TWI823041B - 調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物以及中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物的用途 - Google Patents
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Abstract
提供一種調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其包括:一中草藥複方藥材或一中草藥複方萃取物。該中草藥複方藥材,包括靈芝、紅棗、桂圓以及蓮子。又,該中草藥複方萃取物,包括靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物以及蓮子萃取物。
Description
本揭露係關於中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物,且特別關於含有中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病的組成物,以及中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物的用途。
腸道屏障(Intestinal barrier)調節腸道的恆定,其主要功能包括:(1)水與離子運輸:腸道每天可以處理約9公升的液體,主要由小腸吸收,經由跨細胞或細胞間路徑可以處理液體吸收與分泌過程。(2)調節抗原:調和腸腔內之抗原是維持適當免疫的關鍵,可能藉由細胞間通透性改變而導致特定的樹突狀細胞(dendritic cells)被活化。(3)免疫防禦:腸腔經由沖洗微生物與毒素之過程,可以輔助免疫防禦(黏膜外層具有大量細菌,內層則
維持無菌狀態)。
腸道屏障主要係由數層的防禦機制組成以限制腸腔(intestinal lumen)內抗原(antigen)之移位。腸道屏障包括單層的半透性的上皮細胞(epithelial cells),其頂端細胞連接(apical junctions)之黏連與緊密結合蛋白質(adherens and tight junctions proteins)可以將上皮細胞連結以及調控細胞間(paracellular)抗原與分子(molecule)通過上皮。腸道上皮細胞經由跨細胞路徑(transcellular pathway)將抗原與分子自腸腔運輸至黏膜層(mucosa)。而特定的上皮細胞,例如M細胞(Microfold cells,M cells)可以運輸腸腔內之抗原至上皮內之吞噬細胞與淋巴球,而啟動免疫反應。杯狀細胞(goblet cells)、潘氏細胞(或稱帕內特細胞,Paneth cell)與腸上皮細胞(enterocytes)可以分泌黏液素(Mucins)與抗菌胜肽(antimicrobial peptides,AMPs)而聚合成黏膜層。又,腸道上皮細胞固有層(lamina propria)之漿細胞(plasma cells)可分泌IgA。腸道上皮細胞亦具有許多微生物識別受體(microbial recognition receptors,MRR),例如Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)及NOD樣受體(NOD-like receptors),可以辨識特定微生物相關分子模式(microbial associated molecular patterns,MAMP)。藉由腸道上皮細胞辨識後之腸道微生物可以誘發細胞激素與其他免疫調節因子之分泌,而有助於誘導一免疫調節反應,以對抗腸道微生物以及維持腸道恆定。
腸道屏障具有防止致病性抗原入侵以及維護腸道健康的功能,而腸道菌群是腸道黏膜屏障的重要構成元素。當腸道菌群維持平衡時,可以維持身體正常功能。而當腸道菌群因慢性壓力、慢性便秘與暴露於環境之毒素(例如、服用抗生素的服用、不健康飲食等)使許多細菌被殺死導致失衡時,會使得腸道黏膜被壞菌破壞,而造成食物殘渣與毒素進入到血流,而此現象即腸漏(leaky gut),或是增加之腸道通透性(increased intestinal permeability)。腸漏或是增加之腸道通透性亦會引發發炎反應。
腸漏可由許多因素造成,亦會出現許多不同之臨床表徵或疾病。目前已知腸道屏障功能不正常與腸道菌叢失衡相關疾病包括,發炎性腸道疾病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)、乳糜瀉(coeliac disease或celiac disease)、大腸激躁症(irritable bowel syndrome)、急性胰臟炎(acute pancreatitis)、非酒精性脂性肝炎(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)、酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis)、第一型與第二型糖尿病(diabetes mellitus)、肥胖症(obesity)、慢性腎疾病(chronic kidney disease)、心血管疾病(cardiovascular disease)、多重器官功能障礙(multiple organ failure syndrome(shock,burns and trauma))、愛滋病(AIDS)、氣喘(asthma)、濕疹(eczema)、乾癬(psoriasis)、自閉症(autism)、憂鬱症(depression)、焦慮症(anxiety)、精神分裂症(schizophrenia)、躁鬱症(bipolar disorder)、阿茲海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症
(Parkinson’s disease)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、纖維肌痛(fibromyalgia)、慢性睡眠片段(chronic sleep fragmentation)、失眠(insomnia)等。
然而,迄今仍未有中草藥物被驗證可用於與腸漏相關之疾病的治療,因此目前仍亟需新穎之用於治療腸漏相關之疾病的中草藥物。
本揭露提供一種調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其包括:一中草藥複方藥材或一中草藥複方萃取物。該中草藥複方藥材,包括靈芝、紅棗、桂圓以及蓮子,而於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5。又,該中草藥複方萃取物,包括靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物以及蓮子萃取物,而用以獲得包含於該中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比為0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5。
本揭露也提供一種中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物用於製備調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的用途。該中草藥複方藥材,包括靈芝、紅棗、桂圓以及蓮
子。又,該中草藥複方萃取物,包括靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物以及蓮子萃取物。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂,下文特舉較佳實施例,並配合所附圖示,作詳細說明如下:
第1A圖至第1P圖分別顯示,實施例1中所配製之各試驗樣本的細胞致死濃度測試的結果。
第2圖顯示,單方萃取物之腸道上皮細胞通透性試驗的結果。***:p<0.001與負對照組比較。數據顯示為平均值±標準差(Mean±SD)(n=3)。統計方法為單因子變異數分析(one-way ANOVA)。
第3圖顯示,複方萃取物之腸道上皮細胞通透性試驗的結果。相較於負對照組:*:p<0.05;***:p<0.001。相較於樣本15A:#:p<0.05;##:p<0.01;###:p<0.001。相較於樣本1:Φ:p<0.05,ΦΦ:p<0.01,ΦΦΦ:p<0.001。數據顯示為平均值±標準差(n=3)。統計方法為單因子變異數分析。
第4A圖至第4D圖顯示,不同配比之四味複方萃取物之腸道上皮細胞通透性試驗的結果。相較於負對照組:*:p<0.05;**:p<0.01;***:p<0.001。相較於樣本15A:#:p<0.05;##:p<0.01;###:p<0.001。相較於樣本1:Φ:p<0.05,
