TWI841296B - 用作激酶抑制劑的化合物及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於以氮原子作為雜環原子的雜環化合物藥物合成領域，具體涉及一類用作激酶抑制劑的化合物及其應用，還涉及該化合物的游離鹼晶型的製備。該用作激酶抑制劑的化合物為如式1所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽、溶劑化物或前藥。以上化合物通過生物活性實驗證實，對EGFR和Her2的外顯子20插入突變、EGFR的外顯子19缺失、外顯子21的點突變具有良好的抑制活性，可作為相關藥物的原藥使用。

Description

用作激酶抑制劑的化合物及其應用
本發明屬於以氮原子作為雜環原子的雜環化合物的藥物合成領域，具體涉及一類用作激酶抑制劑的化合物及其應用。
表皮生長因數受體屬於受體酪氨酸激酶（RTK）家族，其包括EGFR/ERBB1、HER2/ERBB2/NEU、HER3/ERBB3和HER4/ERBB4。表皮生長因數受體通過同源二聚或異源二聚啟動其酪氨酸激酶活性，接著使它的底物磷酸化，從而啟動細胞內與它相關的多個下游通路，如涉及細胞存活的PI3K-AKT-mTOR通路和涉及細胞增殖的RAS-RAF-MEK-ERK通路等。表皮生長因數受體的突變或擴增等都會導致表皮生長因數受體激酶的啟動，從而導致人類多種疾病的發生，如惡性腫瘤。如在非小細胞肺癌患者中，美國患者中大約有10%以上的患者具有EGFR突變，而亞洲患者中EGFR突變的患者比例能達到近50%。同時，在非小細胞肺癌患者中，具有HER2突變的發病率大約在2-4%。
EGFR突變主要包括缺失、插入和點突變等，其中，外顯子19缺失和外顯子21的L858R點突變占到EGFR突變的近90%。對於具有這些EGFR突變的腫瘤患者，目前已經上市的EGFR-TKI包括一代的易瑞沙、特羅凱、凱美納，二代的阿法替尼和達克替尼以及三代的奧西替尼。其他的10%的EGFR突變主要涉及EGFR的外顯子18和20，並且，EGFR外顯子20的插入突變占到整個EGFR突變的9%左右。具有HER2突變的腫瘤患者，最常見的HER2突變是HER2外顯子20的插入突變。
TAK-788對於EGFR和HER2的外顯子20插入突變有治療效果，該化合物已在美國上市，從其已經報導的臨床實驗結果來看，客觀緩解率有43%。最近有報導DZD9008對於用於治療EGFR或HER2突變的晚期非小細胞肺癌有效果，EGFR外顯子20ins的客觀緩解率40%，療效不盡如人意。
為了滿足臨床上EGFR和HER2突變患者，尤其是EGFR、HER2外顯子20插入突變患者的用藥需求，WO2021180238披露了一系列具有優良的EGFR和HER2外顯子20插入突變活性及EGFR外顯子19缺失和外顯子21的L858R點突變的化合物，極有潛力開發成治療相關疾病的藥物。其中涉及一類具有三五並胺結構的化合物，經進一步研究表明，該三五並胺結構的立體構型非常重要，當由反式轉為順式時，其體內藥效會有更好的效力，且在相關疾病的不同突變中也有很好的治療作用。在後續的研發中，為了找到更加穩定且生物利用度更高的游離鹼化合物，本發明進行了游離鹼化合物的多晶型研究和篩選。
本發明的目的是提供一類用作激酶抑制劑的化合物，其屬於順式三五並胺結構，對EGFR、HER2外顯子20插入突變、EGFR外顯子19缺失和外顯子21的點突變具有良好的抑制活性。本發明的化合物比專利WO2021180238中相應反式結構的化合物的藥效更好，適用性更廣。
本發明的第二個目的在於提供上述化合物在製備用於治療由EGFR突變和/或HER2突變導致的相關疾病的藥物中的應用。
本發明還涉及上述化合物游離鹼晶型的製備，進行了多晶型研究，從而確定穩定性高且生物利用度更高的實用晶型。
為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是：
一類用作激酶抑制劑的化合物，所述用作激酶抑制劑的化合物為如式1所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽、溶劑化物或前藥：
式1；
式1中，X選自CH、N；
R 1選自 、 ，R 5為H、C1-C3的烷基、C1-C3的氟代烷基；
R 20、R 21、R 22各自獨立地選自甲基或氘代甲基；
R 3選自C1-C3的烷基、C1-C3的鹵代烷基；
R 40、R 41、R 42各自獨立地選自H、D、F。
以上化合物通過生物活性實驗證實，對EGFR和HER2的突變具有良好的抑制活性，可作為相關藥物的原藥使用。
在以上原藥的基礎上，原藥的“藥學上可接受的鹽”指的是一種藥學上可接受的並且擁有母體化合物的所希望的藥理學活性的鹽。此類鹽包括：
與無機酸形成的酸加成鹽，該無機鹽例如是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等，典型的無機酸鹽選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽。與有機酸形成的酸加成鹽，該有機酸例如是甲酸、乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡庚糖酸、4,4’-亞甲基雙-(3-羥基2-烯-1-羧酸)、3-苯丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等；或存在於母體化合物中的酸性質子與一種有機鹼（例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲葡糖胺等）配位形成的鹽。典型的有機酸鹽選自甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、丙酮酸鹽、羥乙酸鹽、乙二酸鹽、丙二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽，羥乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽、谷氨酸鹽、抗壞血酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽。容易理解，該藥學上可接受的鹽是無毒的。
溶劑化物為含有溶劑的化合物，如水合物、二甲基亞碸合物等等。
前藥是指一種化合物，在治療相關疾病時，經過代謝或化學過程的化學轉化而產生本發明中的化合物、鹽、或溶劑化物。
優選地，上述用作激酶抑制劑的化合物為如式2所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽、溶劑化物或前藥：
式2。
進一步優選地，式2中，X選自CH、N；R 3選自-CH 3、-CH 2CH 3、-CH 2CF 3；R 40、R 41均為H，R 42選自H或F。
優選地，上述用作激酶抑制劑的化合物為如式3所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽、溶劑化物或前藥：
式3；
式3中，X選自CH、N；R 3為-CH 3、-CH 2CH 3、-CH 2CF 3；R 40、R 41均為H，R 42選自H或F； R 5選自-CH 3、-CF 3。
優選地，式1所示的化合物為： ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 。
上述用作激酶抑制劑的化合物用於治療由EGFR突變和/或HER2突變導致的相關疾病的藥物中的應用。
上述化合物對EGFR、HER2的外顯子20插入突變的良好抑制活性，對EGFR外顯子19缺失、外顯子21的點突變也有良好抑制活性。
