UA123728C2 - Фармацевтичні композиції, що містять антагоніст інтегрину альфа4, для застосування в лікуванні запальних станів ока - Google Patents

Description

(е)

МН» зу (о) ві | Го

Ж

М он сг - М

Е Н

(в) т (в) (І) або її фармацевтично прийнятну сіль, в лікуванні запального стану ока шляхом місцевого введення в око людини, де окрему дозу сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі в діапазоні від 0,01 до 5 мг вводять у кожне уражене око.

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США Мо 62/189813, поданої 8 липня 2015 року, повний текст якої цим включений у дану заявку за допомогою посилання.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД

Даний винахід стосується застосування фармацевтичної композиції, такої як офтальмологічна композиція для місцевого застосування, що містить антагоніст інтегрину а4, в лікуванні запальних станів ока, в тому числі синдрому сухого ока. Даний винахід також стосується способу лікування запальних станів ока, в тому числі синдрому сухого ока, у людей та інших ссавців за допомогою введення фармацевтичної композиції, такої як офтальмологічна композиція для місцевого застосування, що містить антагоніст інтегрину а4.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ ВИНАХОДУ

Синдром сухого ока (ОЕЮ) є одним із найпоширеніших порушень ока, що заподіюють дискомфорт. Він був визначений як багатофакторне захворювання поверхні ока, яке частіше зустрічається у жінок і людей похилого віку. ОЕЮ асоційований із симптомами дискомфорту, порушенням зорової функції, нестабільністю слізної плівки та запаленням поверхні ока, що призводить до потенційного ураження тканин поверхні ока (звіт ОЕМУ5 щодо вивчення синдрому сухого ока, 2007). Прозапальне середовище характеризується підвищеними рівнями цитокінів і хемокінів у слізній плівці, рогівці та кон'юнктиві й підвищеною інфільтрацією кон'юнктивального епітелію, а в деяких випадках слізної залози, аутореактивними Т-клітинами (РПидгеїдег еї аї., 1999; де Раїма евї а!., 2009а; Маззіпдаїе сеї а!., 2009); як обговорюється Фет і колегами (5іет еї аІ., 2010; тет еї аї., 2013). Зміна складу слізної плівки (слизових секретів, ліпідів, білків) та її знижений об'єм призводять до порушень цілісності слізної плівки, які сприяють циклу розвитку захворювання.

Поміщення мишей у контрольовані умови стресу зневоднення (05) призводить до патології поверхні ока, що багато в чому нагадує ОЕО у пацієнтів-людей (Юиг5ип еї аї., 2002; де Раїма еї а!., 20060; Міедегкогп еї аї., 2006; ае Раїма єї аї., 2009а). На сьогодні ця модель являє собою найкраще охарактеризовану тваринну модель для вивчення ОЕО.

Інтегрини являють собою гетеродимерні глікопротеїни, що складаються з однієї а- й однієї р-

Зо субодиниці. Інтегрини, що експресуються на клітинній поверхні лейкоцитів, відіграють роль їхнього рекрутування до ділянок запалення. Асоціація специфічних а- та В-субодиниць визначає лігандну специфічність інтегрину. «4-субодиниця інтегрину (СО494) є компонентом дуже пізнього антигена-4, МІ А-4 (інтегрин а481; С0р494/С029) та «4р7 (С0494/С0103). У випадку інтегрину а4р1 відповідними лігандами є молекула адгезії судинного ендотелію 1 типу (МСАМ-1) на ендотеліальних клітинах судин, яка належить до молекул адгезії суперродини імуноглобулінів, і глікопротеїн позаклітинного матриксу - фібронектин, які відповідають за хомінг, переміщення, диференціювання, примування, активацію, проліферацію та виживання клітин, які експресують інтегрин а4р1. Інтегрин «481 експресується на лімфоцитах, моноцитах, макрофагах, МК-клітинах й еозинофілах. Інтегрин «487 і відповідний йому ліганд МАаСАМ (молекула клітинної адгезії типу "гздресин" у слизових оболонках 1) регулюють переміщення лейкоцитів у кишечник, проте їхнє залучення до ОЕО не може бути виключене.

Було показано, що наталізумаб, антитіло, спрямоване проти а4-субодиниці інтегрину, значною мірою пригнічує запалення та поліпшує клінічні результати як під час розсіяного склерозу (Сто55 апа Маїзтійй, 2014), так і під час хвороби Крона (Сопеп еї аї., 2014), які також є патологіями, що опосередковуються Т-клітинами. Було показано, що ліфітеграст, низькомолекулярний антагоніст, спрямований проти іншої молекули адгезії (І БА-1, інтегрин о 82), зменшує ступінь забарвлення рогівки та поліпшує симптоми у разі місцевої доставки пацієнтам із синдромом сухого ока (Зперрага еї аї., 2014). Крім того, було показано, що специфічний низькомолекулярний антагоніст інтегрину «481, ВІО-8809, знижує ступінь забарвлення рогівки флуоресцеїном, кількість Т-клітинних інфільтратів кон'юнктиви та рівень експресії ТМЕса у рогівці та кон'юнктиві в мишачій моделі синдрому сухого ока (Есоїййег еї аї., 2008). Загалом ці аспекти стали підставою для додаткового вивчення блокади інтегрину а4 у тваринній моделі ОЕО.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

В одному аспекті дана заявка стосується застосування фармацевтичної композиції, що містить сполуку формули І:

о пут тур її в о М і н кана КАК р ан о сор о

Г Ф. або її фармацевтично прийнятну сіль (які разом називаються терапевтичним засобом А) та одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин, при цьому композиція є застосовною для лікування запального стану ока шляхом місцевого введення в око людини, де окрему дозу сполуки формули І або ії фармацевтично прийнятної солі в діапазоні від 0,01 мг до 5 мг вводять у кожне уражене око. У деяких таких варіантах здійснення фармацевтична композиція придатна для місцевого застосування. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція придатна для застосування щодо кон'юнктивального мішка або повіки. У певних інших варіантах здійснення фармацевтична композиція придатна для застосування під кон'юнктиву, в камеру, у склоподібне тіло, у субтеноновий простір, під сітківку, під судинну оболонку або на судинну оболонку.

В іншому аспекті дана заявка стосується застосування фармацевтичної композиції, що містить терапевтичний засіб А і одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин, де композиція придатна для лікування запального стану ока у разі застосування у формі очних крапель, спрею або аерозолю.

У додатковому аспекті дана заявка стосується застосування фармацевтичної композиції, що містить терапевтичний засіб А і одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин, де композиція придатна для лікування запального стану ока у разі застосування у формі офтальмологічного складу для місцевого застосування.

В іншому аспекті дана заявка стосується застосування фармацевтичної композиції, що містить сполуку формули І: в; тури ще ай з Ж. ще де М. Ко ях сте - 7 й о нЯ о 0). або її фармацевтично прийнятну сіль, де композиція додатково містить одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

У певних варіантах здійснення будь-якого із вищезгаданих аспектів запальний стан ока являє собою синдром сухого ока. В інших варіантах здійснення кожного аспекту запальний стан ока являє собою неінфекційний увеїт (передній, серединний, задній, генералізований), неінфекційний кон'юнктивіт, ірит або склерит.

У певних варіантах здійснення будь-якого із вищезгаданих аспектів терапевтичний засіб А

Зо являє собою сполуку (І) або її фармацевтично прийнятну сіль. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб А являє собою калієву сіль сполуки (Ї).

Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що будь-який із попередніх способів лікування та/або варіантів застосування може бути здійснений за допомогою місцевого або інакшого введення в око фармацевтичної композиції, що містить терапевтичний засіб А. Під використовуваним у даному документі терміном "місцеве введення" мається на увазі застосування у формі очних крапель, спрею, аерозолю, гелю, крему або мазі, застосовуваних щодо поверхні ока,

застосування щодо кон'Юнктивального мішка, застосування за допомогою вкладення, застосування за допомогою пристрою для доставки лікарського засобу, сконструйованого для доставки офтальмологічних лікарських препаратів, тощо. Під використовуваним у даному документі терміном "інакше введення в око" мається на увазі застосування фармацевтично прийнятного складу під кон'юнктиву, в камеру, у склоподібне тіло, у субтеноновий простір, під сітківку, під судинну оболонку або на судинну оболонку, за допомогою вкладення або пристрою, сконструйованого для доставки офтальмологічних лікарських препаратів, тощо.

Із урахуванням даних, представлених у даному документі, очікується, що блокада рецепторів інтегрину са4 буде сприяти лікуванню та полегшенню інших запальних та імунологічних станів ока, в патогенез яких залучені лейкоцити, таких як усі форми увеїту (передній, серединний, задній, генералізований), кон'юнктивіт, ірит або склерит (дифузний, нодулярний, некротизувальний), на додаток до ОЕО.

Сполука формули І, також відома як (5)-3-(4-((4-карбамоїлпіперидин-1-карбоніл)окси)феніл)- 2-((5)-4-метил-2-(2-(о-толілокси)дацетамідо)упентанамідо)пропанова кислота; або (25)-3-І4-(ЦаА- (амінокарбоніл)-1-піперидинілікарбонілюкси)феніл|-2-((25)-4-метил-2-Ц2-(2- метилфенокси)ацетиліаміно)пентаноїл)іаміно)їпропанова кислота; або (УУ559090, є сильним антагоністом інтегрину а4, який раніше клінічно досліджували на пацієнтах із астмою шляхом пероральної інгаляції (Камепзбего еї аї., 2006).

Без обмеження будь-якою теорією щодо механізму дії, ефект сполуки формули Ї, очевидно, є як протизапальним, так і таким, який модифікує перебіг захворювання. У разі локального введення в око сполука формули | поліпшувала бар'єрну функцію рогівкового епітелію, знижувала рівень маркерів запалення в рогівці та кон'юнктиві, зменшувала рекрутування та хомінг Т-лімфоцитів у кон'юнктиву, і, що надзвичайно, блокувала міграцію клітин, що представляють антиген, у дренувальні лімфатичні вузли та їхню активацію в мишачій моделі

РЕО. Сполука формули І була неефективною у разі системного введення. Це надзвичайно з огляду добре відомої ролі інтегринів у переміщенні лейкоцитів. Якщо перешкоджання переміщенню лейкоцитів було єдиним або щонайменше основним механізмом дії антагоніста інтегрину «44, такого як сполука формули І, то можна дійти висновку, що системний вплив лікарського засобу повинен бути важливішим, ніж вплив лікарського засобу на поверхні ока.

Зо Переміщення лейкоцитів пригнічується антагоністом інтегрину 04, який зв'язується з циркулюючими лейкоцитами, перш ніж вони перетнуть ендотеліальну стінку судин у ділянках запалення, за допомогою взаємодії з молекулами клітинної адгезії МСАМ-1 та МАаСАМ. Той факт, що місцевий шлях введення сполуки формули І, а не системний шлях, був ефективним у лікуванні ознак ОЕО у даній тваринній моделі, свідчить про локальний, а не системний ефект антагонізму інтегрину «4. Цей локальний ефект, очевидно, характерний для сполуки формули як антагоніста інтегрину ай і відрізняється від такого у стероїдного лікувального засобу для місцевого застосування (дексаметазону фосфату) тим, що дексаметазон фосфат для місцевого застосування знижував ступінь асоційованого з ОЕО забарвлення рогівки, а не міграцію клітин, що представляють антиген, у дренувальні лімфатичні вузли. Із цього обговорення фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що терапевтичний ефект антагонізму інтегрину ай реалізується завдяки унікальному механізму. Важливим аспектом даного унікального механізму, який забезпечує модифікування перебігу захворювання, є переривання імунного циклу, який присутній під час ОЕбО, на рівні дренувальних лімфатичних вузлів, при цьому даний механізм не властивий іншим лікарським засобам, таким як стероїди для місцевого застосування.

Короткий опис графічних матеріалів

На Фіг. 1 показано, що місцева обробка сполукою формули І дозозалежним чином запобігає дестабілізації рогівкового бар'єра, що індукується О5.

Геометричне середнє ж 95 95 довірчий інтервал показника інтенсивності поглинання СО після 5 днів стресу зневоднення (05). М5 - без піддавання стресу, без обробки; 055 - з піддаванням стресу зневоднення протягом 5 днів, без місцевої обробки; усі інші групи являють собою 055 з місцевою обробкою; ЮМех-0,1 95 дексаметазону фосфату; В55 - збалансований сольовий розчин (Гейег5 РІПаптасу, Сан-Хосе, Каліфорнія), середовище-носій для дексаметазону; М СУМ - фосфатно-сольовий буферний розчин, рН 7 (середовище-носій для

СУУ559090); СУМ 1 мг/мл - ЗУУ559090 (1 мг/мл); СУМ З мг/мл - (ЗУУ559090 (3 мг/мл); СУМ 10 мг/мл - ЗУУ559090 (10 мг/мл); СМУ 30 мг/мл - зУУ559090 (30 мг/мл). М-26-30. яр-0,05; р«0,01 порівняно з контролем (055 порівняно з М5; Оех порівняно з середовищем-носієм для Юех; (ЗМУ порівняно з середовищем-носієм для СУМУ; АМОМА зі змішаними ефектами Іосд10-трансформованих даних ОС).

На Фіг. 2 показано, що сполука формули І! діє головним чином локально, а не системно, з бо поліпшенням дестабілізації рогівкового бар'єра, що індукується О5.

Геометричне середнє ж 95 95 довірчий інтервал показника інтенсивності поглинання СО після 5 днів стресу зневоднення (05). М5 - без піддавання стресу, без обробки; 055 - з піддаванням стресу зневоднення протягом 5 днів, без обробки; усі інші групи являють собою 055 з обробкою; ЮОех-0,1 95 дексаметазону фосфату; М Оех - збалансований сольовий розчин (Гейег5 Рпаптасу, Сан-Хосе, Каліфорнія), середовище-носій для дексаметазону; СУМ місцево -

СУУ559090 місцево (30 мг/мл; 60 мкг із розрахунку на одне око); СУМУ 5С-(3УУ559090 підшкірно (30 мг/мл; 120 мкг); М ЗМУ - фосфатно-сольовий буферний розчин, рН 7 (середовище-носій для

СМуУ559090). М-26-30. хр-0,05; "р«0,01 порівняно з контролем (055 у порівнянні з М5; (СУМ у порівнянні з середовищем-носієм для СУМ; АМОМА зі змішаними ефектами Іод10-трансформованих даних ар).

На Фіг. ЗА та Фіг. ЗВ показано, що місцева обробка сполукою формули | знижує рівень маркерів запалення.

Фіг. ЗА. Відносна кратність зміни експресії генів І-та, ММР-9, СХСОІ -9, ТаР-Б1 у рогівці ж 50.

Фіг. ЗВ. Відносна кратність зміни експресії гена ТОБЕ-р1 в кон'юнктиві ж 50.

Лінією позначений контроль, що не піддавали стресу, без обробки.

М У - фосфатно-сольовий буферний розчин, рН 7 (середовище-носій); СУМ 30 мг/мл -

СУУ559090 (30 мг/мл). М-7-8. "р«е0,05; и хре0 01; треб, 001; иихр«0,0001 (одновибірковий і-критерій).

На Фіг. 4 показано, що місцева обробка сполукою формули І! знижує кількість СО11сж та

Ср11с-/МНе 1Із- дендритних клітин у дренувальних шийних лімфатичних вузлах.

Відсоток гейтованих клітин (РГАС5), виділених із дренувальних СІМ, які об'єднували від кожної миші з забарвленням за СО11с, СО116 та МНС ІІ. М5 - без піддавання стресу, без обробки; 051 - з піддаванням стресу зневоднення протягом 1 дня, без обробки; усі інші групи являють собою 051 з обробкою; Юех-0,1 95 дексаметазону фосфату; М СУМ - фосфатно- сольовий буферний розчин, рН 7 (середовище-носій для дексаметазону та 5УУ559090);. СУМ місцево - ЗУУ559090 місцево, білатерально (30 мг/мл; 60 мкг із розрахунку на одне око); СУМ

ЗС-О2МУ559090 50 ВІЮО (30 мг/мл; 120 мкг). М-16. "р«0,05 порівняно з контролем (051 у порівнянні з Ме; УМ у порівнянні з середовищем-носієм для ОУУ; 2-факторний АМОМА з

Зо фіксованим ефектом, що являє собою обробку, та випадковим експериментальним ефектом із наступною процедурою множинного порівняння з використанням критерію Даннета).

На Фіг. 5 показано, що місцева обробка сполукою формули | знижує інфільтрацію кон'юнктиви Т-клітинами.