ΦΦ:p<0.01,ΦΦΦ:p<0.001。數據顯示為平均值±標準差(n=3)。統計方法為單因子變異數分析。
第5圖顯示,不同濃度之樣本15B之腸道上皮細胞通透性試驗的結果。相較於經鼠李糖處理之負對照組:*:p<0.05;於正對照組與各實驗組中,經鼠李糖處理組相較於未經鼠李糖處理:#:p<0.05。數據顯示為平均值±標準差(n=3)。統計方法為單因子變異數分析。
第6A圖至第6C圖分別顯示,樣本15B對於CLDN3、OCLN與TJP1之基因之表現的影響。負對照組為未經處理之細胞,正對照組經氯化小蘖鹼(berberine chloride,BBC)處理,50μM(18.6μg/mL)之細胞。相較於負對照組:*:p<0.05;**:p<0.01;ns:無顯著(not significant)。數據顯示為平均值±標準差(n=3)。統計方法為單因子變異數分析。
第7圖顯示,樣本15B對於經DSS誘導之小鼠的腸道通透性的影響。相較於未經處理組:#:p<0.05。相較於負對照組:*:p<0.05。數據顯示為平均值±標準差(n=3-4)。統計方法為t檢定(t test)。
第8圖顯示,樣本15B對於生理時鐘擾亂動物的影響。相較於未經處理組:###:p<0.001。相較於負對照組:***:p<0.001。數據顯示為平均值±標準差(n=6)。統計方法為數據為單因子變異數分析與鄧奈特檢定(Dunnett’s test)。
第9A圖、第9B圖與第9C圖分別顯示,樣本15B在運動活動力與探索行為之評估試驗中對於大鼠之洞孔中花費之時間、探洞次數與探索能力的影響。相較於Sham組:#:p<0.05,##:p
<0.01。相較於對照組:*:p<0.05,**:p<0.01。數據顯示為平均值±標準差(n=6)。統計方法為數據為單因子變異數分析與鄧奈特檢定。
第10圖顯示,樣本15B在水迷宮空間操作(spatial performance in Morris water maze)試驗中對於大鼠於水池尋找安全平台之時間的影響。相較於Sham組:#:p<0.05。相較於對照組:**:p<0.01;***:p<0.001。數據顯示為平均值±標準差(n=6)。統計方法為數據為單因子變異數分析與鄧奈特檢定。
第11圖顯示,樣本15B在水迷宮非空間操作(non-spatial performance in Morris water maze)試驗中對於大鼠抵達水池安全平台之時間的影響。相較於Sham組:###:p<0.001。相較於對照組:*:p<0.05;ns:無顯著。數據顯示為平均值±標準差(n=6)。統計方法為數據為單因子變異數分析與鄧奈特檢定。
第12A圖與第12B圖分別顯示,於β類澱粉蛋白誘導學習能力障礙之動物模式中,樣本15B對於大鼠之海馬迴區與額葉皮質區之AChE活性的影響。相較於Sham組:#:p<0.05,###:p<0.001。相較於對照組:**:p<0.01;***:p<0.001;ns:無顯著。數據為統計方法為數據為單因子變異數分析與鄧奈特檢定。
第13圖顯示,樣本15B之高效液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析的結果。
本揭露可提供一種調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其可包括,但不限於,一中草藥複方藥材或一中草藥複方萃取物,但不限於此。
於本揭露中所述「腸漏相關疾病」,只要是與腸漏具有關聯性之疾病即可,並無特別限制。例如,腸漏相關疾病可包括藉由調節腸道通透性及/或藉由減緩及/或治療及/或預防腸漏,而可被減緩及/或治療及/或預防其症狀或其本身的一疾病,或涉及腸漏相關基因及/或蛋白質之表現,而可藉由調節腸漏相關基因及/或蛋白質表現被減緩及/或治療及/或預防其症狀或其本身之一疾病,但不限於此。腸漏相關疾病的例子,可包括,但不限於,發炎性腸道疾病(如,結腸炎等)、乳糜瀉、大腸激躁症、急性胰臟炎、非酒精性脂性肝炎、酒精性肝硬化、第一型糖尿病、第二型糖尿病、肥胖症、慢性腎疾病、心血管疾病、多重器官功能障礙、愛滋病、氣喘、濕疹、乾癬、精神疾病(如,自閉症、憂鬱症、焦慮症、精神分裂症、躁鬱症等)、神經退化性疾病(如,阿茲海默症、帕金森氏症、多發性硬化症、肌萎縮性脊髓側索硬化症或其組合等)、僵直性脊椎炎、纖維肌痛、睡眠障礙(如慢性睡眠片段、失眠或其組合等)或上述之任意組合等。
於上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,上述中草藥複方藥材,可包括,但不
限於靈芝、紅棗、桂圓與蓮子,而上述中草藥複方萃取物可包括,但不限於,靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物。上述中草藥複方藥材或上述中草藥複方萃取物對於腸道通透性具有調節作用,及/或對於腸漏相關疾病具有治療及/或預防之功效。
於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中之靈芝或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的靈芝可包括赤芝、紫芝、鹿角靈芝或其任意組合,但不限於此。在一實施例中,於上述中草藥複方藥材中之靈芝或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的靈芝可為鹿角靈芝。
於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中之紅棗或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的紅棗可包括灰棗、雞心棗、冬棗、大棗、小棗、金絲棗或其任意組合,但不限於此。在一實施例中,於上述中草藥複方藥材中之紅棗或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的紅棗可為灰棗。
於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中之桂圓或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的桂圓可包括,但不限於,粉殼龍眼、紅殼龍眼或青殼龍眼或其任意組合。在一實施例中,於上述中草藥複方藥材中之桂圓或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的桂圓可為粉殼龍眼。
又,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中之蓮子或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的蓮子可包括,但不限於,紅蓮子、白蓮子或其組合。在一實施例中,於上述中草藥複方藥材中之蓮子或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料之一的蓮子可為紅蓮子。
在一特定實施例中,於上述中草藥複方藥材中之靈芝、紅棗、桂圓與蓮子或作為上述中草藥複方萃取物之製備原料的靈芝、紅棗、桂圓與蓮子分別可為鹿角靈芝、灰棗、粉殼龍眼與紅蓮子。
於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,每公克組成物可至少含有約0.2mg的靈芝酸A,例如約每公克組成物至少含有約0.2-20mg的靈芝酸A,例如,約0.2mg、約0.25mg、約0.3mg、約0.4mg、約0.5mg、約0.8mg、約1mg、約2mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg等,但不限於此。在一實施例中,上述靈芝酸A之最低含量可用以確認本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的品質。
在一實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比可為約0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5,例如,約
0.3-12:0.8-1.5:0.8-1.5:0.8-4、約0.5-10:1:1:1-3、約1:1:1:1、約0.5:1:1:1、約3:1:1:1、約6:1:1:1、約10:1:1:1、約1:1:1:3等,但不限於此。在一特定實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比可為1:1:1:1。在另一特定實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比可為3:1:1:1。