優選地，所述EGFR突變和/或HER2突變包括EGFR外顯子20插入突變、HER2的外顯子20插入突變、EGFR外顯子19缺失、EGFR外顯子20點突變、EGFR外顯子21的點突變中的一種或兩種以上組合。經生物活性實驗證實，上述化合物對上述突變類型具有較好的抑制效果。
進一步優選地，所述EGFR突變和/或HER2突變選自EGFR Del 19/T790M/C797S突變、EGFR L858R/T790M/C797S突變，上述化合物對上述突變類型具有較好的抑制效果。
優選地，所述疾病為所述EGFR突變和/或HER2突變導致的癌症。上述化合物也可以和其他藥物聯用，用於癌症的治療。其他聯用的藥物可以是ERK抑制劑或MEK抑制劑。
優選地，所述化合物為晶型、無定型或所述溶劑化物；所述溶劑化物所含溶劑為非水溶劑或非水溶劑和水組成的混合溶劑。
為了更好的提高化合物的穩定性和活性，對通式1所示的化合物，選取部分進行晶型研究。進一步的，對本發明中的實施例1的化合物進行多晶型篩選研究，找到穩定可靠的晶型，既能保證化合物質量的穩定性，也會促使藥物在臨床治療中發揮更好的作用。發現實施例1的產品為結晶度較好的晶體，且為無水晶型，命名為游離鹼晶型 Ⅰ。實施例1的化合物具有如式A所示的化合物：
式A，
晶型為游離鹼晶型Ⅰ，該晶型的X-射線粉末衍射圖譜在9.76°±0.2°，10.45°±0.2°，16.54°±0.2°，18.66°±0.2°，20.07°±0.2°，25.90°±0.2°處有特徵衍射峰。
更進一步的，游離鹼晶型Ⅰ，其X-射線粉末衍射圖譜在9.07°±0.2°，9.76°±0.2°，10.45°±0.2°，11.53°±0.2°，11.80°±0.2°，12.91°±0.2°，13.79°±0.2°，14.67°±0.2°，15.08°±0.2°，15.63°±0.2°，16.54°±0.2°，17.50°±0.2°，18.66°±0.2°，20.07°±0.2°，21.10°±0.2°，23.29°±0.2°，24.16°±0.2°，25.90°±0.2°處有特徵衍射峰。
實施例1化合物的游離鹼晶型Ⅰ可以在大部分溶劑中通過混懸轉晶、反溶劑沉澱、高低溫迴圈和蒸發結晶等方法製備。此處的溶劑包括但不限於二氯甲烷、1,4-二氧六環、二氯乙烷、甲基叔丁基醚、N-甲基吡咯烷酮、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二甲亞碸、乙酸異丙酯、丁酮、環己烷、四氫呋喃、水、乙腈、異丙醇、乙醇、正庚烷中的一種或兩種及以上的混合溶劑等。
本發明發現實施例1化合物有兩種無水晶型(游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅴ)和三種溶劑合物，游離鹼晶型Ⅱ是乙醇溶劑合物，游離鹼晶型Ⅲ是異丙醇溶劑合物，游離鹼晶型Ⅳ是二氯乙烷和水的溶劑合物，並對這幾種游離鹼晶型都進行表徵。對游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅴ兩種無水晶型做了競爭打漿實驗，從結果推斷對游離鹼晶型Ⅰ可能為熱力學穩定晶型，更適合後續的開發。
對游離鹼晶型Ⅰ進行了晶型評價，包括乾法研磨、濕法研磨、壓片（30 MPa）、穩定性和引濕性等研究。乾法研磨5min後就變成了無定型；加水的濕法研磨5 min晶型基本沒變化，加乙醇的濕法研磨5min後結晶度輕微下降；壓片測試中壓力為30 MPa時，結晶度有所下降；穩定性考察中，不同溫度和濕度下，游離鹼晶型Ⅰ比較穩定，液相檢測結果沒有變化；做了動態水蒸汽吸附（DVS）測試，結果表明，在80 %RH時吸水增重0.66%，游離鹼晶型Ⅰ略有引濕性。總之，游離鹼晶型Ⅰ是較穩定的無水晶型，具有穩定的固態性質，且略有引濕性，可以用作後續藥物開發。
相對於專利WO2021180238中的具有反式三五並胺結構的化合物，本發明證實了順式三五並胺結構的體內藥效更好，且在相關疾病的不同突變中也有很好的治療作用。
本發明的化合物當X為CH時的製備方法，反應路線如下所示：
包括以下步驟：
（1）化合物A和化合物B在有機溶劑中進行傅克反應，得到化合物C；
（2）化合物C和化合物D在有機溶劑中，酸催化下進行取代反應，得到化合物E；
（3）化合物E和化合物F在有機溶劑中，鹼催化下進行取代反應，得到化合物G；
（4）化合物G還原後得到化合物H；
（5）化合物H在鹼催化劑下進行縮合反應，得到產品。
R 1為 且R 5為-CF 3時，式1所示的化合物的合成還可按照以下反應路線：
包括以下步驟：
（1）化合物a和化合物b在有機溶劑中進行取代反應，得到化合物c；
（2）化合物c水解，得到化合物d；
（3）化合物d進行縮合反應，得到化合物e；
（4）化合物e脫保護，得到化合物f；
（5）化合物f在鹼催化劑下和三氟乙酸酐進行關環反應，得到化合物g；
（6）化合物g還原後得到化合物h；
（7）化合物h在鹼催化劑下進行縮合反應，得到產品。
本發明的化合物當X為N時的製備方法，反應路線如下所示：
包括以下步驟：化合物A´和化合物B´進行取代反應得到產品。
其中，化合物A´參考WO2021180238合成得到；化合物B´由傅克反應得到。
下面結合具體實施例對本發明的實施過程均進行詳細說明。
一、用作激酶抑制劑的化合物合成的具體實施例
實施例1
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示： 。
本實施例的化合物的合成路線如下：
化合物3的合成：250mL三口瓶，氮氣保護，加入化合物1（2.01g,8.5mmol），用100mL 四氫呋喃全溶，加入無水三氯化鋁（2.26g,17mmol），70℃攪拌1小時。滴加化合物2（1.34g,10.2mmol），滴畢，繼續70℃反應，點板監控反應，4小時後基本反應完畢。處理，得到產品1.31g，收率46.4%。
化合物5的合成：將化合物3（1.30g, 3.9mmol），化合物4（0.88g, 4.68mmol），和對甲苯磺酸（1.35g, 7.8mmol）加入到65mL的1,4-二氧六環中，N 2保護，升溫到80℃，反應過夜。點板監控反應，反應完畢，處理，得到產品1.50g，收率79.7%。
化合物7的合成：將化合物5（6.0g, 12.5mmol）、化合物6（6.3g,100mmol）和N,N-二異丙基乙胺（3.2g, 50mmol）加入到N,N-二甲基乙醯胺120mL中，90℃反應過夜，點板監控，原料反應完後，處理，得到產品8.0g。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 9.53 (s, 1H), 8.97 – 8.75 (m, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.20 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 5.09 (p, J = 6.4 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.84 – 3.63 (m, 1H), 3.02 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 2.84 (s, 3H), 2.70 (s, 3H), 2.43 (s, 2H), 2.32 (s, 1H), 1.27 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.15 (d, J = 6.4 Hz, 6H).