Групові середні значення щільності клітин і 95 95 довірчі інтервали після 5 днів стресу зневоднення (05). МО - без піддавання стресу, без обробки; 055 - з піддаванням стресу зневоднення протягом 5 днів, без обробки; усі інші групи являють собою О55 з обробкою; СУМ місцево - ЗУУ559090 місцево (30 мг/мл; 60 мкг із розрахунку на одне око); М СУМ - фосфатно- сольовий буферний розчин, рН 7 (середовище-носій для (3Му559090). М-5. хр-0,05; иреб, 001 порівняно з контролем 055 (процедура Крускала-Уолліса із наступною процедурою множинних порівнянь із використанням критерію Данна).

На Фіг. 6 показані значення концентрації ЗУУ559090 у кон'юнктивальній і рогівковій тканині після введення 40 мкл (50 мг/мл) ЗУУ559090А. Пунктирною лінією на приблизно 4000 нМ (2400 нг/мл) позначений приблизний рівень у тканині, необхідний для досягнення концентрації ІС90 -80 нм (48 нг/мл), якщо ступінь зв'язування білка становить 98 95. Приблизний рівень у тканині, необхідний для досягнення концентрації ІС50 «8 НМ (5 нг/мл), становить 400 нМ (5240 нг/мл), якщо ступінь зв'язування білка становить 98 95. Після введення 40 мкл (50 мг/мл)

СМУ559090А значення концентрації в кон'юнктивальній і рогівковій тканині перевищували 3000 нг/мл через 30 хвилин, і через З години рівні в рогівковій тканині залишались рівними вище 1000 нг/мл.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

І. Локальна дія антагоніста інтегрину а4 у мишачій моделі ОЕЮ

РЕО являє собою багатофакторне захворювання поверхні ока, яке асоційоване із симптомами дискомфорту, порушенням зорової функції, нестабільністю слізної плівки та запаленням поверхні ока, що призводить до потенційного ураження тканин поверхні ока (звіт

ОЕМ/5 щодо вивчення синдрому сухого ока, 2007). Воно охоплює різноманітний спектр етіологій, як, наприклад, вплив факторів навколишнього середовища, етіологія, зумовлена застосуванням лікарських засобів, носіння контактних лінз, старіння. ОЕЮ також може являти собою очний прояв на фоні системного автоїмунного стану, такого як без обмеження синдром

Шегрена, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, реакція "трансплантат проти хазяїна", синдром Стівенса-Джонсона, очний рубцевий пемфігоїд, саркоїдоз (розглянуто 5гегп еї а!., 2010; 2оиКНтї, 2006).

Як запальне захворювання поверхні ока, ЮОЕО опосередковується аутореактивними Т- клітинами та асоціюється з порушенням функції рогівкового бар'єра, підвищеною експресією та рівнями запальних цитокінів і хемокінів, нестабільністю слізної плівки та дискомфортом. Автор даного винаходу виявив, що антагоніст інтегрину 44 у разі локального введення в око відновлював бар'єрну функцію рогівкового епітелію, знижував рівень експресії маркерів запалення в рогівці та кон'юнктиві, зменшував інфільтрацію кон'юнктиви Т-клітинами та пригнічував міграцію клітин, що представляють антиген, у дренувальні лімфатичні вузли та їхню активацію в мишачій моделі ОЕО.

Лімфоцити, що зазнали примування, й активовані Т-лімфоцити переміщаються із кров'яного русла в ділянки запалення за допомогою рецепторів адгезії, що експресуються на їхній клітинній поверхні, які взаємодіють із відповідними молекулами адгезії на ендотелії судин. Лімфоцитарні інтегрини а481 (МІ А-4), а487 та а 82 (І ЕА-1) зв'язуються з ендотеліальними МСАМ-1, МАаСАМ та ІСАМ-1 відповідно. У ділянках запалення рецептори лімфоцитів можуть взаємодіяти з певними компонентами тканини, фібронектином у випадку а4ф81, що додатково сприяє хомінгу, активації та проліферації лімфоцитів (Мо)їта еї аї., 1990; Сох еї аі!., 2010). Сполука формули І має високий ступінь афінності щодо «481 (таблиця 1). В аналізах клітинної адгезії вона ефективно блокувала клітинну адгезію «481 до МСАМ-1 їі фібронектину (домен С5-1), а також а487 до МАЙСАМ (таблиця 1). Остання взаємодія має значення у середовищі кишечника, але вона не була вивчена в оці. У пацієнтів із синдромом Шегрена, які мають ксеростомію та ОЕО, інтегрин «481 був виявлений у Т-лімфоцитарних інфільтратах у тканині губи та МСАМ-1 на судинних і дендритних клітинах (Едуагаз еї аї., 1993).

Підвищене поглинання флуоресцентних барвників рогівковим епітелієм є характерною ознакою ОЕО. Раніше повідомлялось про те, що інтенсивність забарвлення рогівки за допомогою Огедоп-сгееп Юехігап (950) у мишей позитивно корелює зі зниженням функції рогівкового бар'єра після експериментального О5 (ає Раїма еї аї., 2009а; де Раїма єї аї., 20066).

Це імітує те, що клінічно спостерігається у пацієнтів із синдромом сухого ока, в яких він підтверджується забарвленням рогівки флуоресцеїном. Низькі показники забарвлення вказують

Зо на виключення барвника, тобто на цілісність рогівкового бар'єра. На відміну від цього, високі показники забарвлення є відображенням порушення функції бар'єра. Показники забарвлення рогівки флуоресцеїном використовували як важливі кінцеві точки для встановлення діагнозу

РЕО і як параметр ефективності в клінічних випробуваннях.

У мишей, які перебували більше 5 днів у контрольованих умовах Ю5 (як описано нижче в розділі "Матеріали та способи"), розвивалось порушення функції рогівкового бар'єра, що виявлялось за точковим забарвленням рогівки за допомогою ОСО (як описано нижче в розділі "Матеріали та способи"), як повідомлялось раніше (де Раїма еї аї., 2009а; де Раїма еї аї., 20066).

У даній мишачій моделі місцеве введення сполуки формули І дозозалежним чином знижувало ступінь забарвлення рогівки за допомогою ОО, подібно кортикостероїду для місцевого застосування - дексаметазону фосфату (Фіг. 1). Стероїди для місцевого застосування є ефективними лікарськими препаратами проти ОЕО, якщо змащувальні засоби і нестероїдні імуномодулятори не ефективні, але їх зазвичай використовують протягом короткого періоду часу внаслідок можливості розвитку пов'язаних із стероїдами побічних ефектів з боку органа зору. Раніше повідомлялось про подібне поліпшення щодо забарвлення рогівки в даній тваринній моделі з іншим антагоністом інтегрину «481 ВІО-8809 (ЕсойпПег еї аї!., 2008). Стосовно ваги тіла, місцеве застосування лікарського засобу щодо ока миші на 2-3 порядки перевищує дозу, яку одержує людина. Можна припустити, що за допомогою місцевої обробки у миші досягається належна системна експозиція. Оскільки інтегрини відіграють роль у переміщенні лейкоцитів, то можна дійти висновку, що системний вплив може бути необхідною умовою для лікування захворювання ока за допомогою антагоніста інтегрину. Отже важливо визначити, чи є системна обробка ефективнішою. Цікаво, що під час одночасного порівняння системної обробки з місцевою з однаковою дозою сполука формули І значно поліпшувала результат забарвлення рогівки лише під час місцевого введення (Фіг. 2). Це несподіване відкриття свідчить про те, що в терапії цього захворювання з використанням сполуки формули І існує критично важлива локальна складова, яка є необхідною для терапевтичного успіху.

Було висловлено припущення, що ОЕО є наслідком імунного циклу, який включає в себе міграцію дендритних клітин, що представляють антиген (які часто називаються АРС або ОС), із поверхні ока у дренувальні шийні лімфатичні вузли (СІМ), де відбувається примування аутореактивних Т-клітин (РПидієїЧег еї аїЇ., 2008). Потім ці аутореактивні СО4Т-клітини бо повертаються до поверхні ока, розповсюджуючи захворювання (Соигзеу 6ї а!., 2013; Міедегкогп еї аї,, 2006; 2папдо еї аї.,, 2012). Якщо інтегринові рецептори присутні на СО4- Т-клітинах, виникає запитання, чи впливає обробка антагоністом інтегрину а4 на Т-клітини у дренувальних лімфатичних вузлах. За один день Ю5З ні підвищувався рівень СО4ж4 або СОвяж Т-клітин у дренувальних лімфатичних вузлах, ні знижувалась кількість Т-клітин, як під час обробки сполукою формули | або дексаметазоном. Як повідомлялось раніше, за 1 день Ю5 значно підвищувався рівень СЮО11р-- моноцитів у дренувальних лімфатичних вузлах (Зспаштрбиго еї аї., 2011; 2папо еї аї., 2014). Проте жодною з обробок лікарським засобом не можна було зменшити кількість моноцитів.

Раніше було показано, що ОС мають важливе значення в імуноопосередкованій патології, індукованій О5, оскільки в мишей, позбавлених ОС, не розвивається ОЕО (Зспаштрбиго еї аї., 2011). Унаслідок короткочасного О5 рівень СО11с-ОсС у дренувальних лімфатичних вузлах, як виявилось, підвищувався, хоч і не значно. На відміну від дексаметазону для місцевого застосування або системної обробки сполукою формули І, які не чинили значимого ефекту на ці клітини, рівень активованих (МНО-1І) і неактивованих СО11с клітин знижувався у разі місцевої обробки сполукою формули І (Фіг. 4). Це несподіване відкриття свідчить про те, що сполука формули І запобігає міграції клітин, що представляють антиген, у дренувальні лімфатичні вузли, і що для цього ефекту необхідна наявність лікарського засобу на поверхні ока. Подібно, як обговорювалось раніше, лише місцева обробка сполукою формули | поліпшувала результат забарвлення рогівки. Без обмеження будь-якою теорією, загалом під цими результатами мається на увазі, що для лікування запалення ока, пов'язаного з ОЕО, сполука формули І діє локально на рівні поверхні ока шляхом запобігання міграції ОС, що представляють антиген, у дренувальні СІ М, що таким чином перериває імунний цикл.

Прозапальне середовище поверхні ока під час ОЕО і дана мишача модель добре описані в літературі (Соггаїез еї а!., 2006; Соигзеу еї а!., 2014; де Раїма еї а!ї., 2009а; де Раїма еї аї., 2006а; де Раїма еї а!., 20096; ае Раїма єї аї., 2011). Експресія багатьох цитокінів і хемокінів підвищується в рогівці та кон'юнктиві, що призводить до їх підвищених рівнів у слізній плівці. У прикладах, представлених у даному документі, місцева обробка сполукою формули І пригнічувала експресію ІІ -1с, ММР-9, СХСЇІ -9 та ТОЕВДІ1 у рогівковому епітелії та ТОЕДІ1 у кон'юнктиві (Фіг. 3).

І/-1« являє собою прозапальний цитокін, який вивільняється з епітелію та запальних клітин.

Зо Його потенційна значущість щодо захворювання демонструється клінічною розробкою антагоніста рецептора 1-1, ЕВІ-005, для лікування запалення поверхні ока (Нои еї аї., 2013;

Соїдвівїп еї аі., 2015). ММР-9 являє собою протеазу, яка була залучена в розрив щільних контактів рогівкового епітелію та дестабілізацію рогівкового бар'єра під час О5 (де Раїма еї аї., 20066; І цо еї а!., 2004; РПшдгтеїдег еї аїІ., 2005). Було показано, що рівні ММР-9 в слізній рідині корелюють з інтенсивністю забарвлення рогівки й іншими клінічними параметрами у пацієнтів із синдромом сухого ока (СпоїїКамапіспй еї аїЇ., 2009). СХСІ19 разом із СХСІ10 та СХСЇІ 11 привертають ТпП1-клітини, що продукують інтерферон-гама, та їхній рівень є підвищеним у слізній плівці та кон'юнктиві у пацієнтів із синдромом сухого ока (Хооп еї аї., 2010). ТОБ-рД1 залучений у примування ТИ-17 разом із ІЇ/-б та 1-23, і, як було виявлено, їхній рівень підвищений у слізній рідині у пацієнтів із синдромом сухого ока (сціспег еї а!., 2011; 5іосКіпдег еї а!., 2007; 7пепо еї аї., 2010). Отже у даній тваринній моделі обробка сполукою формули І знижує рівень деякий маркерів запалення, асоційованих із запаленням поверхні ока під час ОЕО.

Приклади демонструють поліпшення об'єктивних симптомів синдрому сухого ока за допомогою застосування сполуки формули І у мишачій О5-моделі. Сильний антагоніст інтегрину а4 діяв локально на рівні поверхні ока, запобігаючи міграції клітин, що представляють антиген, у дренувальні лімфатичні вузли із перериванням у результаті імунного циклу синдрому сухого ока. Лікування даного захворювання завдяки запобіганню міграції клітин, що представляють антиген, являє собою новий і раніше невідомий механізм дії антагоністів інтегрину.

ІЇ. Способи лікування

Термін "лікування" або "здійснення лікування", стосовно лікування запальних станів ока, у тому числі ОЕО, стосується, з-поміж іншого, попередження розвитку захворювання або зміни перебігу захворювання (наприклад, без обмеження сповільнення прогресування захворювання), або купування симптому захворювання, або зменшення ступеня проявлення одного або більше симптомів, та/або зменшення рівня одного або більше біохімічних маркерів у суб'єкта, попередження погіршення або прогресування одного або більше симптомів, забезпечення відновлення або поліпшення прогнозу, талабо попередження виникнення захворювання у суб'єкта, який не хворіє, а також сповільнення або зменшення прогресування існуючого захворювання. Для даного суб'єкта поліпшення симптому, його погіршення, регресія або прогресування можуть бути визначені за допомогою об'єктивного або суб'єктивного критерію.

Профілактичні способи (наприклад, попередження або зниження частоти виникнення рецидивів) також розглядаються як лікування.

У будь-якого суб'єкта може бути виконана оцінка того, чи має суб'єкт запальний стан ока або чи має ризик виникнення такого. Наприклад, забарвлення рогівки флуоресцеїном використовують для діагностування синдрому сухого ока. Результат оцінки може вказувати на відповідний курс терапії, такий як профілактична терапія, підтримувальна терапія або модулювальна терапія.

Відповідно, в даному документі передбачений спосіб лікування, попередження, модулювання або ослаблення запального стану ока за допомогою введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості терапевтичного засобу. Терапевтичний засіб являє собою сполуку формули | або її фармацевтично прийнятну сіль, естер, гідрат, сольват, поліморф, оптичний ізомер, рацемат, діастереоїзомер або енантіомер. У певних варіантах здійснення суб'єктом є ссавець, такий як людина або інший ссавець.

У певних варіантах здійснення введення здійснюють в око, як, наприклад, місцеве введення або інше введення в око (наприклад, локальна ін'єкція). У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб доставляють до поверхні ока. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб вводять місцево, наприклад, у рогівку, кон'юнктиву та/або повіку. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб вводять місцево в рогівку. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб застосовують щодо кон'юнктивального мішка або повіки. У певних варіантах здійснення місцеве введення передбачає застосування очних крапель, мазей або лосьйонів. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб застосовують під кон'юнктиву, у камеру, у склоподібне тіло, у субтеноновий простір, під сітківку, під судинну оболонку або на судинну оболонку. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб доставляють за допомогою локальної ін'єкції, такої як, наприклад, періокулярна, інтраокулярна, ін'єкція під кон'юнктиву, ретробульбарна або ін'єкція в камеру. Хоча системне введення не є переважним, у певних варіантах здійснення введення може бути системним.

У певних варіантах здійснення введення досягають шляхом вставлення пристрою для сповільненого вивільнення, такого як міні- або мікронасос, який вивільнює терапевтичний засіб.

Пристрій для сповільненого вивільнення може бути біологічно розкладним або біологічно нерозкладним.

Терапевтичний засіб може бути доставлений у фармацевтично прийнятному офтальмологічному середовищі-носії, у результаті чого контакт терапевтичного засобу з поверхнею ока підтримується протягом періоду часу, достатнього для забезпечення проникнення терапевтичного засобу в рогівку та внутрішні відділи ока. Фармацевтично прийнятним офтальмологічним середовищем-носієм може бути, наприклад, мазь, рослинна олія або матеріал для інкапсулювання.

У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб діє локально з перериванням імунного циклу, що включає міграцію клітин, що представляють антиген, з поверхні ока в дренувальний лімфатичний вузол. У певних конкретних варіантах здійснення терапевтичний засіб діє локально із забезпеченням перешкоджання міграції клітин, що представляють антиген, у дренувальний лімфатичний вузол. У певних варіантах здійснення дренувальний лімфатичний вузол являє собою шийний лімфатичний вузол.

У певних варіантах здійснення запальний стан ока являє собою синдром сухого ока, неінфекційний увеїт (у тому числі передній, серединний, задній і генералізований увеїт), неінфекційний кон'юнктивіт, ірит або склерит.