在一實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,包含於上述中草藥複方藥材之各藥材的形式,可包括原始藥材、原始藥材經過切割所獲得之切片/切塊、原始藥材經研磨所獲得之粉末等或其任意組合,並無特別限制。
又,在一實施例中,本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物係包括上述中草藥複方藥材,且本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物可被包裝於一濾袋中。於此實施例中,可將包裝有本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的濾袋以一溶劑進行沖泡後,獲得沖泡液。在一特定實施例中,可將包裝有本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的濾袋以水進行沖泡後,獲得可直接服用之沖泡液。
此外,在一實施例中,於本揭露之調節腸道通透性
及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,用以獲得包含於上述中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比可為約0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5,例如,約0.3-12:0.8-1.5:0.8-1.5:0.8-4、約0.5-10:1:1:1-3、約1:1:1:1、約0.5:1:1:1、約3:1:1:1、約6:1:1:1、約10:1:1:1、約1:1:1:3等,但不限於此。在一特定實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,用以獲得包含於上述中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比可為1:1:1:1。在另一特定實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,用以獲得包含於上述中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比可為3:1:1:1。
再者,在一實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,於上述中草藥複方萃取物中,上述靈芝萃取物、上述紅棗萃取物、上述桂圓萃取物與上述蓮子萃取物之重量比可為約1-40:20-200:20-180:5-130,例如約5-35:40-180:40-170:10-120、約9.3:150.1:136.8:56.2、約5.3:172.28:156.37:64.25、約6.18:100.5:91.21:112.45等,但不限於此。
獲得本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中之中草藥複方萃取物的方法並無特別限定,只要其可獲得製備原料中之所有藥材之萃取物的混合物即可。
在一實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中的中草藥複方萃取物可藉由一方法獲得。上述方法可包括下述步驟,但不限於此。
首先,將包含於一用以形成上述中草藥複方萃取物之製備原料中之各藥材,分別進行一萃取程序,以獲得分別之藥材的萃取液。例如,將包含於一用以形成上述中草藥複方萃取物之製備原料中之靈芝、紅棗、桂圓與蓮子分別以溶劑進行一萃取程序,以獲得分別之靈芝萃取液、紅棗萃取液、桂圓萃取液與蓮子萃取液。
接者,將所獲得分別之藥材的萃取液混合以形成一混合萃取物。例如,將上述所獲得分別之靈芝萃取液、紅棗萃取液、桂圓萃取液與蓮子萃取液混合以形成一混合萃取物,以進而獲得上述中草藥複方萃取物。
而針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用的溶劑可為相同或不同,只要於後續將各萃取液混合之步驟中,各萃取程序所採用之溶劑不互相影響,且不影響混合之萃取物中的成分即可。在一特定實施例中,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用的溶劑可皆為水。
針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用之溫度,可為相同或不同,並無特殊限定,且可視需要進行調整。例如,
針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用之溫度,可依照操作萃取程序當時之環境(如環境之溫度、濕度、壓力等)、欲被萃取之藥材的種類、欲被萃取之藥材的狀態(如含水率、重量等)、所欲進行之萃取時間及/或所採用之萃取溶劑的種類等進行調整,但不限於此。例如,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用之溫度,係在各萃取程序所採用之溶劑的冰點以上與沸點以下。在一實施例中,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用的溶劑皆為水,而針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用之溫度可為約0-100℃,如約4℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約37℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、約90℃、約100℃等,但不限於此。
相似地,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間,可為相同或不同,並無特殊限定,且可視需要進行調整。例如,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間,可依照操作萃取程序當時之環境(如環境之溫度、濕度、壓力等)、欲被萃取之藥材的種類、欲被萃取之藥材的狀態(如含水率、重量等)、所欲採用之萃取溫度及/或所採用之萃取溶劑的種類等進行調整,但不限於此。例如,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間,可為約0.1-10小時,例如,約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約5小時、約8小時、約10小時等,但不限於此。在一實施例中,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用的溶劑皆為水,而針對製備原料中各藥材之各萃取程序
所進行之時間可為約0.1-10小時,例如,約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約5小時、約8小時、約10小時等,但不限於此。
再者,上述獲得於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中的中草藥複方萃取物的方法,視需要而定,於上述將所獲得之分別之製備原料的萃取液混合以形成一混合萃取物之步驟之後,可更包括將上述混合萃取物進行乾燥之步驟。乾燥之方法並無特別限制,只要可使萃取物乾燥即可,例如烘箱乾燥、冷凍乾燥等。在一實施例中,係以冷凍乾燥將上述混合萃取物進行乾燥。
又,在另一實施例中,於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中的中草藥複方萃取物可藉由另一方法獲得。上述方法可包括下述步驟,但不限於此。
首先,將包含於一用以形成上述中草藥複方萃取物之製備原料中之各藥材混合以形成一原料混合物。例如,將包含於一用以形成上述中草藥複方萃取物之製備原料中之靈芝、紅棗、桂圓與蓮子混合以形成一原料混合物。
接著,將上述原料混合物進行一萃取程序以獲得一混合萃取物。例如,將含有靈芝、紅棗、桂圓與蓮子之原料混合物進行一萃取程序以獲得一混合萃取物,以進而獲得上述中草藥複方萃取物。
而針對原料混合物之萃取程序所採用的溶劑,並無
特殊限制,只要不對萃取物中之成分產生負面影響即可。在一特定實施例中,針對原料混合物之萃取程序所採用的溶劑可為水。
針對原料混合物之萃取程序所採用的溫度,也無特殊限定,可視需要進行調整。例如,針對原料混合物之萃取程序所採用的溫度,可依照操作萃取程序當時之環境(如環境之溫度、濕度、壓力等)、欲被萃取之原料藥材所含有之藥材的種類、欲被萃取之原料混合物的狀態(如含水率、重量等)、所欲進行之萃取時間及/或所採用之萃取溶劑的種類等進行調整,但不限於此。例如,針對原料混合物之萃取程序所採用的溫度,係在萃取程序所採用之溶劑的冰點以上與沸點以下。在一實施例中,針對原料混合物之萃取程序所採用的溶劑為水,而針對原料混合物之萃取程序所採用的溫度可為約0-100℃,如約4℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約37℃、約40℃、約50℃、約60℃、約70℃、約80℃、約90℃、約100℃等,但不限於此。
