blood plasma is proposed. The method allows in one step without the use of additional purification methods - gel filtration and ion exchange chromatography to obtain io-antiplasmin without impurity of fibrinogen and histidine-rich protein with high inhibitory activity.

Список посилань. 1. бапо К., Ападегзеп Р.А., Стопаапі-Напзеп .., Киізієпзеп Р., Меїзеп І.5., ЗКимег І. Ріазтіподеп асіїмацог, їв5це дедгадайоп апа сапсег. Аду.Сапсег.Нев.-1985.-44, Ме1 .-р.139-226. 2. Спартап Н.А. Ріазтіподеп асіїмайг, іпієдгіп5, апа (пе соогаїпаїей гедшайоп ої сеїЇ аанезіоп апа тідгайоп.List of references. 1. Bapo K., Apadegzep R.A., Stopaapi-Napzep .., Kiiziepzep R., Meizep I.5., ZKymeg I. Riaztipodep asiimatsog, yiv5ce dedgadayop apa sapseg. Adu. Sapseg. Nev.-1985.-44, Me1.-r. 139-226. 2. Spartap N.A. Riaztipodep asiimaig, ipiedgyp5, apa (pe soogaipaiey gedshayop oi seiY aanesiop apa tidgayop.

Сигт.Орт.Сеї| ВіоіІ.-1997.-9.-р.714-724.Sigt.Ort.Sei| VioiI.-1997.-9.-r.714-724.

З. Гоцепрегу Н.А поме! арргоасп (0 ехріоге Ше гоЇїє ої ріавтіподеп іп Басієга! раодепевів. ТгепавZ. Hotsepregu N.A pome! arrgoasp (0 ehrioge She goYiie oi riavtipodep ip Basiega! raodepeviv. Tgepav

Місгобіо!.-1997.-5.-р.466-468. 4. Цпеп Н.8., Вуїай О.В., СоПеп 0. Рпузісоспетісаї, іттипоспетіса! апа псіопа! сотрагізоп ої питапMisgobio!.-1997.-5.-r. 466-468. 4. Tspep N.8., Vuiai O.V., SoPep 0. Rpuzisospetisai, ittipospetisa! apa psyop! sotragizop oi pitap

Півіаїіпе-псн діусоргоїєїп апа ашогозеце іппіріюг Гасюг. Віоспіт.Віорпуз.Асіа.-1983.-742, Мо1. -р.109-115. 5. МП|пеп Н.В., НоуїЇаєет: М., СоїІеп 0. Ізоїайоп апа спагасієгігайноп ої а питап ріазта ргоїєїп мйй айіпісу ггPiviaiipe-psn diusorgoiieip apa ashogozetse ippiriyug Hasyug. Viospit.Viorpuz.Asia.-1983.-742, Mo1. - r. 109-115. 5. MP|pep N.V., NouiYayeet: M., SoiIep 0. Izoiayop apa spagasiegigaynop oi a pitap riazta rgoieip myy ayipisu gg

