TWI843445B - 周邊血幹細胞擴增方法 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種周邊血幹細胞擴增方法，其包含：提供一周邊血；該周邊血分離出一單核細胞部份及一缺血小板血漿部分；處理該周邊血以得到一增強富含血小板血漿；以及該單核細胞部分以一擴增培養基擴增一周邊血幹細胞，其中該擴增培養基包含該缺血小板血漿部分、該增強富含血小板血漿及一細胞激素。

Description

周邊血幹細胞擴增方法

本發明關於一種周邊血幹細胞擴增方法，特別關於一種提高純度的周邊血幹細胞擴增方法。

近年來再生醫學發展快速，幹細胞療法已能初步應用於退化性關節炎、軟骨缺損、難癒傷口、神經疾病、腦損傷、癌症、退化性眼疾、脊髓損傷等疾病治療上。目前幹細胞療法主要還是使用自體幹細胞，自體幹細胞的來源有骨髓、臍帶血、牙髓、脂肪、周邊血等，其中周邊血不需麻醉即可取得，但其中所含的幹細胞數目稀少(約體內幹細胞的1%~10%)，因此應用非常受限。

周邊血幹細胞(Peripheral Blood Stem Cell, PBSC)主要是造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cell, HSC)，其為人體血液系統及免疫系統的製造工廠，可經由分化成為各種血液細胞及免疫細胞，如運輸氧氣的紅血球、幫助凝血的血小板、抵抗感染的白血球、產生抗體的淋巴球等。目前已經可以應用於阿茲海默症、心血管疾病、神經母細胞瘤、糖尿病併發慢性潰瘍、腦中風、肝硬化、第一型糖尿病、糖尿病併發下肢缺血等。

由於周邊血幹細胞難以擴增，大多數都無法達到足夠的純度，頂多僅有10%左右的純度，導致無法提高治療的療效。因此需要有能提高純度的周邊血幹細胞擴增方法。

本發明提供一種周邊血幹細胞擴增方法，其包含：提供一周邊血；該周邊血分離出一單核細胞部份及一缺血小板血漿部分；處理該周邊血以得到一增強富含血小板血漿；以及該單核細胞部分以一擴增培養基擴增一周邊血幹細胞，其中該擴增培養基包含該缺血小板血漿部分、該增強富含血小板血漿及一細胞激素。

於某些具體實施例中，在擴增起始，該擴增培養基進一步包含洋菜。

於某些具體實施例中，該增強富含血小板血漿係由下列步驟萃取而得：離心該周邊血以得到血漿；離心該血漿以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl ₂溶液以對該富含血小板血漿進行震盪活化，其中該富含血小板血漿的體積為CaCl ₂溶液體積的3~5倍；離心已活化之該富含血小板血漿以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步離心以得到該增強富含血小板血漿。

於某些具體實施例中，該擴增係在一3D振盪器及一圓孔超低吸附盤中進行。

於某些具體實施例中，該缺血小板血漿部分之濃度在擴增期間逐漸降低。

於某些具體實施例中，該擴增係在一CO ₂培養箱中進行，且CO ₂濃度為5%。

於某些具體實施例中，該增強富含血小板血漿之濃度範圍為2~13 vol%。

於某些具體實施例中，該細胞激素係包含選自下列群組之一或多種：Fms相關受體酪胺酸激酶、幹細胞因子、介白素3、介白素6以及甲狀腺過氧化酶。

於某些具體實施例中，該缺血小板血漿部分之濃度範圍為0~30 vol%。

於某些具體實施例中，在擴增末期進一步使用磁珠分離系統分選該周邊血幹細胞。

本發明所提供之周邊血幹細胞擴增方法能大幅提高表現CD34抗原分子的造血幹細胞(CD34+ HSC)的純度，甚至可達到90%以上的純度，以實際應用在慢性缺血性腦中風及嚴重下肢缺血症或其他疾病的治療上。加上周邊血的取得容易，有助於臨床上應用的便利性及安全性。

有關於本發明其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。

如本文所用，冠詞「一」、「一個」以及「任何」是指一個或多於一個(即至少一個)的物品的文法物品。例如，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。