相似地,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間,並無特殊限定,可視需要進行調整。例如,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間,可依照操作萃取程序當時之環境(如環境之溫度、濕度、壓力等)、欲被萃取之原料藥材所含有之藥材的種類、欲被萃取之原料混合物的狀態(如含水率、重量等)、所欲採用之萃取溫度及/或所採用之萃取溶劑的種類等進行調整,但不限於此。例如,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間,可為約0.1-10小時,例如,約0.1小時、約0.5小時、
約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約5小時、約8小時、約10小時等,但不限於此。在一實施例中,針對製備原料中各藥材之各萃取程序所採用的溶劑皆為水,而針對製備原料中各藥材之各萃取程序所進行之時間可為約0.1-10小時,例如,約0.1小時、約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約5小時、約8小時、約10小時等,但不限於此。
再者,上述獲得於本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中的中草藥複方萃取物的方法,視需要而定,於上述將所獲得之分別之製備原料的萃取液混合以形成一混合萃取物之步驟之後,可更包括將上述混合萃取物進行乾燥之步驟。乾燥之方法並無特別限制,只要可使萃取物乾燥即可,例如烘箱乾燥、冷凍乾燥等。在一實施例中,係以冷凍乾燥將上述混合萃取物進行乾燥。
在一實施例中,上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,除了上述中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物,還可更包括一藥學上可接受載體或鹽類,但不限於此。於此實施例中,於上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,上述中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物的含量可為約10-99.5wt%,例如約10-50wt%、約50-99.5wt%等,但不限於此。於此實施例中,上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,可為一醫藥組成物或一保健組成物,但不限於此。
藥學上可接受之載體可包括,但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式,可利用一般方法將藥學組合物配製成劑型(dosage form)。
又,上述藥學上可接受之鹽類可包括,但不限於鹽類包括無機陽離子,例如,鹼金屬鹽類,如鈉、鉀或胺鹽,鹼土金族鹽類,如鎂、鈣鹽,含二價或四價陽離子之鹽類,如鋅、鋁或鋯鹽。此外,也可是為有機鹽類,如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺,胺基酸鹽類,如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。
此外,本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的例子可包括,但不限於,一醫藥組成物或一保健組成物。
本揭露中所述之醫藥組成物或保健組成物,可以非口服、口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式被投予。非口服可包括塗擦於皮膚任一部位或所需部位、皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。
本揭露中所述之醫藥組成物或保健組成物之口服形
式可包括,錠劑、顆粒劑、散劑、小球膠囊劑、膠囊劑、著衣錠、乳劑(emulsions)、溶液劑、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)、沖泡劑等,但不限定於此。
在一特定實施例中,上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物可為一醫藥組成物。於此特定實施例中,該醫藥組成物可為口服劑型,其中該口服劑型可包括錠劑、顆粒劑、散劑、小球膠囊劑、膠囊劑、著衣錠、乳劑、溶液劑、水性懸浮液、分散液等,但不限於此。又,於此特定實施例中,上述醫藥組成物可包括,但不限於,減緩及/或治療及或預防發炎性腸道疾病、神經退化性疾病及/或睡眠障礙的醫藥組成物。
在另一特定實施例中,上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物可為一保健組成物。於此特定實施例中,上述保健組成物可為一保健食品,其中保健食品之形式可包括錠劑、顆粒劑、散劑、小球膠囊劑、膠囊劑、著衣錠、乳劑、溶液劑、水性懸浮液、分散液、沖泡劑等,但不限於此。又,於此特定實施例中,上述保健組成物可包括,但不限於,預防及/或改善發炎性腸道疾病、神經退化性疾病及/或睡眠障礙的保健組成物,但不限於此。
基於前述,本揭露還可提供一種中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物用於製備調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的用途。
又,本揭露也可提供一種中草藥複合藥材或中草藥
複合萃取物製備用於減緩及/或治療及/或預防發炎性腸道疾病之組成物的用途。於此所述之發炎性腸道疾病,可包括,但不限於,結腸炎等。在一實施例中,於此所述之發炎性腸道疾病為結腸炎。
此外,本揭露也可提供一種中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物用於製備減緩及/或治療及/或預防神經退化性疾病之組成物的用途。於此所述之神經退化性疾病,可包括,但不限於,阿茲海默症、帕金森氏症、多發性硬化症、肌萎縮性脊髓側索硬化症或其組合等。在一實施例中,於此所述之發炎性腸道疾病為阿茲海默症。
本揭露還可提供一種中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物用於製備減緩及/或治療及/或預防睡眠障礙之組成物的用途。於此所述之睡眠障礙,可包括慢性睡眠片段、失眠或其組合等,但不限於此。在一實施例中,於此所述之睡眠障礙為失眠。
於上述本揭露之中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物之各用途中,上述中草藥複方藥材或上述中草藥複方萃取物對於腸道通透性具有調節作用,及/或對於腸漏相關疾病具有治療及/或預防之功效。
又,本揭露上述各用途所涉及之中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物的所有相關說明,可參見前方本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的說明段落中,關於中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物的相關敘述,因此不於此進行贅述。
在一實施例中,在本揭露之中草藥複合藥材或中草藥複合萃取物之上述各用途中,一藥學上可接受之載體或鹽類也可被使用於調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的製備。
而關於藥學上可接受之載體或鹽類之相關說明,則同樣可參見前方本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的說明段落中之相關敘述,因此不於此進行贅述。
再者,在上述本揭露之各用途中所製備的組成物,其所有相關說明,可參見前方本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的說明段落中的所有說明,但不限於此。
另外,基於前述,本揭露還可提供一種調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病的方法。上述方法可包括,但不限於,將任一上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,投予至需要其之一個體。
