UA114301C2 - Спосіб визначення зиготності гена fad3 в канолі - Google Patents

Abstract

Винахід належить до способу визначення зиготності рослини каноли, що містить ген fad-3c за допомогою ПЛР-аналізів за кінцевою точкою для детектування гена fad-3с в канолі. Винахід також належить до набору для визначення зиготності рослини або насіння каноли.

Description

Перехресне посилання на споріднену заявку

За даною заявкою запитується пріоритет попередньої заявки США Мо 61/550170, поданої 21 жовтня 2011 р., яка включена в даний опис за допомогою посилання у всій повноті.

Рівень техніки розкриття

Рід Вгаззіса включає канолу, одну з найбільш важливих світових олійних культур і важливу олійну культуру, що вирощується в помірних широтах. Канолу традиційно характеризують як

Вгаззіса париз Г. (вид, виведений внаслідок міжвидового схрещування Вгаззіса гара і Вгаззіса оІегасеа), в якому ерукова кислота і глюкозинолати були усунені або значно зменшені за допомогою звичайної селекції. Велика частина олії каноли має форму рослинних олій, що виготовляються для споживання людиною. Існує також зростаючий ринок використання олії каноли в промислових застосуваннях.

Рід Вгаззіса складається з трьох диплоїдних видів, кожний з яких має унікальний геном, які означують як геном А, геном В або геном С. Рослини Вгазввзіса гара мають диплоїдний геном А.

Рослини Вгаззіса підга мають диплоїдний геном В. Рослини Вгаз5зіса оІегасеа мають диплоїдний геном С. Гібриди даних видів можуть бути отримані за допомогою схрещування між двома диплоїдними видами. Канола є амфідиплоїдним видом, який, як вважають, походить від гібридизації Вгах5іса оІегасеа, що має диплоїдний геном С, і Вгаз5іса гара, що має диплоїдний геном А. Цитогенетичні дослідження показали, що геноми АА і СС демонструють такий ступінь споріднення, що є частково гомологічними один до одного, і вважають, що вони пішли від геному загального предка (Ргаказпй апа Ніпайа, 1980). Хоча технічно їх класифікують як диплоїди, геноми обох видів-попередників містять велику кількість ділянок, які дублюють одна одну (5опо еї аї., 1991). Генетичний аналіз показав, що геном АА Вгаззіса гара вніс десять хромосом у Вгаззіса пари», тоді як Вгаззіса оіегасеа внесла дев'ять хромосом зі свого геному

СС як материнського донора (50п9 еї а!., 1992).

Якість харчової і технічної олії, що отримується з конкретного сорту насіння каноли, визначають за жирними кислотами, які складають його, оскільки тип і рівень ненасиченості жирних кислот має наслідки як для харчових, так і для технічних застосувань. Звичайна олія каноли містить приблизно 6095 олеїнової кислоти (С18:1), 2095 лінолевої кислоти (С18:2) і 1095 ліноленової кислоти (18:3). Кількість поліненасиченої ліноленової кислоти, типова для звичайної

Зо каноли, небажана, оскільки олія легко зазнає окислення, причому на швидкість окислення впливають декілька чинників, включаючи присутність кисню, вплив світла і тепла, і присутність власних або доданих антиоксидантів і прооксидантів в олії. Окислення приводить до неприємних присмаків і згірклого смаку внаслідок повторного смаження (індуковане окислення) або зберігання протягом тривалого періоду (автоокислення). Окислення також може змінювати мастильні і в'язкі властивості олії каноли.

Профілі олії каноли, які демонструють знижений рівень поліненасичених жирних кислот і підвищений рівень мононенасиченої олеїнової кислоти порівняно зі звичайним оліям каноли, пов'язані з більш високою стійкістю до окислення. Схильність окремих жирних кислот до окислення залежить від ступеня їх ненасиченості. Таким чином, швидкість окислення ліноленової кислоти, яка має три подвійні зв'язки вуглець-вуглець, в 25 раз вища, ніж олеїнової кислоти, яка має тільки один подвійний зв'язок вуглець-вуглець, і в 2 рази вища, ніж лінолевої кислоти, яка має дві подвійні зв'язки вуглець-вуглець. Лінолева і ліноленова кислоти також мають найбільший вплив на запах і аромат, оскільки вони легко утворюють гідропероксиди.

Олія з високим вмістом олеїнової кислоти (вміст олеїнової кислоти »-70965) менш схильна до окислення під час зберігання, смаження і рафінування, і може нагріватися до більш високої температури без диміння, що робить її більш придатною як олії для приготування їжі.

Якість олії каноли визначають за жирними кислотами, які складають Її, такими, як олеїнова кислота (С18:1), лінолева кислота (С18:2) і ліноленова кислота (С18:3). Більшість культиварів каноли звичайно дають олію з приблизно 55-6595 олеїнової кислоти і 8-1295 ліноленової кислоти. Високі концентрації ліноленової кислоти приводять до нестабільності олії і нетипового запаху, тоді високий рівень олеїнової кислоти підвищує стійкість до окислення і харчову цінність олії. Отже, розробка культиварів каноли з підвищеним вмістом олеїнової кислоти і зниженим вмістом ліноленової кислоти дуже бажана для якості олії каноли.

Було ідентифіковано два локуси і визначена їх геномна локалізація з культивара каноли, який має підвищений вміст олеїнової кислоти і знижений вміст ліноленової кислоти. Один локус має значний вплив, і другий локус має незначний вплив на виробництво підвищеного вмісту олеїнової кислоти і зниженого вмісту лінолевої кислоти. Визначено, що основним локусом для високого вмісту олеїнової кислоти (С18:1) є ген десатурази-2 жирних кислот (Тад-2), і він розташований на групі зчеплення М5. Другий локус розташований на групі зчеплення МІ. бо Однією з основних локусів кількісних ознак (ОТ) для ліноленової кислоти (С18:3) є ген десатурази-3 жирних кислот геному С (Тад-3с), і він розташований на групі зчеплення М14.

Другий основний ОТІ. розташовується на групі зчеплення М4 і являє собою ген десатурази-3 жирних кислот геному А (Тад-За). Геномні послідовності генів Тад-2 і Таа-3с ампліфікували і секвенували як з індукованого етилметансульфонатом (ЕМС) мутанта, так і з культивара каноли дикого типу. Порівняння послідовностей алелей мутанта і дикого типу генів Тад-2 і Таа-3зс показало наявність однонуклеотидного поліморфізму (ЗМР) в генах рослин, які мутували під дією ЕМО. На основі відмінностей послідовностей між алелями мутанта і дикого типу було розроблено два ЗМР-маркери, які відповідають мутаціям генів Таа-2 і таа-Зс (Ни евї а!., 2006).

Сучасні способи виробництва насіння гібриду Еі Вгаззіса мають обмеження відносно вартості і чистоти насіння. Звичайно для даних способів потрібні стабільні, сибс-несумісні і самонесумісні, близькі до гомозиготних батьківські лінії розведення, які батьківські лінії розведення доступні тільки після повторного самоопилення для створення інбредних ліній. Крім того, інбридинг для розвитку і збереження батьківських ліній здійснюється за допомогою трудомістких методів, таких, як запилення бутонів, оскільки системи виробництва гібридного насіння Вгаззіса, засновані на самонесумісних ознаках, повинні використовувати суворо самонесумісні рослини. Умови навколишнього середовища під час процесу розведення, такі, як температура і вологість, звичайно впливають на ліпідний метаболізм рослин, таким чином також впливаючи на вміст жирних кислот (Наглмоо4, 1999). Мінливість навколишнього середовища, отже, робить фенотипову селекцію рослин менш надійною. Юепд і Зсагій (1998) виявили, що підвищення температури після цвітіння значно знижує рівень С18:3 і підвищує

С18:1. Аналогічні результати наводилися в інших дослідженнях (Уеппапо5 апа Сооаіп, 1965;

Сапміп, 1965).

Селекція сортів з низьким вмістом ліноленової кислоти є особливо складною, оскільки вміст

С18:3 є мультигенною ознакою і успадковується рецесивним чином з відносно низькою успадковуваністю. Генетичний аналіз популяції, яка отримується від схрещування між "5(еїПаг" (що має низький вміст С18:3 (3905)) і "Огаккаг" (що має "звичайний" рівень С18:3 (9-10925)), показало, що ознака низького вмісту С18:3 керується двома основними локусами з адитивною дією, які означуються 1 1 і 12 (Чошигагеп еї а!., 19960). Було виявлено, що ці два основні локуси, які керують вмістом С18:3, відповідають двом генам їай-3 (десатурази-3 жирних кислот); один

Зо розташований в геномі А (що походить від Вгаззіса гара), а інший в геномі С (що походить від

Вгазвіса оІесега) (дошигагеп еї а!., 1996; Ва!теї єї а!., 1999).

