JP2014530624A - キャノーラにおいてfad3遺伝子の接合性を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により本明細書にその全体が組み込まれている、2011年10月21日に出願された、米国仮出願第61/550,170号の優先権を主張する。
bp 塩基対
℃ 摂氏度
DNA デオキシリボ核酸
FRET 蛍光共鳴エネルギー移動
DIG ジゴキシゲニン
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
OLP 重複プローブ
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SNP 一塩基多型
SOP 標準操作手順
SSC 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有する緩衝溶液、pH7.0
TBE Trisベース、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有する緩衝溶液、pH8.3
V ボルト
FAD−3cエンドポイントTAQMAN(登録商標)アッセイ
エンドポイントTaqMan(登録商標)アッセイは、fad−3cの一塩基多型変異を検出するためおよび育種個体群の中でfad−3c遺伝子変異を含有するキャノーラ植物の接合性の状態を決定するために開発された。fad−3c遺伝子のエキソン6および7に位置する高度に保存されたDNA配列に結合するように2種のプライマーを設計した。これらのプライマーは、変異したキャノーラ植物および変異していないキャノーラ植物において、fad−s3cの一塩基多型を含む154bpのDNA断片を増幅した。キャノーラにおけるfad−3c変異は、Huら(2006)によって記載されており、遺伝子のエキソン6およびイントロン6のスプライス部位のジャンクション中に位置する(図1)。野生型fad−3c遺伝子および変異したfad−3c遺伝子(一塩基多型、SNPからなる)の存在を検出するためのレポーター色素としてそれぞれFAMおよびVICを用いて、2種のTaqMan(登録商標)副溝結合型非蛍光性クエンチャー(MGBNFQ)プローブを設計した。これらの2種のプローブは、イントロン6上に位置する近隣の多型を回避するために特別な考慮をしてfad−3cの一塩基多型(図1)のすぐ近くに設計された。別の多型を回避することにより、fad−3c変異体植物の検出用のプローブの特異性を高める結果となった。fad−3c SNPを含有するキャノーラ植物用のTaqMan(登録商標)検出法を、キャノーラ変種「NEX828」(fad−3c SNPを含有する)、対照キャノーラ変種「クアンタム(Quantum)」(fad−3c SNPを含有しない)、およびfad−3c SNPについてヘテロ接合性であることが知られている植物から単離されたDNA試料に対して試験した。エンドポイントTaqMan(登録商標)アッセイを使用して、高処理能力の適用法、例えば、96ウェルおよび384ウェルのプレート形式で試験される、fad−3c SNPの存在を決定し、植物の接合性も決定した。
[実施例1.1]
fad−3c変異および対照キャノーラ植物を含有する異なる156種のキャノーラ植物のゲノムDNA(gDNA)試料をこの試験において試験した。改変したQiagen MagAttract植物DNAキット(Qiagen、Valencia、CA)を使用してゲノムDNAを抽出した。新鮮なキャノーラリーフディスクを、1試料あたり4枚、gDNA抽出に使用した。販売会社の説明書(Molecular Probes、Eugene、OR)に従ってPico Green法を用いて、gDNAを定量した。試料を、DNaseを含まない水で希釈して、この試験の目的のために結果として5ng/μLの濃度にした。
[実施例1.2]
TaqMan(登録商標)エンドポイントアッセイにおける使用のために、特定のTaqMan(登録商標)プライマーおよびプローブを設計した。これらのプライマーおよびプローブは、目的のSNPを含むfad−3c遺伝子の領域を増幅および検出するように設計した。これらの試薬は、キャノーラ植物中の変異したfad−3c遺伝子を検出するために、下の一覧に示されている条件で使用することができる。表1は、キャノーラ植物におけるfad−3c SNPの検出用に特別に開発されたプライマーおよびプローブの配列の一覧である。
Claims (16)
- fad−3c遺伝子を含むキャノーラ植物の接合性を決定するための方法であって、
前記キャノーラ植物からゲノムDNA試料を得るステップと、
前記ゲノムDNA試料を第1のプライマーおよび第2のプライマーと接触させることによって接触試料を作製するステップであり、前記第1のプライマーが、目的の一塩基多型の位置の上流の前記fad−3c遺伝子の領域に優先的に結合し、前記第2のプライマーが、目的の一塩基多型の下流の前記fad−3c遺伝子の領域に優先的に結合し、前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件にかけられたときにアンプリコンを生成するステップと、
前記接触試料をPCR条件にかけるステップであり、前記アンプリコンが生成されるステップと、
第1の蛍光プローブおよび第2の蛍光プローブのそれぞれが、50〜70摂氏度の間の温度で一定時間アンプリコンとハイブリッド形成するのを可能にするステップであり、目的の前記一塩基多型が前記アンプリコン中に存在しないときに、前記第1の蛍光プローブが前記アンプリコンと優先的にハイブリッド形成し、目的の前記一塩基多型が前記アンプリコン中に存在するときに、前記第2の蛍光プローブが前記アンプリコンと優先的にハイブリッド形成するステップと、
可能にするステップにおいて指定された時間の後に前記温度を上昇させるステップと、
上昇させるステップ中に前記第1および第2のプローブのそれぞれによって生じる前記蛍光を捕捉するステップと、
前記キャノーラ植物の接合性を決定するステップであり、決定するステップが、第1および第2のプローブのそれぞれによって生じる蛍光の比較を含み、ホモ接合性SNP陽性対照試料において生じた蛍光を優性に反映している第1および第2のプローブの蛍光は、目的の前記一塩基多型の存在を示し、ホモ接合性SNP陰性対照試料において生じた蛍光を優性に反映している第1および第2のプローブの蛍光は、目的の前記一塩基多型の存在の欠如を示し、ヘテロ接合性SNP陽性対照試料において生じた蛍光を優性に反映している第1および第2のプローブの蛍光は、前記キャノーラ植物が、目的の前記一塩基多型を含む第1のアレルと、目的の前記一塩基多型を欠いている第2のアレルとを含むことを示すステップと
を含む、方法。 - 前記アンプリコンが、91−154塩基対からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記一塩基多型が、GからAへの多型からなる、請求項1に記載の方法。
- 前記野生型配列が、前記位置でグリシンを含む、請求項3に記載の方法。
- 異種交配させたキャノーラ植物の育種の遺伝子移入の検証に使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーが配列番号2および配列番号3を含み、前記第1および第2のプローブが配列番号5および4を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のプローブが、蛍光色素およびクエンチャーの双方で標識されている、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のプローブが、前記第1のプローブの5’末端に前記蛍光色素としてFAMを含み、前記第1のプローブの3’末端上にMGBクエンチャーを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記第2のプローブが、前記第2のプローブの5’末端にVICで標識され、前記第2のプローブの3’末端にMGBクエンチャーで標識されている、請求項7に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号4を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法の蛍光結果が、プレートリーダー内で直接に読み取られる、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA試料が、畑のキャノーラ植物から得られる、請求項1に記載の方法。
- 上昇させるステップが、一定時間あたり実質的に均一な温度上昇で前記温度を上昇させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 上昇させるステップ中に前記第1および第2のプローブのそれぞれによって生じる前記蛍光が、捕捉するステップにおいて、上昇させるステップの各上昇中に捕捉される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を行うためのキットであって、前記第1のプライマーと、前記第2のプライマーと、前記第1のプローブと、前記第2のプローブとを含むキット。
- 前記第1のプライマーが配列番号2からなり、前記第2のプライマーが配列番号3からなり、前記第1のプローブが配列番号5からなり、前記第2のプローブが配列番号4からなる、請求項15に記載のキット。
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