又,基於前述,本揭露也可提供一種治療發炎性腸道疾病的方法。上述方法可包括,但不限於,將任一上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,投予至需要其之一個體。於此所述之發炎性腸道疾病,可包括,但不限於,結腸炎等。
基於前述,本揭露也可提供一種治療神經退化性疾病的方法。上述方法可包括,但不限於,將任一上述本揭露之調節
腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,投予至需要其之一個體。於此所述之神經退化性疾病,可包括,但不限於,阿茲海默症、帕金森氏症、多發性硬化症、肌萎縮性脊髓側索硬化症或其組合等。
基於前述,本揭露也可提供一種治療睡眠障礙的方法。上述方法可包括,但不限於,將任一上述本揭露之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,投予至需要其之一個體。於此所述之睡眠障礙,可包括慢性睡眠片段、失眠或其組合等,但不限於此。
於本揭露中所述之個體,可包括,但不限於脊椎動物。上述脊椎動物可以包括魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類或哺乳動物,但不限於此。哺乳動物的例子可包括,但不限於,人、猩猩、猴子、牛、馬、驢、狗、貓、兔子、天竺鼠、大鼠、小鼠等。在一實施例中,所述之個體可為人類。
實施例
實施例1:試驗樣本之製備
將40g鹿角靈芝、40g灰棗、40g粉殼龍眼與40g紅蓮子,分別以400g水進行回流萃取2小時,而分別獲得鹿角靈芝萃取液(i)(241g)、紅棗萃取液(ii)(338g)、桂圓萃取液(iii)(286g)及蓮子萃取液(iv)(313g)。
依據所使用之製備原料中的各種藥材之總重量為1g時,將各種藥材之萃取液取依據其於製備原料中所佔含量(比例)
所應對應之重量的量並進行混合,來配製下方表1中所示之16種試驗樣本。
例如,單方鹿角靈芝之樣本,即將上方獲得之鹿角靈芝萃取液(i)取其重量之1/40的量(241g*(1/40)=6.025g)(對應於1g鹿角靈芝藥材)進行冷凍乾燥。
例如,二味複方之鹿角靈芝與紅棗的組合樣品,即將上方獲得之鹿角靈芝萃取液(i)取其重量之1/80的量(241g*(1/80)=3.013g)與將上方獲得之紅棗萃取液(ii)取其重量之1/80的量(338g*(1/80)=4.225g)(對應於0.5g鹿角靈芝藥材與0.5g紅棗藥材,藥材之總重量為1g),並將兩者充分混合後進行冷凍乾燥。
例如,三味複方鹿角靈芝、紅棗與桂圓之組合樣品,即將上方獲得之鹿角靈芝萃取液(i)取其重量之1/120的量(241g*(1/120)=2.008g)、將上方獲得之紅棗萃取液(ii)取其重量之1/120的量(338g*(1/120)=2.817g)與將上方獲得之桂圓萃取液(iii)取其重量之1/120的量(286g*(1/120)=2.383g)(對應於0.33g鹿角靈芝藥材、0.33g紅棗藥材與0.33g桂圓藥材,藥材之總重量為1g),並將三者充分混合後進行冷凍乾燥,以獲得所需樣本。
四味複方鹿角靈芝、紅棗、桂圓與蓮子(1:1:1:1)之組合樣品,即將上方獲得之鹿角靈芝萃取液(i)取其重量之1/160的量(241g*(1/160)=1.506g)、將上方獲得之紅棗萃取液(ii)取其重量之1/160的量(338g*(1/160)=2.113g)、將上方獲得之桂圓萃取液(iii)取其重量之1/160的量(286g*(1/160)=1.788g)與將上方獲得之蓮子萃取液(iv)取其重量之1/160的量(313g*(1/160)=1.956g)(對應於0.25g鹿角靈芝藥材、0.25g紅棗藥材、0.25g桂圓藥材與0.25g的蓮子藥材,藥材之總重量為1g)。
依上方所述規則來製備表1中所示之16個試驗樣本。
而各試驗樣本中所含有之各藥材之萃取物的乾重,例如可依據下方表2-5所示之估算方式推得。另,依據下方表2-5中所列對應於1g之各藥材所獲得的各萃取物乾重,以下方公式可計算出各萃取物的萃取率。
萃取率(%)=萃取物乾重/對應之藥材重量*100
各萃取物的萃取率如下所示:
靈芝萃取物之萃取率:3.71%(0.0371g/1g*100)
紅棗萃取物之萃取率:60.3%(0.603g/1g*100)
桂圓萃取物之萃取率:54.73%(0.5473g/1g*100)
蓮子萃取物之萃取率:22.49%(0.225g/1g*100)
實施例2
A.方法
將上述所製備的16種試驗樣本進行細胞致死濃度測試。
經由人類結腸腺癌細胞Caco-2來進行試驗樣本之細胞致死濃度測試。
將細胞分成負對照組(negative control,NC)與分別使用不同試驗樣本之16組實驗組。負對照組為未經處理之細胞,而對於各實驗組,將試驗樣本由最高濃度200μg/mL以2倍稀釋法稀釋至各試驗濃度(試驗樣本先以ddH2O配製為濃度100mg/mL,再以細胞培養基稀釋到200μg/mL濃度,之後再稀釋至各試驗濃度)並分別以不同濃度之試驗樣本與人類結腸腺癌細胞Caco-2於96孔培養盤共同培養48小時。
之後,分別對於負對照組與各實驗組加入0.5mg/mL MTT培養4小時,接著再移除培養基,以DMSO溶解Formazan藍紫色結晶,並測定570nm吸光值。
依據下方所示之公式,來評估細胞的存活率。
細胞存活率=(實驗組之570nm吸光值/負對照組(NC)之570nm吸光值)×100%。
B.結果
結果如第1A圖至第1P圖所示。
依據第1A圖至第1P圖可得知,如表6中所示各樣本在無細胞死亡情況下可採用的最高濃度。
實施例3:單方萃取物對於腸道上皮細胞通透性的影響
A.方法
經由人類腸道上皮細胞所建構之腸道透透性系統,來評估實施例1中所獲得之各萃取液對於腸道通透性之影響(Pham VT,Seifert N,Richard N,et al.The effects of fermentation products of prebiotic fibres on gut barrier and immune functions in vitro[published correction appears in PeerJ.2018 Aug 17;6:.Steinert,Robert[corrected to Steinert,Robert E]].PeerJ.2018;6:e5288.Published 2018 Aug 10.doi:10.7717/peerj.5288)。詳細實施步驟如下所述。
將人類結腸腺癌細胞Caco-2於transwell培養盤培養21天後,將細胞分成負對照組(negative control,NC)、正對照組(positive control,PC)與4組實驗組,以進行體外腸漏平台測試。負對照組為未經處理之細胞。正對照組為經50μM氯化小蘖鹼(berberine chloride)處理之細胞(Valenzano MC,DiGuilio K,Mercado J,Teter M,To J,Ferraro B,et al.(2015)Remodeling of Tight Junctions and Enhancement of Barrier Integrity of the CACO-2 Intestinal Epithelial Cell Layer by Micronutrients.PLoS ONE 10(7):e0133926.)。
4組實驗組分別為經樣本1、樣本2、樣本3與樣本4以不造成細胞死亡的濃度(樣本1:3μg/mL;樣本2:100μg/mL;樣本3:100μg/mL;樣本4:100μg/mL)處理的細胞(樣本先以ddH2O配製為濃度100mg/mL,再以用細胞培養基稀釋到200μg/mL濃度,之後再稀釋至各試驗濃度)。
各組細胞於上述處理後培養48小時,之後將細胞以
350mg/mL鼠李糖脂(Rhamnolipids)誘導細胞通透。
接著於transwell培養盤內盤中加入FITC-葡萄聚糖4(FITC-dextran 4,FD4)螢光染劑,並於反應4小時之後,吸取培養盤下層孔槽之液體,以偵測其螢光強度(激發光波長:485nm;放射光波長:538nm)。
依據下方所示之公式,藉由下層孔槽所獲得之液體的螢光強度,來評估腸道細胞的通透性。
FD4滲漏率=(試驗樣本之FD4螢光值/負對照組(NC)之FD4螢光值)×100%。
B.結果
結果如第2圖所示。
第2圖顯示,樣本1(靈芝萃取物)、樣本2(紅棗萃取物)、樣本3(桂圓萃取物)與樣本4(蓮子萃取物)皆可顯著降低FD4滲漏率,而此代表樣本1至樣本4皆具有抑制腸道通透之活性。
實施例4:複方萃取物對於腸道上皮細胞通透性的影響
A.方法
經由人類腸道上皮細胞所建構之腸道透透性系統,來評估實施例1中所獲得之各萃取液對於腸道通透性之影響。詳細實施步驟如下所述。