Ознаки, які безперервно змінюються через генетичні (адитивні, домінантні і епістатичні) і такі, що стосуються навколишнього середовища, фактори, звичайно називають "кількісними ознаками". Кількісні ознаки можна відрізняти від "якісних" або "дискретних" ознак на основі двох факторів: впливу навколишнього середовища на експресію генів, який здійснює безперервний розподіл фенотипів; і складної схеми розщеплення, яка виробляється мультигенним успадкуванням. Ідентифікація однієї або декількох ділянок геному, пов'язаних з експресією кількісної ознаки, привело до відкриття локусів кількісних ознак ("ОТ"). Тпоптапп еї аї., (1996) локалізували два ОТ, які пояснювали 6095 мінливості вмісту ліноленової кислоти, тоді як зЗотег5 еї аї.,, (1998) ідентифікували три ОТ, які разом пояснювали 5195 фенотипової мінливості вмісту С18:3. Спеп і Вемегзаогі (1990) також описали адитивну модель трьох локусів.

КисКег і Корреіеп (1996) указали, що в стадії десатурації з найбільшою імовірністю беруть участь декілька мінорних генів.

Успадковуваність вмісту С18:3 була визначена такою, що дорівнює 26-5995 (Копага апа

Тпотавз, 1975) (де мінливість успадковуваності є функцією генетики, а не факторів навколишнього середовища). Складність успадкування ліноленової кислоти може пояснюватися тим фактом, що ліноленова кислота може синтезуватися як десатурацією С18:2, так і подовженням С16:3 (Тпотрзоп, 1983).

На відміну від ліноленової кислоти успадкування олеїнової кислоти є менш складним, і успадковуваність олеїнової кислоти відносно висока. Повідомлялося, що високий вміст олеїнової кислоти контролюється основним локусом, який називається ген Тай-2 (десатурази жирних кислот 2), який кодує фермент, що відповідає за десатурацію олеїнової кислоти до лінолевої кислоти (С18:2) (Тапицапраа сеї аїЇ., 1998; 5спієтой еї аїЇ., 2001). Всі копії функціонального гена їай-2, про які було повідомлено, і які були локалізовані до теперішнього часу, розташовані на групі зчеплення М5, що походить з геному А (Зспейег єї аї., 1997;

Зеспієгної! єї аї!., 2000). Спеп і Вемегздогї (1990) повідомляли, що накопичення олеїнової кислоти контролюється двома генетичними системами розщеплення, причому одна діє на подовження ланцюга, а інша використовує десатурацію. Успадковуваність вмісту С18:1 визначали такою, що дорівнює від 5395 до 7895 (Копага апа Тпотавз 1975) і 9495 (Зспіетпо апа ВесКег, 1999)

відповідно. Завдяки більш високій успадковуваності експресія вмісту С18:1 менш схильна до впливу навколишнього середовища і відносно стабільна (Зспіетоїї апа ВескКег, 1999).

У зародковій плазмі каноли Мехега "М від 1 до 2 генів, як виявлено, контролюють вміст С18:1, і щонайменше З гени беруть участь в експресії С18:3 (Мехега"" є товарним знаком Юом/

АдгозЗсіепсе5, ІЇ/С). У потомстві після розщеплення розподіл вмісту С18:3 в насінні є безперервним, що робить складною ідентифікацію генотипових класів із бажаним рівнем С18:3.

Крім того, низька кореляція вмісту жирних кислот між рослинами, які вирощуються в оранжереї (СН) і в полі, що робить ще більш складним надійну селекцію рослин із бажаним рівнем С18:3 в ан.

Для детектування наявності певного гена в зразку тканини рослини можна використовувати різні способи. Одним прикладом є метод піросеквенування, описаний М/іпде (Іппоу. Ріапта.

Теси. 00:18-24, 2000). У даному способі конструюють олігонуклеотид, який перекриває вставлену послідовність ДНК і геномну ДНК, що примикає до неї. Олігонуклеотид піддають гібридизації з одноланцюжковим продуктом ПЛР ("ампліконом") від ділянки, що становить інтерес (тобто один праймер у вставленій послідовності і один у фланкуючій геномній послідовності), і інкубують у присутності ДНК-полімерази, АТФ-сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'-фосфосульфату і люцеферину. ОМТР додають окремо, і їх включення приводить до світлового сигналу, який вимірюють. Світловий сигнал вказує на наявність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності за рахунок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ. (Даний метод звичайно застосовують для початкового секвенування, не для детектування конкретного гена, коли він відомий).

Флуоресцентна поляризація є іншим способом, який можна використовувати для детектування амплікону. При проходженні даного способу олігонуклеотид конструюють так, щоб перекривати з'єднання геномної фланкуючої і вставленої ДНК. Олігонуклеотид піддають гіоридизації з одноланцюжковим продуктом ПЛР від ділянки, що становить інтерес (один праймер у вставленій ДНК і один у фланкуючій геномній послідовності ДНК), і інкубують у присутності ДНК-полімерази і флуоресцентно-міченого ЗФ0МТР. Подовження на одну основу приводить до включення ааМТР. Включення можна вимірювати як зміну поляризації із застосуванням флуориметра. Зміна поляризації вказує на наявність трансгенної

Зо вставки/фланкуючої послідовності за рахунок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу.

Описане застосування молекулярних маяків при визначенні послідовності. Стисло, молекулярні маяки містять олігонуклеотидний зонд ЕКЕТ (резонансне перенесення енергії флуоресценції), який можна конструювати так, щоб ЕКЕТ-зонд перекривав з'єднання фланкуючої геномної ДНК і ДНК вставки. Унікальна структура ЕКЕТ-зонда приводить до того, що він має вторинну структуру, яка утримує флуоресцентний і гасильний фрагменти в безпосередній близькості. ЕКЕТ-зонд і праймери ПЛР (один праймер у послідовності ДНК вставки і один у фланкуючій геномній послідовності) проходять цикл у присутності термостабільної полімерази і аМТР. Після успішної ПЛР-ампліфікації гібридизація ЕКЕТ-зонда з мішеневою послідовністю приводить до зникнення вторинної структури зонда і просторового розділення флуоресцентного і гасильного фрагментів. Флуоресцентний сигнал вказує на наявність фланкуючої геномної послідовності/послідовності трансгенної вставки за рахунок успішної ампліфікації і гібридизації.

Аналіз гідролізу зондів, також відомий як ТадМап? ПЛР (ТадМапФ є зареєстрованим торговим знаком Коспе Моїесшіаг Зузіет»5, Іпс.), пропонує спосіб детектування і кількісного визначення наявності послідовності ДНК. Стисло, ТадМапФ ПЛР використовує олігонуклеотидний ЕКЕТ-зонд, який сконструйований так, щоб частина олігомеру була розташована в трансгені, а інша частина олігомеру - у фланкуючій геномній послідовності для детектування за подією. ЕКЕТ-зонд і праймери ПЛР (один праймер у послідовності ДНК вставки і один у фланкуючій геномній послідовності) проходять цикл в присутності термостабільної полімерази і аМмТР. Гібридизація ЕКЕТ-зонда і подальше розщеплення під час стадії ПЛР- ампліфікації внаслідок 5'-екзонуклеазної активності Тад-полімерази приводить до відщеплення і вивільнення флуоресцентного фрагмента від гасильного фрагмента на ЕКЕТ-зонді.

Флуоресцентний сигнал вказує на наявність фланкуючої послідовності/послідовності трансгенної вставки за рахунок успішної гібридизації і ампліфікації.

Для специфічної до послідовності ідентифікації ДНК також використовують молекулярні маркери. Селекція за молекулярними маркерами заснована на генотипах і, отже, не залежить від впливу навколишнього середовища. Молекулярні маркери допомагають зменшити проблему ненадійності селекції рослини в оранжереї, яка виникає через низьку кореляцію вмісту жирних 60 кислот між рослинами, що вирощуються в оранжереї, і рослинами, що вирощуються в полі.

Важливо зазначити, що молекулярні маркери, тісно пов'язані з генами, які контролюють вміст

С18:1 ї С18:3, можуть полегшувати ранню селекцію рослин, що несуть гени для високого вмісту

С18:1 ії низького вмісту С18:3. Маркерзалежна селекція на ранній стадії може сприяти збереженню простору в оранжереї, підвищує ефективність використання оранжереї і зменшує трудомісткість розведення в полі.

У більш загальному значенні переваги молекулярних маркерів над морфологічними маркерами полягають в тому, що: молекулярні маркери можуть бути високо поліморфними, тоді як морфологічні маркери суворо залежать від фенотипу; морфологічні маркери можуть втручатися в підрахунок деяких кількісних фенотипів, тоді як молекулярні маркери демонструють взаємозв'язок між генотипом і фенотипом 1:1 (тим самим роблячи можливим однозначний підрахунок всіх можливих генотипів для заданого локусу); і епістатичні взаємодії сприяють обмеженню кількості морфологічних маркерів, придатних для популяції, тоді як молекулярні маркери не взаємодіють епістатично.

