UA116134U - Низькомолекулярні органічні сполуки з антитуберкульозною дією на основі тіосемикарбазону бензальдегідів - Google Patents

Abstract

Низькомолекулярні органічні сполуки з антитуберкульозною дією на основі тіосемикарбазону бензальдегідів загальної формули: EMBED ISISServer , де R1 - водень; фтор; хлор; гідроксильна група; пентоксигрупа; R2 - водень; хлор; етоксигрупа; пропоксигрупа; нітрогрупа; R3 - водень; бром; нітрогрупа; диметиламін; гідроксильна група; бензилокси; 4-хлорбензилокси; етоксигрупа; пропоксигрупа; 4-бромбензилокси; пентоксигрупа; 4-метилбензилокси; 3-метилбензилокси; 2-фенілетокси; R4 - водень; етоксигрупа; бром; нітрогрупа; метоксигрупа; ізопропоксигрупа; R5 - водень; хлор; метоксигрупа; хлор, гідроксильна група.

Description

Корисна модель належить до класу тіосемикарбазону бензальдегідів та його застосування в терапії. Більш конкретно ця модель пропонує похідні бензальдегід тіосемикарбазону, що мають антитуберкульозну активність. Запропоновані сполуки є корисними як фармацевтичні агенти для лікування туберкульозу.

Відомими аналогами є препарати першої лінії протитуберкульозної терапії такі як ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти), що пригнічує ріст Мусобасієгішт Шрегсицо5і5 зі значенням

МІС-О,1 мкг/мл, рифампіцин, який має антимікобактеріальну активність зі значенням МІС-0О,5 мкг/мл та етамбутол (МІС-4 мкг/мл) 11.

Відомими аналогами є протитуберкульозні ліки другої лінії такі як стрептоміцин (2,0 мкг/мл), аміносаліцилова кислота (0,5-2,0 мкг/мл), етіонамід (0,63-1,25 мкг/мл), циклосерин (12,5-50 мкг/мл), гентаміцин (2,0-4,0 мкг/мл), канаміцин (1,2-5,0 мкг/мл), тобраміцин (4,0-8,0 мкг/мл), кларитроміцин (8,0-16 мкг/мл), тіацетазон (0,125-2,0 мкг/мл), піриметамін (МІС » 100 мкг/мл).

Відомими аналогами є антитуберкульозні препарати другої лінії терапії серед похідних флуорохінолону - спарфлоксацин (МІС-0,08 мкМ), моксифлоксацин (МІС-0,16 мкм), гатифлоксацин (МІС-1,25 мкМ), левофлоксацин (МІС-1,25 мкМ), ципрофлоксацин (МІС-1,51

МКМ), офлоксацин (МІС-2,5 мкМ) І2І1, 00-159а (МІС-0,14 мкм) (|З), серед похідних оксазолідинону - лінезолід (МІС - 1,5-2,97 мкМ) |4), серед похідних етилендіаміну - 502-109 (МІС-О,7-1,56 мкМ) (51.

Однак, недоліком усіх аналогів вищеперерахованих лікарських препаратів є зниження їх ефективності при лікуванні туберкульозу у зв'язку з виникненням стійкості у Мусовбасіейит тирегсицовів.

У 2012 році вперше за сорок років Управлінням США по контролю за харчовими продуктами і лікарськими засобами (ЕбА) був схвалений новий протитуберкульозний препарат - бедахілін, з комерційною назвою Сіртуро, що пригнічує ріст М. тшбрегсио5і5 зі значенням МІС у діапазоні від 0,05 до 0,12 мкМ, залежно від штаму |б| і призначений для лікування мультирезистентної форми туберкульозу. Однак, нещодавно з'явилися опубліковані дані стосовно резистентності і до

Сіртуро І71.

В основу корисної моделі поставлена задача розробити нові низькомолекулярні сполуки, що мають антибактеріальну активність щодо штамів М. їшбрегсціо5і5, резистентних до існуючих

Зо антибіотиків.

Поставлена задача вирішується тим, що низькомолекулярні органічні сполуки на основі тіосемикарбазону бензальдегідів загальної формули:

А 5

Н в хм Мн, шй о 23 в.

Кк». де В: - водень; фтор; хлор; гідроксильна група; пентоксигрупа;

Вг - водень; хлор; етоксигрупа; пропоксигрупа; нітрогрупа;

Аз - водень; бром; нітрогрупа;х диметиламін; гідроксильна група; бензилокси; 4- хлорбензилокси; етоксигрупа; пропоксигрупа; 4-бромбензилокси; пентоксигрупа; 4- метилбензилокси; З-метилбензилокси; 2-фенілетокси;

Ва - водень; етоксигрупа; бром; нітрогрупа; метоксигрупа; ізопропоксигрупа;

В5 - водень; хлор; метоксигрупа; хлор, гідроксигрупа.