化合物8的合成：將化合物7（7.7g, 41.6mmol）和鈀碳（2.4g, 濕鈀碳55%）加入到100mL甲醇和100mL乙酸乙酯的混合溶劑中，氫氣氣氛下，室溫反應4小時，點板監控，原料反應完後，處理，得到產品7.0g。
實施例1的合成：將化合物8（7.00g, 12.6mmol）和三乙胺（3.82g, 37.8mmol）溶於二氯甲烷中，氮氣保護下降溫至0℃，隨後滴加丙烯醯氯（1.72g, 18.9mmol）的二氯甲烷溶液，保持0℃反應1小時，點板監控，原料反應完後，處理。即加入碳酸氫鈉水溶液和二氯甲烷，攪拌分層，水相再用二氯甲烷萃取一次，合併有機相，乾燥，旋乾，過柱。得到的粗產品先用少許二氯甲烷溶解，後面滴加石油醚析出大量固體，過濾，濾餅直接加入甲醇打漿，乾燥後最終得到3.5g產品。[M+H] +：610.8； 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.38 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.32 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.20 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.44 (m, 2H), 6.32(m,1H), 5.68 (m, 1H), 5.00 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.06 (s, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.61 (m, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.67 (s, 2H), 1.03 (d, J = 6.4 Hz, 6H)。
參照實施例1，合成了實施例2、3、4三個氘代物，具體如下表1所示。
表1實施例2-4的化合物結構及表徵
編號 結構 表徵
實施例2 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.38 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.32 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 7.20 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.13 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.44 (m, 2H), 6.32(m,1H), 5.68 (m, 1H), 5.00 (p, J= 6.2 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.06 (s, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.61 (m, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.67 (s, 2H), 1.03 (d, J= 6.4 Hz, 6H)。 [M+H] +：613.8
實施例3 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.38 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.32 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 7.20 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.13 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.44 (m, 2H), 6.32(m,1H), 5.68 (m, 1H), 5.00 (p, J= 6.2 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.06 (s, 2H), 2.61 (m, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.67 (s, 2H), 1.03 (d, J= 6.4 Hz, 6H)。 [M+H] +：613.8
實施例4 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.38 (s, 1H), 9.60 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.32 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 7.20 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.13 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.44 (m, 2H), 6.32(m,1H), 5.68 (m, 1H), 5.00 (p, J= 6.2 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.06 (s, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.61 (m, 3H), 1.67 (s, 2H), 1.03 (d, J= 6.4 Hz, 6H)。 [M+H] +：613.8
實施例5
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示： 。
本實施例的化合物的合成路線如下：
合成過程如下：
化合物2的合成：2000mL的單口瓶中，加入化合物1(54.6g，303mmol)，乙醯肼(26.64g，395mmol)，加入1000mL的1N的氫氧化鈉水溶液，80℃下反應4小時，有大量固體析出。降溫，加入濃鹽酸80mL，0℃左右低溫攪拌30分鐘，抽濾，濾餅用水攪洗一次，55℃真空乾燥過夜，得到32g產品。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 11.75 (s, 1H), 11.59 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 2.52 (s, 3H)。
化合物3的合成：2000mL的單口瓶中，加入化合物2 (50.0g，258mmol)，室溫下加入甲苯1500mL，三氯氧磷(237g,1550mmol)，N,N-二異丙基乙胺(133g, 1031mmol)，有白霧生成。加熱到80℃，氮氣保護，攪拌過夜。次日，降溫處理，得到30g產品。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 9.19 (s, 1H), 2.71 (s, 3H)。
化合物5的合成：2000mL單口瓶，加入化合物3（30.0g,130mmol），用1500mL1,2-二氯乙烷全溶，加入無水三氯化鋁（29.3g,220mmol），先室溫攪拌30分鐘。降溫到0℃，滴加化合物4（22.1g,169mmol），低溫先攪拌30分鐘，之後升溫到60℃反應，點板監控。反應4小時後，降溫，處理得到產品20.0g。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 8.84 (s, 1H), 8.02 (dt, J = 7.8, 1.0 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.40-7.27 (m, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.50 (s, 3H)。
化合物7的合成：將化合物5（2g, 6.15mmol），化合物6（1.37g, 7.38mmol），和對甲苯磺酸（2.11g, 12.3mmol）加入到100mL的二氧六環中，氮氣保護升溫到80℃，反應過夜。點板監控，反應完畢，處理，得到0.65 g產品。
化合物9的合成：將化合物7（950mg, 2mmol）、化合物8（1.0g,8mmol）和N,N-二異丙基乙胺（516m g, 4mmol）加入到N,N-二甲基乙醯胺 20mL中，100 ℃反應過夜。點板監控，原料反應完後，處理，得到1.0g產品。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 9.56 (s, 1H), 8.88 (s, 1H), 7.92 (d, J = 14.6Hz, 2H), 7.54 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.15 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.84 (s, 1H), 4.06 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.04 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.72 (s, 3H), 2.44 (s, 2H), 2.38 (s, 3H), 1.28 (s, 4H)。
化合物10的合成：將化合物9（1.0g, 1.72mmol）和鈀碳（500mg, 濕鈀碳55%）加入到50mL甲醇中，氫氣氣氛下，室溫反應4小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到900 mg產品。