Було визначено, що різні типи молекулярних маркерів, такі, як маркери КАРО (випадково ампліфікована поліморфна ДНК) (Таппиапраа єї аї!., 1995; Ни еї а!., 1995; На)сап есеї аї., 1999;

УЧоцгагеп еї а. 1996), маркери КЕР (поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів) (ТПогптаптп еї аї., 1996) і маркери ЗСАК (ампліфікована ділянка з відомою послідовністю) (Ни еї а!., 1999), пов'язані з низьким рівнем С18:3 в Вгаз5іса пари5. Також були визначені молекулярні маркери для високого вмісту С18:1. Було визначено, що маркер КАРО пов'язаний з ОТ, що впливає на концентрацію олеїнової кислоти у весняній ріпі олійній (В. гара 55р. Оіеїйега), і пізніше він був перетворений в маркер 5САК (Тапппапраа еї аї., 1996). 5спіетої еї аї., (2000) ідентифікували три маркери АРГР (поліморфізм довжини ампліфікованих фрагментів), пов'язаних з мутацією високого вмісту олеїнової кислоти в озимому олійному рапсі (В. париз ГІ).

Таппиапраа еї аї., (1998) розробили алель-специфічний маркер ПЛР для олеїнової кислоти за допомогою порівняння дикого типу і алеля високого вмісту олеїнової кислоти локусу гена їай-2 у весняній ріпі олійній (В. гара 55р. оіІейега). Однак, більшість цих маркерів є низькопродуктивними маркерами, такими, як КАРО, АРІР ї КРГР, і не підходять для масштабного скринінгу за допомогою автоматики.

Коротка суть винаходу

Зо Розкриття, що розглядається, частково стосується ТадМапФ ПЛР-аналізів за кінцевою точкою для детектування гена Тад-3с у канолі і високопродуктивного аналізу його зиготності.

Розкриття, що розглядається, крім того, стосується частково застосування гена Тад-3с дикого типу в канолі як еталона для застосування у визначенні зиготності. Можна використовувати ті або інші відповідні процедури для того, щоб однозначно встановлювати зиготність і сорт ліній каноли, які містять ген, що розглядається.

Розкриття, що розглядається, також пропонує відповідні набори для визначення зиготності і сорту за зразком (каноли, наприклад).

Таким чином, варіант здійснення розкриття, що розглядається, стосується ТадМапФ ПЛР, гнучкої платформи для високопродуктивного аналізу зиготності і схрещування. Використання способу застосування ТадМапФ ПЛР за кінцевою точкою, що представляється даним розкриттям, пропонує надійний, точний і високопродуктивний спосіб застосування для аналізу зиготності Таа-3с і схрещування у каноли.

Короткий опис фігур

Фігура 1. являє собою ділянку послідовності гена Таа-3с (5ЕБЕО І МО1), що ілюструє положення мутації Тад-3с, ідентифікованої Ни еї аї., (2006) (стрілка). Інтрон 6 надрукований більш світлим текстом, а другий поліморфізм відмічений за допомогою зірочки.

Фігура 2. являє собою приклад результатів аналізу зиготності (каноли), що демонструє три генотипи їад-З3с після ТадМапФ-аналізу за кінцевою точкою (результати отримували із застосуванням програмного забезпечення 505 2.4, доступного від Арріїей Віозузієт5, Роіег

Спу, СА, США).

Короткий опис послідовностей

ЗЕО ІЮ МО:1 пропонує ділянку послідовності гена Тад-З3с, що ілюструє положення мутації

Тад-3с.

ЗЕО ІЮ МО:2 пропонує прямий праймер Ю-СІ-БАОЗОС-Е (який зв'язується з фланкуючою геномною послідовністю).

ЗБО ОО МОЗ пропонує зворотний праймер О0-СІ-РАОЗО-К2 (який зв'язується з послідовністю вставки).

ЗЕО ІЮО МО:4 пропонує зонд Ю-СЇ-РАЮОЗОС-РАМ для переважного зв'язування гена Тад-Зс, який мутував, з однонуклеотидним поліморфізмом о-»А. 60 ЗЕО ІЮ МО:5 пропонує зонд Ю-СІ -БАЮЗО-МІС для детектування гена Тад-3с дикого типу.

Докладний опис розкриття

Розкриття, що розглядається, частково стосується ТадМапФ ПЛР-аналізів за кінцевою точкою для детектування гена Тад-3с в канолі і високопродуктивного аналізу його зиготності.

Розкриття, що розглядається, крім того, стосується часткового застосування гена Тад-3с дикого типу в канолі як еталона для застосування у визначенні зиготності. Можна використовувати ті або інші відповідні процедури, для того, щоб однозначно встановлювати зиготність і сорт ліній каноли, які містять ген, що розглядається. Розкриття, що розглядається, також пропонує відповідні набори для визначення зиготності і сорту за зразком (каноли, наприклад). Таким чином, варіант здійснення розкриття, що розглядається, стосується ТадМапт ПЛР, гнучкої платформи для високопродуктивного аналізу зиготності і схрещування. Використання способу застосування ТадМапФ ПЛР за кінцевою точкою, що представляється даним розкриттям, пропонує надійний, точний і високопродуктивний спосіб застосування для аналізу зиготності тай-

Зс і схрещування у каноли.

Були розроблені нові аналізи винаходу, що розглядається, частково засновані на мутації однонуклеотидного поліморфізму (ЗМР) алеля Тай-Зс відповідно до даних Ни еї аї., (2006).

Аналіз використовує дві ділянки праймерів і два МОВ-зонди для детектування мутантних і дикого типу алелей їад-3с (див. таблиця 1). Праймери і зонди ТадМапФ для детектування даної

ЗМР-мутації конструювали частково за допомогою програмного забезпечення Ргітег ехрге55 (Арріїєа Віозузіетв, А!йзвііп, Тх) із застосуванням послідовностей гена Тай-3с. Даний новий Ттад-3с

Тадмапф-аналіз перевіряли із застосуванням ДНК, екстрагованої із гомозиготних, гемізиготних і дикого типу (без мутації) за геном Тад-3с рослин каноли. Також частково оптимізували Тай-3с

Тадмапе-аналіз за ефективністю за допомогою системи ПЛР у реальному часі Арріїєй

Віозузієт5 7900НТ як в 96, так і в 384-ямковому форматі із застосуванням умов швидкого теплового циклу ПЛР.

Таблиця 1

Послідовності праймерів і зондів, які застосовується в Тад-3с ТадМапф-аналізі

ЗЕО І . .

МО 4 ЕАМ мутантного Тад-Зс Мав

МО:5 МІС дикого типу мав

У аналізі використали зразки листя МЕХ828 і Оцапішт. Для перевірки даного аналізу використали ДНК з популяцій каноли, що розводяться.

Аспекти розкриття, що розглядається, включають способи конструювання і/або виробництва діагностичних молекул нуклеїнової кислоти, які наведені як приклад і/або запропоновані в даному описі. Конкретні ТадМапФ праймери і зонд були сконструйовані, як детально описано в даному описі, частково відповідно до послідовностей ДНК, розташованих у конкретних ЗМР в гені Тад-3с, вказаних в даному описі, або поблизу від них проти ходу транскрипції або по ходу транскрипції.

Таким чином, в деяких варіантах здійснення дане розкриття стосується визначення зиготності рослин каноли, які виробляють олію. Розкриття, що розглядається, частково стосується детектування наявності 5МР, вказаних у даному описі, для того, щоб визначати, чи містить потомство від статевого схрещування ЗМР, що представляють інтерес, і зиготність потомства. Крім того, включені способи детектування зиготності, і вони корисні, наприклад, для дотримання правил, які вимагають передпродажного дозволу і позначення продуктів харчування, що отримуються з рекомбінантних сільськогосподарських культур.

Розкриття, що розглядається, частково стосується заснованого на флуоресценції ТадМапе

ПЛР-аналізу за кінцевою точкою, що використовує ендогенний немутантний ген Тад-Зс як контроль для високопродуктивного аналізу зиготності рослин каноли.

Розкриття, що розглядається, також частково стосується розробки біплексної ТааМап? ПЛР за кінцевою точкою для аналізу зиготності каноли. Крім того, розкриття, що розглядається, частково стосується розробки наборів для аналізу селекції за геном каноли Тад-3с.

Загалом ТадмМапФ-аналізи за кінцевою точкою засновані на стратегії плюс/мінус, в якій "плюс" означає, що зразок позитивний за геном, що аналізується, а "мінус" означає, що зразок негативний за геном, що аналізується. Дані аналізи, як правило, використовують один набір олігонуклеотидних праймерів і два олігонуклеотидні зонди, причому один зонд переважно гібридизується з ЗМР Тад-Зс, який мутував, а інший зонд переважно гібридизується з послідовністю Тад-3с дикого типу відповідно.

Переваги, пов'язані з розкриттям, що розглядається, включають зменшення залежності від якості і кількості ДНК. Крім того, розкриття, що розглядається, не вимагає тривалої початкової стадії денатурації, яка, якщо проведена неправильно, часто може приводити до невдачі інших способів детектування БМР. Розкриття, що додатково розглядається, пропонує спосіб ефективного аналізу великої кількості зразків каноли високопродуктивним способом у комерційних умовах. Іншою перевагою розкриття, що розглядається, є економія часу. ТадМапФ- аналіз за кінцевою точкою, що розглядається, для аналізу зиготності і схрещування каноли надає переваги порівняно з іншими форматами, які застосовуються, особливо коли аналізу піддається велика кількість зразків.