Запропоновані речовини відрізняються за хімічною структурою від відомих у літературі І8-111 та мають кращу антитуберкульозну активність.

Заявлені низькомолекулярні сполуки з антитуберкульозною активністю одержували наступним чином: 1 ммоль тіосемикарбазиду розчиняли при нагріванні у 100 мл етанолу та додавали 1 ммоль відповідного альдегіду. Реакційну суміш кип'ятили до випадіння осаду (приблизно 20-40 хв), потім охолоджували, осад відфільтровували, двічі промивали по 20 мл етанолу та висушували. Структуру синтезованих речовин встановлювали за допомогою спектрів "Н-ЯМР, записаних у ДМСО-Оє на приладі "Майап МегсигумАХ-400" з робочою частотою 400 МГц і внутрішнім стандартом - ТМОС. Одержані результати свідчать про відповідність синтезованих низькомолекулярних органічних сполук заявленим.

Дослідження антимікобактеріальної активності сполук за аеробних умов

Антимікробну активність сполук щодо штаму М. їшбегсиціо5із НЗ7ВуУ, який культивували за аеробних умов, оцінювали шляхом визначення мінімальної інгібувальної концентрації (МІС)

сполуки, тобто концентрації, що повністю припиняла ріст бактерій. Метод грунтувався на вимірюванні росту бактерій у рідкому середовищі флуоресцентного репортерного штаму НЗ7Ву, де показниками були або оптична щільність, або флуоресценція. Використання двох параметрів оцінки мінімізує проблеми, викликані преципітацією сполуки або автофлуоресценцією.

Розраховували значення ІСво - концентрацію сполуки, при якій ріст мікроорганізмів інгібується на 50 95 та ІСоо - концентрацію сполуки, при якій ріст мікроорганізмів інгібується на 90 95.

МІС визначали шляхом вимірювання бактеріального росту через 5 днів за присутності досліджуваних сполук. Сполуки розчиняли в ДМСО (РізНег) та робили серію розведень шляхом двократного зменшення концентрації. Речовини розводили в середовищі 7НО-Тму-ОАОС (4,7 г/л поживного середовища МідаіертоокК 7НО Вазе (ММ/Н), Тмеєп 80 (Рібпег) (0,05 95), МіааІергоокК

ОСОАОС БЗиррієтепі (ММУВ) (1095)) у 9б-лункових плашках (фінальна концентрація ДМСО становила 2 95). Найвища концентрація сполуки становила 200 мкМ у випадку, якщо речовини були розчинні в ДМСО в 10 мМ концентрації. Для сполук із поганою розчинністю найвища концентрація була нижчою в 50 разів, ніж стокова концентрація, наприклад, 100 мкМ для 5 мМ стокового розчину в ДМСО, 20 мкМ для 1 мМ стокового розчину. Для високоактивних сполук досліди повторювали при нижчих початкових концентраціях. Кожна плашка містила декілька контролів (лише середовище/ДМСО, без бактеріальних клітин), відсутність росту - (100 мкМ рифампіцину (Зідта-Аїйгіс!иИ)) та максимальний ріст (лише ДМСО). Плашки інокулювали клітинами М. Шшрегсиціовів та інкубували протягом 5 днів: ріст вимірювали за оптичною щільністю (00590) та флуоресценцією (Ех 560/Ет 590), використовуючи плашковий рідер ВіоТек'м

Зупегау 4. Для вимірювання чисельного значення МІС будували 10-точкову дозо-залежну криву яко росту і підганяли до моделі Гомпертца з використанням СтарипРай Ріїзт 5. МІС розраховували з точки перегину кривої підігнаної до нижньої асимптоти (відсутній ріст бактерій).

Крім того, дозо-залежні криві генерували, використовуючи алгоритм Левенберга-Марквардта і визначали концентрації, при яких спостерігалося інгібування росту бактерій на 50 95 та на 90 95 (значення ІСзо та ІСео, відповідно).

Хімічні структури замісників похідних бензальдегід тіосемикарбазону та антимікобактеріальну активність досліджуваних сполук за аеробних умов наведено в таблиці 1.

Таблиця 1

Хімічні структури замісників похідних тіосемикарбазону бензальдегідів МІС (мкМ), ІСзо (мкМ) та

ІСео (мкМ) за аеробних умов

А 5

Н в хм Мн, шй о 23 в.

Кк».