本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於5%以內，較佳為於3%以內，以及更佳者為於1%以內。於文中所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。

如本文所用，術語「室溫」或「常溫」，若無特別說明，係指18至28 ^oC之間之任意溫度區間。

如本文所用，術語「富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma, PRP)」泛指經離心血漿所得到血小板濃度較高之部分，包含但不限於血小板濃度在5×10 ⁸cells/mL~5×10 ⁹cells/mL，例如6×10 ⁸cells/mL、7×10 ⁸cells/mL、8×10 ⁸cells/mL、9×10 ⁸cells/mL、1×10 ⁹cells/mL、2×10 ⁹cells/mL、3×10 ⁹cells/mL、4×10 ⁹cells/mL、5×10 ⁹cells/mL。術語「缺血小板血漿(Platelet-Poor Plasma, PPP)」係指經離心血漿所得到上層血小板濃度較低之部分。術語「經活化之富含血小板血漿」係指富含血小板血漿再經過CaCl ₂(或進一步和玻璃珠一起震盪)處理而得的具有更多生長因子之富含血小板血漿。術語「增強富含血小板血漿(Platelet-Rich Plasma Plus, PRP-plus)」係指經活化之富含血小板血漿再經進一步離心或後續處理所得到之血小板血漿。

如本文所用，術語「擴增」是指任何將細胞數目、或是純度增加的過程。術語「擴增培養基」是指用於上述擴增過程的細胞培養物質，包含但不限於基礎培養基、或是含有細胞激素(cytokine)、增強富含血小板血漿、自體血漿、營養物、洋菜(agar)、2-巰基乙醇、丙酮酸鈉或盤尼西林/鏈黴素(Penicillin/Streptomycin)等中任一項或多項物質之培養基。

如本文所用，術語「擴增末期」亦指在細胞數目、或是純度增加的最後階段，不包含後續的保存階段，在一特定實施例中可以是擴增的第11~14天。

如本文所用，術語「周邊血幹細胞」、「造血幹細胞」「CD34+幹細胞」或其類似用語係指本文所要得到的幹細胞產物，而「周邊血幹細胞」係從其來源的角度描述，「造血幹細胞」則從其幹細胞功能角度描述，「CD34+幹細胞」則從其表面抗原特性角度描述，皆意指從周邊血取得之幹細胞或是之後經擴增之幹細胞。

如本文所用，術語「圓孔超低吸附盤」是指呈現圓球或是較立體空間之培養孔盤，且以不容易吸附材質製成，包含但不限於在培養孔盤的聚苯乙烯材料表面共價鍵結合一層水凝膠。

如本文所用，術語「磁珠分離系統」係指應用奈米級超順磁珠與特定細胞表面抗原的高度特異性抗體結合來分離所需特定細胞的分離系統。

如本文所用，術語「血漿」係指周邊血中不含血球剩下的清液部份。「血漿」可再分離出「富含血小板血漿」及「缺血小板血漿」。如本文所用，「缺血小板血漿部分」及「缺血小板血漿」僅為了便於分別描述不同製程取出的材料，但本質皆是指血漿中血小板濃度相對低之部分。

如本文所用，術語「周邊血單核細胞」(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)意指不包括骨髓的血液中任何擁有圓形細胞核的細胞，包含但不限於淋巴細胞（T細胞、B細胞、NK細胞）和周邊血幹細胞，不包含紅血球與血小板。

如本文所用，術語「洋菜(agar)」意指從海藻植物(包含但不限於紅藻)提煉出包含多糖和膠質的混合物，包含但不限於線性多醣洋菜糖和硫瓊膠所組成的混合物。

如本文所用，術語「細胞激素(cytokine)」意指生物細胞溝通中用作訊號傳遞之蛋白質或多肽，包含但不限於干擾素-γ、介白素3、介白素4、介白素3、介白素10、介白素13、轉化生長因子β等。