Дане розкриття частково стосується аналізу схрещування рослин. Дане розкриття включає нові способи детектування 5МР в рослинах каноли, які впливають на рівні олеїнової і ліноленової кислот у рослинах, що розглядаються.

Крім того, може виявитися можливим детектувати наявність ЗМР, що розглядаються, за допомогою інших відомих способів детектування нуклеїнової кислоти, таких, як ПЛР або гібридизація ДНК із застосуванням зондів нуклеїнової кислоти, описаних в даному описі. У даному описі розглянуті специфічні до події ПЛР-аналізи. (Див. також М/іпаеї!5 єї аї., (Мед. ГРас.

І апароймли, Опім. (зепі 64/55:459462, 1999).

Як застосовується в даному описі, термін "потомство" означає потомка будь-якого покоління батьківської рослини.

Методи детектування розкриття, що розглядається, в поєднанні з селекцією рослин особливо корисні, наприклад, для визначення зиготності рослин-потомків, після того як батьківську рослину, яка містить ЗМР, що становить інтерес, схрещують з іншою рослиною.

Застосування і способи, що розглядаються, корисні для програм селекції каноли, а також

Зо процесів контролю якості. Тепер можна виготовляти і застосовувати набори для детектування з допомогою ПЛР для ліній каноли, що використовують способи і аналізи, розкриті в даному описі. Крім того, розкриття, що розглядається, може бути корисне для реєстрації продуктів і обліку продуктів.

Рослину каноли, яка містить бажану генетичну композицію їайд-3с, можна вивести за допомогою спочатку статевого схрещування першої батьківської рослини каноли, що є рослиною каноли, вирощеною з насіння будь-якої з ліній, згаданих в даному описі, і другої батьківської рослини каноли, за допомогою чого створюється множина рослин першого потомства; і потім відбору рослин першого потомства, які несуть бажані гени Тай-3с, як розкрито в розкритті, що розглядається; і самоопилення рослини першого потомства, за допомогою чого створюється множина рослин другого потомства; і потім відбору з рослин другого потомства рослини, яка несе бажані гени Тад-3с відповідно до розкриття, що розглядається. Дані стадії можуть додатково включати зворотне схрещування рослини першого потомства або рослини другого потомства з другою батьківською рослиною каноли або третьою батьківською рослиною каноли. Потім можна сіяти урожай каноли, який містить насіння каноли розкриття, що розглядається, або їх потомство.

Дане розкриття додатково включає способи здійснення схрещувань із використанням рослини каноли, яка містить бажану генетичну композицію Тад-3с як щонайменше одного батька. Наприклад, розкриття, що розглядається, включає Е:-гібридну рослину, яка має як одного або обох батьків будь-яку рослину каноли, що містить бажану генетичну композицію Тад-

Зс. Також у межах розкриття, що розглядається, лежить насіння, яке отримується за допомогою таких гібридів Еї. Дане розкриття включає спосіб ідентифікації насіння гібриду Еї за допомогою схрещування зразка рослини з іншою (наприклад, інбредною батьківською) рослиною і збору і аналізу насіння гібриду, що отримується із застосуванням способу розкриття, що розглядається.

Рослини каноли, які застосовують для отримання гібриду Бі, можуть являти собою або материнську форму, або батьківську форму.

Також потрібно розуміти, що можна отримувати трансгенні рослини, які містять гени Таа-3с, розкриті в даному описі. Додатково, трансгенні рослини, які мають характеристики гена Тай-з3с, розкриті в даному описі, можна схрещувати з рослиною, яка містить іншу генетичну композицію, тим самим створюючи потомство, що містить екзогенні гени, які незалежно сегрегуються. 60 Самозапилення відповідного потомства може виробляти рослини, які є гомозиготними за доданими екзогенними генами. Також передбачені зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткросинг із нетрансгенною рослиною, як і вегетативне розмноження. У даній галузі техніки відомі інші способи розмноження, які звичайно використовуються для різних ознак і культур. Зворотне схрещування застосовують для перенесення генів високоуспадковуваних ознак, які легко інтрогресуються, у бажаний гомозиготний культивар або інбредну лінію, що являють собою рекурентного батька. Джерело ознаки, яка повинна бути перенесена, називають батьком-донором. Очікується, що рослина, яка отримується, має атрибути рекурентного батька (наприклад, культивар) і бажану ознаку, перенесену від батька-донора. Після первинного схрещування вибирають особин, які мають фенотип батька-донора, і повторно схрещують їх (піддають зворотному схрещуванню) з рекурентним батьком. Очікується, що батько, який отримується, має атрибути рекурентного батька (наприклад, культивар) і бажану ознаку, перенесену від батька-донора. Спосіб розкриття, що розглядається, пропонує високопродуктивний заснований на флуоресценції ТадМапФ ПЛР-аналіз за кінцевою точкою для детектування трансгена їТай-3с у рослинах-потомках і для визначення рівня зиготності рослин-потомків.

Способи даного розкриття, наприклад, олігонуклеотидні праймери і зонди, можна використовувати для способів маркерзалежної селекції (МАВ). Способи даного розкриття, наприклад, олігонуклеотидні праймери і зонди, можна використовувати зі спорідненими способами аналізу (аналізами поліморфізму довжини ампліфікованих фрагментів (АРІ Р), аналізами поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (КЕР), аналізами випадково ампліфікованої поліморфної ДНК (КАРБ)), які ідентифікують генетично пов'язані агрономічно корисні ознаки за допомогою детектування 5МР або простих послідовностей (З5К), що повторюються, із застосуванням публічно доступних протоколів, які відомі в даній галузі техніки.

ЗМР, розкриті в даному описі, можна відстежувати в потомстві від схрещування з рослиною каноли (або потомства від неї і будь-якого іншого культивара або сорту каноли) розкриття, що розглядається, із застосуванням МАВ-способів. Молекули ДНК можна використовувати як маркери для даної ознаки, і МАВ-способи, які добре відомі в даній галузі техніки, можна використовувати для відстеження 5МР в рослинах каноли, де щонайменше одна рослина каноли розкриття, що розглядається, або її потомство являє собою батька або предка. Способи

Зо даного розкриття можна використовувати для ідентифікації будь-якого сорту каноли, який має

ЗМР, що розглядаються, розкриті в даному описі.

Способи розкриття, що розглядається, включають спосіб створення рослини каноли, що містить комбінацію ЗМР, вказаних в даному описі, причому згаданий спосіб містить схрещування з рослиною розкриття, що розглядається. Більш конкретно, згадані способи можуть містити схрещування двох рослин розкриття, що розглядається, або однієї рослини розкриття, що розглядається, і будь-якої іншої рослини. Ілюстративні способи можуть додатково містити відбір потомства від згаданого схрещування за допомогою аналізу згаданого потомства на ЗМР розкриття, що розглядається, детектованого відповідно до розкриття, що розглядається.

Наприклад, розкриття, що розглядається, можна використовувати для відстеження зиготності рослин каноли протягом циклів схрещування з рослинами, які мають інші бажані ознаки, такі, як агрономічні ознаки, такі, як досліджені в даному описі в різних прикладах. Рослини, які містять

ЗМР, що розглядаються, і бажані ознаки, можна також, наприклад, детектувати, ідентифікувати, відбирати і швидко використовувати в подальших циклах схрещування. 5МР/ознаки, що розглядаються, можна також комбінувати під час схрещування і відстежувати відповідно до розкриття, що розглядається, з іншими ознаками, наприклад, з можливою ознакою(ами) стійкості до комах-шкідників і/або з ознаками стійкості до гербіцидів. Одним варіантом здійснення останнього є рослина, яка містить один або декілька ЗМР, що розглядаються, в поєднанні з геном, який кодує стійкість до гербіциду, такого, як гліфосат.

У деяких варіантах здійснення дане розкриття включає послідовності ДНК, які містять суміжний фрагмент, застосовні як послідовності праймера для створення ампліконового продукту, діагностичного для однієї або декількох рослин каноли Тайд-3с.

Споріднені варіанти здійснення стосуються послідовностей ДНК, які містять щонайменше 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжних нуклеотидів частини послідовностей ДНК, вказаних в даному описі, або їх комплементів. Такі послідовності можна використовувати як праймери ДНК у способах ампліфікації ДНК.

Амплікони, які отримуються із застосуванням даних праймерів, можуть бути діагностичними для будь-якої комбінації і зиготності сортів каноли їад-Зс, що згадуються в даному описі. Отже, дане розкриття також включає амплікони, які виробляються такими праймерами ДНК і гомологічними праймерами.