Мо 4 | нн Її он | н | н | 06 | 17 | 15 у ви норкову вт

Продовження таблиці 1 ек ЯВИ но нранраиуен 1 -- о го. й 1 - ш'л2 --о0 -ь ' й 23 | є ЇЇ н Її н ЇЇ н | с | 27 | 87 | 9

Продовження таблиці 1 23 он я нн МО» Н 17 88 51 ри

Мм- 32 Н Н сл Н Н 130 200 200

Дослідження антимікобактеріальної активності сполук за умов низького вмісту Оксигену

Антимікробну активність сполук щодо штаму Мусобрасієйит Шбегсцозізє НЗУ7Вм за умов гіпоксії визначали способом ГОВА (Іом/ охудеп гесомегу аззау). Бактерії спочатку адаптували до умов низького вмісту Оксигену і потім експонували до сполук при гіпоксії. Це супроводжувалося певним періодом росту за аеробних умов, а ріст вимірювали, використовуючи люмінесценцію.

Сполуки розчиняли в ДМСО (Різпег) та робили серію розведень шляхом двократного зменшення концентрації. Речовини розводили в середовищі Юиров- Гу-АІритіп (ОТА) (6,5 г/л поживного середовища ЮБибоз Вгоїй Вавзе (РізПпег), биро5 тедіит аІритіп (Рівпег) (10 Ув), Гуееп 80 (Рівпег) (0,05 9о)) у 9б-лункових плашках (фінальна концентрація ДМСО становила 2 9б).

Найвища концентрація сполуки становила 200 мкМ у випадку, якщо речовини були розчинні в

ДМСО в 10 мМ концентрації. Клітини М. їшврегсшціові5, що конститутивно експресують оперон

ІихАВСОЕ інокулювали в середовище ОТА в газонепроникних скляних пробірках та інкубували 18 днів для досягнення умов гіпоксії (модель гіпоксії Вейна). За відсутності Оксигену бактерії перебувають у нереплікуючому стані. Їх інокулювали в плашки із середовищем, що містило сполуки та інкубували за анаеробних умов протягом 10 днів, а потім інкубували протягом 28 годин за аеробних умов. Крім того, нереплікуючі бактерії інокулювали в плашки із середовищем, що містило сполуки та інкубували за аеробних умов протягом 5 днів. Ріст в обох випадках вимірювали за показниками люмінесценції. Рифампіцин (Зідта-Аїйагісн) та метронідазол (Зідта-

АїІдгісй) використовували як позитивні контролі загибелі М. Шрегсціобзіє за аеробних та анаеробних умов, відповідно.

Антимікобактеріальну активність досліджуваних сполук за умов гіпоксії наведено в таблиці 2.

Дослідження мінімальної бактерицидної концентрації сполук

Бактерицидну активність сполук досліджували щодо штаму М. їШшврегсціовіє НЗ7ВУ, який вирощували за аеробних умов у середовищі 7НЗ-Ту-ОАОС. Обрахунок живих клітин проводили через З тижні експозиції до сполук для визначення рівня загибелі.

Клітини М. їшбБетгсціозіз вирощували за аеробних умов до логарифмічної фази та

Зо інокулювали в рідке середовище, що містило чотири різні концентрації сполук із максимальною концентрацією ДМСО 2 95. Для сполук зі значенням МІС » 20 цМ, відібрані концентрації були

ТОХ МІС, 5Х МІС, 1Х МІС ї 0.25Х МІС (200, 100, 20 ї 5 М). Культури інкубували зі сполуками протягом 21 дня, а виживання клітин визначали шляхом підрахунку колоніє-утворюючих одиниць на агарових плашках в 0, 7, 14 та 21 день. Мінімальну бактерицидну концентрацію визначали як мінімальну концентрацію, необхідну для досягнення 2-04 загибелі на 21 день.

ДМСО був використаний як позитивний контроль росту.

Мінімальну бактерицидну концентрацію (МВС) сполук наведено в таблиці 2.

Таблиця 2

Активність похідних тіосемикарбазону бензальдегідів МІС (мкМ),

ІСво (мкМ), ІСоо (мкМ) за анаеробних умов та мінімальна бактерицидна активність МВС (мкМ) 111171771111108117 17711111 261 77115200 17111586 77776 0072 | «19. | (й 5780 7278617 17111110и7. | 14 | 15 | 54 77778. 0015 | .--.,лиОМВ | 20 | а2 77712... | 0062 | 066 | 2 .-.ЮюЮюИивВеЮ | 530 о Рифампіцин.ї | 00013 | 0016. | (007

Метронідазол | 19 2 | (792 юКмКк | 200 2 М (

Дослідження цитотоксичності та внутрішньоклітинної активності

Цитотоксичність сполук щодо еукаріотичних клітин визначали на клітинній лінії моноцитів людини ТНР-1. Клітини диференціювали в макрофагоподібні клітини за використання 4- форбол-12-міристат-13-ацетату (ФМА) (бідта-АїІдгісти) та інкубували зі сполуками протягом трьох днів і визначали рівень виживання клітин. Значення ІСзо визначали як концентрацію, що призводить до зниження рівня виживання клітин на 50 95.