將人類結腸腺癌細胞Caco-2於transwell培養盤培養21天後,將細胞分成負對照組(NC)、正對照組(PC)與9組實驗組,以進行體外腸漏平台測試。負對照組為未經處理之細胞。正對
照組為經50μM氯化小蘖鹼處理之細胞。9組實驗組分別為經以1.5μg/mL之樣本1、樣本2、樣本3、樣本4、樣本6、樣本9、樣本11、樣本12與樣本15A處理的細胞。
各組細胞於上述處理後培養48小時,之後將細胞以350mg/mL鼠李糖脂誘導細胞通透。
接著於transwell培養盤內盤中加入FITC-聚葡萄糖4(FITC-dextran 4,FD4)螢光染劑,並於反應4小時之後,吸取培養盤下層孔槽之液體,以偵測其螢光強度(激發光波長:485nm;放射光波長:538nm)。
依據下方所示之公式,藉由下層孔槽所獲得之液體的螢光強度,來評估腸道細胞的通透性。
FD4滲漏率=(試驗樣本之FD4螢光值/負對照組(NC)之FD4螢光值)×100%。
B.結果
結果如第3圖所示。
第3圖顯示,當將樣本2(紅棗萃取物)、樣本3(桂圓萃取物)與樣本4(蓮子萃取物)由實施例3所採用之濃度100μg/mL濃度下降至1.5μg/mL後,樣本2、樣本3與樣本4,並未顯著性降低FD4滲漏率,而僅有樣本1可顯著降低FD4滲漏率。
又,第3圖也顯示,對於不同之複方萃取物而言,僅樣本12(靈芝萃取物+紅棗萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為1:1:1))與樣本15A(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為1:1:1:1)),可顯著降低FD4滲漏率。在相同作用濃度
(1.5μg/mL)下,樣本15A相較於樣本1與樣本12,可更顯著地抑制FD4滲漏率,而此代表樣本15A對於抑制腸道通透具有更佳之活性。
實施例5:不同配比之四味複方對於腸道上皮細胞通透性的影響
A.方法
經由人類腸道上皮細胞所建構之腸道透透性系統,來評估實施例1中所獲得之各萃取液對於腸道通透性之影響。詳細實施步驟如下所述。
將人類結腸腺癌細胞Caco-2於transwell培養盤培養21天後,將細胞分成負對照組(NC)、正對照組(PC)與6組實驗組。以進行體外腸漏平台測試。
於此實驗中,以4個批次進行實驗。各批次中,負對照組皆為未經處理之細胞,而正對照組皆為經50μM氯化小蘖鹼處理之細胞。
於第1批次中,6組實驗組分別為經樣本1、樣本15A、樣本15B、樣本15C、樣本15D與樣本15E以1.5μg/mL處理的細胞。
於第2批次中,6組實驗組分別為經樣本1、樣本15A、樣本15F、樣本15G、樣本15H與樣本15I以1.5μg/mL處理的細胞。
於第3批次中,6組實驗組分別為經樣本1、樣本15A、樣本15J、樣本15K、樣本15L與樣本15M以1.5μg/mL處理的細胞。
於第4批次中,6組實驗組分別為經樣本1、樣本
15A、樣本15N、樣本15O、樣本15P與樣本15Q以1.5μg/mL處理的細胞。
各組細胞於上述處理後培養48小時,之後將細胞以350mg/mL鼠李糖脂誘導細胞通透。
接著於transwell培養盤內盤中加入FITC-聚葡萄糖4(FITC-dextran 4,FD4)螢光染劑,並於反應4小時之後,吸取培養盤下層孔槽之液體,以偵測其螢光強度(激發光波長:485nm;放射光波長:538nm)。
依據下方所示之公式,藉由下層孔槽所獲得之液體的螢光強度,來評估腸道細胞的通透性。
FD4滲漏率=(試驗樣本之FD4螢光值/負對照組(NC)之FD4螢光值)×100%。
B.結果
第1批次實驗、第2批次實驗、第3批次實驗與第4批次實驗的結果分別如第4A圖、第4B圖、第4C圖與第4D圖所示。
依據第4A圖、第4B圖、第4C圖與第4D圖可知,樣本15A(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為1:1:1:1))與樣本15B(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為3:1:1:1))具有較佳之抑制腸道通透活性,其中,樣本15A相較於樣本15B,可更顯著地抑制腸道通透。
實施例6:四味複方萃取物對於腸道上皮細胞通透性之影響
經由人類腸道上皮細胞所建構之腸道透透性系統,
來評估實施例1中所獲得之樣本15B(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為3:1:1:1))對於腸道通透性之影響。詳細實施步驟如下所述。
將人類結腸腺癌細胞Caco-2於transwell培養盤培養21天後,將細胞分成2組負對照組(NC)、2組正對照組(PC)與6組實驗組,以進行體外腸漏平台測試。2組負對照組為未經處理之細胞。2組正對照組為經50μM氯化小蘖鹼處理之細胞。6組實驗組分別為經0.3μg/mL、0.3μg/mL、0.6μg/mL、0.6μg/mL、1.5μg/mL與1.5μg/mL之濃度的樣本15B處理的細胞。
各組細胞於上述處理後培養48小時,之後將一半之實驗組別(包含負對照組、正對照組與經3種濃度之樣本15B處理之實驗組)的細胞以350mg/mL鼠李糖脂誘導細胞通透,而另一半實驗組別的細胞則未以鼠李糖脂處理。
接著於transwell培養盤內盤中加入FITC-葡萄聚糖4(FITC-dextran 4,FD4)螢光染劑,並於反應4小時之後,吸取培養盤下層孔槽之液體,以偵測其螢光強度(激發光波長:485nm;放射光波長:538nm)。
依據下方所示之公式,藉由下層孔槽所獲得之液體的螢光強度,來評估腸道細胞的通透性。
FD4滲漏率=(試驗樣本之FD4螢光值/負對照組(NC)之FD4螢光值)×100%。
B.結果
結果如第5圖所示。未以鼠李糖脂處理之組別的細胞皆並未顯示明顯的螢光強度。於負對照組中,相較於未以鼠李糖脂
誘導之組別,經鼠李糖脂誘導之組別的螢光強度顯著增強,又於經鼠李糖脂誘導之組別中,0.6μg/mL與1.5μg/mL之濃度的樣本15B(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為3:1:1:1))皆可顯著降低螢光強度,而此代表其具有抑制腸道通透之活性。
實施例7:四味複方萃取物對於腸道上皮細胞緊密連接蛋白基因表現量之影響
A.方法
分別收集實施例6中經鼠李糖脂誘導之組別中的負對照組、正對照組與實驗組(以1.5μg/mL之濃度的樣本15B處理)的細胞。
藉由Total RNA Purification Kit(GeneMark,Taichung,Taiwan)來分離細胞的全核醣核酸(total RNA)。藉由Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific),依據製造商之操作步驟,將所獲得之全核醣核酸以反轉錄聚合酵素連鎖反應將訊息核醣核酸(mRNA)反轉錄為cDNA。
接著,將cDNA樣品進行即時定量聚合酶連鎖反應,以測定CLDN3、OCLN與TJP1 mRNA的表現量。以相對定量數據分析2-(△△CT)法計算基因表現差異,並以(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為參考基因(Reference Gene)。針對各基因所使用的引子如表7所示。
B.結果
結果如第6A圖、第6B圖與第6C圖所示。結果顯示,相較於負對照組,正對照組及實驗組皆可顯著增加CLDN3、OCLN與TJP1之基因的表現量。
實施例8:四味複方萃取物對於葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)誘發動物腸道通透性異常的影響
A.方法
於此實驗中所使用之動物為5-6週大C57BL/6公鼠(購自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center))。
以葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)誘發腸道通透性異常之動物模型(Laroui H,Ingersoll SA,Liu HC,Baker MT,Ayyadurai S,et al.(2012)Dextran Sodium Sulfate(DSS)Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon.PLoS ONE 7(3):e32084.doi:10.1371/journal.pone.0032084)進行試驗。