У наступних варіантах здійснення розкриття, що розглядається, включає способи створення

ЗМР Тад-3Зс розкриття, що розглядається, причому згаданий спосіб містить стадії: (а) статевого схрещування першої батьківської лінії каноли, яка містить один із ЗМР, які розкриті в даному описі і несуть одну з ознак олеїнової і/або ліноленової кислоти, розкритих в даному описі, і другої батьківської лінії каноли (в якій відсутні дані 5МР), за допомогою чого створюють множину рослин-потомків; і (6) відбір рослини-потомка із застосуванням молекулярних маркерів. Такі способи можуть необов'язково містити додаткову стадію зворотного схрещування рослини-потомка з другою батьківською лінією каноли для отримання рослини каноли чистого розмноження або гомозиготної, яка містить згадані ознаки їай-Зс.

Відповідно до іншого аспекту даного розкриття пропонуються способи визначення зиготності потомства від схрещування зі згаданими рослинами каноли їТайд-3с. Згадані способи можуть включати в себе приведення зразка, що містить ДНК каноли, в контакт із набором праймерів розкриття, що розглядається. Згадані праймери при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномної ДНК від щонайменше однієї із згаданих рослин каноли Таа-3с виробляють перший амплікон, який є діагностичним для щонайменше одного із згаданих ЗМР каноли або генів дикого типу. Такі способи додатково включають в себе здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, за допомогою чого виробляється перший амплікон, і детектування першого амплікону за допомогою зондів, специфічних до ЗМР Тад-Зс, розкритих в даному описі, і генів дикого типу. Дані способи додатково включають у себе здійснення застосувань алельного дискримінантного плавлення ампліконів, до яких відпалені розкриті зонди, і порівняння відносної флуоресценції зондів, використаних у застосуванні алельного дискримінантного плавлення. Відносна флуоресценція зондів вказує, чи містить зразок БМР, що становить інтерес, і якщо так, чи є зразок гетерозиготним або гомозиготним за даним ЗМР.

Можуть бути розроблені набори для детектування ДНК із застосуванням композицій, розкритих у даному описі, у поєднанні зі способами, добре відомими в галузі техніки детектування ДНК. Дані набори корисні для ідентифікації ЗМР каноли, що розглядаються, в зразку і можуть застосовуватися в способах селекції рослин каноли, які містять дану ДНК. Дані набори містять послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні до ампліконів, наприклад, розкритих в даному описі. Дані послідовності ДНК можна використовувати в реакціях

Зо ампліфікації ДНК або як зонди в способах гібридизації ДНК. Дані набори можуть також містити реагенти і матеріали, необхідні для здійснення способу детектування. "Зонд" являє собою виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої прикріплена звичайна детектована мітка або репортерна молекула (така, як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний засіб або фермент). Такий зонд комплементарний до ланцюжка мішеневої нуклеїнової кислоти, у випадку даного розкриття - ланцюжка геномної ДНК від однієї із згаданих рослин каноли, що містять гени їайд-3с, які становлять інтерес, або від рослини каноли, або від зразка, який містить ДНК від трансформанта. Зонди відповідно до даного розкриття включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, а й також поліаміди і інші матеріали для зондів, які специфічно зв'язуються з мішеневою послідовністю ДНК і можуть використовуватися для детектування наявності мішеневої послідовності ДНК.

Були сконструйовані специфічні зонди, що містять флуоресцентний репортер (флуорофор) і гасник, який гібридизується з мішеневою ДНК між праймерами ПЛР. Молекулу флуорофору приєднують до олігонуклеотидного зонда під час синтезу олігонуклеотидного зонда, за допомогою чого позначають олігонуклеотидний зонд. До олігонуклеотидного зонда можна приєднувати інші молекули, такі як молекула гасника. Приєднання даних молекул до олігонуклеотидного зонда не порушує функцію олігонуклеотидного зонда при гібридизації з одноланцюжковою ДНК і отриманні нового ланцюжка ДНК в процесі ампліфікації.

Були розроблені численні флуорофори, які збуджуються при певних довжинах хвиль і відомі в даній галузі техніки. Збудження флуорофору приводить до випущення флуорофором флуоресцентного сигналу, який може бути погашений гасником, розташованим в безпосередній близькості від флуорофору. Коли гасник від'єднується від флуорофору, флуоресцентний сигнал більше не гаситься, і суму флуоресцентного сигналу, яка прямо корелює з кількістю мішеневої

ДНК, можна детектувати в реальному часі з допомогою автоматичного флуориметра.

Флуорофори можна використовувати в комбінації, причому спектри збудження і випущення значно відрізняються, роблячи можливим множинне детектування двох або декількох флуорофорів. Деякі переважні варіанти здійснення флуорофорів включають: флуоресцентний барвник НЕХ, флуоресцентний барвник ТЕТ, флуоресцентний барвник СуЗ, флуоресцентний барвник Су3.5, флуоресцентний барвник Су5, флуоресцентний барвник Су5.5, флуоресцентний барвник Су/, або флуоресцентний барвник КОХ. Один переважний варіант здійснення бо флуорофору для використання зі способом, який включає систему детектування для гомогенного аналізу для процесу ПЛР із застосуванням ЕКЕТ винаходу, що розглядається, включає флуоресцентний барвник РАМ флуоресцентного барвника Ч9оЕ.

Були розроблені гасники для гасіння флуорофорів на певній довжині хвилі, і вони відомі в даній галузі техніки. Коли гасник розташований в безпосередній близькості до флуорофору, флуорофор передає енергію гаснику. Гасник передає дану енергію і повертається у вихідний основний остан за допомогою спаду випромінювання або безвипромінювально. При безвипромінювальному або темновому спаді енергія, що передається від флуорофору, виділяється у вигляді молекулярних коливань. При виборі гасника беруть до уваги такі якості, як низька фонова флуоресценція, висока чутливість і максимальне спектральне перекриття, для отримання гасника, який може зробити можливим широке використання флуорофорів. Деякі переважні варіанти здійснення гасників включають: гасники барсуї, гасники Татга, гасник ОХІ, гасник Ісулха БіаскК БО, гасник Іожа ріаск КО або гасник ІК Юуе ОС-1. Особливо переважний варіант здійснення гасника включає гасник ВіасКпоІїе, що використовується як мітка на олігонуклеотидному праймері, який сконструйований як антисмисловий ЕАМ-міченому олігонуклеотиду. "Праймери" являють собою виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які піддають відпалу на комплементарному мішеневому ланцюжку ДНК за допомогою гібридизації нуклеїнової кислоти, завдяки чому утворюється гібрид між праймером і мішеневим ланцюжком ДНК, і потім подовжують вздовж мішеневого ланцюжка ДНК за допомогою полімерази, наприклад, ДНК- полімерази. Пари праймерів даного розкриття стосуються їх застосування для ампліфікації мішеневої послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших звичайних способів ампліфікації нуклеїнових кислот.

Зонди і праймери звичайно мають довжину 5, 6, 7, 8,9,10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, АЗ, 44, 45, 46, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159,

Зо 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 216, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 00, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, зго, 321, Зз22, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359,

З6О, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, А16, 417, 418, 419, 420, 421, 422, А23, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, А76, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500 полінуклеотидів або більше. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з мішеневою послідовністю в умовах гібридизації високої суворості. Переважно, зонди і праймери відповідно до даного розкриття мають повну схожість послідовності з мішеневою послідовністю, хоча можна за допомогою звичайних способів конструювати зонди, відмінні від мішеневої послідовності, які зберігають здатність гібридизуватися з мішеневою послідовністю.

Способи отримання і застосування зондів і праймерів описані, наприклад, в Моіесшіаг

Сіопіпа: А І арогаїогу Мапиаї, 2па єд., мої. 1-3, єд. Затргсок еї аї., Соід5ргіпаНагсог І абогаюгу

Ргез5, Соїй Зргіпд Нагброг, М.М., 1989. Пари ПЛР-праймерів можна отримувати з відомих послідовностей, наприклад, із застосуванням комп'ютерних програм, призначених для цієї мети.

Праймери і зонди, основані на послідовностях ДНК, розташованих проти ходу транскрипції і по ходу транскрипції від ЗМР, розкритих в даному описі, можна використовувати для підтвердження (і, якщо необхідно, виправлення) розкритих послідовностей за допомогою звичайних способів, наприклад, за допомогою повторного клонування і секвенування таких 60 послідовностей.

Нуклеїново-кислотні зонди і праймери даного розкриття гібридизуються в суворих умовах із мішеневою послідовністю ДНК. Загалом для ідентифікації наявності ДНК зі зразка Таа-3с можна використовувати будь-який звичайний спосіб гібридизації або ампліфікації нуклеїнової кислоти.