Сполуки розчиняли в ДМСО (Різйег) та робили серію розведень шляхом трикратного зменшення концентрації. Найвища концентрація тестованої сполуки становила 50 мкМ, де сполуки були розчинні в ДМСО в 10 мМ концентрації. Клітини ТНР-1 культивували в середовищі

ВАРМІ (АРМІ-1640 (Різнег), фетальна бичача сироватка, рН 7,2 (10 95) (Рівпеї)), 2 мМ СішамАХ (Рівпеї), 1 мМ пірувату натрію) та диференціювали в макрофагоподібні, використовуючи 80 нм

РМА протягом ночі при 37 "С, 5 95 СО».

Клітини культивували в плашках протягом 24 годин перед додаванням розчинів сполук (фінальна концентрація ДМСО становила 0,5 95). Як контроль використовували стауроспорин.

Потім клітини інкубували протягом З днів при 37 "С, 595 СО»; ріст вимірювали за допомогою

СеПТпег-СіоФ І итіпезсепі Сеї! Міарійу Авзау (Рготеда), що використовує АТФ як індикатор росту клітин. Відносні одиниці люмінесценції вимірювали, використовуючи плашковий рід ер

Віоїек бупегду 4. Дозозалежну криву генерували, використовуючи алгоритм Левенберга-

Марквардта і визначали концентрацію, при якій спостерігалося інгібування росту бактерій на 95 (значення ІСво) (таблиця 3).

Таблиця З

Цитотоксичність похідних тіосемикарбазону бензальдегідів (ІСво, мкМ) ни жити нишшшшй

Продовження таблиці З нин"нЕЮ ж нини нини шишшшш нІнИБШЕІЕНЦННШЕІИИІВВЛИРІИТВВВВ ВХ

Внутрішньоклітинну активність сполук визначали за використання клітин ТНР-1, інфікованих

М. Шшбегсціовів. Клітини диференціювали в макрофагоподібні клітини за використання ФМА та інфікували бактеріями. Інфіковані клітини інкубували зі сполуками протягом 72 годин.

Сполуки розчиняли в ДМСО (Різйєг) та робили серію розведень шляхом трикратного зменшення концентрації. Найвища концентрація тестованої сполуки становила 50 мкМ, де сполуки були розчинні в ДМСО в 10 мМ концентрації. Клітини ТНР-1 культивували в середовищі

ВАРМІ (АРМІ-1640 (Різнег), фетальна бичача сироватка, рН 7,2 (10 95) (Рівпеї)), 2 мМ СішамАХ (Рівпеї), 1 мМ пірувату натрію) та диференціювали в макрофагоподібні, використовуючи 80 нм

РМА протягом ночі при 37 "С, 5 95 СО».

Клітини. ТНР-1 інфікували люмінесцентним штамом НЗ7Н.М (що конститутивно експресує

ІохАВСОЕ) та інкубували протягом ночі при 37 "С, 5 95 СО». Інфіковані клітини відновлювали за допомогою розчину Ассшазе/ЕЮТА (Різйегб), двічі відмивали фосфатним буфером для видалення позаклітинних бактерій та висівали в плашки. До клітин додавали розчини сполук (кінцева концентрація ДМСО становила 0,5 95). Плашки інкубували протягом 72 год. при 37 "С, 595 СО». Як контроль використовували ізоніазид. Кількість живих бактеріальних клітин визначали за рівнем люмінесценції. Відносні одиниці люмінесценції визначали за використання плашкового рідера ВіоїеК Зупегду 2. Дозозалежну криву генерували, використовуючи алгоритм

Левенберга-Марквардта і визначали концентрації, при яких спостерігалося інгібування росту бактерій на 50 95 та на 90 95 (значення ІСво та ІСво, відповідно) (табл. 4).

Таблиця 4

Внутрішньоклітинна активність (ІСво, ІСвео (МКМ)) похідних тіосемикарбазону бензальдегідів нн нини пиши: пи нини пиши: ни нини пиши: пи

Дослідження антибактеріальної активності щодо резистентних штамів М. їибрегсиціовів

Активність сполук щодо п'яти резистентних штамів М. шШврегсціо5із визначали за аеробних умов. Використовували два ізоніазидрезистентні штами (ІМН-Н1 ії ІМН-Н2), два рифампіцинрезистентні штами (ВІР-А1 ї ВІБ-Н2) та флуорохінолонрезистентний штам (БО-А1).

Метод грунтується на вимірюванні росту бактерій в рідкому середовищі за показником оптичної густини. ІМН-А1 був отриманий із НЗ7Ву (мутація гена Каїсї (М1557)), ІМН-Н2 - штам АТСС35822.

ВІБ-В1 був отриманий із НЗ7Ву (мутація гена гроВ (55221)), ВІБ-Н2 - штам АТСС35828. ЕО-В1 був отриманий із НЗ7Ву (мутація гена дугВ (094М)).