實施例5的合成：將化合物10（900mg, 1.63mmol）和三乙胺（495mg, 4.90mmol）溶於二氯甲烷中，氮氣氣氛下降溫至0℃，隨後滴加丙烯醯氯（223mg, 2.45mmol）的二氯甲烷溶液，保持0℃反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到200mg產品。 [M+H] +：606.8。
參照實施例5，合成了實施例6、7、8三個氘代物，具體如下表2所示。
表2 實施例6-8的化合物結構及表徵
編號 實施例6 實施例7 實施例8
結構
表徵 [M+H] +：609.8 [M+H] +：609.8 [M+H] +：609.8
實施例9
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示： 。
本實施例的化合物的合成路線如下：
本實施例的化合物的合成過程如下：
化合物3的合成：將化合物1（6.0g, 13.30mmol）、化合物2（5.03g, 39.91mmol）和N,N-二異丙基乙胺(3.43g, 26.6mmol)加入到N,N-二甲基乙醯胺 60mL中，80℃反應過夜。點板監控，原料反應完後，處理，得到6.17g產品。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d)δ 9.50 (s, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.24 -7.99 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.38 (dt, J = 8.2, 1.0 Hz, 1H), 7.31-7.23 (m, 1H), 7.23-7.16 (m, 1H), 6.65 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.94 (s, 3H) , 3.70 (s, 3H), 2.95 (s, 3H), 2.89 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.85-2.76 (m, 2H), 2.27 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 1.91 – 1.81 (m, 2H)。
化合物4的合成： 將化合物3（6.17g, 11.08mmol）、一水合氫氧化鋰（2.33g, 55.39mmol）加入到四氫呋喃/甲醇/水體積比為6：3：1的混合溶劑中，40℃反應16小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到6.02g產品。
化合物5的合成：將化合物4（6.02g, 11.08mmol）、肼基甲酸叔丁酯（4.39g, 33.26mmol），N,N-二異丙基乙胺（8.58g, 66.48mmol）加入到160 mL N,N-二甲基甲醯胺中，攪拌15min後再加入1H-苯並三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽（6.90g, 13.30mmol），25℃反應16小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到1.67g產品。
化合物6的合成：將化合物5（1.67g, 2.54mmol）溶於15mL四氫呋喃中，緩慢加入到15mL的4M的 氯化氫二氧六環溶液中，氮氣保護下40 ℃反應5小時。液質監控，原料反應完後，處理，得到1.20g產品。
化合物7的合成：將化合物6（1.0g, 1.68mmol）、三乙胺（679 mg, 6.72mmol）加入到20 mL二氯甲烷中，攪拌15分鐘後，分批加入三氟乙酸酐（1.59g, 7.58mmol），40℃反應8小時，反應完畢。處理，得到521mg產品。
化合物8的合成：將化合物7（521 mg, 0.82mmol）和鈀碳（156 mg, 10%）溶解20mL甲醇中，氫氣下，25℃攪拌反應3小時，液質監控，原料反應完後，處理，得到412g產品。
實施例9的合成：將化合物8（412 mg, 0.68mmol）和三乙胺（206 mg, 2.04mmol）溶於15mL二氯甲烷中，氮氣下降溫至0℃，隨後滴加丙烯醯氯（93 mg, 1.02mmol）的二氯甲烷溶液，保持0℃反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到產品122 mg。[M+H] +：660.5； 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 11.36 (m, 1H), 9.87 (m, 1H), 9.09 (m, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.37 (m, 1H), 7.95 (m, 1H), 7.33 (m, 1H), 7.18 (m, 1H), 7.01 (m, 2H), 6.80 (m, 1H), 6.46 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.92 (d, J = 13.5 Hz, 6H), 3.29 (m, 2H), 3.04 (m, 1H), 2.78 (m, 8H), 2.21 (m, 2H)。
參照實施例9，合成了實施例10、11、12三個氘代物，具體如下表3所示。
表3實施例10-12的化合物結構及表徵
編號 實施例10 實施例11 實施例12
結構
表徵 [M+H] +：663.5 [M+H] +：663.5 [M+H] +：663.5
實施例13
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示： 。
本實施例的化合物的合成路線如下：
化合物2的合成：500mL單口瓶，加入化合物1（10.00g,62.88mmol），用100mL 四氫呋喃全溶，加入碳酸銫（20.50g,62.88mmol），三氟乙醇（6.29g,62.87mmol），加畢，氮氣保護。點板監控，23℃反應6小時基本反應完畢。處理，得到產品14.35g，收率95.5%。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 8.01 (dd, J = 9.1, 5.8 Hz, 1H), 7.09 – 6.72 (m, 2H), 4.50 (q, J = 7.8 Hz, 2H)。
化合物3的合成：將化合物2（14.00g, 58.57mmol）溶於60mL乙醇中，加入15mL水，氯化銨(9.60g,179.44mmol)，還原鐵粉（20.00g, 357.14mmol），加畢，升溫到80℃，反應過夜。點板監控反應，反應完畢，處理，得到產品10.50g，收率85.78%。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 6.89 – 6.34 (m, 3H), 4.34 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.84 – 3.27 (m, 2H)。
化合物4的合成：250mL三口瓶，加入化合物3（10.00g, 47.83mmol），攪拌下加入50mL濃硫酸，降溫到0℃，分批加入硝酸鉀固體（6.10g，60.34mmol）,加畢，氮氣保護。室溫下反應4小時後，點板反應完畢，處理，得到產品8.26g，收率67.98%。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 7.44 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 4.46 (q, J = 7.7 Hz, 2H), 4.01 (m, 2H)。
化合物6的合成：將化合物4（2.00g, 6.08mmol）和化合物5（2.00g, 7.87mmol）加入到50mL乙腈中，再加入對甲苯磺酸的一水合物（0.81g,4.26mmol），80℃下攪拌過夜。次日，點板監控，原料基本反應完畢。降溫，反應液中析出固體，過濾，濾餅旋乾後加入甲醇打漿，得到1.67g產品。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 9.89 (s, 1H), 9.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.39 (m, 1H), 7.33 (m, 1H), 7.19 (m, 1H), 6.89 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 5.14 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.59 (q, J = 7.7 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 1.22 (d, J = 6.2 Hz, 6H)。
化合物8的合成：將化合物6（1.52g, 2.78mmol）、化合物7（1.05g,8.33mmol）和N,N-二異丙基乙胺（1.05 g, 8.14mmol）加入到N,N-二甲基乙醯胺 25mL中，90 ℃反應過夜。點板監控，原料反應完後，處理，得到1.16g產品。
化合物9的合成：將化合物8（0.59g, 0.90mmol）和鈀碳（400mg, 濕鈀碳55%）加入到20mL甲醇和20mL乙酸乙酯的混合溶劑中，氫氣氣氛下，室溫反應3小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到520 mg產品。