У певних варіантах здійснення, в яких запальний стан ока являє собою синдром сухого ока, синдром сухого ока спричинений алергіями, діабетом, функціональною недостатністю слізних залоз, системним червоним вовчаком, реакцією "трансплантат проти хазяїна", хворобою

Паркінсона, синдромом Шегрена, ревматоїдним артритом, ускладненнями, що виникли після терапії за методикою ГАБІК для корекції зору, використанням контактних лінз, дією посушливого клімату, забрудненням повітря або палінням сигарет, пошкодженням рогівки, кон'юнктивальним фіброзом, синдромом Стівенса-Джонсона, вродженою алакримією, очним рубцевим пемфігоїдом, саркаїдозом або лікуванням іншими лікарськими засобами, які спричиняють симптоми синдрому сухого ока, або асоційований із ними. У певних варіантах здійснення запальний стан ока являє собою синдром сухого ока, асоційований із синдромом

Шегрена. Таким чином, в одному варіанті здійснення способи передбачають уведення терапевтичного засобу людині, в якої наявні алергії, діабет, функціональна недостатність слізних залоз, системний червоний вовчак, реакція "трансплантат проти хазяїна", хвороба

Паркінсона, синдром Шегрена, ревматоїдний артрит, ускладнення, що виникли після терапії за 60 методикою ІГАЗІК для корекції зору, людині, яка використовує контактні лінзи, піддається дії посушливого клімату, забрудненню повітря або палить сигарети, людині, у якої наявне пошкодження рогівки, кон'юнктивальний фіброз, синдром Стівенса-Джонсона, вроджена алакримія, очний рубцевий пемфігоїд, саркаїдоз, або людині, яка одержує лікування іншими лікарськими засобами, що спричиняють симптоми синдрому сухого ока.

Загалом дозування терапевтичного засобу буде варіюватися залежно від таких факторів, як вік, вага, зріст, стать, загальний стан здоров'я та попередній анамнез суб'єкта. Як правило, доцільно забезпечувати реципієнту окрему дозу терапевтичного засобу, яка знаходиться в діапазоні від приблизно 0,001 мг до приблизно 3000 мг, більш конкретно від приблизно 0,01 мг до приблизно 300 мг, більш конкретно від приблизно 0,1 мг до приблизно 30 мг, більш конкретно від приблизно 0,5 мг до приблизно 10, більш конкретно від приблизно 1 мг до приблизно 5 мг, у кожне уражене око. У певних варіантах здійснення окрема доза терапевтичного засобу становить приблизно 0,6, приблизно 0,8, приблизно 1,0, приблизно 1,2, приблизно 1,4, приблизно 1,6, приблизно 1,8, приблизно 2,0, приблизно 2,2, приблизно 2,4, приблизно 2,6, приблизно 2,8, приблизно 3,0, приблизно 3,2, приблизно 3,4, приблизно 3,6, приблизно 3,8 або приблизно 4,0 мг у кожне уражене око. У певних варіантах здійснення окрема доза терапевтичного засобу становить приблизно 1,8 мг у кожне уражене око. У певних варіантах здійснення окрема доза терапевтичного засобу становить приблизно 3,0 мг у кожне уражене око. Слід відзначити, що значення дозування можуть варіюватися залежно від типу та ступеня важкості стану, що має бути полегшений. Додатково слід враховувати, що для будь-якого конкретного суб'єкта відповідні режими дозування слід коригувати з плином часу згідно з індивідуальною потребою та професійною думкою фахівця, який здійснює введення або контролює введення композицій, і що діапазони дозувань, викладені в даному документі, є лише ілюстративними та не призначені обмежувати обсяг або практичне застосування заявленої композиції.

Для лікування, у тому числі профілактичного, терапевтичний засіб вводять суб'єкту в терапевтично ефективній кількості у фармацевтично прийнятному носії. "Терапевтично ефективна кількість" являє собою кількість, яка є фізіологічно значущою. Терапевтичний засіб є фізіологічно значущим, якщо його наявність приводить до виявлюваної зміни у фізіології суб'єкта-реципієнта.

Зо У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить від приблизно 1 мг/мл до приблизно 100 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить від приблизно 10 мг/мл до приблизно 100 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить від приблизно 10 мг/мл до приблизно 50 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 10 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 15 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 20 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 25 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 30 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 35 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 40 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 45 мг/мл терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція містить приблизно 50 мг/мл терапевтичного засобу.

У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі від приблизно 10 мкл до приблизно 100 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі від приблизно 20 мкл до приблизно 80 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 20 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 30 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 40 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 50 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 60 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 70 мкл. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять в об'ємі приблизно 80 мкл.

У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше один раз на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше двічі на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше тричі на добу. У певних бо варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше чотири рази на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше п'ять разів на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше шість разів на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше сім разів на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше вісім разів на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше дев'ять разів на добу. У певних варіантах здійснення фармацевтичну композицію вводять у кожне уражене око щонайменше десять разів на добу.

У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в тканині, що становить щонайменше приблизно 240 нг/мл, протягом щонайменше однієї щонайменше двох, щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти або щонайменше шести годин після введення. У певних варіантах здійснення тканина являє собою кон'юнктиву. У певних варіантах здійснення тканина являє собою рогівку. Таким чином, у певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в кон'юнктивальній або рогівковій тканині, що становить щонайменше приблизно 240 нг/мл, протягом щонайменше однієї, щонайменше двох, щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти або щонайменше шести годин після введення. У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в кон'юнктивальній або рогівковій тканині, що становить щонайменше приблизно 240 нг/мл, протягом щонайменше шести годин після введення.

У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в тканині, що становить щонайменше приблизно 358 нг/мл, протягом щонайменше однієї щонайменше двох, щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти або щонайменше шести годин після введення. У певних варіантах здійснення тканина являє собою кон'юнктиву. У певних варіантах здійснення тканина являє собою рогівку. Таким чином, у певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в кон'юнктивальній або рогівковій тканині, що становить щонайменше приблизно 358 нг/мл, протягом щонайменше однієї, щонайменше двох,

Зо щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти або щонайменше шести годин після введення. У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в кон'юнктивальній або рогівковій тканині, що становить щонайменше приблизно 358 нг/мл, протягом щонайменше шести годин після введення.

У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в тканині, що становить щонайменше приблизно 1000 нг/мл, протягом щонайменше однієї щонайменше двох, щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти або щонайменше шести годин після введення. У певних варіантах здійснення тканина являє собою кон'юнктиву. У певних варіантах здійснення тканина являє собою рогівку. Таким чином, у певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в кон'юнктивальній або рогівковій тканині, що становить щонайменше приблизно 1000 нг/мл, протягом щонайменше однієї, щонайменше двох, щонайменше трьох, щонайменше чотирьох, щонайменше п'яти або щонайменше шести годин після введення. У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення концентрації в кон'юнктивальній або рогівковій тканині, що становить щонайменше приблизно 1000 нг/мл, протягом щонайменше трьох годин після введення.

У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість, що вводиться в око, забезпечує біологічну незначну системну дію терапевтичного засобу. У певних варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість, що вводиться в око, не приводить до системної імуносупресії.

Розкриті терапевтичні засоби та/або фармацевтичні композиції, що містять такі терапевтичні засоби, можна вводити протягом будь-якого придатного періоду, такого як щонайменше приблизно 12 тижнів, щонайменше приблизно 24 тижні, щонайменше приблизно 36 тижнів або щонайменше приблизно 48 тижнів. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб вводять протягом щонайменше 12 послідовних тижнів. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб вводять протягом щонайменше 24 послідовних тижнів. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб вводять протягом щонайменше 36 послідовних тижнів. У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб вводять протягом щонайменше 48 послідовних тижнів.

У певних варіантах здійснення лікування передбачає щодобове введення терапевтичного бо засобу протягом щонайменше двох послідовних тижнів. За такого режиму лікування терапевтичний засіб можна вводити більш ніж один раз на добу, наприклад, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять або дванадцять разів на добу. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує два тижні. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує три тижні. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує чотири тижні. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує п'ять тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує шість тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує сім тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує вісім тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує дев'ять тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує десять тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує одинадцять тижнів. У певних варіантах здійснення тривалість режиму лікування перевищує дванадцять тижнів.

У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб (наприклад, терапевтичний засіб А) вводять разом з одним або більше додатковими терапевтичними засобами в одній або в окремих фармацевтичних композиціях. Такі додаткові терапевтичні засоби можуть включати інші терапевтичні засоби, застосовувані для лікування запальних станів ока.

У певних варіантах здійснення додатковим терапевтичним засобом є циклоспорин А.

Циклоспорин А являє собою циклічний пептид з одинадцяти амінокислот, синтезований мікроскопічним грибом Тоїуросіадіит іпЯаїшт. Циклоспорин А характеризується формулою (К- (ГАМА Е)Ї-циклічний(--аланіл-О-аланіл-М-метил-Ї -лейцил-М-метил-Ї -лейцил-М-метил-їі -валіл-

З-гідрокси-М, 4-диметил-і -2-аміно-6-октеноїл-Ї -а-амінобутирил-М-метилгліцил-М-метилі-ї - лейцил-ї! -валіл-М-метил-і -лейцил) (номер за СА5 59865-13-3).

У певних варіантах здійснення додатковим терапевтичним засобом є стероїд. У деяких таких варіантах здійснення стероїд являє собою глюкокортикоїд. У деяких таких варіантах здійснення стероїд являє собою дифлупреднат, преднізолон, дексаметазон, флуоцинолон, флуорометолон, лотепреднол, медризон, римексолон, триамцинолон, кортизон або гідрокортизон. У певних варіантах здійснення стероїд являє собою дексаметазон (такий як дексаметазон у вигляді основи або дексаметазону фосфат), дифлупреднат, флуоцинолон, флуорометолон (такий як флуорометолон у вигляді основи або флуорометолону ацетат),

Зо лотепреднол, преднізолон (такий як преднізолону ацетат або преднізолону фосфат), римексолон або триамцинолон (такий як триамцинолону ацетонід).

У певних варіантах здійснення додатковим терапевтичним засобом є нестероїдний протизапальний засіб. У деяких таких варіантах здійснення нестероїдний протизапальний засіб вибраний із групи, що складається з бромфенаку, диклофенаку, флурбіпрофену, кеторолаку та непафенаку.

У певних варіантах здійснення додатковим терапевтичним засобом є антагоніст І ГА, такий як ліфітеграст. Ліфітеграст також відомий як (25)-2-(2-(1-бензофуран-6-карбоніл)-5,7-дихлор- 3,4-дигідро-1Н-ізохінолін-б-карбоніл|іаміно|-3-(З-метилсульфонілфеніл)пропанова кислота, і він визначений у УМО2006/125119, повний уміст якої включений у даний документ за допомогою посилання.

У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб можна застосовувати у ветеринарії, зокрема під час лікування запальних станів ока, таких як, наприклад, сухий кератокон'юнктивіт у собак, кішок і коней; хронічний поверхневий кератит (СК) у собак, кішок і коней і лімфоплазмоцитарна інфільтрація мигальної перетинки у собак, кішок і коней.

І. Сполуки

Сполуку формули І можна синтезувати за допомогою синтезу, описаного в патенті США Мо 6867192, приклад 27. Повний уміст патенту США Мо 6867192 таким чином включено за допомогою посилання.

Коротко кажучи, в одному варіанті здійснення 1-(З-диметиламінопропіл)-3З-етилкарбодіїміду гідрохлорид (0,4 г) і 1-гідроксибензотриазол (0,3 г) додають у розчин (2-метилфенокси)оцтової кислоти (0,345 г) в ацетонітрилі (50 мл) в атмосфері азоту. Після перемішування протягом 30 хвилин при 20 "С додають 4-(25)-2-4(25)-2-аміно-4-метилпентаноїл|аміно)-3-(трет-бутокси)-3- оксопропілІфеніл-4-(амінокарбоніл)-1-піперидинкарбоксилату гідрохлорид (Її г) а потім дііззопропілетиламін (0,35 мл) і перемішування продовжують протягом 18 год. Суміш концентрують у вакуумі та залишок розділяють між 1 М хлористоводневою кислотою (100 мл) та етилацетатом (300 мл). Шари розділяють та органічну фазу промивають 1 М хлористоводневою кислотою (2х100 мл), насиченим водним розчином гідрокарбонату натрію (3х100 мл) і сольовим розчином (100 мл), висушують над сульфатом магнію та випарюють у вакуумі з одержанням білої твердої речовини. У розчин даної речовини в хлороформі (5 мл) додають трифтороцтову бо кислоту (5 мл) і воду (1 мл). Після перемішування протягом З год. при 20 "С розчинник випарюють у вакуумі та залишок піддають азеотропній перегонці з толуолом (2х20 мл), потім розтирають З етером З одержанням (25)-3-І4-(Ц4-(амінокарбоніл)-1- піперидинілІікарбоніліокси)фенілі|-2-((25)-4-метил-2-Ц2-(2- метилфенокси)ацетиліаміно)пентаноїл)аміно|пропанової кислоти.

Альтернативно в іншому варіанті здійснення розчин (25)-3-І(4-(алілокси)феніл|-2-Ктрет- бутоксикарбоніл)ламіно|Іпропанової кислоти (115,8 г) та 1-гідроксибензотриазолу (48,6 г) у ОМЕ (475 мл) додають до смоли Ванга (50 г). Через 15 хвилин додають 1,3-діізопропілкарбодіїмід (56,5 мл) і суміш перемішують протягом 24 год. при 45 "С. Смолу фільтрують і промивають ОМЕ (3х360 мл), метанолом (3х360 мл) і дихлорметаном (3х700 мл). У завись смоли у дихлорметані (644 мл) додають піридин (14,7 мл). Додають оцтовий ангідрид (26,9 мл) і суміш перемішують протягом 12 год. при 20 "С. Смолу фільтрують і промивають дихлорметаном (3х550 мл), метанолом (3х370 мл) і дихлорметаном (3х550 мл).

Завись 20 г смоли у дихлорметані (100 мл) охолоджують до 2-5 "С та оброблюють розчином фенолу (20 г) у дихлорметані (80 мл). По краплях додають хлортриметилсилан (20 мл) і суміш перемішують протягом б год. при 2-5"С. Смолу фільтрують і промивають дихлорметаном (3х200 мл), метанолом (3х200 мл), ОМЕ із 1095 умістом води (2х200 мл), 1095 діззопропілетиламіном у ОМЕ (3х200 мл), ОМЕ (200 мл), метанолом (3х200 мл) і дихлорметаном (3х200 мл).

Завись смоли в ОМЕ (55 мл) оброблюють розчином Етос-лейцину (32,7 г) та 1- гідроксибензотриазолу (12,5 г) у ОМЕ (85 мл). Через 5 хвилин додають 1,3- діізопропілкарбодіїмід (19,3 мл) і суміш перемішують протягом 15 год. при 20 7С. Смолу фільтрують і промивають ОМЕ (3х150 мл), метанолом (3х150 мл) і дихлорметаном (3х150 мл).

Смолу оброблюють 20 95 піперидином у ОМЕ (180 мл) і перемішують протягом 1 год. при 20"С. Смолу фільтрують і промивають ОМЕ (3х150 мл), дихлорметаном (3х150 мл), ОМЕ (3х150 мл) і дихлорметаном (3х150 мл). У завись її в ОМЕ (50 мл) додають розчин (2- метилфенокси)оцтової кислоти (17,9 г) і 1-гідроксибензотриазолу (14,6 г) у ОМЕ (100 мл). Через 5 хвилин додають 1,3-діізопропілкарбодіїмід (16,9 мл) і суміш перемішують протягом 65 год. при 20"С. Смолу фільтрують і промивають ОМЕ (2х150 мл), метанолом (3х150 мл) ишїі дихлорметаном (З3х150 мл).

Зо Завись смоли в дихлорметані (60 мл) оброблюють розчином тетракіс(трифенілфосфін)паладію(0) (5,21 г) у дихлорметані (140 мл), а потім морфоліном (13 мл). Суміш перемішують протягом 2 год. при 20 "С, потім смолу фільтрують і промивають дихлорметаном (7 х200 мл).

Завись смоли в дихлорметані (160 мл) оброблюють діїзопропілетиламіном (12,4 мл), а потім 4-нітрофенілхлорформіатом (24,8 г) З порціями з 5-хвилинними інтервалами. Суміш перемішують протягом 1 год. при 20 "С. Смолу фільтрують і промивають дихлорметаном (3х200 мл). Смолу оброблюють розчином ізоніпекотаміду (15,8 г) у ОМЕ (180 мл) і суміш перемішують протягом 1,5 год. при 20 "С. Смолу фільтрують і промивають ОМЕ (4х200 мл) і дихлорметаном (2х200 мл).