如圖1所示，本發明提供一種周邊血幹細胞擴增方法，其包含：提供一周邊血(步驟S10)；該周邊血分離出一單核細胞部份及一缺血小板血漿部分(步驟S20)；處理該周邊血以得到一增強富含血小板血漿(步驟S21)；以及該單核細胞部分以一擴增培養基擴增一周邊血幹細胞，其中該擴增培養基包含該缺血小板血漿部分、該增強富含血小板血漿及一細胞激素(步驟S30)。

於某些具體實施例中，上述周邊血幹細胞擴增方法進一步包含：在擴增起始，該擴增培養基進一步包含洋菜。其中，該洋菜的濃度可以佔該擴增培養基之1 vol%以下，例如0.05 vol%、0.1 vol%、0.15 vol%、0.2 vol%、0.25 vol%、0.3 vol%、0.35 vol%、0.4 vol%、0.45 vol%、0.5 vol%、0.55 vol%、0.6 vol%、0.65 vol%、0.7 vol%、0.75 vol%、0.8 vol%、0.85 vol%、0.9 vol%。

於某些具體實施例中，該增強富含血小板血漿係由下列步驟萃取而得：離心該周邊血以得到血漿；離心該血漿以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl ₂溶液以對該富含血小板血漿進行震盪活化，其中該富含血小板血漿的體積為CaCl ₂溶液體積的3~5倍；離心已活化之該富含血小板血漿以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步離心以得到該增強富含血小板血漿。

於某些具體實施例中，該富含血小板血漿的體積為CaCl ₂溶液體積的3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍。

於某些具體實施例中，在CaCl ₂溶液中進一步加入玻璃珠以對該富含血小板血漿進行震盪活化。

於某些具體實施例中，該富含血小板血漿與該CaCl ₂溶液之總體積和該玻璃珠之體積比為7:1至13:1，例如7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1。

於某些具體實施例中，上述增強富含血小板血漿製備方法進一步包含：真空冷凍乾燥該增強富含血小板血漿以得到粉狀之該增強富含血小板血漿。

於某些具體實施例中，該缺血小板血漿與該上清液之體積比為4:6至6:4，例如4:6、4.2:5.8、4.4:5.6、4.6:5.4、4.8:5.2、5:5、5.2:4.8、5.4:4.6、5.6:4.4、5.8:4.2、6:4。

於某些具體實施例中，CaCl ₂溶液的濃度為5 wt% ~ 15wt%，例如5 wt%、6 wt%、7 wt%、8 wt%、9 wt%、10 wt%、11 wt%、12 wt%、13 wt%、14 wt%、15 wt%。

於某些具體實施例中，該擴增係在一3D振盪器及一圓孔超低吸附盤中進行。

於某些具體實施例中，該缺血小板血漿部分之濃度在擴增期間逐漸降低。

於某些具體實施例中，該擴增係在一CO ₂培養箱中進行，且CO ₂濃度為5%。

於某些具體實施例中，該增強富含血小板血漿之濃度範圍為2~13 vol%，例如2 vol%、3 vol%、4 vol%、5 vol%、6 vol%、7 vol%、8 vol%、9 vol%、10 vol%、11 vol%、12 vol%、13 vol%。

於某些具體實施例中，該細胞激素係包含選自下列群組之一或多種：Fms相關受體酪胺酸激酶、幹細胞因子、介白素3、介白素6以及甲狀腺過氧化酶。

於某些具體實施例中，該缺血小板血漿部分之濃度範圍為0~30 vol%，例如1 vol%、2 vol%、3 vol%、4 vol%、5 vol%、6 vol%、7 vol%、8 vol%、9 vol%、10 vol%、11 vol%、12 vol%、13 vol%、14 vol%、15 vol%、16 vol%、17 vol%、18 vol%、19 vol%、20 vol%、21 vol%、22 vol%、23 vol%、24 vol%、25 vol%、26 vol%、27 vol%、28 vol%、29 vol%、30 vol%。