實施例13的合成：將化合物9（520mg, 0.83mmol）和三乙胺（253mg, 2.50mmol）溶於二氯甲烷中，氮氣氣氛下降溫至0℃，隨後滴加丙烯醯氯（114mg, 1.25mmol）的二氯甲烷溶液，保持0℃反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到170mg產品。 [M+H] +：606.8。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.63 (s, 1H), 10.11 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.66 (m, 2H), 7.29 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.22 – 7.16 (m, 1H), 7.15 – 7.09 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.37 (dd, J = 16.9, 2.0 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 10.1, 2.0 Hz, 1H), 5.00 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.44 (q, J = 8.2 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.27 – 2.99 (m, 2H), 2.87 – 2.51 (m, 6H), 2.11 (m, 2H), 1.18 – 0.91 (m, 6H)。
參照實施例13，合成了實施例14，具體如下表4所示。
表4實施例14的化合物結構及表徵
編號 結構 表徵
實施例14 [M+H] +:674.8
實施例15
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示：
本實施例的化合物的合成路線如下：
實施例15的合成：50mL單口瓶中，加入化合物2（112mg，1.24mmol），二氯甲烷20ml，草醯氯（142mg，1.12mmol），氮氣保護下攪拌2小時。降溫到0℃，滴加化合物1（438mg, 78.92mmol）的二氯甲烷溶液和三乙胺（152mg, 1.50mmol），保持0℃反應1小時，點板監控，原料反應完後，處理，最終得到160mg產品。[M+H] +：628.8； 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d)δ 9.53 (m, 1H), 9.12 (m, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.35 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.15 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.84 (s, 1H), 5.84 (dd, J = 48.2, 3.4 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 15.5, 3.4 Hz, 1H), 5.04 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 3.92 (s, 6H), 3.49 (m, 2H), 2.64 (m, 9H), 2.19(m, 2H), 1.09 (m, 6H)。
實施例16
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示： 。
本實施例的化合物的合成路線如下：
化合物3的合成：100mL單口瓶，加入化合物1（313mg,1mmol），加入5mL乙腈，再加入化合物2的粗品(441mg),加畢，氮氣保護。點板監控，80℃反應過夜基本反應完畢。處理，得到產品300mg。
化合物4的合成：將化合物3（1.83g, 4.54mmol）溶於60mL甲醇中，加入1.2mL濃鹽酸，加畢，升溫到60℃，反應過夜。點板監控反應，反應完畢，處理，得到產品0.89g。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 7.61 (s, 1H), 4.80 (q, J = 8.4 Hz, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.10 (s, 3H), 3.02 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 2.59 – 2.33 (m, 4H), 2.06 (s, 3H), 1.76 – 1.51 (m, 2H)。
化合物6的合成：100mL單口瓶，加入化合物4（73.8mg, 0.21mmol），加入化合物5（56mg,0.17mmol）,對甲苯磺酸（48mg,0.25mmol），然後加入二氧六環5mL，80℃攪拌過夜，氮氣保護。點板監控，反應完畢，處理，得到產品50mg。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 9.76 (s, 1H), 8.90 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.39 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.33 – 7.27 (m, 1H), 7.24 – 7.17 (m, 1H), 5.10 (p, J = 6.2 Hz, 1H), 4.94 (s, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.78 (m, 2H), 3.18 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 3.01 (m, 3H), 2.57 (m, 5H), 2.31 (m, 2H), 1.16 (d, J = 6.2 Hz, 6H)。
化合物7的合成：將化合物6（98mg, 0.15mmol）和鈀碳（80mg, 濕鈀碳55%）加入到3mL甲醇和2mL乙酸乙酯的混合溶劑中，氫氣氣氛下，室溫反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到98 mg產品。
實施例16的合成：將化合物8（300mg, 0.48mmol）和三乙胺（150mg, 1.48mmol）溶於二氯甲烷中，氮氣氣氛下降溫至0℃，隨後滴加丙烯醯氯（70mg, 0.77mmol）的二氯甲烷溶液，保持0℃反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到118mg產品。 [M+H] +：688.8。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.39 (s, 1H), 9.97 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.59 (m, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.33 (m, 1H), 7.23 (m, 1H), 7.14 (m, 1H), 6.45 (m, 1H), 6.31 (m, 1H), 5.72 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 5.01 (p, J = 6.5 Hz, 1H), 4.83 (q, J = 8.5 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.14 – 2.88 (m, 2H), 2.85 – 2.52 (m, 6H), 2.33 (s, 3H), 1.69 (m, 2H), 1.04 (d, J = 6.3 Hz, 6H)。
實施例17
本實施例的用作激酶抑制劑的化合物，結構式如下所示： 。
本實施例的化合物的合成路線如下：
化合物2的合成：100mL三口瓶，加入化合物1（153mg,0.38mmol），加入5mL四氫呋喃，再加入4-二甲氨基吡啶 (17.8mg),加畢，氮氣保護，滴加二碳酸二叔丁酯（1.06g，4.86mmol）。點板監控，80℃反應2小時，基本反應完畢。處理，得到產品104mg。
化合物3的合成：將化合物2（104mg, 0.21mmol）溶於2ml甲醇中，加入5.4mol/L的甲醇鈉的甲醇溶液0.05mL，加畢，反應30分鐘。點板監控反應，反應完畢，處理，得到產品30mg。
化合物4的合成：將化合物3（30mg, 0.065mmol）和鈀碳（15mg, 濕鈀碳55%）加入到1mL甲醇和1mL乙酸乙酯的混合溶劑中，氫氣氣氛下，室溫反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到30 mg產品。
化合物5的合成: 將化合物4（30mg, 0.069mmol）和三乙胺（13mg, 0.14mmol）溶於二氯甲烷中，氮氣氣氛下降溫至0℃，隨後滴加丙烯醯氯（7mg, 0.077mmol）的二氯甲烷溶液，保持0℃反應2小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到12mg產品。
實施例17的合成：將化合物5（12mg, 0.024mmol）和化合物6（6mg, 0.018mmol）、對甲苯磺酸（8mg,0.042mmol）溶於1mL的N-甲基吡咯烷酮和2mL的乙二醇單甲醚中，氮氣氣氛下升溫至100℃，反應4小時。點板監控，原料反應完後，處理，得到3mg產品。 [M+H] +：675.8。 1H NMR (400 MHz, Chloroform- d) δ 10.42 (s, 0H), 9.97 (s, 0H), 8.91 (s, 0H), 8.70 (m, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.33 (d, J = 8.2 Hz, 0H), 7.18 (m, 1H), 6.99 (m, 1H), 6.45 (m, 1H), 6.33 (m, 1H), 5.73 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 4.85 (m, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.78 (m, 1H), 2.62(m,2H) , 2.35 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.10 – 1.95 (m, 2H)。