Смолу оброблюють 50 95 ТЕА у дихлорметані (200 мл). Після перемішування протягом 1 год. при 20 "С смолу фільтрують і промивають дихлорметаном (5х200 мл). Об'єднаний фільтрат і змивання випарюють у вакуумі. Залишок піддають азеотропній перегонці з толуолом (2х100 мл), потім розтирають з етером (50 мл) та одержану в результаті білу тверду речовину фільтрують. До неї додають ацетонітрил (150 мл) і суміш нагрівають зі зворотним холодильником до появи конденсату. Забезпечують охолодження одержаної в результаті суспензії до 20 "С і перемішують протягом 18 год. Суміш фільтрують з одержанням (25)-3-|4- ((4-«амінокарбоніл)-1-піперидинілікарбоніл)оксо)феніл|-2-((25)-4-метил-2-Ц2-(2- метилфенокси)ацетиліаміно)пентаноїл)аміно|пропанової кислоти.

У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб (наприклад, терапевтичний засіб А) являє собою фармацевтично прийнятну сіль сполуки (ІМ. Фраза "фармацевтично прийнятний" використовується в даному документі для позначення таких сполук, матеріалів, композицій та/або лікарських форм, які з медичного погляду є придатними для застосування в контакті з тканинами людей і тварин без надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції або іншої проблеми або ускладнення, зіставними з доцільним співвідношенням користь/ризик.

У певних варіантах здійснення терапевтичний засіб (наприклад, терапевтичний засіб А) являє собою калієву сіль сполуки (1).

У певних варіантах здійснення сполуку формули (І) вводять у формі кон'югату, комплексу або проліків. У певних варіантах здійснення сполуку формули (І) вводять у формі проліків. Такі проліки можуть метаболізуватися в організмі суб'єкта з одержанням сполуки формули (1). бо ЇМ. Фармацевтичні композиції

Використовувана в даному документі фраза "Фармацевтично прийнятний носій" означає фармацевтично прийнятні матеріал, композицію або середовище-носій, таке як рідкий або твердий наповнювач, розріджувач, допоміжна речовина, розчинник або матеріал для інкапсулювання, що беруть участь у переміщенні або транспортуванні засобів, що розглядаються, з одного органа або частини організму в інший орган або частину організму.

Кожен носій має бути "прийнятним" у сенсі сумісності з іншими інгредієнтами складу, наприклад, носій не зменшує вплив засобу на лікування. Інакше кажучи, носій є фармацевтично інертним.

Композиція може бути складена згідно з відомими способами одержання фармацевтично прийнятних композицій, за яких сполуку змішують із фармацевтично прийнятним носієм.

Стерильний фосфатно-сольовий буферний розчин є одним прикладом фармацевтично прийнятного носія. Інші придатні носії добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Див., наприклад, КЕМІМОТОМ'Є РНАЕМАСЕШТІСАГ ЗСІЕМСЕЗ5, 191П Ед. (1995).

Фармацевтичні композиції, пристосовані для місцевого введення, можуть бути складені у формі мазей, кремів, емульсій, суспензій, лосьйонів, порошків, розчинів, паст, гелів, спреїв, розпилюваних засобів, аерозолів або масел. У певних варіантах здійснення фармацевтична композиція являє собою розчин, такий як офтальмологічний розчин. У таких варіантах здійснення офтальмологічний розчин вводять людям або відмінним від людини ссавцям місцевим шляхом у формі однієї або більше крапель на добу в кожне око.

Для лікування ока композиції можна застосовувати у формі мазі або крему для місцевого застосування. Під час складання у формі мазі активний інгредієнт можна використовувати з парафіновою основою або мазевою основою, що змішується з водою. Альтернативно активний інгредієнт може бути складений у формі крему з кремовою основою типу "масло у воді" або "вода у маслі".

Фармацевтичні композиції, пристосовані для місцевого введення в око, включають очні краплі, при цьому активний інгредієнт розчиняється або суспендується в придатному носії, зокрема у водному розчиннику. Склади, що підлягають уведенню в око, будуть мати офтальмологічно сумісний рН та осмоляльність. Один або більше офтальмологічно прийнятних засобів та/лабо буферних речовин, що регулюють рН, можуть бути включені в композицію за даним винаходом, у тому числі кислоти, такі як оцтова, борна, лимонна, молочна, фосфорна та хлористоводнева кислоти; основи, такі як гідроксид натрію, фосфат натрію, борат натрію, цитрат натрію, ацетат натрію та лактат натрію; і буфери, такі як цитрат/декстроза, бікарбонат натрію та хлорид амонію. Такі кислоти, основи та буфери можуть бути включені в кількості, необхідній для підтримки рН композиції в офтальмологічно прийнятному діапазоні. Одна або більше офтальмологічно прийнятних солей можуть бути включені в композицію в кількості, достатній для приведення осмоляльності композиції в офтальмологічно прийнятний діапазон.

Такі солі включають солі з катіонами натрію, калію або амонію та хлорид-, цитрат-, аскорбат-, борат-, фосфат-, бікарбонат-, сульфат-, тіосульфат- або бісульфат-аніонами.

Композиції за даним винаходом можна застосовувати місцево щодо ока, під кон'юнктиву, у камеру, у склоподібне тіло, у субтеноновий простір, під сітківку, під судинну оболонку, на судинну оболонку, у кон'Юнктивальний мішок або на повіку із застосуванням пристрою або вставки для доставки в око. Такі пристрій або вставка можуть бути сконструйовані з можливістю контрольованого вивільнення одного або більше терапевтичних засобів із декількома визначеними швидкостями, а також із кінетикою сповільненого вивільнення дози та проникністю. Контрольоване вивільнення може бути досягнуто шляхом конструювання полімерних матриць, що включають біологічно розкладні/біологічно руйновані полімери різних варіантів і властивостей (наприклад, полі(етиленвініл)їуацетат (ЕМА), надгідролізований РМА), гідроксиалкілцелюлозу (НРС), метилцелюлозу (МС), гідроксипропілметилцелюлозу (НРМО), полікапролактон, полі(гліколеву)кислоту, полі(молочну)кислоту, поліангідрид, що стосується молекулярної маси полімерів, ступеня кристалічності полімерів, відношень співполімерів, умов

БО обробки, обробки поверхні, геометрії, додавання допоміжних речовин і нанесень полімерних покриттів, які будуть посилювати дифузію лікарських засобів, руйнування, розчинення й осмос.

Склади для доставлення лікарського засобу із застосуванням офтальмологічних пристроїв або вставок можуть об'єднувати один або більше активних засобів і допоміжних засобів, що відповідають указаному шляху введення. Наприклад, активні засоби можуть бути змішані з будь-якою фармацевтично прийнятною допоміжною речовиною, лактозою, сахарозою, порошкоподібним крохмалем, естерами целюлози й алканових кислот, стеариновою кислотою, тальком, стеаратом магнію, оксидом магнію, натрієвими та кальцієвими солями фосфорної та сірчаної кислот, акацієвою камеддю, желатином, альгінатом натрію, полівінілпіролідином та/або полівініловим спиртом, таблетовані або інкапсульовані для традиційного введення. бо Альтернативно сполуки можуть бути розчинені в поліетиленгліколі, пропіленгліколі, колоїдних розчинах карбоксиметилцелюлози, етанолі, кукурудзяній олії, арахісовій олії, бавовниковій олії, кунжутній олії, трагакантовій камеді та/або різних буферах. Сполуки також можуть бути змішані з композиціями як біологічно розкладних, так і біологічно нерозкладних полімерів, а також із носієм або розріджувачем, які характеризуються властивістю вповільнення. Типові приклади біологічно розкладних композицій можуть включати альбумін, желатин, крохмаль, целюлозу, декстрани, полісахариди, полі(О, І -лактид), співполімери 0, І -лактиду та гліколіду, полігліколід, полігідроксибутират, поліалкілкарбонат та полі(ортоестери) та їх суміші. Типові приклади біологічно нерозкладних полімерів можуть включати співполімери ЕМА, силіконовий каучук і поліметилакрилат та їх суміші.

Фармацевтичні композиції для доставлення в око також включають водну композицію, здатну утворювати гель іп 5йи. Така композиція містить гелеутворювальний засіб у концентрації, ефективній для забезпечення утворення гелю під час контакту з оком або із слізною рідиною.

Придатні гелеутворювальні засоби включають без обмеження полімери, що тверднуть під дією температури. Під використовуваним у даному документі терміном "здатний утворювати гель іп 5" передбачають не тільки рідини з низькою в'язкістю, які утворюють гелі під час контакту з оком або зі слізною рідиною, але також передбачаються більш в'язкі рідини, такі як напіврідкі та тиксотропні гелі, що характеризуються значно підвищеною в'язкістю або міцністю гелю під час уведення в око. Див., наприклад, І пам/ід (2005), включений у даний документ за допомогою посилання, для розгляду його прикладів полімерів для застосування в очному доставленні лікарських засобів.

М. Набори

Також у даному документі передбачені набори, наприклад, набори для терапевтичних цілей.

Набір може містити одну або більше сполук, описаних у даному документі, наприклад, у попередньо встановлених дозах. Набір необов'язково може містити пристрої для приведення в контакт клітин зі сполуками та інструкції для застосування.

Пристрої включають шприци, імплантовані насоси, такі як міні- та мікронасоси, та інші пристрої для офтальмологічного застосування.

Також у даному документі передбачені терапевтичні комбінації, що містять терапевтичний засіб А та інший терапевтичний засіб (ті самі, що використовуються в комбінованих

Зо терапевтичних засобах і комбінованих композиціях) в окремих лікарських формах, але пов'язаних одна з одною. Використовуваний у даному документі термін "пов'язані одна з одною" означає, що окремі лікарські форми упаковані разом або інакше з'єднані одна з одною так, що легко зрозуміти, що окремі лікарські форми призначені для реалізації та введення як частини одного режиму. Сполуку та інший засіб переважно упаковують разом у блістерній упаковці або в іншій багатокамерній упаковці або у вигляді об'єднаних окремо запечатаних контейнерів (таких як саше з фольги тощо), які споживач зможе розділити (наприклад, шляхом розривання по лінії розлому між двома контейнерами).

У ще одному варіанті здійснення даного винаходу передбачений набір, що містить в окремих ємностях: а) сполуку за даним винаходом та б) інший терапевтичний засіб, такий як описаний в інших розділах даного опису.

ПРИКЛАДИ

Матеріали

ІЗНІСУУ559090 спеціально синтезували в Атегепат з умістом п'яти ЗН атомів на молекулу, що давало питому активність 76 Сі/ммоль.

Усі дослідження на тваринах проводили з використанням мишей С57ВІ /6 віком 6-8 тижнів, яких купували в Уаскзоп І арх (Бар Харбор, Мен).

Зв'язування та клітинна адгезія

Клітини ЧУигкаї 9Уб (лінія лімфобластних клітин людини) вирощували у вигляді суспензійної культури в КЕРМІ 1640, доповненому ЕСЗ5 (10 95) і глутаміном (2 мМ). Клітини КРМІ8866 (лінія В- лімфоїдних клітин людини) вирощували у вигляді суспензійної культури в КРМІ 1640, доповненому ЕС (10 95) і глутаміном (2 мМ). Клітини КВІ-2НЗ3 (лінія клітин базофільної лейкемії щура) культивували в МЕМ Ігла із солями Ерла, доповненому 2 мМ Г-глутаміну, 1 мМ пірувату натрію, їх амінокислотами, що не належать до незамінних, 1 мМ пірувату Ма, 10 96 інактивованою нагріванням ембріональною телячою сироваткою.

Аналіз насичення б (аналіз із фільтрацією). Зв'язування сполуки формули характеризували в клітинах людини Уб, що експресують МІ А-4. Клітини б збирали шляхом центрифугування протягом 5 хвилин при 5009 і повторно суспендували в буфері для аналізу (50

ММ НЕРЕФЗ, рН 7,5, 100 мМ Масі, 2 мМ глюкози, 1 мМ Мпсігг). У кожній лунці містилися 1х105 клітин та або 10 мкМ холодного (зУУ559090 для визначення М5В (неспецифічного зв'язування), 60 або буфер. ІЗНІСУУ559090 (0,02-50 нМ) додавали до кінцевого об'єму 500 мкл та інкубували протягом 2 год. при 37 "С. Зв'язаний ІЗНІСУУ559090 відокремлювали від вільного шляхом швидкого вакуумного фільтрування через попередньо змочені фільтри УМпайтап СБ/В із наступними трьома промиваннями льодяним буфером, потім на фільтрувальні диски додавали сцинтилятор і вимірювали число розпадів на хвилину на сцинтиляційному лічильнику ВесКтап.

Фактичну кількість ІЗНІСУУ559090, доданого для кожної концентрації кривої насичення, вимірювали шляхом підрахунку числа розпадів з аліквоти об'ємом 50 мкл діапазону розбавлення мітки.

Аналіз зв'язування методом насичення в клітинах КВІ -2НЗ (аналіз БРА). Буфер для аналізу містив 50 мМ НЕРЕЗ5, 100 мМ масі, 1 мМ Масі», рН 7,5 (з Маон). Гранули М/ЗА для 5РА використовували з розрахунку 1 мг/лунка. Клітини збирали та повторно суспендували в буфері для аналізу та 1 мільйон клітин на лунку додавали в планшет із білим дном. Додавали холодний

СУУ559090 з одержанням кінцевої аналізованої концентрації 20 мкМ (для визначення неспецифічного зв'язування) або буфер окремо, а потім додавали ІЗНІСМ/559090 за діапазоном концентрацій у планшеті (номінальний діапазон концентрацій (ЗНІСУУ559090 становив 0,01-200

НМ). Кінцевий аналізований об'єм становив 250 мкл. Потім планшет інкубували при 37 "С протягом 2 год. Число розпадів підраховували за сцинтиляцією (від гранул М/ЗА для 5РА) у пристрої для зчитування планшетів УмаПас Місгобеїа.

Фактичну кількість (ЗНІСМУ559090, доданого для кожної концентрації кривої насичення, вимірювали шляхом підрахунку числа розпадів за хвилину з аліквоти об'ємом 50 мкл діапазону розбавлення мітки.

Аналіз клітинної адгезії з МСАМ. Полістирольні 9б-лункові мікротитраційні планшети покривали Ідс за концентрації 0,05 мг/мл у бікарбонатному буфері протягом 2 годин при 37 "С.

Розчин видаляли аспірацією та планшети промивали двічі за допомогою РВ5. Потім планшети інкубували протягом ночі при 4 "С із МСАМ-1 із розбавленням 1:4000 у З 95 ВЗА у РВ5. Перед застосуванням МСАМ-1 видаляли аспірацією та планшети промивали двічі за допомогою РВ5.

Клітини Уб або ЕРМІ (згідно з вимогою) мітили флуоресцентним барвником ВСЕСЕ-АМ (10

МКМ і бх105 клітин/мл)у протягом 10 хв. при 37 "С перед видаленням надлишку шляхом центрифугування при 5009 протягом 5 хв., і клітини повторно суспендували за концентрації клітин 1,2х107 клітин/мл у НВ55. Рівні об'єми НВ55, що містить сполуку формули І (у діапазоні

Зо концентрацій 38,1 пМ-10 мкМ) і клітини, додавали в покриті МСАМ-1 планшети. Після 30 хвилин інкубації при 37 "С неадгезовані або слабко адгезовані клітини видаляли шляхом перевертання планшета й просочування тонким папером. Після двох промивань за допомогою РВЗ5 і просочування додавали Тгтйоп Х-100 (2 95 об./06.). Планшети зчитували на Умайас Мікіог. Для сполук, які пригнічували адгезію, одержували більш низький показник зчитування флуоресценції.

Аналіз клітинної адгезії з МАаСАМ. Полістирольні 96-лункові мікротитраційні планшети покривали дО за концентрації 0,05 мг/мл у бікарбонатному буфері протягом 2,5 годин при 37 "С. Розчин видаляли аспірацією та планшети промивали двічі за допомогою РВ5. Потім планшети інкубували протягом ночі при 4 "С із МАаСАМ за концентрації 204,0 нг/мл у З 95 ВЗА в

РВ5. Перед застосуванням МАЯСАМ видаляли аспірацією та планшети промивали двічі за допомогою РВ5. Клітини Уб або ЕРМІ (згідно з вимогою) мітили флуоресцентним барвником

ВСЕСРБЕ-АМ (10 мкМ і 6х105 клітин/мл) протягом 10 хв. при 37 "С перед видаленням надлишку шляхом центрифугування при 5009 протягом 5 хв., і клітини повторно суспендували за концентрації клітин 1,2х107 клітин/мл у НВ5З5. Рівні об'єми НВЗ5, що містить сполуку формули І (у діапазоні концентрацій 38,1 пМ-10 мкМ) і клітини, додавали в покриті МАаСАМ планшети.