Мінімальну інгібувальну концентрацію сполуки визначали шляхом вимірювання бактеріального росту через п'ять днів за присутності досліджуваної сполуки. Сполуки розчиняли в ДМСО (Різпйег) та робили серію розведень шляхом двократного зменшення концентрації.

Речовини розводили в середовищі 7НО-Тм-ОАЮОС у 96б-лункових плашках (фінальна концентрація ДМСО становила 2 95). Найвища концентрація сполуки становила 200 мкМ у випадку, якщо речовини були розчинні в ДМСО в 10 мМ концентрації. Кожна плашка містила декілька контролів (лише середовище/ДМСО, без бактеріальних клітин), відсутність росту - (100

МКМ рифампіцину (бідта-Аїагісн)) та максимальний ріст (лише ДМСО). Планшети інокулювали клітинами М. Шшрегсиціовів та інкубували протягом 5 днів: ріст вимірювали за оптичною щільністю (ОО5о0). Для вимірювання чисельного значення МІС будували 10-точкову дозозалежну криву як росту і підганяли до моделі Гомпертца з використанням СтарипРай Ріїзт 5. МІС розраховали з точки перегину кривої підігнаної до нижньої асимптоти (відсутній ріст бактерій).

Крім того, дозозалежні криві генерували, використовуючи алгоритм Левенберга-Марквардта і визначали концентрації, при яких спостерігали інгібування росту бактерій на 50 95 та на 90 95 (значення ІСзо та ІСео, відповідно).

Мінімальну інгібувальну концентрацію похідних бензальдегіду тіосемикарбазону (МІС, мкМ) щодо резистентних штамів М. їшбегсціовіє наведено в таблиці 5, ІСво (мкМ) - в таблиці 6, ІСво (мкМ) - в таблиці 7.

Таблиця 5

Мінімальна інгібувальна концентрація (МІС, мкМ) похідних тіосемикарбазону бензальдегідів відносно до резистентних штамів М. їШбБегсиовів 75 890 | 60 | 95 | 87 | 12 761 058 2 | 045 | 027 | 053 | 053 778 1 044 | 045 | 069 | 01 | 050 / 77798 ..1 014 | 0050 | 02 | 03 | о о ізоназид. | 5200 | 5200 | 032 | 066 | 064

Таблиця 6

ІСво похідних тіосемикарбазону бензальдегідів відносно до резистентних штамів М. їшШбвегсиіовів (МКМ) 21111110 1036 | 075 | 090 | 140 7777771717171776 1 ..юЮюЮюЮюЮюЮюЮю | 0089 | 0040 | 0057 | 0097 | ле 77711778 77777771 0076 | 0037 | 0084 | 0056 | 0082 171779... | 0024 | 0013 | 0024 | 0024 | 0031

Таблиця 7

ІСео похідних тіосемикарбазону бензальдегідів відносно до резистентних штамів М. їширегсцо5ів (мкМ) 17111117171711114 | 067 1 090 | 60 | 50 77777776. 077 | 020 | 030 | 084 | 074 7777778 77 053 | 020 | 072 | 051 | 057 7777779... | 015 | 0053 | 012 | 015 | 09 77771077. 096 | 039 | 068 | 26 | 10 15.77 43 | 053 | 096 | 6з | 55

Дослідження зв'язування з протеїнами плазми крові сполук 14 та 16.

Зв'язування з протеїнами плазми крові людини для кожної досліджуваної сполуки визначали за допомогою рівноважного діалізу. Сполуки тестували з використанням напівпроникної мембрани, яка розділяє два об'єми, що відповідно містять протеїн (плазма крові людини) і буфер. Молекули можуть проникати вільно, але білки не можуть проходити через мембрану.

Досліджувані сполуки змішували з плазмою крові людини і вносили до приладу. Після врівноваження при 37 "С з РВ5, досліджувану сполуку в кожному компартменті визначали кількісно за допомогою І С-М5/М5.

Сполуки додавали до плазми крові при фіксованій концентрації 5 мкМ. Суміш піддавали діалізу в приладі ВЕО (Раріа Едпійїбгішт Оіаїузів, Пірс) проти РВ5 та інкубували на орбітальному шейкері протягом 4 год. при 37 "С. Збирали аліквоти плазми і РВ5; однаковий об'єм РВ5 додавали до зразків плазми крові і однаковий об'єм плазми додавали до зразків РВ5. Три об'єми метанолу (містить внутрішній стандарт зв'язування - пропранолол (бідта)) додавали для осадження білків і вивільнення сполуки. Кожну сполуку тестували два рази. Зразки центрифугували, супернатант відновлювали і аналізували за допомогою І С-М5/М5. Кожний зразок включав варфарин (бідта) як високозв'язувальний контроль.