二．化合物生物學測試評價
1. 化合物對細胞增殖抑制作用的測試
1.1 EGFR 和 HER2 exon 20 插入突變的細胞增殖抑制活性測試實驗：
實驗中所選取的工程細胞Ba/F3-FL-EGFR-V769-D770 ins ASV、Ba/F3-FL-EGFR-D770-N771 ins SVD、Ba/F3-FL-EGFR-H773-V774 ins NPH 、Ba/F3-FL-EGFR- A763-Y764 ins FQEA、Ba/F3-HER2-A775-G776 ins YVMA由合肥中科普瑞昇生物醫藥科技有限公司提供，並且在用於本研究之前經過驗證。
配製20×的待測化合物母液備用，9個濃度，3倍梯度稀釋，從1μM起稀釋。
取對數生長期細胞懸液，接種于96 孔白色細胞培養板，每孔體積為95 μL（2000 個細胞/孔）。取5 μL 20×待測化合物按照鋪板圖分別加入上述含有95 μL 細胞懸液的培養板中，混勻。37℃ 、5% CO 2培養箱中孵育72 小時。CellTiter-Glo 法測定化合物的增殖抑制活性。SpectraMax Paradigm 讀數得出對應的每孔螢光值RLU 。細胞增殖抑制率（Inhibition Rate）資料採用下列公式來處理：Inhibition Rate (Inh%)=100-(RLU compound-RLU blank)/(RLU control-RLU blank)* 100%。在EXCEL 中計算不同濃度化合物對應的細胞活力，然後用GraphPad Prism軟體作細胞活力曲線圖並計算IC 50值。表5為對照品的名稱和結構。
表5  對照品的名稱及結構
名稱 TAK-788 DZD9008
結構
表6、表7和表8的實驗結果中，依據IC 50值大小分為3類，其中A≤30nM，30nM＜B≤100nM，C＞100nM。
表6不同化合物的EGFR exon 20插入突變的細胞增殖抑制活性測試結果
化合物 Ba/F3-FL-EGFR
V769-D770ins ASV D770-N771ins SVD H773-V774ins NPH A763-Y764ins FQEA
DZD-9008 A B B A
TAK-788 A A A A
實施例1 A A A A
實施例2 A A A A
實施例3 A A A A
實施例5 A A A A
實施例7 A A A A
實施例8 A A A A
表7 不同化合物的HER2 exon 20插入突變的細胞增殖抑制活性測試結果
化合物 DZD9008 TAK-788 實施例1 實施例5
Ba/F3-HER2-A775-G776 ins YVMA B A A A
從表6可知，實施例中的化合物對EGFR exon 20插入突變均有很好的抑制能力。優於DZD9008，與TAK-788的活性相當。從表7可知，實施例5 在HER2 exon 20插入突變中的細胞活性和TAK-788相當，優於DZD9008。
1.2 化合物對細胞系 NCI-H1975 和 PC9 的細胞增殖抑制活性測試實驗：
實驗中所選取的細胞系NCI-H1975和PC9由中美冠科生物技術(北京)有限公司提供，並且在用於本研究之前經過驗證。
配製10×的待測化合物母液備用，9個濃度，4倍梯度稀釋，從10μM起稀釋。
取對數生長期細胞懸液，接種于96 孔培養板，每孔體積為90 μL（2000 個細胞/孔）。取10 μL 10×待測化合物按照鋪板圖分別加入培養板中，混勻。37℃ 、5% CO 2培養箱中孵育。CellTiter-Glo 法測定化合物的增殖抑制活性。細胞增殖抑制率（Inhibition Rate）資料採用GraphPad Prism8.0軟體作細胞活力曲線圖並計算IC 50值。結果如表8所示：
表8 不同化合物相關突變的細胞增殖抑制活性測試結果
化合物 DZD9008 TAK-788 實施例1 實施例5
NCI-H1975 A A A A
PC9 B A A A
從表8可知，本發明的化合物對細胞系NCI-H975和PC9的細胞增殖有很好的抑制作用，且優於DZD9008。
2. 化合物的體內藥效實驗
2.1 對肺癌 LU0387PDX 模型的藥效學研究
肺癌LU0387PDX模型是冠科的一種常用的異種移植瘤模型，該模型的實驗情況說明如下：荷瘤鼠安樂死後，無菌狀態下剖出瘤塊，將瘤塊清洗乾淨，去除血污及結締組織和壞死部分，腫瘤切成2*2*2 mm 3的小塊。用轉接針接種於經消毒的實驗小鼠於右側背部皮下。定期觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至平均體積100~200 mm 3時根據腫瘤大小和小鼠體重隨機分組給藥。在給藥開始前，稱量所有動物的體重，並用遊標卡尺測量腫瘤體積。根據鼠的腫瘤體積隨機分組，以保證不同組別間的腫瘤體積相似。每組3只小鼠，每日口服給藥一次，給藥後對接種部位進行觀察。每週兩次測量腫瘤體積和小鼠體重。
實驗設計及結果如表9所示，其中，P.O是口服給藥；QD:每天一次；TGI(腫瘤體積抑制率)=（1-治療組瘤重量/對照組瘤重量）*100%。
表9 LU0387模型設計及結果
組別 給藥劑量 給藥方式 TGI（%）
1 溶媒對照組 / P.O、QD﹡13 days /
2 實施例1 30mg/kg P.O、QD﹡13 days 79.01
3 實施例1 50mg/kg P.O、QD﹡13 days 97.44
4 TAK-788 30mg/kg P.O、QD﹡13 days 68.03
5 實施例5 30mg/kg P.O、QD﹡13 days 66.90
6 DZD-9008 30mg/kg P.O、QD﹡13 days 32.55
實驗中，腫瘤體積隨著給藥天數發生變化，結果如圖1所示。
由圖1看出，在LU0387模型中相同劑量下，實施例1的藥效優於TAK-788和DZD9008。實施例5的藥效和TAK-788類似。隨著實施例1 劑量的增加，則藥效也明顯增強。
2.2 對 Ba/F3-EGFR-D770_N771 ins SVD 工程細胞株皮下移植瘤模型的體內藥效學研究
細胞株Ba/F3 EGFR D770_N771 ins SVD採用RPMI1640 +10%胎牛血清+1%雙抗,37℃ 、5% CO 2培養，一周2-3次傳代處理。當細胞飽和度為80-90%，數量達到要求時，收取細胞。將0.2ml(1*106個) 細胞皮下接種於6-8周齡，體重18-22g的雌性裸鼠的右後背。腫瘤平均體積達到約150-200 mm 3時開始分組給藥。在給藥開始前，稱量所有動物的體重，並用遊標卡尺測量腫瘤體積。根據鼠的腫瘤體積隨機分組，以保證不同組別間的腫瘤體積相似。每組3只小鼠，每日口服給藥一次，給藥後對接種部位進行觀察。每週兩次測量腫瘤體積和小鼠體重。
表10  Ba/F3 EGFR D770_N771 ins SVD模型分組
組別 給藥劑量 給藥方式 TGI (%)
1 溶媒對照組 / P.O、QD﹡14days /
2 實施例1 30mg/kg P.O、QD﹡14days 61.08
3 實施例40 30mg/kg P.O、QD﹡14days 37.84
4 實施例5 30mg/kg P.O、QD﹡14days 59.51
5 實施例18 30mg/kg P.O、QD﹡14days 32.22
表中實施例18和實施例40是專利WO2021180238中的具有反式三五並胺結構的化合物。名稱及結構見表11：
表11 反式結構化合物的名稱及結構
名稱 實施例40 實施例18
結構
實驗中，腫瘤體積隨著給藥天數發生變化，結果如圖2所示。
由圖2看出，在Ba/F3-EGFR-D770_N771 ins SVD細胞移植模型中，相同劑量下，實施例1和實施例5的體內藥效都遠優於專利WO2021180238中的具有反式三五並胺結構的化合物，腫瘤抑制率提高達到1.6倍以上。
綜上，本專利中的化合物對EGFR或HER2的外顯子20插入突變有良好抑制效果，對細胞系NCI-H1975和PC9的細胞增殖也有很好的抑制作用；對EGFR外顯子20插入突變、HER2的外顯子20插入突變、EGFR外顯子19缺失、EGFR外顯子20點突變、EGFR外顯子21的點突變中的一種或兩種以上組合，其藥物預期對相關疾病具有較好的治療效果。
三．實施例1的結構確認和游離鹼晶型研究。
1. 結構確認
取實施例1的化合物214mg，加入0.5mL的二氯甲烷和0.5mL的乙腈，溶清過濾，濾液裝入有封口膜的樣品瓶中，紮孔後置於通風櫥緩慢揮發，得到粒狀晶體（游離鹼晶型Ⅰ）。單晶衍射進行結構確認，結果如圖3所示，確認化合物構型。
2. 實施例 1 的游離鹼晶型研究
對實施例1得到的化合物進行多晶型篩選，尋找其潛在晶型，以期找到適合後續開發的優良的晶體形式。以合成得到的實施例1為起始原料，對其檢測發現，化合物為結晶度較好的晶體，且為無水晶型，命名為游離鹼晶型Ⅰ。隨後用乾法研磨的方式製備了無定型的游離鹼化合物。用以上兩種類型為起始原料，開展晶型篩選實驗。
2.1 初始原料的製備和表徵。
2.1.1 實施例 1 化合物的游離鹼晶型 Ⅰ 的表徵
對實施例1化合物的游離鹼晶型Ⅰ的原料進行了全面表徵。通過偏光顯微鏡(PLM)看到，原料為結晶度較好的不規則形狀晶體。圖4為游離鹼晶型Ⅰ的XRPD圖譜，圖5為該晶型的DSC和TGA疊加圖譜。差示掃描量熱(DSC)曲線在230℃有1個吸熱峰，應為熔融峰。熱重分析(TGA)曲線在分解前無明顯失重，為無水晶型。
表12  游離鹼晶型Ⅰ的X-射線粉末衍射峰資料
2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%)
6.195 3.2 18.163 9.2 27.562 9.7