Адгезія відбувалася протягом З30-хвилинної інкубації при 37 "С. Неадгезовані або слабко адгезовані клітини видаляли шляхом перевертання планшета та просочування тонким папером.

Після двох промивань за допомогою РВЗ і просочування додавали Топ Х-100 (2 95 об./об.).

Планшети зчитували на М/аПйас Мікіог.

Аналіз клітинної адгезії з С5-1. Полістирольні 96б-лункові мікротитраційні планшети покривали С5-1 (з'єднувальний сегмент 1, домен прикріплення до клітини фібронектину) за концентрації 0,01 мг/мл у бікарбонатному буфері протягом ночі при 4 "С. Розчин видаляли аспірацією та планшети промивали двічі за допомогою РВ5. Потім планшети інкубували за кімнатної температури в присутності З 95 ВЗА протягом 60 хв., простукували кінчиками пальців, щоб витіснити В5А, та промивали двічі в бікарбонатному буфері. Клітини Уб або ЕРМІ (згідно з вимогою) мітили флуоресцентним барвником ВСЕСЕ-АМ (10 мкМ і бх105 клітин/мл) протягом 10 хв. при 37 "С перед видаленням надлишку шляхом центрифугування при 5009 протягом 5 хвВ., і клітини повторно суспендували за концентрації клітин 1,2х107 клітин/мл у НВ55. Рівні об'єми

НВЗ5, що містить сполуку формули І (у діапазоні концентрацій 19,0 пМ-5 мкМ) ії клітини, бо додавали в покриті С5-1 планшети. Адгезія відбувалася протягом 30-хвилинної інкубації при

37 "С. Неадгезовані або слабко адгезовані клітини видаляли шляхом перевертання планшета та просочування тонким папером. Після двох промивань за допомогою РВ5З і просочування додавали Топ Х-100 (2 95 об./06.). Планшети зчитували на УмаМас Міког.

Індукування стресу зневоднення, режим обробки

Самок мишей С57ВІ/6 віком 6-8 тижнів піддавали О5 протягом 5 днів (055), як описано раніше (де Раїма еї аї., 2006Б; Мієдетгкогп еї аїЇ., 2006). Місцеву білатеральну обробку за допомогою 1 краплі очних крапель із розрахунку на одне око (об'єм 2 мкл) або підшкірну ін'єкцію (об'єм 4 мкл) 2 рази на добу починали в день 1 одночасно з Ю5 і продовжували до дня 4.

Обробку сполукою формули І або 0,1 95 дексаметазону фосфатом порівнювали з відповідно обробленим контролями середовищем-носієм. Мишей рандомізували для одержання одного з тестованих продуктів. Контрольних мишей тримали в умовах без стресу (М5), що підтримувалися за 50-75 95 відносної вологості, без дії потоку повітря або скополаміну та не оброблювали тестованим або контрольним продуктом. Ефекти обробки оцінювали за забарвленням рогівки за допомогою Огедоп Сгееп ЮОехігап (000); експресією маркерів запалення в тканинах поверхні ока за допомогою ПЛР у режимі реального часу; аналізом клітинної популяції в дренувальних шийних лімфатичних вузлах за допомогою аналізу ЕАС5; інфільтрацією кон'юнктиви Т-клітинами за допомогою імуногістохімії.

Забарвлення рогівки за допомогою ОБО

На ранок 5-го дня миші одержували одну 5.сє. дозу скополаміну. Через дві години забарвлення рогівки оцінювали з використанням Огедоп Сгееп Оехігап (050-488), який являє собою кон'югований флуоресцентний барвник із розміром молекули 70 кДа (Іпмігодеп-МоїІесшаг

Ргобе5), як описано раніше (де Раїма єї аїІ., 200606). Процедура полягала в інстиляції 0,5 мкл

ОО на рогівку з використанням скляної капілярної піпетки за 1 хвилину до евтаназії. Мишей піддавали евтаназії шляхом вдихання ізофлуранового газу з наступним зміщенням шийних хребців. Потім очні яблука прополіскували за допомогою 2 мл В55. Надлишок рідини обережно просочували з поверхні ока фільтрувальним папером, не торкаючись рогівки. Цифрові зображення обох очей одержували за довжини хвилі збудження 470 нм і довжини хвилі емісії 488 нм із застосуванням стереомікроскопа Мікоп 5М2-1500 із часом витримки 2 секунди.

Оцінювали обидва ока від кожної тварини; у всіх випадках спочатку праве око, а потім ліве око.

Зо Середню інтенсивність у центральній частині рогівки оцінювали за цифровими зображеннями з використанням МІЗ ЕІетепів (версії 3.0), поміщаючи фіксовану ділянку, що становить інтерес (кружок діаметром 2 мм), на центральну частину рогівки. Середню інтенсивність флуоресценції зчитували за допомогою програмного забезпечення та зберігали в базі даних (Ехсеї, Місго5оЮ.

Дане вимірювання флуоресценції в центральній кільцевій ділянці незалежно виконували 2 спостерігачі сліпого дослідження для кожного ока миші. Після закінчення експерименту результати від двох спостерігачів усереднювали з використанням усіх даних, зібраних протягом усіх тижнів дослідження (Ехсеї, Місго5ої). Результати представляли у вигляді геометричного середнього х 95 95 довірчий інтервал відносно рівнів сірого.

Виділення РНК та зворотна транскрипція

Виділяли загальну РНК з рогівкового та кон'юнктивального епітелію, який збирали та об'єднували від 2 очей (правого та лівого) у кожний момент часу від необроблених контрольних мишей, мишей, підданих ОЗ протягом 5 днів (055), мишей, підданих О55, оброблених місцево сполукою формули | (30 м/мл), і тварин, оброблених середовищем-носієм (п-7/група), із застосуванням набору для виділення РНК РісоРиге"м (Асіиги5 Віозсіепсе Іпс, Маунтін-В'ю,

Каліфорнія, США) згідно з протоколом виробника. Коротко кажучи, епітеліальні клітини рогівки зіскрібали та цільну кон'юнктиву розрізали, поміщали в 100 мкл екстракційного буфера та інкубували при 42 "С протягом 30 хвилин. Клітинний екстракт завантажували в попередньо кондиціоновану очищену колонку, яку центрифугували, оброблювали ДНКазою (Оіадеп,

Валенсія, Каліфорнія, США) та промивали двічі двома різними промивальними буферами. РНК елюювали в 12 мкл буфера з низькою іонною силою. Концентрацію РНК вимірювали шляхом поглинання при 260 нм із застосуванням спектрофотометра (МапоОгор 2000, Тпепто зЗсіепійіс,

Вілмінгтон, Делавер, США) та зразки зберігали при -80 "С до застосування. Першу нитку СОМА синтезували з 1 мкг загальної РНК за допомогою довільних гексамерів із використанням зворотної транскриптази М-Ми! М (ВАеаду-То-бо Моци-Ргіте Рігзі-5мнпапі Веаде; АтегзНат

Рпагтасіа Віоїтесп, Іпс., Піскатавей, Нью-Джерсі), як описано раніше (ае Раїма еї а!., 2006а).

Абсолютна кількісна оцінка за допомогою полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу

Аліквоту СОМА (1-4 мкл) зі зразків використовували для проведення ПЛР у режимі реального часу в загальному об'ємі 10 мкл, що містить наступне з розрахунку на одну реакцію: 0,3 мкл бо зондів Тадтап, специфічних щодо використовуваного гена, і 5 мкл 2Х мастер-мікс для швидкої

ПЛР Тадтап (Арріїеа Віозузіетв5). ПЛР у режимі реального часу виконували на системі ПЛР у режимі реального часу БіерОпеРіиз м (Арріїей Віозузіетв5), і параметри включали попередню денатурацію при 95 "С протягом 22 сек., потім 40 циклів денатурації при 95" протягом 1 секунди, відпал і подовження при 60 "С протягом 20 сек. Зразки та стандарти аналізували у двох повторностях. У всі експерименти включали контроль без матриці та загальну РНК без ретротранскрипції для оцінювання ПЛР і контамінації ДНК використовуваних реагентів.

Використовували наступні зонди Тадтап, специфічні щодо І/-ї5 (Міт00439620); ММР-9 (Мто0442991); СХОСІ 9 (Мто004434946); ТаБ-В1 (Мт00441724) і НРЕТ-1 (Міп00446968) миші.

Ген НРЕТ-1 використовували як внутрішній еталон для кожної реакції. Результати кількісної

ПЛР аналізували методом порівняння Ст, де цільова зміна - 2-ДА Ст. Результати нормалізували за значенням Ст НРАТ-1 контрольної групи без обробки (ае Раїма еї а!., 20066).

Дисекція дренувальних лімфатичних вузлів

Шийні дренувальні лімфатичні вузли (СІМ) вирізали хірургічним шляхом, поміщали в круглодонний планшет для культивування з «8 мл повного середовища КРМІ та роздавлювали між двома матовими скельцями.

Проточна цитометрія

Одержували суспензію окремих клітин СІМ від мишей С57ВІ /6, оброблених в умовах О5 протягом 1 дня, центрифугували, а потім фільтрували, як описано раніше (де Раїма еї аї., 2009а). Потім додавали 1,0 мл розчину АСТ протягом 30 секунд, а потім 2,0 мл повного КРМІ.

Клітини ще раз центрифугували та супернатант видаляли аспірацією. Потім клітини повторно суспендували в 2,0 мл повного КРМІ та підготовлювали для підрахунку. Використовували десять мкл трипанового синього для підрахунку та клітини розділяли по пробірках у кількості 1х106 клітин/мл. Потім клітини інкубували на льоду в 20 мкл некон'югованого антитіла до ср16/26032 миші (ВО РПпагтіпдеп, Сан-Дієго, Каліфорнія), а потім у 80 мкл безпосередньо кон'югованого первинного антитіла або ізотипу. Зрештою зразки промивали за допомогою 1 мл

РВ5БЛ 95 ЕВ5, центрифугували та повторно суспендували в 0,3 мл РВ5Б/1 95 ЕВ5, що містить 1:1000 РІ. Зразки зберігали при 4 "С до виконання аналізу на настільному проточному цитометрі

ВО І 5. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення ВО Оіма (ВО

Рпагтіпдеп) та Ріоулудо (Ттеесіаг Іпс).

Зо Інфільтрація кон'юнктиви Т-клітинами

Для імуногістохімічного аналізу вирізали очні яблука та прилеглі структури у 5 мишей/група (п-5), поміщали в матричне середовище для кріотомії (реактив ОСТ; УЛМУК, Савані, Джорджія) та піддавали миттєвому заморожуванню в рідкому азоті. Нарізали сагітальні зрізи товщиною 8 мкм за допомогою кріостата (НМ 500; Місгоп, Вальдорф, Німеччина) та поміщали на предметні скельця, що зберігали при -80 "С.

Виконували імуногістохімічний аналіз для виявлення та підрахунку клітин у кон'юнктивальному епітелії та стромі, які позитивно забарвлювалися на С04 (клон НІ129.9, 10 мкг/мл, ВО Віозсіепсе, Сан-Дієго, Каліфорнія). Кріозрізи забарвлювали вищезгаданим первинним антитілом і відповідним біотинільованим вторинним антитілом (ВО РІаптіпдеп) і

Месдіазіаіп ЕІйе АВС з використанням реагентів Момакеа (Месіог, Бурлінгейм, Каліфорнія). Також використовували вторинне антитіло окремо та відповідне антитіло до ізотипу миші (ВО

Віозсіепсе5) як контролі. Вивчали по два зрізи від кожної тварини та фотографували за допомогою мікроскопа, оснащеного цифровою камерою (Есіїрхсе Е400 із 0О5-РЇ1; МіКоп).

Позитивно забарвлені клітини підраховували в ділянці кон'юнктиви з високим умістом бокалоподібних клітин за довжиною щонайменше 500 мкм в епітелії на відстані 500 мкм із використанням програмного забезпечення для аналізу зображень (програмне забезпечення МІ5

ЕІетепібв, версія 3,0, ВК, Мікоп).

Статистичний аналіз

Через асиметричний розподіл даних ОО аналіз виконували за шкалою 0910 для забезпечення більш нормального розподілу даних. І од10-трансформовані дані ОБО, одержані двома спостерігачами під час дослідження правого та лівого ока, усереднювали. Модель

АМОМА зі змішаними ефектами включала групу, що одержувала обробку, як фіксований ефект і тиждень як випадковий ефект. Передбачалися 95 95 і 99 95 довірчі інтервали для захворювання (5 днів О5 порівняно з групою без обробки, представників якої тримали в окремому віварії) та ефектів обробки сполукою (обробка порівняно із середовищем-носієм). Оскільки всі ці порівняння заздалегідь планували (порівнюючи кожну групу обробку з групою обробки її середовищем-носієм), коригування за множинністю не виконували. Оцінки ефекту обробки за шкалою Іод10 та довірчі інтервали перетворювали назад на вихідну шкалу ОБО, представляючи таким чином оцінку відношення групових геометричних середніх до їхніх довірчих інтервалів. бо Для аналізу експресії генів виконували аналіз із використанням одновибіркового І-критерію для порівняння обробки лікарським засобом і середовищем-носієм. Для аналізу даних проточної цитометрії використовували 2-факторний АМОМА із фіксованим ефектом, що являє собою обробку, і випадковим експериментальним ефектом для перевірки відмінностей в обробках.

Після аналізу виконували процедуру множинного порівняння з використанням критерію

Даннетта для порівняння кожної з груп, що одержували обробку, із групою, що одержувала середовище-носій. Щільність Т-клітин розраховували для кожного зрізу та усереднювали за всіма зрізами для кожної тварини. Оскільки розподіл усереднених даних щільності клітин не був нормальним, їх аналізували з використанням непараметричних методів (процедура Крускала-

Уолліса з наступною методикою множинних порівнянь із використанням критерію Данна).

Приклад 1. Фармакодинамічні характеристики СМУ559090

Зв'язування ІЗНІСУУ559090 з клітинами людини б було насиченим і характеризувалося в цих експериментах за допомогою одного сайту зв'язування із середньою Ка 0,19 нм (0,08-0,43) (геометричне середнє та 95 95 СІ), одержаною з 4 окремих експериментів. Один високоафінний сайт зв'язування для |ІЗНІСУУ559090 також було відзначено в клітинах КВІ-2Н3 щура, які експресують а4р1 щура, із середньою Ка 1,04 нМ (0,58-1,89).

Пригнічення клітинної адгезії визначали для а4р1 (клітини Уигкаї 9Уб) із МСАМ-1 і С5-1 (домен фібронектину); для «а487 (клітини КРМІ 8866) із МАЯСАМ у покритих мікротитраційних планшетах. -ЗУУ559090 пригнічував адгезію клітин б із МСАМ-1 монофазним чином із середньою ІС50 7,72 нМ (2,39-24,9). (ЗМ/559090 також пригнічував адгезію клітин б із С5-1 із середньою ІС50 8,04 нМ (3,05-21,2) і з МАСАМ двофазним чином, що свідчить про наявність високо- та низькоафінного сайту для зв'язування МАЯСАМ - С-ЗУУ559090 у клітинах .б6.

Зв'язування КРМІ 8866 із МАСАМ переважно є показником опосередкованої «4рф7 клітинної адгезії. СУУ559090 пригнічував адгезію клітин КРМІ 8866 із МАСАМ із ІС50 23,0 нм (20,0-26,4).

СУУ559090 також пригнічував зв'язування клітин КРМІ 8866 із МСАМ-1 і С5-1 простим монофазним чином із відповідними ІС50, що становлять 4,81 нМ (2,82-8,20) і 24,5 нМ (ідентичні значення в повторностях).

Таблиця 1

Зв'язування ІЗНІСУУ559090 з інтегринами ай та пригнічення клітинної адгезії

Зв'язування (Ка) а4р81 людини 0,19 нм а4рф81 щура 1,04 нм

Пригнічення клітинної а4р81 - МСАМ-1 1,12 нм адгезії (ІС5О) а4р81 - С5-1 8,04 НМ а4ф87 - МААСАМ 23,0 нм

Крім того, сполуку формули І відзначали як високоселективну порівняно з інтегринами, що

Зо не містять а4, у тому числі ГЕА-1 (Камепзрегу еї аїЇ., 2006). Не спостерігали істотного пригнічення сполукою формули І (при 10 мкМ) в аналізах радіолігандного зв'язування з використанням 53 рецепторів і 4 транспортерів у скринінгу МО5 РПагта.