於某些具體實施例中，Fms相關受體酪胺酸激酶於培養基的濃度為80~120 ng/mL，包含但不限於85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL、105 ng/mL、110 ng/mL、115 ng/mL。於某些具體實施例中，幹細胞因子於培養基的濃度為80~120 ng/mL，包含但不限於85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL、105 ng/mL、110 ng/mL、115 ng/mL。於某些具體實施例中，介白素3於培養基的濃度為40~60 ng/mL，包含但不限於45 ng/mL、55 ng/mL。於某些具體實施例中，介白素6於培養基的濃度為10~30 ng/mL，包含但不限於15 ng/mL、25 ng/mL。於某些具體實施例中，甲狀腺過氧化酶於培養基的濃度為80~120 ng/mL，包含但不限於85 ng/mL、90 ng/mL、95 ng/mL、105 ng/mL、110 ng/mL、115 ng/mL。

材料與實驗

促進生長材料

1. 細胞激素

1.1 Fms相關受體酪胺酸激酶 (Fms Related Receptor Tyrosine Kinase 3, FLT-3) (Medchemexpress Cat. No.: HY-P70178，美國): 100 ng/mL

1.2 幹細胞因子 (Stem Cell Factor, SCF) (Thermo fisher scientific Cat #PEP-0860，美國): 100 ng/mL

1.3 介白素3 (Interleukin 3, IL-3) (Thermo fisher scientific Catalog # PHC0031，美國): 50 ng/mL

1.4 介白素6 (Interleukin 6, IL-6) (Sigma Aldrich Catalog #I1395，美國): 20 ng/mL

1.5甲狀腺過氧化酶 (Thrombopoietin, TPO) (Sigma Aldrich Catalog #GF037，美國): 100 ng/mL

2 增強富含血小板血漿 (PRP-plus)

抽取受試者110~150 mL全血至包含抗凝血劑(citrate phosphate dextrose adenine, CPDA-1)的密閉式血袋(JMS，日本廣島)中，並在無菌正壓環境中操作。離心步驟中，以720 × g離心5分鐘以得到三層產物：血漿、紅血球 (pack RBC)、含白血球和血小板之膚色血球 (buffy coat)。取1mL血漿使用自動血液分析定義其血小板濃度，將血漿以1440 × g離心10分鐘以得到懸浮在上層的缺血小板血漿(Platelet-Poor Plasma, PPP)以及沉積在下層的片狀沉澱(Pellet)，再將片狀沉澱與PPP依照定義的血小板濃度調整為1×10 ⁹cells/mL的富含血小板血漿(PRP)。活化步驟中，使用10 wt% CaCl ₂加入PRP中進行活化，收集的PRP與CaCl ₂溶液之體積比為4:1，並再加入以上溶液總體積約1/10體積量的玻璃珠後，以200 rpm振盪3~4小時以進行活化，活化後再以1440 × g離心10分鐘取出上清液以得到已活化的PRP，此步驟能釋放更多生長因子。以相等體積的PPP稀釋已活化的PRP，再以2330 × g離心5分鐘取出上清液以得到增強富含血小板血漿(PRP-plus)，這樣能去掉多餘的纖維蛋白(fibrin，纖維蛋白過多會影響凍乾產品的回溶率)。最後以等份量沉積在無菌注射瓶中。最後，在凍乾步驟中，所有水分都藉由真空冷凍乾燥排出(約19~23小時)以得到PRP-plus之凍乾粉末。真空冷凍乾燥係先90分鐘預冷-30 ^oC，5分鐘冷凝-40 ^oC，5分鐘抽真空0.2Torr，最後以10 ^oC加熱乾燥成粉末。上述PRP-plus粉末依照不同體積濃度加入擴增培養基中。

上述PRP-plus提供了大量細胞激素以及許多生長因子，例如表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、似胰島素生長因子結合蛋白(insulin-like growth factor-binding protein, IGFBP)、血小板來源生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor, PDGF-R)、血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)等。