9.071 16.3 18.660 40.5 28.603 1.3
9.765 52.8 18.964 11.2 29.112 4.0
10.488 100.0 20.067 54.3 29.693 2.4
11.530 13.4 21.103 23.6 30.264 4.1
11.795 25.8 21.399 6.4 30.659 4.3
12.912 11.6 21.833 5.2 31.192 3.2
13.181 3.6 22.397 5.4 31.703 1.7
13.788 7.2 23.290 28.3 32.799 4.1
14.667 15.6 24.164 30.4 34.024 1.3
15.076 18.9 24.512 2.5 35.238 2.2
15.629 26.0 25.171 8.9 37.325 1.6
16.537 91.8 25.897 73.2 38.347 0.8
17.495 18.1 27.032 7.6
2.1.2 實施例 1 游離鹼晶型 Ⅰ 的溶解度測試
在18種溶劑中通過目測法粗略的測定了化合物實施例1游離鹼晶型Ⅰ在室溫條件下的溶解度。結果如表13所示。游離鹼晶型Ⅰ僅在二氯乙烷和二氯甲烷中溶解度較高，在大部分所測試溶劑中溶解度較低。
表13 實施例1的游離鹼晶型Ⅰ的溶解度目測結果
序號 溶劑 溶解度mg/mL 序號 溶劑 溶解度mg/mL
1 二氯甲烷 ＞107 10 1,4-二氧六環 ＜0.27
2 二氯乙烷 61.75-123.50 11 甲基叔丁基醚 ＜0.33
3 N-甲基吡咯烷酮 18.25-27.38 12 乙酸乙酯 ＜0.29
4 丙酮 2.22-4.44 13 甲醇 ＜0.40
5 二甲亞碸 2.60-2.93 14 乙酸異丙酯 ＜0.30
6 丁酮 2.78-4.44 15 環己烷 ＜0.33
7 四氫呋喃 2.55-3.19 16 水 ＜0.27
8 乙腈 0.93-1.01 17 異丙醇 ＜0.35
9 乙醇 ＜0.30 18 正庚烷 ＜0.30
2.1.3 無定型原料的製備和表徵
稱取736 mg實施例1化合物（游離鹼晶型Ⅰ）進行乾法研磨5小時，成功製備得到669.86 mg無定型產品。做了XRPD檢測，結果如圖6所示。
2.2. 表徵中物理化學檢測儀器的使用方法和參數
2.2.1  X 射線粉末衍射（ XRPD ）
XRPD衍射圖由Bruker D2 Phaser型採集獲得。將待測樣品放置於光滑無背景的矽片上進行測樣。測量參數如表14所示。
表14  XRPD方法參數
儀器 Bruker, D2 Phaser 光管電壓/電流 30 KV/10 mA
放射波長 Cu Kα (λ = 1.5418 Å) 主光路軸向索拉狹縫 2.5 o
感應模式 步進測量 次級光路軸向索拉狹縫 2.5 o
掃描軸 θs- θd 探測器狹縫 5.827 o
掃描角度 3-40˚ (2θ) 發散狹縫寬度 0.6 mm
掃描步長 0.02˚ (2θ) 防散射狹縫 0 mm
掃描速度 0.2 s/step 旋轉 開
2.2.2 偏光顯微鏡 (PLM)
使用奧特光學顯微鏡BK-Pol進行PLM分析。取少量樣品，置於載玻片上，滴一滴矽油分散，隨後蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察。
2.2.3 差示掃描量熱分析 (DSC)
DSC曲線由TA儀器的DSC 250型採集獲得。DSC 250型儀器測試方法為：精密稱取適量的樣品至紮孔的鋁坩堝中，以10 ℃/min的升溫速率從25 ℃升溫至最終溫度300 ℃，用流速為50 mL/min的氮氣吹掃。
2.2.4 熱重分析 (TGA)
TGA資料由TA儀器的TGA 550型採集獲得。取適量的樣品放入提前去皮的鋁坩堝內，以10 ℃/min的升溫速率從室溫升溫至300 ℃，天平室用40mL/min的氮氣吹掃，樣品室用25mL/min的氮氣吹掃。
2.3 實施例 1 化合物的游離鹼多晶型的研究。
主要採用混懸轉晶、反溶劑沉澱、高低溫迴圈和蒸發結晶等方法來製備。
混懸轉晶是根據實施例1化合物的目測溶解度結果，在25 ℃和50 ℃條件下，分別以游離鹼晶型Ⅰ和無定型晶型為起始原料，分別在所選的單一溶劑(溶劑選自二氯甲烷， 1,4-二氧六環，二氯乙烷，甲基叔丁基醚，N-甲基吡咯烷酮，乙酸乙酯，丙酮，甲醇，二甲亞碸，乙酸異丙酯，丁酮，環己烷，四氫呋喃，水，乙腈，異丙醇，乙醇，正庚烷)或混合溶劑中進行晶型的製備。共得到兩種晶型，游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅱ。
反溶劑沉澱是根據實施例1化合物的目測溶解度結果，以二氯甲烷和二氯乙烷作為良溶劑，然後於室溫（~25 ℃）攪拌條件下分別向其中加入不同的反溶劑來進行晶型製備。共得到兩種晶型，游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅲ。
高低溫迴圈是向化合物中加入溶劑(溶劑選自二氯甲烷， 1,4-二氧六環，二氯乙烷，甲基叔丁基醚，N-甲基吡咯烷酮，乙酸乙酯，丙酮，甲醇，二甲亞碸，乙酸異丙酯，丁酮，環己烷，四氫呋喃，水，乙腈，異丙醇，乙醇，正庚烷)，然後於50 ℃~5 ℃溫度迴圈條件下攪拌來進行晶型製備。共得到了兩種晶型，游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅱ。
蒸發結晶是向化合物中加入溶劑，製成的溶劑過濾後將濾液滴加到樣品瓶中，瓶口覆蓋的封口膜紮孔後，置於通風櫥緩慢揮發。得到了兩種晶型，游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅳ。將游離鹼晶型Ⅳ加熱至150 ℃脫溶劑後製備得到新晶型，命名為游離鹼晶型Ⅴ。
2.3.1 游離鹼晶型 Ⅰ 的製備和表徵
游離鹼晶型Ⅰ可以在大部分溶劑中得到，實施例1所得到的化合物為游離鹼晶型Ⅰ。其表徵結果如圖4和圖5所示。
2.3.2 游離鹼晶型 Ⅱ 的製備和表徵
游離鹼晶型Ⅱ可以在某些含有乙醇的溶劑體系中得到，以無定形的化合物為原料，通過單一溶劑乙醇的混懸轉晶能得到游離鹼晶型Ⅱ。其表徵結果如圖7和圖8所示，游離鹼晶型Ⅱ的DSC曲線在124℃和230℃有兩個吸熱峰，TGA曲線在65-150 ℃有4.48%的失重，且游離鹼晶型Ⅱ是在乙醇的溶劑體系中得到。綜上推斷， 游離鹼晶型Ⅱ應為乙醇的溶劑合物。DSC曲線上124 ℃處的吸熱峰應為脫溶劑峰。
表15  游離鹼晶型Ⅱ的X-射線粉末衍射峰資料
2Ɵ( o) ±0.2 相對強度 (100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度 (100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度 (100%)
5.298 2.5 17.215 3.2 24.233 5.8
8.075 1.8 17.593 11.1 24.596 1.7
9.092 100.0 18.077 2.7 24.918 16.7
9.720 36.1 18.367 9.0 25.162 2.3
10.036 5.4 19.031 10.8 26.067 6.8
10.843 31.1 19.313 2.4 26.337 14.7
11.151 22.9 19.608 8.3 26.658 2.7
11.975 3.6 19.778 9.1 27.011 5.1
13.483 2.4 20.083 37.7 27.268 1.6
13.853 6.7 20.614 2.5 28.449 2.2
14.036 9.1 21.573 2.8 29.643 5.0
14.621 37.5 21.839 8.8 31.371 2.0
15.440 14.1 22.443 6.9 32.074 2.9
15.922 49.1 22.943 10.8 33.583 1.0
16.417 20.2 23.213 7.6 36.957 1.1
17.018 1.9 23.865 54.8
2.3.3 游離鹼晶型 Ⅲ 的製備和表徵
游離鹼晶型Ⅲ可以在某些含有異丙醇的溶劑體系中得到，在通過反溶劑沉澱來製備晶型時，在二氯甲烷/異丙醇或二氯乙烷/異丙醇體系中發現了游離鹼晶型Ⅲ。其表徵結果如圖9和圖10所示，游離鹼晶型Ⅲ的DSC曲線在121℃和230℃有兩個吸熱峰，TGA曲線在75-145 ℃有9.57%的失重，且游離鹼晶型Ⅲ在加熱至150℃脫溶劑後，XRPD轉變為游離鹼晶型Ⅰ。游離鹼晶型Ⅲ是在異丙醇的溶劑體系中得到，綜上推斷，游離鹼晶型Ⅲ應為異丙醇的溶劑合物，DSC曲線上121 ℃處的吸熱峰應為脫溶劑峰。
表16  游離鹼晶型Ⅲ的X-射線粉末衍射峰資料
2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%)
8.169 1.1 17.487 1.1 24.678 2.1
8.972 100.0 18.041 12.1 24.880 5.8
9.758 12.6 18.526 7.0 25.204 1.4
10.576 6.6 19.596 4.2 25.973 1.0
10.793 3.2 19.769 16.7 26.204 7.3
11.088 13.6 19.934 2.9 26.978 1.0
11.713 2.9 20.602 0.5 27.210 1.0
13.736 1.8 21.403 3.3 27.941 0.7
14.157 2.3 21.732 0.8 28.464 1.1
14.689 9.0 22.331 4.6 29.615 1.3
15.701 12.2 22.712 4.1 31.181 2.0
16.281 5.2 23.155 1.9 31.794 2.7
16.565 1.1 23.377 3.0 32.597 0.7
17.080 7.0 23.741 26.6
2.3.4 游離鹼晶型 Ⅳ 的製備和表徵