Приклад 2. Місцева обробка сполукою формули І, що запобігає індукованій зневодненням дестабілізації рогівкового бар'єра

Автори даного винаходу виявили значне підвищення проникності рогівки, вимірюване шляхом забарвлення за допомогою ОС0О, між групою, що не піддається обробці, стресу (М5), і контрольною групою із синдромом сухого ока (055, Фіг. 1). Оскільки повідомлялося, що терапія кортикостероїдами поліпшує стан рогівкового епітелію під час синдрому сухого ока як у людей, так і в мишей (ае Раїма еї а!., 2006а; де Раїма еї аї., 2006Б; Магхп апа РПисдтеїдег, 1999), автори даного винаходу використовували місцеву обробку дексаметазоном (Оех) як позитивний контроль. Обробка за допомогою 0,1 95 ЮОех значно поліпшувала показники інтенсивності ОСО.

Досліджували діапазон доз сполуки формули !/ із мінімальним значенням 1 мг/мл і максимальним значенням 30 мг/мл. Відзначали значуще зниження показників інтенсивності

ОО із концентраціями сполуки формули І, які підвищуються, порівняно з її середовищем- носієм. Найбільш ефективною концентрацією була 30 мг/мл (Ффіг.7), яку через це використовували в наступних дослідженнях.

Приклад 3. Сполука формули І, що діє місцево на поверхню ока

Для вивчення ефекту системного введення сполуки формули | щодо забарвлення рогівки порівнювали два шляхи введення - місцевий і підшкірний (5С). Ідентичну дозу давали 5С (120 мкг у вигляді одного болюсу по 4 мкл) і місцево (60 мкг у вигляді крапель по 2 мкл у кожне око).

Мишам, що одержували сполуку формули І системно, також давали очні краплі із середовищем- носієм місцевим шляхом. Як показано на Фіг. 2 і подібно фіг. 1, місцевий дексаметазон знижував поглинання 0050. Місцева обробка сполукою формули І знову значно знижувала О5-індуковану дестабілізацію рогівкового бар'єра порівняно з її середовищем-носієм. Даний ефект не спостерігали під час системного введення сполуки формули І. Ці результати вказують на те, що локальний терапевтичний ефект сполуки формули І! досягається шляхом місцевого введення у вигляді традиційних очних крапель. Це є несподіваним відкриттям, враховуючи відому роль інтегринів у переміщенні лейкоцитів із кровотоку, що потребує системної дії лікарського засобу.

Така локальна дія лікарського засобу, що вводиться місцевим шляхом, свідчить про новий механізм дії для антагоніста інтегрину а4.

Приклад 4. Місцева обробка сполукою формули І, що знижує рівень маркерів запалення на поверхні ока

РЕО зазвичай супроводжується підвищеними рівнями зв'язаних із Т-клітинами цитокінів, матриксних металопротеїназ і запальних цитокінів у рогівці та кон'юнктиві (Соигзеу еї аї., 2014; де Раїма єї аї!., 2009а; Мооп еї аї!., 2010). Автори даного винаходу досліджували експресію 1-1, тТакг-В1, ММР-9 та СХСІ -9 у рогівці та кон'юнктиві з використанням мишей, яких оброблювали місцево сполукою формули І у кількості 30 мг/мл протягом 5 діб О5, і порівнювали з мишами, яким уводили дозу середовища-носія. Ці гени вибирали, оскільки вони є високоіндукованими під час О5 (Соигзеу єї аї., 2014; де Раїма еї аї., 2009а; де Раїма еї аї., 200665; де Раїма ев! а!., 2006а;

Мооп еї аіІ., 2007). Обидві експериментальні групи та контролі, що не піддавалися стресу, характеризувалися подібним рівнем експресії гена "домашнього господарства"; експериментальні групи порівнювали з контролем, що не піддавався стресу. Результати представлені на Фіг. З.

Спостерігали значне зниження рівня транскриптів ІЇ-1с, ММР-9, ТаБ-В1 ї СХСІ 9 у рогівці в оброблених за допомогою ЗУУ559090 порівняно з обробленим середовищем-носієм контролем (Фіг. ЗА). У кон'юнктиві спостерігали значне зниження рівня експресії ТОБЕ-Д1, але без змін щодо

І/-1їс, ММР-9 та СХСЇІ -9 (Фіг. ЗВ). Ці результати указують на те, що сполука формули | може знижувати рівень маркерів запалення на поверхні ока.

Приклад 5. Місцева обробка сполукою формули І знижує активацію дендритних клітин

Зо Дренувальні СІМ є невід'ємною частиною імунного циклу під час ОЕО (РПидгіеїІдег еї аї., 2008; 5спаитрбиго еї аї., 2011). Для визначення впливу сполуки формули І, якщо такий наявний, щодо СІМ мишей піддавали ЮО5 протягом 1 дня та оброблювали або місцево, або системно (підшкірно; доза 120 мкг, ідентична місцевій) двічі на добу сполукою формули І. Мишам, що одержували підшкірно лікарський засіб, паралельно місцево вводили середовище-носій в обидва ока для імітації зволоження поверхні ока, яке відбувається під час місцевого введення очних крапель. Дренувальні СІМ вирізали та підготовлювали для аналізу проточною цитометрією щодо рівня Т-клітин (204, СОВ8), моноцитів (СО11Б), дендритних клітин (СО11с) і

МНО 1.

Через одну добу Ю5 приводив до значущого підвищення рівня СО110р моноцитів у Сі М порівняно з нормальними мишами. Жодна з інших досліджуваних клітинних популяцій істотно не змінювалася під час О5 у дренувальних СІМ. Жоден із видів обробки не впливав на жодну з популяцій Т-клітин або СО11р-- моноцитів. У той час як рівень СО11с" ії СО11с/МНО І" клітин, як правило, підвищувався під час О5, хоч і не значно, місцева обробка сполукою формули зменшувала рівень як активованих, так і неактивованих форм ОС порівняно з контрольною групою, обробленою середовищем-носієм. Ні системна обробка сполукою формули І, ні місцева обробка дексаметазону фосфатом не давала такий же ефект. Результати представлені на

Фіг. 4.

Цікавим відкриттям є той факт, що сполука формули І! пригнічувала міграцію клітин, що представляють антиген, у СІМ та поліпшувала результат забарвлення рогівки в даній мишачій моделі синдрому сухого ока тільки під час місцевого введення, але не під час системного введення. Це свідчить про локальний, а не системний ефект антагоніста інтегрину а4 у лікуванні рЕО. Цей локальний ефект, очевидно, характерний для антагоніста інтегрину а4 (ЗМУ5Б59090 і відрізняється від такого у стероїдного лікувального засобу для місцевого застосування (дексаметазону фосфату) тим, що дексаметазону фосфат для місцевого застосування знижував ступінь асоційованого з СЕЮО забарвлення рогівки, але не міграцію клітин, що представляють антиген, у дренувальні лімфатичні вузли. Із цього обговорення фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що терапевтичний ефект антагонізму інтегрину а4 реалізується завдяки унікальному та новому механізму.

Приклад 6. РК дослідження на кроликах

Калієву сіль СУУ559090, що називається в даному документі ЗУУ559090А, давали самцям новозеландських білих кроликів шляхом місцевого введення в око у вигляді однієї краплі білатерально (дослідження Мо 1: п-2 кролики/4 ока з розрахунку на один момент часу; дослідження Мо 2: п-З кролики/6 очей із розрахунку на один момент часу). У визначені моменти часу (через 0,5, 1, 3, 6 годин після введення) тканини ока збирали й оброблювали для аналізу.

Концентрації зУУ559090 вимірювали в рогівці та бульбарній кон'юнктиві за допомогою рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (І С-М5/М5).

Після однократного місцевого введення 40 мкл (50 мг/мл) значення Стах у бульбарній кон'юнктиві спостерігали через 1 годину після введення дози (Ттах) для обох досліджень.

Середні концентрації в кон'юнктиві зазвичай знижувалися з плином часу та піддавалися кількісній оцінці через 6 годин після введення дози. Після однократного місцевого введення 40 мкл (50 мг/мл) середні значення Сіпах у рогівці спостерігали через 0,5 години після введення дози (Ттах) для обох досліджень. Середні концентрації в рогівці зазвичай знижувалися з плином часу та піддавалися кількісній оцінці через б годин після введення дози. Середні концентрації в рогівці були вищими за середні концентрації в кон'юнктиві в моменти часу - З і 6 годин - після введення дози. Концентрації в кон'юнктивальній і рогівковій тканинах, що становлять приблизно 358 нг/мл, зберігалися аж до б годин (Фіг.б). Концентрації в кон'юнктивальній і рогівковій тканині перевищували 3000 нг/мл через 30 хвилин, і рівні в рогоподібній тканині, що становлять вище за 1000 нг/мл, зберігалися через З години (Фіг. б).

Приклад 7. Місцеве введення в око новозеландським білим кроликам протягом 13 тижнів

У даному дослідженні використовували (ЗУУ559090А. Дози та концентрації в даному прикладі виражені щодо вихідної сполуки (зЗУУ559090.

СУУ559090А давали новозеландським білим кроликам шляхом місцевого введення в око протягом 13 тижнів. Тваринам вводили дозу шість або дванадцять разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами. Групами, що одержують обробку, були: (1) середовище- носій (12 разів на добу), (2) 30 мг/мл/приймання з уведенням шість разів на добу, (3) 50 мг/мл/приймання з уведенням шість разів на добу або (4) 50 мг/мл/приймання з уведенням 12 разів на добу.

СУУ559090А складали у вигляді маточного розчину в 25 мМ фосфатному буфері з 0,5 95

Зо хлоридом натрію для одержання маточного розчину з концентрацією 50 мг/мл, який використовували для введення групам З або 4, або додатково розбавляли 25 мМ фосфатним буфером із 0,75 956 хлоридом натрію для одержання розчину з концентрацією 30 мг/мл для введення групі 2. Контрольних тварин оброблювали середовищем-носієм у разі використання розчину з концентрацією 50 мг/мл (у 25 мМ фосфатному буфері з 0,5 95 хлоридом натрію).

Протягом 1З3-тижневого періоду обробки кролики щодобово одержували за допомогою місцевого введення в око дози ЗУУ559090А або середовище-носій за постійного об'єму дози 0,06 мл (з уведенням 6 або 12 разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами). Склад на основі тестованого продукту або середовище-носій обережно закапували в частково вивернену нижню повіку правого ока з придатної відстані для запобігання контакту піпетки прямого витіснення з оком. Потім нижню та верхню повіку обережно утримували разом протягом приблизно п'яти секунд для запобігання втраті дози та для забезпечення рівномірного розподілу по зовнішній поверхні ока. Око, в яке не вводили дозу, не піддавали маніпуляціям у жодний момент часу, і воно слугувало як необроблена контрольна ділянка у тварини.

Інстиляція (ЗУУ559090А протягом 13 тижнів шляхом місцевого введення в око в дозі 30 або мг/мл/приймання шість разів на добу або 50 мг/мл/приймання 12 разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами добре переносилася та не спричиняла жодної зміни щодо очей або системну токсичність. Рівень, за якого відсутні видимі небажані ефекти (МОАЕЇ), становив 50 мг/мл/приймання 12 разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами. За даної дози, на підставі значень тижня 13 експозиція АШСО-1 (0-24) становила 19,6 (235) нг'год./мл для 50 самців і 35,5 (426) нг"год./мл для самиць; Стах становила 38,1 г/мл для самців і 68,0 нг/мл для самиць.

Сукупні середні значення токсикокінетичних параметрів для ЗУУ559090 від самців і самиць кроликів після введення в око ЗУУ559090А показані в таблиці 2 та таблиці З відповідно.

Таблиця 2

Сукупні середні значення токсикокінетичних параметрів для ЗУУ559090 від самців кроликів після введення в око СУУ559090А

Параметр Період

АОСо-л(АШСо-за) (не-год./мл)

Стах: (нг/мл)

Ттахе (год.) а. 6 добових доз р. 12 добових доз с. Після першої добової дози

МА: не застосовується.

Таблиця З

Сукупні середні значення токсикокінетичних параметрів для ЗМУ559090 від самиць кроликів після введення в око СУУ559090А

Параметр Період

АОСо-л(АШСо-за) (нг-"год./мл)

Стах: (нг/мл)

Таж (году а. 6 добових доз р. 12 добових доз с. Після першої добової дози

МА: не застосовується. "АСо-а" стосується значення АШСо-ї, помноженого на загальне число добових доз для представлення загальної добової розрахункової АОС.

Приклад 8. Місцеве введення собакам породи бігль в око протягом 13 тижнів

У даному дослідженні використовували (ЗУУ559090А. Дози та концентрації в даному прикладі виражені щодо вихідної сполуки (зЗУУ559090.

СУУ559090А давали собакам породи бігль шляхом місцевого введення в око протягом 13 тижнів. Тваринам вводили дозу шість або дванадцять разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами. Групами, що одержують обробку, були: (1) середовище-носій (12 разів на добу), (2) 30 мг/мл/приймання з уведенням шість разів на добу, (3) 50 мг/мл/приймання з уведенням шість разів на добу або (4) 50 мг/мл/приймання з уведенням 12 разів на добу.

СУУ559090А складали у вигляді маточного розчину в 25 мМ фосфатному буфері з 0,5 95 хлоридом натрію для одержання маточного розчину з концентрацією 50 мг/мл, який використовували для введення групам З або 4, або додатково розбавляли 25 мМ фосфатним буфером із 0,75 956 хлоридом натрію для одержання розчину з концентрацією 30 мг/мл для введення групі 2.

Протягом 13-тижневого періоду обробки собаки щодобово одержували за допомогою місцевого введення дози в око (3УУ559090 або середовище-носій (12 разів на добу) за постійного об'єму дози 0,06 мл (з уведенням 6 або 12 разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами). Склад на основі тестованого продукту або середовище-носій обережно закапували у частково вивернену нижню повіку лівого ока з придатної відстані для запобігання контакту піпетки прямого витіснення з оком. Потім нижню та верхню повіку обережно утримували разом протягом приблизно п'яти секунд для запобігання втрати дози та для забезпечення рівномірного розподілу по зовнішній поверхні ока. Око, в яке не вводили дозу, не піддавали маніпуляціям у жодний момент часу, і воно слугувало як необроблена контрольна ділянка у тварини.

Інстиляція тестованого продукту під нижню повіку лівого ока аж до 12 разів на добу за концентрацій до 50 мг/мл добре переносилася. Не виявляли жодних ознак, які можуть бути пов'язані з локальними або системними ефектами тестованого продукту.

Наостанок місцеве введення ЗУУ559090 собакам породи бігль в око протягом 13 тижнів у дозі 30 або 50 мг/мл/приймання шість разів на добу або 50 мг/мл/приймання 12 разів на добу з одногодинним інтервалом між дозами добре переносилося та не спричиняло жодної зміни щодо очей або системну токсичність.

Таким чином, рівень, за якого відсутні видимі небажані ефекти (МОАЕЇ), становив 50 мг/мл/приймання під час уведення 12 разів на добу. За даної дози на підставі об'єднаних значень тижня 13 від самців і самиць експозиція АОсСо-ї становила 11,2 нг"год./мл (розрахункова

Ко) АШМсСо-га становила 134 нг"год./мл); Стах становила 28,7 нг/мл.

Зведення значень токсикокінетичних параметрів для ЗУУ559090 від самців і самиць собак після введення ЗУУ559090А в око показана в таблиці 4 та таблиці 5 відповідно.

Таблиця 4

Токсикокінетичні параметри для СУУ559090 від самців собак після введення ЗУУ559090А в око

Параметр Період (дм

Спа (нг/мл)

Тай (год) а. Після першої добової дози р. 6 добових доз с. 12 добових доз

МА: не застосовується.

Таблиця 5

Токсикокінетичні параметри для СУУ559090 від самиць собак після введення ЗУУ559090А в око

Параметр Період (дм

Ста (нг/мл)

Тай (год) а. Після першої добової дози р. 6 добових доз с. 12 добових доз

МА: не застосовується.

Приклад 9. Рандомізований, подвійний сліпий, плацебо-контрольований дизайн із паралельними групами для оцінки безпеки, переносимості й ефективності -УУ559090 у пацієнтів із синдромом сухого ока

Дане дослідження складається з двох частин. Частина 1 буде проводитися в одному або більше центрах та являє собою відкрите випробування зі зниженням дози за оцінкою переносимості (зУУ559090 на здорових добровольцях. Після визначення переносимої дози дослідження буде переходити до частини 2. Частина 2 являє собою проспективне, плацебо- контрольоване, рандомізоване, подвійне сліпе, з паралельними групами, багатоцентрове дослідження за оцінкою безпеки й ефективності (3У/559090 для лікування синдрому сухого ока (ОЕБ).

Частина 1 буде передбачати дві групи обробки. Не більш ніж 10 здорових добровольців будуть одержувати 50 мг/мл ЗУУ559090 ТІО в одне око протягом періоду, що становить 7 днів.