Молекули нуклеїнової кислоти або її фрагменти здатні специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнової кислоти в певних умовах. Як застосовується в даному описі, кажуть, що дві молекули нуклеїнової кислоти здатні специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо дві молекули здатні до утворення антипаралельної дволанцюжкової нуклеїново-кислотної структури. Кажуть, що молекула нуклеїнової кислоти є "комплементом" іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вони демонструють повну комплементарність. Як застосовується в даному описі, кажуть, що молекули демонструють "повну комплементарність", коли кожний нуклеотид однієї з молекул комплементарний до нуклеотиду з іншої. Кажуть, що дві молекули є "мін мально комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною зі стабільністю, достатньою для того, щоб дозволяти їм залишатися відпаленими одна на одній щонайменше в звичайних умовах "низької суворості". Аналогічно, кажуть, що молекули є "комплементарними", якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною зі стабільністю, достатньою для того, щоб дозволяти їм залишатися відпаленими одна на одній у звичайних умовах "високої суворості". Звичайні умови суворості описані в затюогоок еї аї!., 1989. Отже, відхилення від повної комплементарності допустимі доти, поки такі відхилення не усувають повністю здатність молекул утворювати дволанцюжкову структуру. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила як праймер або зонд, вона повинна тільки мати достатньо комплементарну послідовність для того, щоб бути здатною утворювати стабільну дволанцюжкову структуру при конкретних використовуваних концентраціях розчинника і солі.

Як застосовується в даному описі, по суті гомологічна послідовність являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка буде специфічно гібридизуватися з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, з якою її порівнюють, в умовах високої суворості. Термін "суворі умови" функціонально визначають відносно гібридизації нуклеїново-кислотного зонда з мішеневою нуклеїновою кислотою (тобто з конкретною послідовністю нуклеїнової кислоти, що становить інтерес) за допомогою процедури специфічної гібридизації, розглянутої в Затбьгоок еї аІ., 1989, на 9.52-9.55. Див. також ЗатюогоокК еї а!., 1989 на 9.47-9.52 і 9.56-9.58. Відповідно

Зо нуклеотидні послідовності даного розкриття можна застосовувати в зв'язку з їх здатністю селективно утворювати подвійні молекули з комплементарними відрізками фрагментів ДНК.

Залежно від передбачуваного застосування можна використовувати різні умови гібридизації для досягнення різного ступеня селективності зонда відносно мішеневої послідовності. Для застосувань, що вимагають високої селективності, для утворення гібридів будуть, як правило, використовуватися відносно суворі умови, наприклад, будуть вибрані умови відносно низької концентрації солі і/або високої температури, такі, як такі, що отримуються при від приблизно 0,50 мМ до приблизно 02,00 мМ МаосСіг при температурах, які становлять від приблизно 5020; до приблизно 75200. Можна змінювати як температуру, так і сіль, чи або температуру, або концентрацію солі можна підтримувати постійними, в той же час змінюючи іншу змінну. Такі умови селективності допускають невелику кількість, якщо взагалі допускають, незбігів між зондом і матричним або мішеневим ланцюжком. Детектування послідовностей ДНК за допомогою гібридизації добре відоме фахівцям в даній галузі техніки, і ідеї патентів США МоМо 4965188 і 5176995 є прикладами способів гібридизаційних аналізів.

В одному ілюстративному варіанті здійснення нуклеїнова кислота даного розкриття специфічно гібридизується з одним або декількома з праймерів (або ампліконів або інших послідовностей), які наведені як приклад або пропонуються в даному описі, включаючи комплементи і їх фрагменти, в умовах високої суворості. У одному аспекті даного розкриття маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного розкриття має послідовність нуклеїнової кислоти, наведену в даному описі в одному із прикладів послідовностей або їх комплементів іабо фрагментів.

У іншому аспекті даного розкриття маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного розкриття має від 8095 до 10095 або від 9095 до 10095 схожості послідовності з такими послідовностями нуклеїнової кислоти. У наступному аспекті даного розкриття маркерна молекула нуклеїнової кислоти даного розкриття має від 9595, 9695, 9795, 9895 і/або 9995 до 10095 схожості послідовності з такою послідовністю. Такі послідовності можна застосовувати як маркери в способах селекції рослин для ідентифікації потомства генетичних схрещувань. Гібридизацію зонда з мішеневою молекулою ДНК можна детектувати за допомогою будь-якої кількості способів, відомих фахівцям в даній галузі техніки, вони можуть включати, але без обмеження, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки, засновані на антитілах, і хемілюмінесцентні бо мітки.

Відносно ампліфікації мішеневої послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, за допомогою ПЛР) із застосуванням конкретної пари праймерів для ампліфікації, "суворі умови" являють собою умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися насамперед і з високою перевагою з їх мішеневими послідовностями нуклеїнової кислоти, що дозволяє парі праймерів зв'язуватися і, переважно, виробляти унікальний амплікон.

Термін "специфічний до (мішеневої послідовності)" вказує на те, що зонд або праймер гібридизується в суворих умовах гібридизації насамперед і з високою перевагою з послідовністю нуклеїнової кислоти в зразку, що містить мішеневу послідовність.

Як застосовується в даному описі, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" стосується продукту нуклеїново-кислотної ампліфікації мішеневої послідовності нуклеїнової кислоти, яка є частиною нуклеїново-кислотної матриці. Наприклад, для того, щоб визначити, чи містить рослина каноли, яка отримується статевим схрещуванням, ЗМР, що становить інтерес, як розкрито в даному описі. ДНК, екстраговану зі зразка тканини рослини каноли, можна піддавати способу ампліфікації нуклеїнової кислоти із застосуванням пари праймерів, яка включає праймер, що походить від послідовності, розташованої в геномі рослини каноли проти ходу транскрипції або по ходу транскрипції від ділянки ЗМР, і другий праймер, що походить від іншого кінця послідовності, розташованої в геномі рослини каноли проти ходу транскрипції або по ходу транскрипції від ділянки ЗМР, завдяки чому створюється амплікон, який є діагностичним для наявності 5МР. Амплікон має довжину і послідовність, які також є діагностичними для гена дикого типу або такого, який мутував. Довжина амплікону може лежати в діапазоні від загальної довжини пар праймерів плюс одна пара нуклеотидних основ і/або загальної довжини пар праймерів плюс приблизно 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, 52,53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182,

Зо 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, З02, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, А15, 416, 417, 416, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 423, 427, 428, 429, АЗ0, 431, 432, 433, 434, 435, 433, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 443, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 434, 435, 433, 437, 438, 439, 470, 471, 472, А73, 474, АТ5, 473, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, або 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більше пар нуклеотидних основ (плюс або мінус будь-що з приростів, перерахованих вище). Член пари праймерів, які походять від геномної послідовності рослини, може бути розташований на відстані від послідовності ЗМР. Дана відстань може лежати в діапазоні від однієї пари нуклеотидних основ аж до приблизно двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. Застосування терміну "амплікон" прямо виключає димери праймерів, які можуть утворюватися в реакції теплової ампліфікації ДНК.

Ампліфікацію нуклеїнової кислоти можна здійснювати за допомогою будь-якого з різних способів ампліфікації нуклеїнової кислоти, відомих в даній галузі техніки, включаючи ПЛР.

Багато способів ампліфікації відомо в даній галузі техніки і описано, зокрема, в патенті США Мо 4683195 і патенті США Мо 4683202. Були розроблені способи ампліфікації з допомогою ПЛР для ампліфікації аж до 22 т. п. н. геномної ДНК. Дані способи, а також інші відомі в даній галузі техніки способи ампліфікації ДНК, можна застосовувати при здійсненні на практиці даного розкриття. Послідовність ЗМР Таа-3с можна верифікувати за допомогою ампліфікації таких послідовностей із застосуванням праймерів, які походять від послідовностей, що пропонуються в даному описі, з подальшим стандартним секвенуванням ДНК ПЛР-амплікону або клонованої

ДНК.

Амплікон, що отримується в даних способах, можна детектувати за допомогою множини методів. Електрофорез на агарозному гелі і фарбування за допомогою броміду етидію є звичайним добре відомим способом детектування ампліконів ДНК. Іншим таким способом є генетичний біт-аналіз, в якому конструюють олігонуклеотид ДНК, який перекриває як прилеглу фланкуючу геномну послідовність ДНК, так і вставлену послідовність ДНК. Олігонуклеотид імобілізують в ямках мікроямкового планшета. Після ПЛР ділянки, що становить інтерес (із застосуванням одного праймера у вставленій послідовності і одного в прилеглій фланкуючій геномній послідовності), одноланцюжковий продукт ПЛР можна гібридизувати з імобілізованим олігонуклеотидом, і він може служити як матриця для реакції подовження на одну основу із застосуванням ДНК-полімерази і мічених ЗаМТР, специфічних до наступної очікуваної основи.

Прочитання результату може бути засноване на флуоресценції або ЕГІ5ЗА. Сигнал вказує на наявність вставленої/фланкуючої послідовності за рахунок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу.

ТадМаптж ПЛР являє собою спосіб детектування і кількісного визначення наявності послідовності ДНК. Стисло, конструюють олігонуклеотидний ЕКЕТ-зонд, який перекриває ЗМР, що становить інтерес. ЕКЕТ-зонд і праймери ПЛР (щонайменше один, розташований проти ходу транскрипції, і щонайменше один, розташований по ходу транскрипції від ЗМР, що становить інтерес) проходять цикл в присутності термостабільної полімерази і аМмтТР.