游離鹼晶型Ⅳ可以在某些含有二氯乙烷的溶劑體系中得到。稱取92.28mg原料，加入到樣品瓶中，加入5.0mL的二氯乙烷溶解，樣品瓶上面覆蓋封口膜，紮孔後置於通風櫥緩慢揮發，這樣通過蒸發結晶來製備晶型Ⅳ。其表徵結果如圖11和圖12所示，游離鹼晶型Ⅳ的DSC曲線在108℃和231℃有兩個吸熱峰，TGA曲線在25-150 ℃有10.41%的失重。 1H NMR結果顯示只含6.14%二氯乙烷溶劑殘留，由此推測該樣品可能含有4.27%的水分。綜上推斷，游離鹼晶型Ⅳ可能為二氯乙烷和水混合的溶劑合物。
表17  游離鹼晶型Ⅳ的X-射線粉末衍射峰資料
2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%)
4.761 100.0 15.402 5.1 19.759 3.0
5.460 55.1 15.567 4.8 21.310 1.2
8.619 31.7 16.029 3.3 21.781 6.9
9.174 2.0 16.337 14.1 22.612 6.1
9.595 5.7 16.659 9.6 22.984 6.0
9.962 3.0 16.938 11.7 23.420 7.4
10.804 5.4 17.540 1.8 23.839 1.3
11.012 1.9 17.845 2.5 25.136 2.9
11.618 5.4 18.502 4.9 25.511 2.5
14.435 5.3 19.109 11.7 26.272 6.6
15.099 2.1 19.311 53.9
2.3.5 游離鹼晶型 Ⅴ 的製備和表徵
游離鹼晶型Ⅳ在加熱至150℃脫溶劑後，通過XRPD表徵，顯示轉變為新晶型，命名為游離鹼晶型Ⅴ。其表徵結果如圖13和圖14所示，游離鹼晶型Ⅴ的DSC曲線在231℃有一個吸熱峰，TGA曲線在分解前無明顯失重。綜上推斷， 游離鹼晶型Ⅴ應為無水晶型。
表18  游離鹼晶型Ⅴ的X-射線粉末衍射峰資料
2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%) 2Ɵ( o) ±0.2 相對強度(100%)
5.622 100.0 16.363 14.9 22.903 33.3
8.021 20.5 16.726 13.1 23.526 12.3
8.328 5.9 16.935 17.0 24.074 3.5
8.706 14.1 17.756 2.6 25.048 2.5
9.243 12.9 18.486 3.7 26.027 17.5
9.743 1.5 18.907 10.8 26.335 5.8
10.776 6.9 19.214 14.4 26.877 6.4
11.341 21.2 19.630 4.7 27.111 4.5
11.638 7.9 19.924 4.1 27.481 1.6
12.159 13.0 20.980 5.7 28.113 2.7
15.082 24.3 21.382 11.5 29.449 3.1
15.409 6.4 21.671 1.9 30.927 2.9
15.815 41.6 22.054 4.4 33.106 3.4
3. 游離鹼晶型 Ⅰ 的晶型評價
在本次的篩選過程中僅發現了游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅴ兩種無水晶型，用丙酮和乙腈這兩種溶劑，分別配製飽和溶液，然後在25 ℃或50 ℃，對兩者進行了競爭打漿，從結果推斷游離鹼晶型 I可能為化合物的熱力學穩定晶型。並且游離鹼晶型Ⅴ未在篩選實驗中直接獲得，僅通過游離鹼晶型Ⅳ脫溶劑得到。因此，僅對游離鹼晶型 I進行了晶型評價，包括乾法研磨、濕法研磨、壓片（30 MPa）、穩定性和引濕性研究。
通過研磨實驗發現，游離鹼晶型Ⅰ經過乾法研磨5分鐘後，就轉為無定形狀態；加水濕法研磨5分鐘後，結晶度未見明顯變化；加乙醇濕法研磨5分鐘後，結晶度輕微下降。
壓片實驗中，當壓力為30MPa時，結晶度輕微下降。
穩定性實驗中發現，當游離鹼晶型Ⅰ敞口放置在80℃下3天、60℃下7天、25 ℃/60 %RH下7天、40 ℃/75 %RH下7天和25 ℃/90±5 %RH下7 天，分別取樣進行XRPD檢測。結果發現，游離鹼晶型Ⅰ沒有明顯變化，藥物的液相檢測結果也沒有變化。
對游離鹼晶型Ⅰ做了動態水蒸汽吸附（DVS）測試，結果表明，在80 %RH時吸水增重0.66%，游離鹼晶型Ⅰ略有引濕性。
綜上，確定了如式1所示的這類化合物的空間構型，尤其精準確定了實施例1的空間結構。在對實施例1化合物進行的晶型篩選研究中，共發現2個無水晶型（游離鹼晶型Ⅰ和游離鹼晶型Ⅴ）和3個溶劑化合物（游離鹼晶型Ⅱ、游離鹼晶型Ⅲ和游離鹼晶型Ⅳ）。在實驗中發現，游離鹼晶型Ⅰ為較穩定的無水晶型，具有穩定的固態性質，且略有引濕性，可以用作後續藥物開發。
無
圖1為LU0387模型中腫瘤體積變化(mm 3)。 圖2為Ba/F3 EGFR D770_N771 ins SVD模型腫瘤體積變化(mm 3) 。 圖3為實施例1的單晶的單晶衍射圖。 圖4為游離鹼晶型Ⅰ的XRPD圖譜。 圖5為游離鹼晶型Ⅰ的DSC和TGA疊加圖譜。 圖6為乾法研磨法所得無定型樣品的XRPD圖譜。 圖7為游離鹼晶型Ⅱ的XRPD圖。 圖8為游離鹼晶型Ⅱ的DSC和TGA疊加圖譜。 圖9為游離鹼晶型Ⅲ的XRPD圖。 圖10為游離鹼晶型Ⅲ的DSC和TGA疊加圖譜。 圖11為游離鹼晶型Ⅳ的XRPD圖。 圖12為游離鹼晶型Ⅳ的DSC和TGA疊加圖譜。 圖13為游離鹼晶型Ⅴ的XRPD疊加圖譜。 圖14為游離鹼晶型Ⅴ的DSC和TGA疊加圖譜。

Claims (13)

  1. 一類用作激酶抑制劑的化合物，其中用作激酶抑制劑的化合物為如式1所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 112109618-A0305-02-0049-1
     式1中，X選自CH、N； R1選自
    Figure 112109618-A0305-02-0049-2
    、
    Figure 112109618-A0305-02-0049-3
    ，R5為H、C1-C3的烷基、C1-C3的 氟代烷基；R20、R21、R22各自獨立地選自甲基或氘代甲基；R3選自C1-C3的烷基、C1-C3的鹵代烷基；R40、R41、R42各自獨立地選自H、D、F。
  2. 如請求項1所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中為如式2所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 112109618-A0305-02-0050-4
  3. 如請求項2所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中式2中，X選自CH、N；R3選自-CH3、-CH2CH3、-CH2CF3；R40、R41均為H，R42選自H或F。
  4. 如請求項1所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中為如式3所示的化合物，或其氘代物，或藥學上可以接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 112109618-A0305-02-0050-5
  5. 如請求項4所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中式3中，X選自CH、N；R3為-CH3、-CH2CH3、-CH2CF3；R40、R41均為H，R42選自H或F，R5選自-CH3、-CF3。
  6. 如請求項1所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中式1所示的化合物為：
    Figure 112109618-A0305-02-0051-8
  7. 如請求項1至請求項6中任一項所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中所述化合物為晶型、無定型或所述溶劑化物； 所述溶劑化物所含溶劑為非水溶劑或非水溶劑和水組成的混合溶劑。
  8. 如請求項7所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中其結構如式A所示的化合物：
    Figure 112109618-A0305-02-0052-7
     晶型為游離鹼晶型I，該晶型的X-射線粉末衍射圖譜中2θ為9.76°±0.2°，10.45°±0.2°，16.54°±0.2°，18.66°±0.2°，20.07°±0.2°，25.90°±0.2°具有特徵衍射峰。
  9. 如請求項8所述的用作激酶抑制劑的化合物，其中所述游離鹼晶型I的X-射線粉末衍射圖譜中2θ為9.07°±0.2°，9.76°±0.2°，10.45°±0.2°，11.53°±0.2°，11.80°±0.2°，12.91°±0.2°，13.79°±0.2°，14.67°±0.2，15.08°±0.2°，15.63°±0.2，16.54°±0.2°，17.50°±0.2°，18.66°±0.2，20.07°±0.2°，21.10°±0.2°，23.29°±0.2°，24.16°±0.2°，25.90°±0.2°具有特徵衍射峰。
  10. 一種如請求項1至請求項9中任一項所述的用作激酶抑制劑的化合物在製備用於治療由EGFR突變和/或HER2突變導致的相關疾病的藥物中的應用。
  11. 如請求項10所述的應用，其中所述EGFR突變和/或HER2突變包括EGFR外顯子20插入突變、HER2外顯子20插 入突變、EGFR外顯子19缺失、EGFR外顯子21的點突變、EGFR外顯子20的點突變中的一種或兩種以上組合。
  12. 如請求項11所述的應用，其中所述的EGFR突變和/或HER2突變選自EGFR Del 19/T790M/C797S突變，EGFR L858R/T790M/C797S突變。
  13. 如請求項10、請求項11或請求項12所述的應用，其中所述疾病為所述EGFR突變和/或HER2突變導致的癌症。
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