Якщо дана доза виявиться переносимою для 10 пацієнтів, то дослідження буде переходити до частини 2, а більш низьку дозу не будуть вивчати. Якщо 50 мг/мл виявиться погано переносимою дозою, то друга когорта з 10 здорових добровольців буде одержувати 30 мг/мл

СУУ559090 ТІО в одне око протягом періоду, що становить 7 днів. Якщо дана доза виявиться переносимою, то дослідження буде переходити до частини 2. Оцінка переносимості буде базуватися на аналізі фізичних показників і відповідей на опитувальник за переносимістю.

Дослідження буде зупинено, якщо жодна доза не виявиться переносимою. Максимальна тривалість участі в даній фазі згідно з протоколом для окремого пацієнта буде становити 22 діб (14 діб скринінгу, 7 діб (3УМ/559090, 1 доба наступного спостереження).

У частині 2 приблизно 90 суб'єктів із ОЕО від помірного до важкого ступеня важкості будуть переходити у період уведення із прийманням плацебо, протягом якого вони будуть одержувати одну краплю плацебо ТІЮ протягом 14 днів. Після періоду введення з прийманням плацебо перші приблизно 76 суб'єктів, які все ще відповідають критеріям включення та демонструють схильність до введення дози у періоді введення, будуть рандомізовані в одну з двох груп у співвідношенні 2:11 (5УУ559090:плацебо). Суб'єкти будуть рандомізовані або до найбільш

Зо високої переносимої дози СУУ559090 (із частини 1), що доставляється три рази на добу, або до дози плацебо (середовища-носія) три рази на добу. Суб'єкти будуть продовжувати приймання лікарського засобу згідно з призначенням аж до 12 тижнів. Максимальна тривалість участі суб'єктів у даній фазі згідно з протоколом буде становити 115 діб (14 діб скринінгу, 14 діб періоду введення з прийманням плацебо, 84 діб обробки та З доби наступного спостереження).

Частина 2 згідно з протоколом призначена для експериментальної перевірки концепції в популяції із синдромом сухого ока. Враховуючи, що ефективність, спостережувана в доклінічних моделях, не поступалася дексаметазону, доцільно очікувати, що значущі ефекти будуть спостережуватися щодо об'єктивного фізіологічного біомаркера (забарвлення рогівки), який безпосередньо відображає цілісність очного епітелію. Подвійний сліпий рандомізований підхід є придатним, оскільки декілька кінцевих точок піддаються систематичній помилці повідомлення інформації або дослідником, або суб'єктом. Групу плацебо (середовище-носій) включають, оскільки попередні дослідження демонструють явні ефекти плацебо, частково через змащувальний ефект очних крапель із середовищем-носієм. Таким чином, клінічний результат не можна оцінити, не враховуючи даний ефект.

Приклад 10. Дослідження для оцінки безпеки, переносимості й ефективності ЗУУ559090 у пацієнтів із синдромом сухого ока

У даному дослідженні спочатку буде проведено скринінг приблизно 200 суб'єктів із ОЕО від помірного до важкого ступеня тяжкості. Приблизно 120 суб'єктів будуть рандомізовані в одну з двох груп у співвідношенні 1:1 (зУ/559090:плацебо). Суб'єкти будуть рандомізовані або до найбільш високої переносимої дози ЗУУ559090 (наприклад, 50 мг/мл), що доставляється три рази на добу, або до дози плацебо (середовища-носія) три рази на добу. Тривалість даної фази дослідження буде становити 98-101 діб (14 діб періоду введення з прийманням плацебо, 84 доби обробки та необов'язково З доби наступного спостереження).

Після закінчення проміжного аналізу додаткові суб'єкти будуть згодом рандомізовані в паралельному дослідженні для визначення оптимальної дози. Якщо в проміжному аналізі виявлять сильну реакцію на ТІО найбільш високої переносимої дози, то приблизно 200 суб'єктів будуть рандомізовані в одну з п'яти груп: плацебо ТІЮ; З мг/мл ТІЮ; 30 мг/мл ТІЮ; 50 мг/мл ТІЮ або 50 мг/мл ВІО. Якщо в проміжному аналізі виявлять помірну реакцію на ТІО найбільш високої переносимої дози, то приблизно 140 суб'єктів будуть рандомізовані в одну з чотирьох груп: плацебо ТІЮ; З мг/мл ТІЮ; 30 мг/мл ТІО або 50 мг/мл ТІЮ.

Посилання

СпоїїКамапісі 5, де Раїма С5, Гі БО, Спеп 9, Віап Е, Рапеу МУ, Ршаїеїдег ЗО. Ргодисійоп апа

Асіїмйу ої Маїйіх МеїаїІПоргоївіпаєе-9 оп Ше Осшціаг Зипасе Іпстеазе іп Оузішпсійпа! Теаг

Зупаготе. Іпмезі ОрпіНаїтої Мів Зсі. 2009;50:3203-3209.

Сопеп І.В., Мапа В.М., ОвєіІ2ог Р., Мештап М.С. Віоіодіс ІНегаріеєв іп іпПаттаїйогу ромує! дієевазе. Тгапвіайопаї гезеагсй: Пе іоитпаї ої Іабогаюгу апа сіїпіса! тедісіпе. 2014;163:533-556.

Сотаіе5 В.М., біет М.Е., де Раїма С.5., Меїсп 9., 1 ї 0.0., РПшдтєїдег 5.0. Резіссаїйіпу 5іге55

Зо 5зітшацтевз ехргезвіоп ої таїйіх теїаІІоргоїєїпазе5 Бу Ше сотвеаї ерійеїйшт. Іпмезі ОрпіНаїтої Мі зЗсі. 2006:47:3293-3302.

Соигзеу Т.а., ВоНаї В., Ватбоза Р.І., РПидгеїідег 5.С., де Раїма 0.5. ЮРезіссаїйіпу 5ігез5-іпдисєй спетокіпе ехргезвіоп іп Ште еріїнеїйшт і5 дерепадепі оп иргедшіайоп ої МКагор/вВАЕ-1 апа геїІєазе оПІЕМ-датта іп ехрегітепіа! агу еує. у Іттипої. 2014:193:5264-5272.

Соцгвеу Т.Сс., Сапані М.В., Моїре Е.А., РПшид'єЇдег 5.С., де Раїма 0.5. СпетокКіпе гесеріог5

ССВАб апа СХОВЗ аге песеззагу ог СОА(-) Т сеїЇ тедіаїєд осціаг зипасе аїізеавзе іп ехрегітепіаї! агу еує дізеазе. РІ о5 Опе. 2013;8:678508.

Стов5 А.Н., Маівтій Н.Т. Евіабізней ап поме! аізеазе-тоаіїуїпу Меайтепів іп тийіріе 5сіІеговів. / Іпїет Мед. 2014:275:350-363.

Сох 0., Вгеппап М., Могап М. Іптедгіп5 аз Іпегарешііс їагдеїв5: Іез5оп5 апа орропипіев. Маї

Вем Огид Оібвсом 2010:9:804-20. де Раїма С.5., Споїїкамапіснп 5., Рапдеїїпап 5.В., Ріїснег 9У.0О., І, Рапду В., 7пепд Х., Ма Р.,

Еапеу МУ/.)., ЗівєтазКо К.5., Мієдетжогп У.М., біегтт М.Е., Її 0.0., РПпдіеідег 5.0. 1-17 аівгирів сотеаї батієг тоПом/іпд девіссаїіпо 5іге55. Мисовзаї Іттипої!. 2009а;2(3):243-253. де Раїма С.5., Сотаіез В.М., МіМПатеєа! А.Г., Рапеу МУ., (ії 0.0., Бієт М.Е., РПид'еєїдег 5.0.

Сопісовієгоїй апа дохусусіпе зуирргез5 ММР-9 апа іпЯаттаїйогу суїюКіпе ехргеззіоп, МАРК асіїмайноп іп Шїте сотеаї ерййеїїшт іп ехрегітепіаї! агу еує. Ехр Еує Нез. 200ба;83:526-535. де Раїма С.5., Соїтаіез В.М., МіПагтєа! А.Г., Рапйеу МУ/., її 0.0., 5івєтп М.Е., РПидтєїдег 5.0.

Аріса! сотвеаї Баїтівг дівгирійп іп ехрегітепіа! тигіпе агу еує і5 абгодаїєд Бу теїНуІргедпізоЇопе апа дохусусіїпе. Іпмезі Орпійа!тої Мі сі. 20060:47:2847-2856. де Раїма С.5., Рапдеїпап 5.В., Спапд Е., Мооп К.С., Рапйеу М/.9У., 1 0.0., Рішодтеїдег 5.0.

Евзепіаї! гої Тог с-Уип М-іегтіпаї! Кіпазе 2 іп согпеа! еріїпеїіа! гезропзе 0 девзіссаїййпу 5ігев55. Агсп

Орпійаї!тої. 20096;127:1625-1631. де Раїма С.5., МоІре Е.А., Сапані М.В., 7Напао Х., 7Непд Х., РісНег У.0., І, Рапйеу М/.У., єіет

М.Е., МіведеКогп 9.М., Гі 0.0., Ніаме!! В.А., Рпаїєїдег 5.0. Оівгирібп ої ТОаг-реїга 5ідпаїїпа

Ітргоме5 Осшціаг зипасе Еріїнеїїа! Сізеазе іп Ехрегітепіа! Ашоіїттипе Кегагосопійпсіїміїів Зісса.

РІГо5 Опе. 2011;6б:'6є29017. Електронна публікація 14 грудня 2011 р.

Битвип О., Мапа М., Мопгоу 0., Її 0.0., ГоКезпулаг В.І., біг М.Е., РішатеїІдег 5.0. А тоизе тоавїі ої Кегаїосопіипсіїміїів вісса. Іпмезі ОрпіНаїтої Мів 5сі. 2002:43:632-638.

ЕсоїНіег Т., ЕІ Аппап .)., Вавпіа 5., Зспаитбего 0., бапа В. Модипайоп ої іпіедгіп аїрнадреїта! (МІ А-4) іп агу вує дізеазе. Агсп Орпійаїтої. 2008;126:1695-1699.

Едулагав 9.б., ММіКіпвоп І.5., Зреїдні Р., Ізепрегу О.А. Мазсшіаг сеїЇ аанезіоп тоїесціе 1 апа аірна 4 апа Беїа 1 іпієдсгіпв іп Іутріосуїє аддгедаїевз іп б|одгеп'є зупаіготе апа тПешйтаїйоїа аппийв. Апп Апецт бів. 1993;52:806-811.

Соїдеївіп МН, Тиргіду КІ, Адапідіап У, Рийіпе Е, Мадії! М, Комаїсніп У, Сюїдеп К, 7агбів-

Раравіоїївів (1, 500п9 Е, Заіараїек АМ, біетрбрего С, СеїІпікег А. А Ріазе 2 Ехріогаюгу Зщшау ог а

Момеї! ІпіепйецйКіп-1 Весеріюог Іппірйог (ЕВІ-005) іп Ше Тгтєаїтепі ої Модегаїе-ю-5емеге АЇПегаїс

Сопійпсіїміїв5. Еує Сопіасі І епв. 2015:41:145-55

Сшіснег І., ОопКог М.К., Ма О0., ВидепезКу А.У., НРіамеї! А.А., Її М.О. Ашостіпе Мапв5іоптіпа дгоумій Тасіог-беїа! рготоїез5 іп мімо Тп17 сеї! айегепіайноп. Іттипйпу. 2011:34:396-408.

Нои У), Томпзоп 5А, Комаїспіп ОТ, Мавсі А, Кіпег О, Зп! У, Кіпа ВМ, 5сНіптег Е, Соїдеп К,

Тпотаз С, Сагсіа КС, 7агрів-Раравіоїївів С, Гипіпе Е5, Вагтевз ТМ. Оевідп ої а зирегіог суїюкКіпе апіадопіві ог іоріса! орпіНаїтіс изе. Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А. 2013:110:3913-8.

І памід А. Те ибзе ої тисоадпевзіме роїутег!5 іп осшціаг агид аеїїмегу. Адм Ота ОєїЇїм Нем 2005;57:1595-639. шо Г., 1 0.0., Бозі А., Рапеу МУ., Сотаієз В.М., РПшатеідег 5.0. Ехрегпітепіа! агу єуе 5ітшатез ргодисіоп ої іпїаттацогу суїюКіпе5 апа ММР-9 апа асіїмаїез МАРК зідпаїїпд раїпжмаув5 оп Ше осшціаг зипасе. Іпмевзі Орпїнаї!тої Мі 5сі. 2004:45:4293-4301.

Мати Р., РЯПидієїдег 5.С0б. Торісаї попргезегуєд / теїНуІргедпізоїопе Шегару г

Кегаюсопішйпсіїміїів вісса іп Зіоагеп зупаготе. ОрпіпаІтоїоау. 1999:106:811-816.

Маззіпдаїе М.Г., Гі Х., МаПавна|озуціа М., Спеп 0., МУвї У., Авбеї! Р.А. Апаїувів ої іпаттайогу суюкіпез іп Пе івагз ої агу еує раїйепів. Согтпєа. 2009:28:1023-1027.

МіедетКотт .М., 5іет М.Е., РПмдтеїдег 5.С., де Раїма С.5., Сота|ез В.М., Сіао у., зіетавко К.

Резіссайпа 5ігез55 Іпдисез Т СеїІ-Медіаїєд 5іодгеп'є Зупаготе-їі іКе І астіта! Кегаюсопіипсіїміїів. У

Іттипої!. 2006;176:3950-3957.

Моїїта У., Нитрнпгієв5 М.)., Моціа А.Р., Котогіуа А., Матада К.М., 5спіозвтап 5.Р., Могітоїю

С. МГА-4 теїдаїєз СОЗ-дерепдепі СО4-- сеї! асіїмайоп міа Ше С51 аїегпаїмеїу в5іїсей дотаїп ої

Тргопесіїп. ) Ехр Меа 1990;172:1185-92.

Ко) РіїндгеїІдег 5.С., де Раїма С.5., 1 ії О0.0., 5іет М.Е. ЕріїпеїЇіаІ-іттипе сеї! іп'егасіюоп іп агу еує.

Согпеа. 2008:27 Зиррі 1:59-11.

РїнатеІдег 5.С., Рапеу МУ., Їцо Ї., СНеп І.27., де Раїма С.5., ОІто5 І.С., Її 0.0., Ріпі М.Е.

Маїйх теїаїІПоргоївіпазе-9 КпосКоції сопієг5 гевзібїапсе їо согпеа! еріїпеїЇйаІ Батег аїівгиріоп іп ехрептепіаї! агу єує. Ат У Раїної. 2005;166:61-71.

Рїндгеїдег 5.С., допез 0., і 7., Абопво А., Мопгоу 0. Айегеа суїоКіпе Баїапсе іп їйе їєаг Під апа сопіпсіїма ої раїйєпів м/йй Біодгеп'є зупдготе Кегасопішйпсіїмів вісса. Сип Еуе Вев. 1999;19:201-211.

Вамепзбрега А.У., І ціїЇкК В., УУевієїв Р., Нієтвіга Р.5., (ек Р.)., Її аттегв УМУ., Вабре К.Р. Тне еПесі ої а 5іпдіє іппаієд дове ої а МІ А-4 апіадопібі оп аПегдеп-іпдисей аіпмау гезроп5е5 апа аігмау іпїтаттацогп іп раїепів Мп азіпта. АїПегау. 2006;61:1097-1103.

Везеагсіп іп агу єує: герой ої Ше Везеєатєси ЗиЇирсоттіНеє ої Ше Іпіегпайопа! Огу Еуе

МоКЗПпор. Оси! Зип 2007;:5:179-193.

Зспаштбриту С.5., бівєтавзКко К.ЕР., де Раїма С.5., РПшдіеідег 50, 5ієт М.Е. Осшціаг Зипасе

Апіїдеп Ргезепіїпуд СеїЇє аге Месеззагу ог Асіїмайоп ої Аціогеасіїме Т сеїї5 апа Оеємеіортепі ої

Ашоіттипе І астіта! Кегасопішпсіміів. У Іттипої. 2011:187:3653-3662.

ЗПперрага .0., Тоїкідвеп С.Ї., І опзааІє 9У.0., С'Атьговіо Б.А., Уг., Мсі ашгіп Е.В., ЕПептап

В.А. Кеппеду К.5., Зетра С.Р. І ййедгаві орпінаі!тіс 5оЇшіоп 5.0 95 ог ігеайтепі ої агу єує дізеазе: гезиїї5 ої Ше ОРИБ-Ї рпазе З зшау. ОрпіпаІтоїіоду. 2014:121:475-483.

Зіегпт М.Е., 5спаштрига С.5., Оапа В., Саопде М., МіедеКогтп ..М., РЯаїеЇдек 5.0...