將小鼠分為未經處理組(Naïve)、負對照組(載劑:水)、正對照組(5-胺柳酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA))與3組實驗組(樣本15B(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為3:1:1:1)))。未經處理組之小鼠並未經任何處理。負對照組之小鼠為給予含有0.5%(v/v)葡聚糖硫酸鈉(MP Biomedicals)飲水,以誘導其發生腸道通透性異常;正對照組之小鼠為給予0.5%(v/v)葡聚糖硫酸鈉以及200μM之5-胺柳酸。3組實驗組之小鼠為分別給予0.5%(v/v)葡聚糖硫酸鈉與100mg/kg之樣本15B、0.5%(v/v)葡聚糖硫酸鈉與200mg/kg之樣本15B,及0.5%(v/v)葡聚糖硫酸鈉與400mg/kg之樣本15B。
實驗為期14天。在實驗結束當天,於將小鼠禁食3-4小時後,給予小鼠500mg/kg之FITC-聚葡萄糖(FD4,Sigma)。於2小時後,犧牲小鼠、採集其血液並分離血清。
以多功能微量盤分光光譜儀(Molecular Device,FlexStation®3)進行小鼠血清中之FITC-聚葡萄糖含量,以作為腸道通透性之指標。
B.結果
第7圖顯示,相較於未經處理組,以0.5%(v/v)DSS處理之負對照組之血清中FITC-聚葡萄糖濃度顯著增加,而此顯示0.5%(v/v)葡聚糖硫酸鈉可誘導小鼠腸道通透性增加。又,相較於負對照組,正對照組及實驗組皆可降低血清FITC-聚葡萄糖濃度,而此顯示樣本15B(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為3:1:1:1))可以改善葡聚糖硫酸鈉誘發之腸道通透性增加。
實施例9:四味複方萃取物對於生理時鐘擾亂動物模式之影響
A.方法
於此實驗中所使用之動物為8週大C57BL/6公鼠(購自國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center))。
將小鼠進行手術以裝載電極於腦殼以記錄腦波。經過7天復原期後,將小鼠在正常之光暗週期12小時:12小時條件下飼養2週,並記錄小鼠24小時腦波變化作為基礎點。
接著,將小鼠分為未經處理組(Naïve)、負對照組(載劑)、正對照組(二氯平(Diazepam)及實驗組(樣本15B(靈芝萃取物+紅棗萃取物+桂圓萃取物+蓮子萃取物(用以獲得各萃取液之各藥材原料的重量比為3:1:1:1)))。未經處理組之小鼠為為繼續飼養於正常之光暗週期2週(光暗週期為12小時:12小時)。負
對照組、正對照組實驗組之小鼠在光暗週期為7小時:7小時之條件下飼養7天,以透過擾亂生理時鐘(circadian disruption)誘導小鼠失眠,其中於飼養期間,負對照組之小鼠給予等量無菌水、正對照組之小鼠給予二氯平(口服2.5mg/kg),而實驗組小鼠則給予200mg/kg之樣本15B。
於生理時鐘擾亂後的第4天記錄小鼠24小時腦波變化,以分析快速動眼期(Rapid Eye Movement,REM)、非快速動眼期(Non-Rapid Eye Movement,NREM)之時間比例(%)等睡眠週期參數。
B.結果
結果如第8圖所示。結果顯示,相較於未經處理組,負對照組之快速動眼期之時間比例與非快速動眼期之時間比例皆顯著減少,而此顯示生理時鐘擾亂可誘導小鼠失眠。又,相較於負對照組,正對照組及實驗組皆可顯著提升非快速動眼期之時間比例,具有緩解小鼠失眠之功效。
實施例10:四味複方萃取物對於amyloid β誘導動物學習操作能力障礙之影響
A.方法
經由以β類澱粉蛋白(amyloid β)誘導動物之腦部形成似老年斑塊的沉積的動物模式(Kim,H.Y.,Lee,D.K.,Chung,B.R.,Kim,H.V.,Kim,Y.Intracerebroventricular Injection of Amyloid-β Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits.J.Vis.Exp.(109),e53308,doi:10.3791/53308(2016).)來評估樣本15B對於學習
操作能力的影響。實驗步驟如下所述:
於此實驗中所使用之動物為Sprague-Dawley系雄性大鼠(體重300-330g,購自樂斯科)。
將大鼠分為Sham組、對照組與實驗組。Sham組之大鼠注射人工腦脊髓液,對照組之大鼠注射2.5μL β類澱粉蛋白胜肽(amyloid β peptide)1-40,而實驗組之大鼠注射2.5μL β類澱粉蛋白胜肽1-40以及口服給予樣本15B(127mg/kg/天)持續30天。
於實驗第22至23天進行運動活動力與探索行為之評估試驗
運動活動力與探索行為之評估說明如下:
大鼠之運動活動力與探索行為之評估試驗係於一實驗箱中進行。實驗箱具有長、寬、高均40cm的尺寸。又,實驗箱具有一個不銹鋼底板,而底板上具有16個直徑3cm的孔洞,其排列為4*4之矩陣,其中相鄰之兩個孔洞之間的間距為4cm,而矩陣之各側邊與孔洞間距為7cm。以感測器TruScan Line E63-01HS、TruScan Sensor E63-22(Coulbourn Instruments International Corporation)感應並記錄大鼠之運動,並以分析軟體Coulbourn Instruments’ The Habitest System進行分析。每隻大鼠之測定時間為15分鐘。測定項目包括洞孔花費時間、探洞次數與探索能力。
實驗第24至28天進行水迷宮實驗。
水迷宮實驗說明如下:
將泳池分成四個象限,而安全平台固定置於第四象
限上。將大鼠置於泳池(於每次實驗中每隻大鼠皆置於不同象限),每天訓練2次,每次2分鐘。若大鼠於2分鐘內即找到安全平台,讓大鼠休息30秒鐘後,離開泳池休息30秒鐘,再進行下一次之訓練。而若大鼠於2分鐘尚未找到安全平台,則將大鼠放置於安全平台,休息30秒鐘後,離開泳池休息30秒鐘,再進行下一次之訓練;共訓練4天。
之後,分別進行水迷宮空間操作(spatial performance in Morris water maze)試驗與水迷宮非空間操作(non-spatial performance in Morris water maze)試驗。在水迷宮空間操作試驗中,在安全平台的相對位置處,設立參考點,再將大鼠置於第一象限,記錄大鼠於泳池內抵達原安全平台所花之時間。在水迷宮非空間操作試驗中,移除參考點,再將大鼠置於第一象限,記錄大鼠於泳池內抵達原安全平台所花之時間。
所有動物於行為測試結束後次日,將大腦海馬迴(hippocampus)區與額葉皮質(frontal cortex)區取出,以進行AChE活性分析及蛋白質含量的測定。
B.結果
第9A圖、第9B圖與第9C圖顯示大鼠之運動活動力與探索行為之評估試驗的結果。結果顯示,相較於Sham組的大鼠,給予β類澱粉蛋白胜肽1-40之對照組的大鼠減低了於洞孔中花費之時間、探洞次數與探索能力。然而,實驗組顯示,樣本15B可改善大鼠因β類澱粉蛋白胜肽1-40所導致之洞孔花費時間、探洞次數與探索能力的下降,並提升大鼠之洞孔花費時間、探洞次數與探索能力。
第10圖與第11圖顯示大鼠之水迷宮試驗的結果。
第10圖顯示,大鼠於水迷宮空間操作試驗中尋找安全平台之時間。第10圖顯示,相較於Sham組的大鼠,給予β類澱粉蛋白胜肽1-40之對照組的大鼠抵達水池安全平台之時間明顯增長。然而,實驗組顯示,樣本15B可改善大鼠因β類澱粉蛋白胜肽1-40所導致之於第1天至第2天出現的空間操作障礙(即縮短抵達安全平台所需之時間)。
第11圖顯示,大鼠於水迷宮非空間操作試驗中抵達安全平台之時間。
相較於Sham組的大鼠,給予β類澱粉蛋白胜肽1-40之對照組的大鼠尋找放置安全平台區域之時間明顯增長。然而,實驗組顯示,樣本15B可改善大鼠因β類澱粉蛋白胜肽1-40所導致之參考記憶(reference memory)障礙(即縮短於水池尋找放置安全平台區域之時間)。
第12A圖與第12B圖分別顯示,於β類澱粉蛋白誘導學習能力障礙之動物模式中,大鼠之海馬迴區之AChE活性與大鼠之額葉皮質區之AChE活性。
第12A圖與第12B圖顯示,相較於Sham組的大鼠,給予β類澱粉蛋白胜肽1-40之對照組的大鼠之海馬迴區與額葉皮質區之AChE活性明顯增加。然而,實驗組顯示,樣本15B可以改善因β類澱粉蛋白胜肽1-40所導致之大鼠之海馬迴區與額葉皮質區之AChE活性的上升現象。
實施例11:四味複方之靈芝酸A含量的確認
A.方法
靈芝酸A(Ganoderic acid A)含量測定:
1.對照標準品儲備溶液配製:
將精確秤量10mg之對照標準品靈芝酸A(Ganoderic acid A),置於10mL之定量瓶內,之後加入甲醇溶液,以超音波振盪使靈芝酸A完全溶解,然後將上述溶液定量至10mL,使該溶液每1mL含1mg靈芝酸A,以獲得一對照標準品溶液(1mg/mL)。
2.注入可重複性測試:
分別取1mL之對照標準品溶液(1mg/mL)置於10mL定量瓶中,再以甲醇定量至刻度。上述溶液(0.1mg/mL)以HPLC分析重複注入五次(注入可重複性測試),計算靈芝酸A波峯面積之相對標準差(RSD)不得大於2.0%。
3.檢量線製作(靈芝酸A標準品):