Відсоток зв'язування з білками плазми крові для сполук 14 та 16 наведено в таблиці 8.

Таблиця 8

Зв'язування з протеїнами плазми крові сполук 14 та 16, 95

Дослідження проникності сполук 14 та 16 через моношар клітин Сасо-2

Проникність сполук 14 та 16 оцінювали з використанням моношару клітин Сасо-2.

Проникність сполук визначали в обох напрямках. Для напрямку проникності А-Б, досліджувані сполуки додавали до апікальної сторони моношару клітин Сасо-2 і визначали транспорт сполуки до базальної сторони. Для напрямку проникності Б-А, досліджувані сполуки додавали до базальної сторони моношару клітин Сасо-2 і визначали транспорт сполуки до апікальної сторони. Дослідження проводили протягом 2 годин два рази. Кількість сполуки, наявної в кожному компартменті визначали кількісно за допомогою І С-М5/М5.

Сасо-2 клітини трипсинізували, ресуспендували в середовищі і наносили на 96-лункову плашку Мійроге 96-жшеі! Сасо-2 ріаїє. Клітини росли та диференціювалися протягом трьох тижнів. Додавання поживних речовин проводили з інтервалом у два дні. Для дослідження проникності від апікальної до базолатеральної (А-Б) сторони, сполуки додавали до апікальної (А) сторони і проникнення сполуки визначали на базолатеральній (Б) стороні; для дослідження проникності від базолатеральної до апікальної (Б--А) сторони, сполуки додавали до базолатеральної (Б) сторони і проникнення сполуки визначали на апікальній (А) стороні. У кожному експерименті як контроль використовували атенолол (МР Віотедіса!в5) (низька проникність), пропранолол (бідта) (висока проникність) та талінолол (ТАС) (Р-ар- залежний транспорт)

Якісний контроль. Сторона А містила 100 мкМ барвника Іисіїєг уєПомж (бідта) у транспортному буфері із рН 6,5 (1,98 г/л глюкози у 10 мМ НЕРЕЗ (бідта), 1Х Напк'5 Ваіапсей зай Боішіоп (І оплга)), а В сторона містила транспортний буфер із рН 7,4 (1,98 г/л глюкози у 10

ММ НЕРЕЗ (5ідта), їх НапК5 Ваїіапсейд зЗаїї ЗоіІшіоп (І опга)). Сасо-2 клітини інкубували з цими буферами 1 або 2 години, буфер приймальної сторони аналізували за допомогою ІС-М5/М5.

Аліквоти клітинних буферів аналізували за рівнем флуоресценції для визначення транспорту непроникного барвника І исітег увом/ з метою підтвердження того, що моношар клітин Сасо-2 правильно сформувався.

В таблиці 9 дані представлені як проникність сполук Рарр-(аСуаю /СоА) асуа - рівень проникнення

Со - початкова концентрація сполуки

А - площа моношару

Таблиця 9

Проникнення через моношар клітин Сасо-2 сполук 14 та 16 дослідження (год.) см/с) см/с) 214711111111117111111375. | 247 |1рюрюи 066 г щ

Дослідження інгібувальної активності сполук 14 та 16 до шести ізоформ цитохрому Р.450.

Сполуки 14 та 16 тестували на здатність інгібувати шість ізоформ ензиму Р.450-СУР2Вб,

СУР2СОСВ8, СМР2ОС9, СУР2С19, СУР2Об ії СУРЗАЯ4. Для кожного аналізу мікросоми печінки людини інкубували із специфічним субстратом кожної ізоформи СуУР за присутності сполуки.

Формування метаболітів для кожної ізоформи визначали кількісно за допомогою І С-М5Б/М5 як ступінь активності ферменту. Розраховували ферментативну активність і визначали ІСбво.

Сполуки розчиняли в суміші ацетонітрил:ДМСО (9:1). Кінцевий вміст ДМСО в реакційній суміші був однаковий у всіх розчинах, які використовували в аналізі, і становив «0,2 95.

Експерименти проводили з повтором. Сполуки інкубували з мікросомами печінки людини в буферному розчині, що містив 2 мМ НАДФН (5ідта) і субстрату в кінцевому об'ємі 200 мкл.

Реакційні суміші інкубували при 37 "С протягом оптимального часу (10-60 хв), і зупиняли додаванням метанолу, що містив внутрішній стандарт (пропранолол) для аналітичного визначення. Зразки інкубували при 4 "С протягом 10 хв і центрифугували при 4 "С протягом 10 хв. Супернатант видаляли і метаболіти субстрату аналізували за допомогою ІС-М5/М5.

Зниження кількості метаболіту в порівнянні з контролем використовували для розрахунку значення ІСво (значення концентрації, яка призводить до інгібування на 50 95).