營養物

1. 左旋麩醯胺酸(L-glutamine): 2mM

2. MEM 非必需胺基酸溶液: 1 vol%

其它試劑

1. 2-巰基乙醇 (2-mercaptoethanol): 0.1mM

2. 丙酮酸鈉 (sodium pyruvate): 1 vol%

流式細胞儀分析

將300 µL 細胞懸浮液樣本稀釋到1～3×10 ⁷個細胞之總有核細胞濃度。針對要分析的目標CD34 ⁺、CD45 ⁺、CD3 ⁺或CD4 ⁺分別加入藻紅素(phycoerythrin, PE) 標記之小鼠 IgG1 抗人類 CD34 抗體(CD34 MicroBead Kit UltraPure, human - Miltenyi Biotec (#130-046-702))、螢紅異硫代氰酸鹽（fluorescein isothiocyanate, FITC）標記之小鼠 IgG1 抗人類 CD45 抗體(CD45 MicroBead Kit UltraPure, human - Miltenyi Biotec (#130-121-563)))、FITC 標記之小鼠 IgG1 抗人類 CD3 抗體(Anti-IgG MicroBeads, human (#130-047-501); CD3 MicroBeads, human | T cells - Miltenyi Biotec (#130-050-101)) 、別藻藍蛋白Allophycocyanin (APC)標記之小鼠 IgG1 抗人類 CD4 抗體(CD4 MicroBeads, human | T cells - Miltenyi Biotec (#130-045-101))，並加入存活染劑至終濃度為1 μg/mL，取充分混合之細胞樣本100 μL，置管底並混合。避光培養20分鐘，取稀釋（1X）紅血球裂解緩衝液2 mL加入。

在流式細胞儀上獲得數據之前，立即將充分混合之懸浮計數磁珠100 μL移至上述製備之細胞檢品中。管子上蓋，並以上下倒轉方式緩慢混合。流式細胞儀(BD FACS AriaIII，美國)立即進行液流收取，收集至少100個CD34+細胞。依照其螢光訊號在分析軟體透過繪圖區與框選獲取與分析，計算300 µL 細胞懸浮液中表達CD34 ⁺、表達CD45 ⁺、表達CD3 ⁺或表達CD4 ⁺之細胞數，再藉此計算出其佔周邊血單核細胞之比例。

取得周邊血幹細胞

受試者先連續施打5天(10 μg/kg)白血球生長激素(Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF)，用以將CD34 ⁺從骨髓驅動至血液中便於收集。施打G-CSF後，受試者血液中的白血球通常會上升10倍左右，此時在舒適安全的環境下採集血液約3~5小時，並利用血液血球分離機(Terumo spectra optia，日本)分離出約250 mL細胞袋(細胞袋中包含了欲擴增的周邊血幹細胞及其他種周邊血單核細胞，不包含血小板、紅血球)、缺血小板血漿袋(缺血小板血漿部分則做為自體血漿使用)，最後分別分裝至冷凍小管中以液態氮−196 °C進行冷凍。作為自體血漿使用，冷凍前更佳可將缺血小板血漿部分的紅血球含量降低，若血溶比大於2則以1000 × g 離心10分鐘取上清液，接著藉由離心將血小板含量降低，以720 × g 離心5分鐘取上清液以得到所需之缺血小板血漿部分。

增強富含血小板血漿之濃度實驗

將4 mL解凍的上述細胞稀釋在36 mL基礎培養基中，200 × g離心5分鐘，丟棄上清液，用20 mL PBS清洗完再重複上述離心。重新將細胞懸浮於擴增培養基並適時更換擴增培養基，其包含基礎培養基 10 mL、前述材料與實驗中之營養物及其他試劑、20 vol%自體血漿和1 vol%盤尼西林/鏈黴素溶液(只在第1次加)，此外不同組別還分別添加0 vol%、5 vol %、15 vol %及30 vol %之PRP-plus。在5%CO ₂低氧氣培養箱中將細胞以密度2~5 × 10 ⁶/mL培養於35mm的塑膠培養皿中，並在第1天、第5天及第6天取出300 μL細胞懸浮液量測細胞數及流式細胞分析。

如圖2A所示，擴增到第5天，擴增培養基有加5 vol % PRP-plus的組別有最高的CD34 ⁺比例，代表5 vol % PRP-plus最能提高周邊血幹細胞的純度。如圖2B亦顯示，擴增培養基有加5 vol % PRP-plus的組別其CD34 ⁺細胞數都比其他組別多，代表5 vol % PRP-plus能提高周邊血幹細胞的細胞數。