Ашоіттипйу аї їйе осціаг зипасе: раштодепевзів апа гедшайоп. Мисозаї! Іттипої. 2010;3:425-442.

Зіет М.Е., Зспаштбриго С.5., РПшдієїдег 5.0. ЮОгу еує аз а тисоза! ашоіїттипе аїівзеазе. Іпі

Вем Іттипої. 2013;32:19-41. зЗіоскіпдег, В., Меідноеп М., Мапіп В. ТН17 Т сеїІв: ПиКіпу іппаїе апа адаріїме іттипйу. Зетіп

Іттипої. 2007:19:353-361.

Уооп К.С., де Раїма С.5., ОЇ Н., Снеп 2., Рапеу МУ/.9., Пі 0.0, Ріїшотеїдег 5.С. Ехргезвіоп ої 1-1 спетокіпе5 апа спетокіпе гесеріог5 оп Ше осціаг зипасе ої С57ВІ /6 тісе: еМПесів ої аевзіссайіпа 5іге55. Іпмезі Орпіпаїтої Мі 5сі. 2007:48:2561-2569.

Мооп К.С., Рак 0.5., Мои І.б., Спої Н.)., ее К.Н., Іт 5.К., Ра Н.У., РПидієЇїдег 5.0.

Ехргезвіоп ої СХОЇГ 9, -10, -11, апа СХСВЗ іп Пе їєаг їїт апа осціаг зипасе ої раїепів м/йй агу еує 60 зупаготе. Іпумевзі Орпіна!тої Мі сі. 2010:51:643-650.

7папду Х., Зспаштбрига С.5., боцтвеу Т.С., Зіетазко К.Р., Моїре Е.А., Сапані М.В., Її 0.0.,

МієдетКогп У.М., 5іет М.Е., Рішатеідег 5.0., де Раїма С.5. СОВ(-) сеї геаціаїє Ше Т НеїІрег-17 гезропзе іп ап ехрегітепіа! тигіпе тодеї ої Біодгеп зупаготе. Мисозаї Іттипої. 2014;:7:417-427. папа Х., Моїре Е.А., Сапані М.В., Зспайтригуд С.5., ЗіетавзКо К.Р., Раподеїїпап 5.В., КеїПу 5.О0., Наудау А.С., її 0.0., 5іет М.Е., МівєдеКогп .).М., РПшдієїдег 5.С., де Раїма 0.5. МК сеїЇв рготоїе ТН-17 тедіаїеай согвеаї баїттієг дівгирійоп іп агу єує. РІ о5 Опе. 2012;7:е36822.

Ппепя Х., де Раїма С.5., Нао К., Ії 0.0., Рапеу МУ/.)., ет М., РІПидгеїдег 5.0. Емаїчайоп ої Те тапвіоптіпу дгоуми Тасіог-реїа асіїміу іп поттаї апа агу еує питап ївагз Бу ССІ -185 сеї! Біоаззау.

Согтеа 2010:29:1048-1054. гоикпті 0. Ебесі ої іпїтаттацоп оп Іасгітаї! діапа їпсіоп. Ехр Еує Нез 2006;82:885-98.

ІЛЮСТРАТИВНІ ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ

А1. Фармацевтична композиція, що містить сполуку формули І, яка являє собою ї2 пу ра рр хі я

Ф вай Ме АЖ ОН

ЩІ ї н о ЧО. о т Ф. або будь-яке з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу та одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А2. Фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення А", де композиція застосовується місцево.

АЗ. Фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення А!, де композиція застосовується щодо кон'юнктивального мішка або повіки.

А4. Фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення А", де композиція застосовується під кон'юнктиву, у камеру, у склоподібне тіло, у субтеноновий простір, під сітківку, під судинну оболонку або на судинну оболонку.

АБ. Фармацевтична композиція згідно з варіантами здійснення А2, АЗ або А4, яка застосовна для лікування запального стану ока.

Аб. Фармацевтична композиція згідно з будь-яким із попередніх варіантів здійснення, де композиція застосовується у формі очних крапель, спрею або аерозолю.

А7. Фармацевтична композиція згідно з будь-яким із попередніх варіантів здійснення, де композиція застосовується за допомогою вставки або іншого пристрою для доставки.

Зо АВ. Спосіб лікування запального стану ока у ссавця/людини, що потребує цього, який передбачає введення вказаному ссавцю/людині терапевтично ефективної кількості сполуки формули І, яка являє собою в. ин, о М 4 пр й бсди 55 о

Н сода ит ЖК | сн бут о ми - 0 ( або будь-якого з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А9У. Спосіб згідно з варіантом здійснення Ав, де композицію застосовують місцево.

А10. Спосіб згідно з варіантом здійснення А8, де композицію застосовують щодо кон'юнктивального мішка або повіки.

А11. Спосіб згідно з варіантом здійснення Ав8, де композицію застосовують під кон'юнктиву, у камеру, у склоподібне тіло, у субтеноновий простір, під сітківку, під судинну оболонку або на судинну оболонку.

А12. Спосіб згідно з будь-яким із попередніх варіантів здійснення, де композицію застосовують у формі очних крапель, спрею або аерозолю.

А13. Спосіб згідно з будь-яким із попередніх варіантів здійснення, де композицію застосовують за допомогою вставки або іншого пристрою для доставки.

А14. Фармацевтична композиція, що містить сполуку формули І, яка являє собою о ще Мн; ев : Гм

Бе З Зони М шо я ча. Ка ж титр у ек: те

Е н

ЕІ. с ГУ

Ф. або будь-яке з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу та одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин, для застосування в лікуванні запального стану ока.

А15. Спосіб лікування запального стану ока у ссавця/людини, що потребує цього, шляхом блокування міграції клітин, що представляють антиген, у лімфатичні вузли, при цьому спосіб передбачає введення вказаному ссавцю/людині терапевтично ефективної кількості сполуки формули І, яка являє собою о пу дж у що о се о о н рі

Щу : СУ я ше В СА Я о ва о (. ч-- з " " . або будь-якого з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А16. Спосіб лікування запального стану ока у ссавця/людини, що потребує цього, який передбачає введення вказаному ссавцю/людині терапевтично ефективної кількості: (а) фармацевтичної композиції, що містить сполуку формули І, яка являє собою по

Су тре о сах о З

Ж Ж он 2 ту У М щі о Зоя о (Ф), або будь-яке з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу; і (Б) циклоспорину А, та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А17. Спосіб лікування запального стану ока у ссавця/людини, що потребує цього, який передбачає введення вказаному ссавцю/людині терапевтично ефективної кількості: (а) фармацевтичної композиції, що містить сполуку формули І, яка являє собою

І

І "Мн; тур рас й о М о

Ї А М Її ян ня зи я ка о о о

ОФ. або будь-яке з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу; та (Б) місцевого стероїду, вибраного з групи, що складається з дексаметазону у вигляді основи та дексаметазону фосфату, дифлупреднату, флуоцинолону, флуорометолону у вигляді основи й флуорометолону ацетату, лотепреднолу, преднізолону ацетату та преднізолону фосфату, римексолону та триамцинолону ацетоніду, та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А18. Спосіб лікування запального стану ока у ссавця/людини, що потребує цього, який передбачає введення вказаному ссавцю/людині терапевтично ефективної кількості: (а) фармацевтичної композиції, що містить сполуку формули І, яка являє собою

Її ше тн ув во а | Зании о

Е ет ай КК, и ту в) а о 0). або будь-яке з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу; та (Б) нестероїдного протизапального лікарського засобу, вибраного з групи, що складається з бромфенаку, диклофенаку, флурбіпрофену, кеторолаку та непафенаку, та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А19. Спосіб лікування запального стану ока у ссавця/людини, що потребує цього, який передбачає введення вказаному ссавцю/людині терапевтично ефективної кількості: (а) фармацевтичної композиції, що містить сполуку формули І, яка являє собою

З су

Тур сш

С а З

М

М Ж ОН йстетр и М

В Кк (Ф) Ах т НИ т Ф. або будь-яке з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу; та (Б) антагоніста інтегрину ГЕА-1, та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

А20. Спосіб згідно з варіантом здійснення А19, де антагоніст інтегрину ГЕА-1 являє собою ліфітеграст.

А21. Спосіб згідно з варіантами здійснення А15, А16, А17, А18, А19 або А20, де композицію застосовують місцево у формі очних крапель, спрею або аерозолю.

А22. Застосування сполуки формули І, яка являє собою

І су ря (9) М

ДО я а ! п ! ради Ж ві «он ни ши В у о хх о но ах або будь-якого з її фармацевтично прийнятного ізомеру, гідрату, ангідриду, сольвату, естеру, форми солі, вільної кислоти або основи, проліків, комплексу, кон'югату або поліморфу та однієї або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин у виготовленні лікарського препарату для лікування запального стану ока.

А23. Фармацевтична композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким із попередніх варіантів здійснення, де запальний стан ока являє собою синдром сухого ока, неінфекційний увеїт (наприклад, передній, серединний, задній або генералізований увеїт), неінфекційний кон'юнктивіт, ірит або склерит.

А24. Фармацевтична композиція, спосіб або застосування згідно з будь-яким із попередніх варіантів здійснення, де запальний стан ока являє собою синдром сухого ока.

Claims (10)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування фармацевтичної композиції, яка містить сполуку формули І:

(о) Мне а (е) (о) н г - М Е Н (Ф) ва (9) (І) або її фармацевтично прийнятну сіль, в лікуванні запального стану ока шляхом місцевого введення в око людини, де окрему дозу сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі в діапазоні від 0,01 до 5 мг вводять у кожне уражене око.

2. Застосування за п. 1, де окрема доза знаходиться в діапазоні від 0,1 до 5 мг.

3. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де композицію застосовують щодо поверхні ока, кон'юнктивального мішка та/або повіки.

4. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де композицію застосовують під кон'юнктиву.

5. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де запальний стан ока являє собою синдром сухого ока.

6. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де композиція додатково містить одну або більше фармацевтично прийнятних допоміжних речовин.

7. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де композиція складена у формі очних крапель, гелю, мазі, спрею або аерозолю.

8. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де композиція складена у формі офтальмологічного розчину.

9. Застосування за п. 8, де офтальмологічний розчин містить 30 мг/мл сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі.

10. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, де композиція додатково містить один або більше додаткових терапевтичних засобів, вибраних із групи, що складається 3: (а) циклоспорину А; (Б) стероїду, вибраного з групи, що складається з дексаметазону у вигляді основи, дексаметазону фосфату, дифлупреднату, флуоцинолону, флуорометолону у вигляді основи, флуорометолону ацетату, лотепреднолу, преднізолону ацетату, преднізолону фосфату, римексолону та триамцинолону ацетоніду; (с) нестероїдного протизапального засобу, вибраного з групи, що складається з бромфенаку, диклофенаку, флурбіпрофену, кеторолаку та непафенаку. Ех Зб жк ж т в з 5 800 й В г ре ш КІ тай ЕЕ! 5 я ех В чеки ЖК. Шо я ще клени ин кої ОК Я БО БМ ща он шк и и ня: - Щи м «су о ий се і я -ї Ко; а? Я ро м маш

Фіг. 1

2 5 400 Га й в «а я Я В ОВ тва; т вод зп тях ! а що ; « В ! ВЗ ! щосв - ОК ШИ щож і и» ЩЕ ! КО ве ЗБЕ ор 1 ШІ р ве і з Е лож» ЖК хиннньик З І хи З Я щш В ; ШК ШЕ мама З Е ЕОЗ Ко КЕ жк ЖЕ хо. ЩЕ мас Ко даееяяк ОБО Ж я о ШЕ : ОК КЕ

ЖЕ. ЩЕ зайнни: ! ож ж в КЗ у," ШЕ зн ! и БО ; а і ОБО ВО ЕС І Шуть ЩЕ ване ї о Ж БУ ВО Ще Шен | ОК В ОК -н-ня БО Б ВЕ ЕЕ хе м т х МК знань Я ЗХ МК ж Ж Ж. дос ни В Я, чек Кн ще я Я ої су ше що, у с с з

Фіг. 2 п-1е х В - зу В - ОВ я є х д. ММР» я схсі.а Бо ів т 5 ко нка, БО ней 00 Воно ві ЦЕ а РОоокйммм во З й ЕД В а и ЗМ ЇХ ме ОЇ ам ЗИ пох Н о ЖК : Бо Ї щоде зу Я 7 он ан

Ж. до : що Зоя Е щОМ о що 3 росою її і шт Б кожи я БЕ їх ще В Я ся ЗЕ НЯ : ше В : во ; КО й 7 МЖК я не НЕ КУ КТК ук пюм сеоТКНєє ДЕ ГУ Ме я - ха що З х НК. -х хх я г х «й й ОЇ -5 КЗ Ка тк у Б СУ ще ак

Фіг. ЗА Я тОав-Ві тлот.й Я я - Я Кох Я : ця ! ення Ж щ Ї , х Щі Е - дк, он Ї як - я 7 Я хі ї Ук одна ОХ чере СЗШ Сея ї "У ОК ї щООху де х мо хви З х ж ж |! я в Е Е ше тк і хю вк Ж т е и щ МО Ї з ЩО Х чен жа докт жом Ж Моя ож ож нен БЖ З Ж Ен о: НВ ЕВОеЯ ВОМ ру В плине ж ї ша Б: Ин ДЕК КУ і шли ли я ГО ис ї Во пк: МІ в і во МлшН ВИ щі у й с Ж сх а а ШЕ» Х дк ки я д с жу де її з к Ж яв Ж їх «й кКх ШО я ій Ї с й м - - дв век;

Фіг. ЗВ

СН ше Я З АЖ. 3 Кч м 3 Ми. хх ЕЗ ж ще ЗШ жк З З не р -Е: МК х Й ско щ В «3 я зак яку Шосе З от ух Мох а ї й 3 хх 3 ККУ х то хх ХО Ух КЗ М мое ж що ЩО Ме шк МОВ СО ох АЕН М З - Ж З ХХ ох Мої ОМ КОХ ХМ ОБОЄ зо ЗИ С 5 ВХ о З -- БЖ З ОО І М ХХ . в мо МК МВ ХХ ї-щ ке. Кук ОК ЗУ ОКХ ХХ х м. Ж - Вк ЩО . Но ВІ Щ її Б БО ЗУ ЗО В Б З ке ї У Е ОК. 3: ВМО м ХХ її ЗМ МА : ЕХ ЗІ: 1 М КИ Б и їх ХХ МНН сх К- ща ХХХ ОХ - їх У - Кок КУ хе х «ще «У к їтЕ Но; їх ЗК х що хх Ка Ж КАСУ ше Ше я З В ОЗ ЗМ ВНУ че ою КОМИ І Еодх де Б Жде й -х Сен КХ ЖЕ МИ ЩІ ік І меж КУ с ре в. КАМ СЕК Я : С . 7 зх жех ЖЕ Й ке ще 3 Й Ба Е ня х 2. ї Ж мово зх З що а ке ІЗ НЕ а «й шомо а х - ме Кі Н З х Я ТХ мож ся ке хе о : ЖЕ шо Яр ч ВОМ во - БОБ мово ж ВЖК ЗЕ хо І М дак ЗХ пЕОВО а БИЖХ ок: У З т Ж скккекК ОХ Ж 4 ВМ ї спимок ОХ ОО І БИ СХ З -- 7 ЖИ 55 Бех З Я ВЕУ ги й ї М дае що Же ТЕЮО.ї МХ МУ . ЩІ : ВМ Б СХ ЕН ей о. Е ПІ ще ТНК Я ЗКУ Ем чесся ОХ ЗК З че Вч щу то ОК ков ко ШКО ОЗ - не що ВЕ «ОК о ЕВ я у У щи. Ам КО КУ ту КУ ча Ме. (- Я х он Бо ЗМУ ох Бу НКУ К- Ж З (ж «х сх ок Коси що о

Фіг. 4 "

ке. Зх У т Е З й Її : Бика З як УНН Я ї ш пе Ех г чі - неайсм че ї Ь й КУ Я Ес сн ще 1 Ж жк Ж оф Щ і 1 ся зх - зн вл ме Пе 0 УУМ 0 ОМ міспево

Фіг. 5

Крапля об'ємом 40 мікролітрів, 50 меймлоска59090 : Крапля 2 мг/око те: Ї Е ши ща З х поко цоцже леск Щек ад шини НК ви и с : а Б ше Ши шо ї З ! с ОЩ о ЕІ че Ши че ! шен й й -- Кон'янЕтина, пон ! : сере Приблияний рівень дл Їзо ! я--е- Кон'онктива, лоелідженни Ме 2 й -- Рогінха, дослідвення Ме З Іа Миття току мг па а и в В й 1 2 з 4 2 6 години

Фіг. 6