Таблиця 10

Інгібування ізоформ цитохрому сполуками 14 та 16, ІСзо (МКМ) 16

Дослідження мікросомної стабільності сполук 14 та 16

Сполуки тестували на мікросомну стабільність за використання пулу мікросом 59 печінки людини (СеїЇвів). Мікросоми інкубували з досліджуваною сполукою при 37 "С за присутності кофактора НАДФН (5бідта), реакцію зупиняли, супернатант відновлювали і сполуки кількісно визначали за допомою І С-М5/М5. Фіксовані концентрації тестованої сполуки визначали два рази при 5 часових точках, а стабільність сполуки виражали як функцію часу.

Сполуки тестували із мікросомами печінки людини при 37 "С з повтором. Кожний зразок містив 0.3 мг/мл мікросомного протеїну людини у буферному розчині (2 мМ НАДФН, З мМ Масіг (бБідта), 100 мМ натрій фосфатний буфер; рН 7,4). Зразки відділяли через 0, 5, 15, 30, і 45

Зо хвилин, перемішували з рівним об'ємом розчину (метанол), що зупиняє реакцію (містить пропранолол (бідта) як внутрішній стандарт), та інкубували х10 хвилин при -20 "С. Вносили додатковий об'єм води, центрифугували для відділення преципітованого протеїну і супернатант аналізували за допомогою |С-М5/М5 для кількісного визначення вихідної сполуки, що залишилася. Проводили контрольну реакцію без НАДФН (контрольний буфер) для того щоб визначити деградацію сполук, що не залежить від НАДФН. Верапаміл (бідта) та декстрометофарм (Зідта) вносили як контрольні сполуки.

Аналіз даних. Дані конвертували у до сполуки, що залишилася в порівнянні з нульовою точкою часу. Дані були встановлені на моделі розпаду першого порядку для визначення часу піврозпаду сполуки. Характеристичний кліренс (Сі) розраховували, виходячи з часу піврозпаду та концентрації протеїну:

Сіа-Іп(2,4(Т1» |мікросомний протеїн|)

Т1і2-0.693/-К

СІ пехарактеристичний кліренс; Т1/2-час піврозпаду; К-зсув

Дані стосовно мікросомальної стабільності для сполук 14 та 16 наведено в таблиці 11.

Таблиця 11

Мікросомна стабільність іп мйго сполук 14 та 16, час напіврозпаду (Т1/2 (хв)) . НАДФН-залежний час | НАДФН-незалежний час

Дослідження цитотоксичності сполук 14 та 16 щодо еукаріотичних клітин Нерсг

Цитотоксичність сполук щодо еукаріотичних клітин визначали за використання клітин печінки людини Нерс2 (АТСС). Клітини Нераг інкубували зі сполуками протягом 72 годин і визначали життєздатність клітин. ІСво встановлювали як концентрацію сполуки, що призводить до зниження виживання клітин на 50 95 через 72 години інкубації.

Цитотоксичність сполук визначали шляхом вимірювання життєздатності клітин Нерсг через

З дні інкубації в присутності тестованих речовин. Сполуки серійно розчиняли в ДМСО. Найвища концентрація сполуки становила 100 мкМ, де сполуки були розчинні в ДМСО при 10 мМ концентрації. Клітини Нерс2 культивували в середовищі ОМЕМ (середовище ОМЕМ з високим рівнем глюкози (Іпуйтодеп), 1Х розчин пеніциліну-стрептоміцину (Різпег), 2 мМ Соптіпду Сішодго зирріетепі (Різпег), 1 мМ пірувату натрію (РізНег), фетальна бичача сироватка (10 ос) (РівНег)), висівали в 384 - лункові плашки для аналізу, що містили сполуки та інкубували протягом 24 год. при 37 "С, 5 95 СО». Після додавання сполук клітини інкубували ще протягом 72 годин. Кінцева концентрація ДМСО складала 1 95. Життєздатність клітин визначали за допомогою СейПТіетг-

СіоФ І итіпезсепі Сеї! Міарійу Авззау (Рготеда) вимірюючи відносні одиниці люмінесценції (ВШ). Дозо-залежну криву відгуку будували з використанням алгоритму Левенберга-

Марквардта. ІСво визначали як концентрацію сполуки, що призводить до зниження життєздатності клітин на 5095. Як контроль використовували стауроспорин (Запіа Стги?

Віоїтесппоіоду).

Сполука 14 виявилася не цитотоксичною (ІСво 5100 мкМ), сполука 16 мала ІСво-41 мкМ, тоді як значення ІСво стауроспорину становить 0,045 мкМ.