使用細胞激素及懸浮培養的實驗測試

將4 mL解凍的上述細胞稀釋在36 mL基礎培養基中，200 × g離心5分鐘，丟棄上清液，用20 mL PBS清洗完再重複上述離心。重新將細胞懸浮於擴增培養基並定期更換，擴增培養基包含基礎培養基10 mL、前述材料與實驗中之營養物及其他試劑、20 vol%自體血漿和1 vol%盤尼西林/鏈黴素溶液(只在第1次加)，此外一個組別進一步添加前述材料與實驗中之細胞激素並在圓孔極低吸附盤(round-well ultra-low attachment plate)中及3D震盪器上培養，一個組別不添加細胞激素並在35mm的塑膠培養皿培養。在5%CO ₂低氧氣培養箱中將細胞以密度2~5 × 10 ⁶/mL培養，並在第4天、第7天、第11天及第14天取出300 μL細胞懸浮液量測周邊血單核細胞數及CD34 ⁺細胞數，並在第4天、第7天、第12天、第19天以顯微鏡拍攝細胞生長狀態。

如圖3A及圖4A所示，有使用細胞激素培養和懸浮培養，周邊血單核細胞數及CD34 ⁺細胞數都在持續成長，且形成明顯的小球聚落(白箭頭處)。如圖3B所示，未使用細胞激素培養及懸浮培養，周邊血單核細胞數及CD34 ⁺細胞數都降至0，圖4B也顯示周邊血幹細胞沒有辦法進行擴增。圓孔極低吸附盤和3D震盪器讓周邊血幹細胞進行3D增殖成球狀，使細胞較不易因分散而死亡，亦可使周邊血幹細胞不貼附並避免分化。

實施例 周邊血幹細胞擴增方法

擴增第1天，先回溫市售基礎培養基，在37 °C水浴中解凍前述細胞，將4 mL解凍的細胞慢慢稀釋在36 mL基礎培養基中。混合均勻後取出300 μL細胞懸浮液量測細胞數及流式細胞分析。接著，在離心步驟中，以200 × g離心剩下的細胞5分鐘，丟棄上清液。用20 mL磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)清洗完再重複上述離心步驟，並重新將細胞懸浮於第一擴增培養基，其包含基礎培養基 10mL、5 vol% PRP-plus、前述材料與實驗中之細胞激素、營養物及其他試劑、20 vol%自體血漿和1 vol%盤尼西林/鏈黴素溶液。在5%CO ₂低氧氣培養箱中將細胞以密度2~5 × 10 ⁶/mL培養於35mm的塑膠培養皿中，其中還添加1 mL瓊脂培養基(0.4 vol% 洋菜)，並將培養皿放在3D振盪器上持續輕微搖晃避免細胞貼附底壁。

第4天將細胞聚落從洋菜培養皿中取出，依序以400 × g、500 × g或600 × g進行離心5分鐘(離心後丟棄上清液並以PBS清洗)，並重新將細胞懸浮於第二擴增培養基，其包含基礎培養基 10 mL、5 vol% PRP-plus、前述材料與實驗中之細胞激素、營養物及其他試劑和10 vol%自體血漿。取出300 μL細胞懸浮液量測細胞數及流式細胞分析。在上述低氧氣培養箱中將細胞聚落培養於圓孔極低吸附盤中，以800 × g離心5分鐘，並將吸附盤放在3D振盪器上。第7天及第10天都需更新第二擴增培養基並量測細胞數及流式細胞分析。

第14天以磁珠分離系統 (Miltenyi Biotec MACS，德國)， 依照CD34 Multisort Kit的操作說明，將待分選之細胞懸浮液與CD34 ⁺抗原結合的磁珠(Miltenyi Biotec MACS，德國)混合，通過 磁場平台結合分選柱將富含表現CD34抗原分子的造血幹細胞(CD34 ⁺)篩選出來，量測細胞數及流式細胞分析，使用PBS清洗後以600 × g進行離心5分鐘並丟棄上清液。臨床使用上，則可透過自動細胞分選儀CliniMACS Plus加上CliniMACS CD34試劑系統 (FDA核准臨床CD34分選系統)，分選出的高純度CD34 ⁺細胞可直接用於治療臨床上人類疾病。