Після ампліфікації може бути здійснений алельний дискримінантний аналіз (із застосуванням гідролізу зонда ТадМапФ), описаного вище) для визначення наявності ЗМР, що становить інтерес, і зиготності зразка. Під час алельного дискримінантного аналізу два різні гібридизаційні зонди (один зонд включає нуклеотид, комплементарний до допослідовності ЗМР, а інший зонд несе нуклеотид, комплементарний до послідовності дикого типу) гібридизуються з ампліконом і розщеплюються, за допомогою чого із зонда вивільняються гасильні фрагменти завдяки 5'-екзонуклеазній активності їад-полімерази, і це приводить до флуоресценції.

Порівняння відносної флуоресценції зонда, специфічного до гена дикого типу, із зондом, специфічним до ЗМР, забезпечує індикацію наявності і зиготності БМР, що становить інтерес.

Всі патенти, патентні заявки, попередні заявки і публікації, на які посилається даний опис, або які перераховані в даному описі, включені за допомогою посилання у всій повноті до того ступеня, в якому вони не є несумісними зі зрозуміло вираженими ідеями даного опису винаходу.

Наступні приклади включені для ілюстрації способів здійснення даного розкриття на практиці і для демонстрації деяких переважних варіантів здійснення даного розкриття. Дані приклади не треба розглядати як такі, що обмежують. Фахівцям у даній галузі техніки повинно бути зрозуміло, що методи, розкриті в наступних прикладах, представляють конкретні підходи, які застосовуються для ілюстрації переважних варіантів їх практичного здійснення. Однак, фахівцям в даній галузі техніки в світлі даного розкриття повинно бути зрозуміло, що можна здійснювати багато змін в даних конкретних варіантах здійснення, отримуючи при цьому такі ж або схожі результати, без відхилення від суті і об'єму даного розкриття. Якщо не вказане інше, всі процентні частки наведені за вагою, і всі співвідношення сумішей розчинників наведені за об'ємом, якщо не відмічено інше.

Якщо не вказано інше, використовуються наступні скорочення. п. о. - пара основ 20 - градуси Цельсія

ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота

ЕВЕТ- резонансне перенесення енергії флуоресценції

Іа - дигоксигенін

ЕДТА - етилендіамінтетраоцтова кислота т. п. н.- тисяча пар нуклеотидів мкг - мікрограм мкл - мікролітр мл - мілілітр

М - молярна маса

ОЇ Р - перекриваючий зонд

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція

РТ - транскрипційна одиниця рослини

ДСН - додецилсульфат натрію

ЗМР - однонуклеотидний поліморфізм бо ОР - стандартний порядок дій

ЗОЗ - буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0

ТВЕ - буферний розчин, що містить суміш основи Тгтгі5, борної кислоти і ЕДТА, рН 8,3

М - вольти

Приклади

Приклад 1: ЕАО-3с ТадМапф-аналіз за кінцевою точкою

Був розроблений ТадМап-аналіз за кінцевою точкою для детектування мутації однонуклеотидного поліморфізму Ттай-3с і для визначення стану зиготності рослин каноли, які містять мутацію гена Тад-Зс в популяціях, що розводяться. Сконструювали два праймери для зв'язування з високо консервативними послідовностями ДНК, розташованими на екзоні 6 і 7 гена Тад-3с. Дані праймери ампліфікували фрагмент ДНК розміром 154 п. о., який перекривав однонуклеотидний поліморфізм Тад-53с у рослинах каноли, які мутували і які не мутували.

Мутація тад-3с в канолі описана Ни еї аї., (2006) і розташована біля з'єднання екзону 6 і інтрону 6 в сайті сплайсингу даного гена (фіг. 1). Сконструювали два зонди ТадМапФ), які зв'язуються з малою борозенкою і несуть нефлуоресцентний гасник (МОВМЕО), з ЕАМ і МІС як репортерних барвників для детектування наявності гена Тад-З3с дикого типу і гена Тад-Зс (який містить однонуклеотидний поліморфізм, ЗМР), який мутував, відповідно. Дані два зонди були сконструйовані з особливою увагою до того, щоб уникнути сусіднього поліморфізму, розташованого в інтроні б і в безпосередній близькості від однонуклеотидного поліморфізму

Тад-Зс (фіг. 1). Уникнення другого поліморфізму приводить до зростання специфічності зондів у детектуванні Тайд-Зс-мутантних рослин. Спосіб ТадмМапФ-детектування рослин каноли, які містять ЗМР Тай-Зс, тестували на сорті каноли "МЕХ 828" (який містить ЗМР Таа-зс), контрольному сорті каноли "СОчапішт" (не містить ЗМР Тайд-Зс) і зразку ДНК, виділеному з рослин, про які відомо, що вони є гетерозиготними за ЗМР Тай-3с. ТадмМапФф-аналіз за кінцевою точкою використали для визначення наявності ЗМР Таа-зс, а також для визначення зиготності тестованих рослин при високопродуктивному способі застосування, наприклад, у форматі 96- і 384-ямкового планшета.

Приклад 1.1: Виділення г ДНК

У даному дослідженні тестували зразки геномної ДНК (гДНК) 156 різних рослин каноли, що містять мутацію їТад-Зс, і контрольних рослин каноли. Геномну ДНК екстрагували із

Зо застосуванням модифікованого набору Оіадеп МадАнгасі ріапіМА (Оіадеп, Маіепсіа, СА). Для екстракції ГДНК використовували свіжі листяні диски каноли по 4 на зразок. гДНК кількісно характеризували за допомогою методу Рісо сгееп відповідно до інструкцій виробника (МоїЇесціаг

Ргорех, Еийдепе, ОК). Зразки розбавляли вільною від ДНКази водою, отримуючи концентрацію 5 нг/мкл для даного дослідження.

Приклад 1.2: ТадМапф-аналіз і результати

Були розроблені специфічні праймери і зонди ТадМап?Ф для використання в ТадМапФ- аналізі за кінцевою точкою. Дані праймери і зонди конструювали так, щоб ампліфікувати і детектувати ділянку гена Таа-3с, яка містить 5МР, що становить інтерес. Дані реагенти можна використовувати в умовах, перерахованих нижче, для детектування гена Тад-3Зс, який мутував, в рослинах каноли. Таблиця 1 перелічує послідовності праймерів і зондів, які були розроблені спеціально для детектування ЗМР Таа-3с у рослинах каноли.

Таблиця 2

Праймери ПЛР і зонди ТадМапФ

ЗЕОІЮ |0-СІ-ЕАОЗс- Зворотний прайме СААИТАССТСААСААСССТТ ТИС ТСААСА

МОЗ В р раимер СТТОТТААТССТСОСАССОТ

ЗЕОІО |0-СІ-РАОЗс-| Зонд для детектування

ЗЕОІО |0-СІ-РАОЗс-| Зонд для детектування

Реакційні суміші для ПЛР для ампліфікації мають наступний вигляд: 1Х ТадМапФ СТЕхргев55

Мазхіег Міх, 0,9 мкМ прямого праймера (5ЕО ІО МО:2), 0,9 мкМ зворотного праймера (5ЕО ІО

МО:3), 0,2 мкМ зонда для мутантного ЕАЮ-3С (ЗЕО ІО МО:4), 0,2 мкМ зонда для дикого типу

(ЗЕО ІЮ МО: 5), 15 нг гДНК при загальному об'ємі реакції, який дорівнює 6 мкл. Реакційну суміш піддавали ампліфікації, використовуючи наступні умови теплового циклу: на початку дві стадії при 502С протягом 2 хвилин і 95202 протягом 30 секунд; потім 40 циклів по З секунди при 9520 і 30 секунд при 6220. Потім реакцію тримали при 1020 доти, поки не виймали з термоциклера.

Теплові цикли ПЛР можна здійснювати із застосуванням або системи для ПЛР у реальному часі

АВІ-Арріїеа Віозубзієт5 7900 НТ, або термоциклера Арріїед Віозузієт5 Мепу (І їе Тесппоіодіев,

Сапзрад, СА). Планшети для зразків містили контрольну ДНК з рослин каноли, які є гомозиготними за мутантним їайд-3с ("МЕХ 828"), гетерозиготними за мутантним їад-3с або гомозиготними за Тад-3с дикого типу ("Оцапішт"). Додатково включали контроль без матриці, який не містив ДНК. Після ампліфікації зчитували флуоресцентні сигнали в кінцевій точці (МІС і

ЕАМ) із застосуванням системи для ПЛР у реальному часі Аррієй Віозузієт5 7900 НТ відповідно до алельного дискримінантного способу зчитування планшетів, як описано виробником. Потім дані аналізували із застосуванням програмного забезпечення 505 2.4 (І те

Тесппоодіе5, Сагізрайд, СА) для визначення відносної флуоресценції кожного зразка (фіг. 2).

Був протестований спосіб детектування мутації Тас-3с в канолі з допомогою ТадМапФ за зразками, про які відомо, що вони є гомозиготними, гемізиготними і дикого типу. Аналіз флуоресценції, яка створюється кожним зондом (в реакції із зразком), з флуоресценцією, яка створюється зондами контрольних зразків, сприяв визначенню зиготності кожного зразка. Даний аналіз продемонстрував високу специфічність детектування однонуклеотидного поліморфізму

Тад-Зс з мутацією і дикого типу в канолі і не створював або не збільшував ніяких детектованих помилково-позитивних результатів від контрольних зразків. Специфічні до події праймери і зонди можна використовувати для детектування мутантного гена Тад-з3с і гена Таа-3с дикого типу в канолі, і дані умови і реагенти застосовні для аналізів зиготності.