Таким чином, похідні тіосемикарбазону бензальдегідів проявляють високу антитуберкульозну активність щодо патогенного штаму Мусобасієтішт іШбрегсціовів НЗУВм за аеробних, анаеробних умов та мають високу внутрішньоклітинну активність на

Зо макрофагоподібних клітинах. Крім того, сполуки цього класу є ефективними стосовно ізоніазід-, рифампіцин- та флуорохінолінрезистентних штамів мікобактерій. Це дозволяє використовувати їх у фармацевтиці як препарати для лікування мультирезистентних форм туберкульозу.

Джерело інформації: 1. Міпітаї! іппірйогу сопсепігайопв5 ої ібвопіагід, птатріп, еєпатршиої, апа зігеріотусіп адаїіпві

Мусобасіейцт іШбегсиовзів в5ігаіп5 ізоїаїей Беїоге ігеайтепі ої раїйєпів іп Таїмап. / У. 5цОо, С.

Снапа, Т. "п, І. Неїїеїв. // Везрігайогу Різєазе. - 1988. - Мої. 138. - Р. 999-1001. 2. Мем апіі--Ширегсціозіз адепі5 атопдві Кпом/п агавз / (К. І оцдпеєда, 0. Тауїють, 5. О5ротер еї а1.1. // Тирегсціовів (Еаіпб.). - 2009. - Мої. 89. - Р. 364-370.

З. Оаїїсні Рпнаппасецііса! Со., ЦЯ. МО Раїепі УУО2006123767А1, 2006 4. Ваграспуп М. Охагоїідіпопе 5ігисіиге-асіїмну геІайоп5Пірв Ієадіпд о Іїпегоїїа / М. Вагбаспуп,

С. Рога. // Апдем/ Спет Іпії Ей Епо). - 2003. - Мої. 42. - Р. 2010-2023. 5. МІН, РаїепЕ УУО 2003/096989, 2003 6. Удапезеп Ріаптасеціїса, Раїепі УУО 2004/011436, 2004 7. ОеІатапіїй апа Бедадиййте тгезівїапсе іп Мусобасієгішт Шбрегсціов5іє апсевзіга! Веїпа депоїуре сайзіпа ХОВ-ТВ іп а їїбейап гегидеє / ІН. Ноїтапп, Т. Копі, 5. Ноїтапп-ТНів! єї а//). //

Ат. 9. Везріг. Сиї. Саге Меа. - 2016. - Мої. 193. - Р. 337-340. 8. Тпозетісагбагопе5, 5етісагра?опе5, апйпіосагбагатє5з апа Нуагагіде/плудгагопев: Апії-

Мусобасієгішт їшрегсціовів асіїмнпу апа суїююхісіїу / (Е. Рамап, Р. да 5 Маїа, 5. І еїїе єї а!.|. // Єиг. у.

Мед. Спет. - 2010. - Мої. 45. - Р. 1898-1905. 9. Бупійезіз апа апітусорасієгіаї асімйу ої МА-КЕ)-(топозирзійшеа-репгуїїдепе)1-2- ругагіпесагропуагагіде дегімайімез / ГГ. Мегдага, С. І іта, М. Непіідчнез еї а/!.). // Єшг. ). Мед. Спет. - 2009. - Мої. 44. - Р. 4954-4959.

10. Бупіневзів ої поме! 4-пігорутоіе-разед зетісагтбагіде апа іозетісаграгіде Нубгіав мій апіійтісторіа! апа апіі-тирегсціаг асіїміту / (В. Напе, 5. Марнаде, Р. Ваподаїйоге еї а!.|. // Віоогуд. Мед.

Спет. І ей. - 2014. - Мої. 24. - Р. 3079-3083. 11. Ваїа 5. Моме! 1-(4-вирзійшей Бепгуїїдепе)-4-(1-(вирзійшеай теїНу1ї)-2,3-діохоіпаоіїп-5- у)зетісатбагіде дегімайїмевз ог изе адаінвії Мусобасієтішт їшбрегсціовзів НЗУВм (АТОСС 27294) апа

МОВ-ТВ 5ігаїп / 5. Найда, С. РгаКавни. // Агой. Рнагт. Вев. - 2013. - Мої. 36. - Р. 411-422.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Низькомолекулярні органічні сполуки з антитуберкульозною дією на основі тіосемикарбазону бензальдегідів загальної формули: А 5 Н в хи Мн, М й З

   З в. Кк; де В: - водень; фтор; хлор; гідроксильна група; пентоксигрупа; Вг - водень; хлор; етоксигрупа; пропоксигрупа; нітрогрупа; Вз - водень; бром; нітрогрупа; диметиламін; гідроксильна група; бензилокси; 4-хлорбензилокси; етоксигрупа; пропоксигрупа; 4-бромбензилокси; пентоксигрупа; 4-метилбензилокси; /3- метилбензилокси; 2-фенілетокси; Ва - водень; етоксигрупа; бром; нітрогрупа; метоксигрупа; ізопропоксигрупа; В5 - водень; хлор; метоксигрупа; хлор, гідроксильна група.