重新將細胞懸浮於第三擴增培養基，其包含基礎培養基 10 mL、5 vol% PRP-plus、前述材料與實驗中之細胞激素、營養物及其他試劑和5 vol%自體血漿。在上述低氧氣培養箱中將CD34 ⁺造血幹細胞以密度2~5 × 10 ⁶/mL培養於圓孔極低吸附盤中，以800 × g離心5分鐘，並將吸附盤放在3D振盪器上。至此周邊血幹細胞的純度已經到90%以上，接下來是維持保存的步驟，準備將周邊血幹細胞冷凍並使解凍後的存活率最高。

第17天照樣量測細胞數及流式細胞分析，使用PBS清洗後以600 × g進行離心5分鐘並丟棄上清液。重新將細胞懸浮於第四擴增培養基，其包含基礎培養基 10 mL、5 vol% PRP-plus、前述材料與實驗中之細胞激素、營養物及其他試劑和2 vol%自體血漿。在上述低氧氣培養箱中將CD34 ⁺造血幹細胞以密度2~5 × 10 ⁶/mL培養於圓孔極低吸附盤中，以800 × g離心5分鐘，並將吸附盤放在3D振盪器上。第19天重複第17天的步驟，唯一的差別是改採用第五擴增培養基，其包含基礎培養基10 mL、5 vol% PRP-plus、前述材料與實驗中之細胞激素、營養物及其他試劑。

第21天依舊量測細胞數及流式細胞分析，使用PBS清洗後以600 × g進行離心5分鐘。重新將10 vol%的細胞與90 vol%自體血漿形成凍存溶液，接著加入抗凍劑-二甲基亞碸(DMSO)，凍存溶液與DMSO的體積比為9:1。分裝到冷凍小瓶中並儲存在液氮筒中，剩餘細胞可用於通過 CD34、CD45、CD133、CD314、CD3、CD56 和 CD4 等評估造血幹細胞的自發分化潛能。

周邊血幹細胞擴增結果

如圖5所示，本發明實施例之周邊血幹細胞擴增方法到了第14天磁珠分選後可以得到純度達到90%的CD34 ⁺周邊血幹細胞。除此之外，為了進一步確認擴增的CD34 ⁺周邊血幹細胞有正常分化能力，將90 vol%擴增的CD34 ⁺周邊血幹細胞與10 vol%自體血漿培養以進行自動分化。如圖6所示，大概到第18天CD34 ⁺比例已大幅下降，顯示有進行分化。

在第28天量測表達CD45 ⁺抗原細胞數、表達CD3 ⁺抗原細胞數、表達CD4 ⁺抗原細胞數。如圖7A至圖7C顯示，表達CD45 ⁺抗原細胞比例95.4%、表達CD3 ⁺抗原細胞比例72.14%、表達CD4 ⁺抗原細胞比例20.2%。也就是說，CD34 ⁺周邊血幹細胞可以分化成CD4 ⁺T 細胞 (同時表達CD4 ⁺抗原和CD3 ⁺抗原)、淋巴球細胞(表達CD45 ⁺抗原)。

本發明實施例之周邊血幹細胞擴增方法不使用動物血清改採自體血漿培養，並以90%自體血漿凍存，亦使用自體增強富含血小板血漿可以減少因不同物種而導致免疫反應。在一開始使用0.4 vol% 洋菜使細胞聚集成團塊，因此細胞較不易因分散而死亡。第4天開始使用圓孔超低吸附盤並搭配離心，讓周邊血幹細胞進行3D增殖成球狀，使細胞較不易因分散而死亡。使用3D振盪器讓細胞處於如血液中流動的環境，避免貼附也可阻止分化。在低氧氣培養能阻止周邊血幹細胞分化、維持幹細胞特性。第14天分選高純度造血幹細胞後，逐步降低自體血漿濃度至無血清，阻止造血幹細胞分化、維持幹細胞特性及高純度。