х ния ТРЕК В путь пи ВУ спмсокЕ ПОСЛІДОВНЕ И

Еш бич гру щ- дідо Хннх Адцхощлпата зай піци о зу со ггухі мус цлАСИМИ дитин Зако ДО ЩІУТУЙ оту модою хо позутеуюиту пед КО УМА МО ПТО «180 СЛрлпопіб визначения вмлзашнмиииі вста КАПІ в окхамосМі З поОопомогою ТлЛОМАМ ПТ за хшіІіРИЛаТНЮЮ ЩІ КІНО зи туда плед 04 ли Ю «Ус йАД-РООВ-А ОМ В «іч б дл ща т «180» ПЕ ал/555,175 «13і» ВОДИ жи ч чу З рен А

ФІТО Еаиелгт аква схм О.О «Ах У

ЧИ тех каТ1зо 58 пт пи хи МИХ коло них зи -к пи рих, пої ит ях штусюва ІМ УЛА УУВНвИтТе «йді» тую я густим узи им міхи актллу Жити щІЗИТ У хи длднаяка посла леВнока Сама мах 3Зс о камоя «др хх А шен іти у що ахоритии в комин серии вуючи жи вечич и пуд или дю ит жи Ух й зксствсссгаз сдтвзтвшова сустшиовст їасмхевсавс ахсосв'зесов совісасавУ о фоияжуи вючиу Й суєти ря КУ пуд уки тт пи діву р су В долити ки оо зле сіЗестішеяї пвсазцазисав зпУусазшсача бпсазчовісасє ссзізалааз свасвагтлах їшо топі мо шортів В ит е чан ками спудткюи т плода спв плвацосцава Бопемсаюмас спол чатваеа базсаловас зва Ме дуичук личка века ЕВесицІВвОс Бисдатаао Да зай щпоУксапасаа потшнвсвастя спчасачлала зеаспчзвко сосаасласа оесвксасоуд зай палтуса с дес ТИС пошле пЕкс сусасадати со пп «и саЕКАМ КА я йТйМ ДЕК ее екв ііт сТе МмеУ чи праве Ний ОТО ЛО РМ КТ стутют савух «пай праймуу ей Ух т кут їх водасовива Фоїеиом у я «ам З

СоскЬ ле

Мох Я жАдам ДЯЖ «3 кивуцня пенал нУВИ МОСІЇ» сиро сах ча тизаємоер «00» редщи тв ЕДДІ ЗА мечі ля по «З чия й «ах 015 «Зійх ре аа НК сао Шттечня пили дові

«пах

«вах зонд

«поз 4 сацадесаву ага 5 са

«візх ДЕК

«13 штучна шалі деИ ую квиах понд асацацесвна пока 17

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб визначення зиготності рослини каноли, що містить ген Таа-Зс, причому згідно зі згаданим способом: отримують зразок геномної ДНК з рослини каноли; гібридизують зразок геномної ДНК з першим праймером і другим праймером, де перший праймер і другий праймер містять БЕО ІЮО МО: 2 і БЕО ІО МО: 3; піддають згаданий зразок умовам полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), при яких утворюється амплікон; надають можливість кожному з першого зонда і другого зонда гібридизуватися з вказаним ампліконом протягом періоду часу і при температурі 50-70 градусів Цельсія, де згаданий перший зонд і згаданий другий зонд містять ЗЕО ІО МО: 5 і БЕО ІО МО: 4, де кожний із згаданого першого зонда і згаданого другого зонда помічений флуоресцентним барвником і гасником; підвищують згадану температуру після періоду часу; вимірюють флуоресценцію згаданого першого зонда, згаданого другого зонда або їх комбінації; і визначають зиготність згаданої рослини каноли.

2. Спосіб за п. 1, в якому згаданий амплікон складається з 91-154 пар основ.

3. Спосіб за п. 1, в якому зразок геномної ДНК містить мутовану Тад-Зс послідовність, що має однонуклеотидний поліморфізм, де згаданий однонуклеотидний поліморфізм складається з поліморфізму 5--А.

4. Спосіб за п. 3, в якому зразок геномної ДНК додатково містить Тад-3с послідовність дикого типу.

5. Спосіб за п. 1, в якому згаданий спосіб застосовують для верифікації інтрогресії при селекції у кросбредних рослин каноли.

6. Спосіб за п. 1, в якому згаданий перший зонд гібридизується з ділянкою мутованої їай-Зс послідовності, що має однонуклеотидний поліморфізм (ЗМР), і згаданий другий зонд гібридизується з ділянкою їад-3с послідовності дикого типу. Зо

7. Спосіб за п. б, в якому згаданий перший зонд містить ЕАМ як згаданий флуоресцентний барвник на 5'"-кінці згаданого першого зонда і МОВ-гасник на 3'-кінці згаданого першого зонда.

8. Спосіб за п. 6, в якому згаданий другий зонд помічений МІС на 5'-кінці згаданого другого зонда і МОВ-гасником на 3'-кінці згаданого другого зонда.

9. Спосіб за п. 1, в якому згаданий другий зонд містить 5ЕО ІЮ МО: 4.

10. Спосіб за п. 1, в якому результати флуоресценції згаданого способу аналізують безпосередньо в планшет-рідері.

11. Спосіб за п. 1, в якому згаданий зразок ДНК отримують з рослини каноли в полі.

12. Спосіб за п. 1, в якому стадія підвищення включає в себе стадію, на якій підвищують згадану температуру з по суті однорідними приростами температури за період часу.

13. Спосіб за п. 1, в якому згадану флуоресценцію, яка створюється кожним із згаданого першого зонда і згаданого другого зонда під час стадії підвищення, вимірюють під час кожного приросту на стадії підвищення згаданої температури.

14. Набір для здійснення способу за п. 1, причому згаданий набір містить перший праймер, який складається з 5ЕО ІЮ МО: 2, другий праймер, який складається з 5ЕО ІЮО МО: 3, перший зонд, який складається з БЕО ІО МО: 5, і другий зонд, який складається з БЕО ІЮ МО: 4.

Бкаж й і ІСТОТА ОЦІ АСВ ТО ТОК ОСА АНУС АСОАТЗАТААВ Ппуюв а Ї ту ух "тд лити дити пок и КИ доб АЛ АС ло дово доки пит СТОССТТОВТАСАВАВІКАЛЕ В ТАМУТАОАТАЛВИАТТАТТР ТАЗА АКТКАТВМ Ж - Зкза ; й МжтТйЙЦія белі- сло Ще кові Й і ТАТА ОАВТЯАТ ТАТІ ТТААТЕТТТТ ПЛІВА АТСАКУ ТАТО печу ходи ди рити дж ст дя Кт ди жи в я тив ате так ШТАТ К ТАКА ТО КАСА АТ АСОМ СТАВ АКАЇТКАТСАСОАТА і і ТАТ АКТОМ ТОК АКАВАТККЄ і пп ААА АНА ААААААКААКААКААККААКААААААААААААААКААКАААААКААККАААААКААКАААААКААКАААКНАККААКААААААААА АЛАНА ААААААААя яти Фк ї фоздіаєюя муза пси а ас ма ри клахтери Зразки ДЕК ва сито навниноав зима М ЗЯ Контроль без матриці Моумиїсеми Калюрувцики; Теж ія да Й Грайнк вавльмої дискримнвиої не ДЕКО ВЕДЕ НЕК ЕЕ КЕ їх і й диннніннянинно Група мімозмесї за Гай. Я зикоги ПЕВНИМ евиваа: вве й : й пот. ВЖЕ ххх ШЕ НЕ ше ки ИН: ТНТУ вах «ва вааажнихиая в о: ші з вх х мн ле м ик и НЕ ЗМ НЕЧЕЗІ ил Щ Й ек ШИ ин ЧЕ яв п х Фен КД руна ригеромихик за Та Бе сажеаажис свв. шов х Я Шведа ж ж аж ви сжес в ЖІ: - Пса же ов ожожо о сфжжвваК раль повна в а хв ех жк хо, КОХ, Груввкомозниєт за мутантнним Беі-Зе Шеф его в ве с Зх НО й реч жваве скх ве г ЕН НЕ Ж ЖЕ МИМО Рожик і Уменн: пизодчевих ще фев Ж ій ин м ль ри : . і 7 У | міохоженоий Мав: важив со ж ва вве ах хо « Ален Х

Бр. шаг же вва ва. вва. т Еч ожив БУ зло сввах оф ШИ С у ШЕ чи о Ашичк У ьо вон ай» Зб» жа : а мі во За 35 хо за лю о КУ я 5 Алезь Х гмутинуний БАУ г г ве й щ- с п я т че ш Ж. Е Фі.