Ше Іузіпе Біпаїпд 5ігез іп ріазтіподеп. У.8.С.-1980.-255, Мо21.-р.10214-10222. 6. Могої М., Аокі М. ІвоЇайоп апа спагасіегігайноп ої со-ріазтіп іппіріог їот питап ріазта. А помеї! ргоївіїпазе іппіріог міс іпнібіїз асімацог-іпдисеа сіої увів. У.Віої.Спет.-1976.-251, Ме19.-р.5956-5965. 7. Мітап В., СоПеп 0. Рипійсайоп апа сНагасіегіганоп ої питап апіїріазтіп, (пе Таві-асіїпду ріазтіп іппіріюг їп ріазта. Ешиг.уУ.Віоспет.-1977.-78, Ме1.-р.19-26. 8. Мітап В., І пеп Н.В., СоПеп О. Оп їйе 5ресійс іпіегасйіоп рейуєеп Ше Іузіпе-ріпаїпоу 5іез іп ріазтіп апа сотріетепіагу 5і(ев іп оі2-апіїріаєтіп апа іп йргіподеп. Віоспіт.Віорпуз.Асіа.-1979.-579, Ме1.-р.142-154. 9. Науевз М.Г., Савієїїйпо Е.). Сагропуагаїе ої Ше питап ріазтіподеп мапапів. 9.ВіоІ.СНпет.-І979.-254, Мо.- р.8768-8771. 10. Магсп 5.0., Рапкп І., Сцаїгесазав Р. А взітрійвєа теїтоа юг суаподепе5 Бготіаде асіїмайоп ої адагоб5е г аніпйу спготайодгарну. Апаї Віоспет.-1974.-60, Ме1.-р.149-152. 11. бошир-Уепзеп ІГ., 7аїде! М., Сіаєуз Н єї аІ. Тпе рпітагу вігисішге ої питап ріазтіподеп: ізоїайоп ої моShe Iuzipe Bipaipd 5igez ip riaztipodep. U.8.S.-1980.-255, Mo21.-r.10214-10222. 6. M. Mogoi, M. Aoki. And spills! rgoiviipaze ippiriog mis ipnibiiz asimatsog-ipdisea sioi uviv. U. Vioi. Spet.-1976.-251, Me19.-r. 5956-5965. 7. Mitap V., SoPep 0. Rypiysayop apa sNagasiegiganop oi pitap apiiriaztip, (pe Tavi-asiipdu riaztip ippiriyug ip riazta. Eshig.uU.Viospet.-1977.-78, Me1.-r.19-26. 8. Mitap V., I pep N.V., SoPep O. Op yile 5resiis ipiegasiiop reyuyeep She Iuzipe-ripaipou 5iez ip riaztip apa sotrietepiagu 5i(ev ip oi2-apiiriayetip apa ip yrgipodep. Viospit.Viorpuz.Asia.-1979.-579, Me1.-p.142-154. 9. Nauevz M.G., Saviiypo E.). Sagropuagaie oi She pitap riaztipodep mapapiv. 9. VioI.SNpet.-I979.-254, Mo.- p.8768-8771. 10. Magsp 5.0., Rapkp I., Stsaigesazav R. A vzitriyvea teitoa yug suapodepe5 Bgotiade asiimayop oi adagob5e g anipyu spgotayodgarnu. Apai Viospet.-1974.-60, Me1.-r.149-152. 11. Boshir-Uepzep IG ., 7aide! M., Siayeuz N eyi aI.

Іузіпе-ріпаіпд їадтепів апа опе "тіпі-ріаєтіподеп" (М.М/.38000) ру еіазіазе сагаіулеа зресіїйс Ітйеа ргоїеоувів.Iuzipe-ripaipd iadtepiv apa ope "tipi-riaetipodep" (M.M/.38000) ru eiziaze sagaiulea zresiiys Ityea rgoieouviv.

Ргодгевв іп спетісаї! йрііпоїузіз апа (пготброїувів. М.У. Вамеп Ргевг5.-1978.-3.-р.І91-209. 12. Мітап В. Айтійу-спготайюдгарніс ригісайноп ої питап 012-апііріаєтіп. Віоспет..).-1980.-191, Ме1.-р.229- 232. 13. ЦП)пеп Н.В., СоПеп 0. АІрна-2-апіїріазтіп. У.Меа.-1985.-16, Ме1-3.-р.225-283. 14 Апав М., 5оїїв О., Оіа2-Машцтіпо Т. Іпмометепі ої пе Іузіпе-ріпаїпо зе ої ріазтіподеп оп її іпЇегасбйоп мн сопсапамаїїп А. Тпготбр. Невз.-1989.-56, Меб.-р.709-718.Rgodgevv ip spetisai! yriipoiuziz apa (pgotbroiuviv. M.U. Vamep Rgevg5.-1978.-3.-yr.I91-209. 12. Mitap V. Aitiyu-spgotaiyudgarnis rigisainop oyi pitap 012-apiiriyatip. Viospet..).-1980.-191 , Me1.-r.229- 232. 13. CP)pep N.V., SoPep 0. AIrna-2-apiiriaztip. U.Mea.-1985.-16, Me1-3.-r.225-283. 14 Apav M., 5oiyiv O., Oia2-Mashtipo T. Ipmometepi oi pe Iuzipe-ripaipo ze oi riaztipodep op her ipIegasbyop mn sopsapamaiiip A. Tpgotbr. Nevz.-1989.-56, Meb.-r.709-718.

15. М/ітап В.15. M/itap V.

Нитап аг-апіїріаєтіп.Nitap ag-apiiriayetip.

Меїтодвз іп Епгупої.-1981.-80.-р.395-408.Meitodvz ip Epgupoi.-1981.-80.-r. 395-408.

Claims

The method of obtaining highly purified o2-antiplasmin from human blood plasma by affinity chromatography, which is characterized by the fact that affinity chromatography is carried out sequentially on lysine-sepharose, K1-3-sepharose (Tug79-Ma!Iz353, I form) and K1-3-sepharose ( Tug79-MaI337, II form).