本發明已透過上述之實施例揭露如上，僅是本發明部分較佳的實施例選擇，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此一技術領域具有通常知識者，在瞭解本發明前述的技術特徵及實施例，並在不脫離本發明之精神和範圍內所做的均等變化或潤飾，仍屬本發明涵蓋之範圍，而本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之請求項所界定者為準。

無

圖1為本發明實施例之周邊血幹細胞擴增方法流程圖。

圖2A為周邊血幹細胞擴增方法分別使用0 vol%、5 vol%、15 vol%、30 vol%之增強富含血小板血漿，在第1天、第5天、第6天之CD34 ⁺比例折線圖。圖2B為周邊血幹細胞擴增方法分別使用0 vol%、5 vol%、15 vol%、30 vol%之增強富含血小板血漿，在第1天、第5天、第6天之CD34 ⁺細胞數折線圖。

圖3A為周邊血幹細胞擴增方法使用細胞激素或不使用細胞激素，在第4天、第7天、第11天、第17天之周邊血單核細胞數折線圖。圖3B為周邊血幹細胞擴增方法使用細胞激素或不使用細胞激素，在第4天、第11天之CD34 ⁺細胞數折線圖。

圖4A為本發明實施例之周邊血幹細胞擴增方法使用5%增強富含血小板血漿並使用細胞激素，在第4天、第7天、第12天、第19天之40倍率顯微鏡照片(比例尺100 μm)。圖4B為使用一般細胞擴增方法，在第4天、第7天、第12天、第19天之40倍率顯微鏡照片(比例尺100 μm)。

圖5為本發明實施例之周邊血幹細胞擴增方法使用5%增強富含血小板血漿並使用細胞激素，在第4天、第11天、第14天之CD34 ⁺比例折線圖。

圖6為本發明實施例所擴增之周邊血幹細胞，在分化實驗中第1天、第7天、第18天、第19天、第28天之CD34 ⁺比例折線圖。

圖7A為本發明實施例所擴增之周邊血幹細胞(CD34 ⁺)，在分化實驗中CD45 ⁺流式細胞分析結果圖。圖7B為本發明實施例所擴增之周邊血幹細胞，在分化實驗中CD3 ⁺流式細胞分析結果圖。圖7C為本發明實施例所擴增之周邊血幹細胞，在分化實驗中CD4 ⁺流式細胞分析結果圖。

Claims (9)

1. 一種周邊血幹細胞擴增方法，其包含：提供一周邊血；該周邊血分離出一單核細胞部份及一缺血小板血漿部分；處理該周邊血以得到一增強富含血小板血漿；以及該單核細胞部分以一擴增培養基擴增一周邊血幹細胞，其中該擴增培養基包含該缺血小板血漿部分、該增強富含血小板血漿及一細胞激素，其中該缺血小板血漿部分之濃度在擴增期間逐漸降低。
2. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中在擴增起始，該擴增培養基進一步包含洋菜。
3. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中該增強富含血小板血漿係由下列步驟萃取而得：離心該周邊血以得到血漿；離心該血漿以得到富含血小板血漿及缺血小板血漿；加入CaCl₂溶液以對該富含血小板血漿進行震盪活化，其中該富含血小板血漿的體積為CaCl₂溶液體積的3~5倍；離心已活化之該富含血小板血漿以得到上清液；以及以該缺血小板血漿稀釋該上清液並進一步離心以得到該增強富含血小板血漿。
4. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中該擴增係在一3D振盪器及一圓孔超低吸附盤中進行。
5. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中該擴增係在一CO₂培養箱中進行，且CO₂濃度為5%。
6. 如請求項3所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中該增強富含血小板血漿之濃度範圍為2~13vol%。
7. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中該細胞激素係包含選自下列群組之一或多種：Fms相關受體酪胺酸激酶、幹細胞因子、介白素3、介白素6以及甲狀腺過氧化酶。
8. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中該缺血小板血漿部分之濃度範圍為0~30vol%。
9. 如請求項1所述之周邊血幹細胞擴增方法，其中在擴增末期進一步使用磁珠分離系統分選該周邊血幹細胞。