取對照標準品儲備溶液,以甲醇進行稀釋,根據樣品濃度配製靈芝酸A標準品五種濃度,其濃度範圍需包含樣品中之靈芝酸A濃度80-120%,分別將五種濃度之標準品溶液注入高效液相層析儀(high performance liquid chromatography,HPLC)進行分析,以波峰面積對濃度作線性回歸,其R2不得小於0.995。
4.檢品配製:
將檢品(靈芝萃取物(樣本1)或樣本15B)1.0g,置於20mL之定量瓶中,之後加入約10mL的純水,並將定量瓶放置於水浴中超音波震盪10分鐘。靜置冷卻後將純水加入定量瓶定量
至20mL以形成檢品溶液。將適量檢品溶液離心(10000rpm,5分鐘),並以0.45μm濾膜過濾,之後進行高效液相層析分析,計算檢品中靈芝酸A之含量。
5.高效液相層析分析條件:
層析管柱種類:Inertsil 5 ODS-2 4.6×250mm或equivalent
偵測波長:257nm
pump流速:1.0mL/分鐘
每一樣品分析時間:120分鐘
總注射體積:20μL
移動相配製:
移動相A=10%MeOH於CH3CN中(體積比)
移動相B=0.075%磷酸水溶液(將522μL之85%磷酸(密度=1.685g/mL)至1L定量瓶內,以純水稀釋至刻度)。
6.靈芝酸A含量計算
靈芝酸A含量(mg/g)=檢品中靈芝酸A濃度(mg/mL)×20(mL)
B.結果
將靈芝酸A標準品、靈芝萃取物(樣本1)與樣本15B之如上方所述分別配製的檢品進行上述高效液相層析分析並計算樣本15B中之靈芝酸A含量。結果如第13圖所示。
參第13圖,由上方所述標準品之檢量線可計算出靈芝萃取物及樣本15B中之靈芝酸A含量分別為66.3mg/g及4.96mg/g。
藉由確定樣本中之靈芝酸A含量,可以確認樣本之品質。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可作些許之更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物以及中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物的用途
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<220>
<223> 針對GAPDH基因之逆向引子
<400> 8
Claims (23)
- 一種調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,包括:一中草藥複方藥材或一中草藥複方萃取物為活性成分,其中該中草藥複方藥材,係由以下所組成:靈芝;紅棗;桂圓;以及蓮子,其中,於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5,又,其中該中草藥複方萃取物,係由以下所組成:靈芝萃取物;紅棗萃取物;桂圓萃取物;以及蓮子萃取物其中,用以獲得包含於該中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比為0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5,其中該腸漏相關疾病為發炎性腸道疾病、乳糜瀉、大腸激躁症或阿茲海默症。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該靈芝包括赤芝、紫芝或鹿角靈芝。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該紅棗包括灰棗、雞心棗、冬棗、大棗、小棗或金絲棗。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該桂圓包括粉殼龍眼、紅殼龍眼或青殼龍眼。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該蓮子包括紅蓮子或白蓮子。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中於該調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,每公克組成物含有0.2-20mg的靈芝酸A。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中,於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為1:1:1:1。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中,於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為3:1:1:1。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中,用以獲得包含於該中草藥複方萃取 物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比為1:1:1:1。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中,用以獲得包含於該中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比為3:1:1:1。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。
- 如請求項11之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物的含量可為10-99.5wt%。
- 如請求項1之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物為一醫藥組成物或一保健組成物。
- 如請求項13之調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物,其中該醫藥組成物或保健組成物的口服形式包括錠劑、顆粒劑、散劑、小球膠囊劑、膠囊劑、著衣錠、溶液劑或沖泡劑。
- 一種中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物為活性成分用於製備調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物的用途,其中該中草藥複方藥材,係由以下所組成: 靈芝;紅棗;桂圓;以及蓮子,其中,於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5,又,其中該中草藥複方萃取物,係由以下所組成:靈芝萃取物;紅棗萃取物;桂圓萃取物;以及蓮子萃取物,其中,用以獲得包含於該中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之作為製備原料之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子的重量比為0.1-15:0.6-2:0.6-2:0.6-5,其中該腸漏相關疾病為發炎性腸道疾病、乳糜瀉、大腸激躁症或阿茲海默症。
- 如請求項15之用途,其中於該調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物中,每公克醫藥組成物或保健組成物含有0.2-20mg的靈芝酸A。
- 如請求項15之用途,其中,於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為1:1:1:1。
- 如請求項15之用途,其中,於該中草藥複方藥材中,靈芝、紅棗、桂圓與蓮子的重量比為3:1:1:1。
- 如請求項15之用途,其中,用以獲得包含於該中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之原始藥材之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子重量的比為1:1:1:1。
- 如請求項15之用途,其中,用以獲得包含於該中草藥複方萃取物中之靈芝萃取物、紅棗萃取物、桂圓萃取物與蓮子萃取物分別所需之原始藥材之靈芝、紅棗、桂圓、蓮子重量的比為3:1:1:1。
- 如請求項15之用途,其中該調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物更包括一藥學上可接受之載體或鹽類。
- 如請求項21之用途,其中該中草藥複方藥材或中草藥複方萃取物的含量可為10-99.5wt%。
- 如請求項15之用途,其中該調節腸道通透性及/或治療及/或預防腸漏相關疾病之組成物為一醫藥組成物或一保健組成物。
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