TWI821996B - 氧化鋅用於提高農藥防治其抗藥性病原菌之功效的應用及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種提高農藥防治其抗藥性病原菌能力的方法，特徵在於將氧化鋅與一農藥組合，使該農藥產生抑制具抗藥性之病原菌生長的效力，藉以防治該抗藥性病原菌造成的植物病害。
Description
本發明係關於農業化學防治領域，特別是關於利用氧化鋅與農藥組合以防治抗藥性病原菌之植物病害。
過量、頻繁使用相同作用機制藥劑會促使田間病原菌產生抗藥性。例如，國內苗栗草莓產區在 2016 年苗改場調查中，分離自田間的草莓炭疽病菌菌株超過半數都抗史托比類藥劑（苗栗區農業改良場 105 年報，115 頁，2017），近幾年也有農民口頭反應三氟敏對炭疽病的防治效果不彰。近年來環境友善意識與永續農業抬頭，因應行政院農業委員會 2017 年推動之十年農藥減半政策，開發替代性生物資材或其他非農藥新穎資材為降低田間化學藥劑使用量且降低抗藥性風險之策略（林等人，農業試驗所特刊 229 期，1-8頁，2020）。
先前有研究指出，奈米氧化鋅對來自多種作物的不同病原真菌具有抑制能力，且已被美國食品藥物管理局（The United States Food and Drug Administration, USFDA）列為安全資材（Xie et al.,
Scientific reports,
4(1), 1-9, 2011）。奈米氧化鋅具有光解（photodegradation）特性，推論其施用於土壤後可能有共同移除汙染物的能力（Chang et al.,
Journal of Cleaner Production, 262, 121342, 2020），是環境友善且有潛力替代合成化學藥劑。CN 107410294 A 揭露一種包含植物油、奈米氧化鋅的農藥用助劑，其中加入奈米氧化鋅的作用是為紫外線（400 nm）屏障，藉以減緩農藥的降解，從而達到延長農藥的藥效。CN 103461387 B 揭露一種包含白僵菌孢子粉、毒死蜱原藥和紫外線保護劑（包括奈米氧化鋅等）的殺蟲劑，可兼防治甘蔗金龜子及甘蔗螟蟲，然而該案並沒有明確指出使用紫外線保護劑對於降低害蟲抗藥性的作用。
由炭疽病菌（
Colletotrichumspp.）引起的草莓炭疽病（anthracnose）為草莓生育期主要病害，可危害全株，其中以子苗的冠部感染造成移植後倒伏之影響最為嚴重，目前田間病害管理仍以化學防治為主，然而相同作用機制的藥劑頻繁噴施，容易促使草莓炭疽病菌產生抗藥性。三氟敏（trifloxystrobin）屬於史托比類（strobilurin）藥劑，為常用於防治草莓炭疽病之慣行藥劑，苗栗區農業改良場於 105 年年報曾報導分離自該區菌株超過半數對史托比類藥劑具有抗性。
於是，本發明首先提出將氧化鋅，尤其是奈米氧化鋅，與一種已產生抗藥性病原菌株的農藥（例如，三氟敏）組合，來使該農藥產生對抗其抗藥性病原菌能力，以達到防治抗藥性病原菌感染的目的。
於一方面，本發明係關於一種用於防治已對一農藥產生抗藥性之植物病原菌的方法，包含將氧化鋅與該農藥組合施用，使該農藥產生可抑制已對其產生抗藥性之病原菌生長的能力。於一些實施例中，所述之氧化鋅包括奈米態氧化鋅。
於一些實施例中，所述之方法包含將 10-100 ppm，較佳為 20-80 ppm 之氧化鋅與該農藥之田間建議施用濃度組合施用於已受抗藥性之植物病原菌感染的植株。
於一些實施例中，所述之農藥包括史托比類（strobilurin）、苯并咪唑類（benzimidazoles）以及三唑類（triazole）等藥劑。於一實施例中，所述之農藥為三氟敏（trifloxystrobin）。
於一實施例中，所述之病原菌為炭疽病菌（
C. gloeosporioidesspecies complex）。
於另一方面，本發明提供一種抑制抗藥性植物病原菌生長的組合物，包含氧化鋅與一已產生抗藥性病原菌的農藥。於一些實施例中，所述之組合物包含 10-100 ppm，較佳為 20-80 ppm 之氧化鋅與一田間建議施用濃度之農藥。於一實施例中，所述之氧化鋅為奈米氧化鋅。
於一些實施例中，所述之農藥為史托比類（strobilurin）藥劑。於一實施例中，所述之農藥為三氟敏（trifloxystrobin）。
透過參考本發明下述中各種實施例的詳細描述，可更容易理解本發明，另外，除非專利範圍中另有具體說明，否則本發明之內容不限於具體的製備方法、載體或製劑。此外，本發明中所用的術語僅用於描述特定實施例之目的，並非用於加以限制。
於說明書與專利範圍中所使用的單數形式如“一”與“該”亦包含其複數形式，因此，除非於上下文中另有注釋，否則單數術語應包含其複數，而複數術語應包含其單數。
本文中的術語“農藥”係指用於防除農林作物或其產物之有害生物者。如用於田間之除草劑、殺菌劑、殺蟲劑、殺蟎劑、殺鼠劑、除螺劑及殺線蟲劑等，其中包括蘇力菌、枯草桿菌、純白鏈黴菌素及嘉賜黴素等生物製劑。
本文中的術語“抗藥性（fungicide resistance）”係指植物病原菌對於有害物質（如藥劑、農藥）的忍受程度提升，導致該病原菌遇到該藥劑或農藥時能夠忍受並存活，而產生具有抵抗此種藥劑或農藥的能力。抗藥性一詞等於藥劑或農藥劑量失敗或藥物抵抗，造成相同劑量卻不如當初有效或失效的情況。
本文中的術語“協同效應（synergism）”係指使用“混合製劑的預期效力（expected effect of the mixture）”而不是“單獨成分之效力的總和（sum of the effects of individual components）”。
本文中的術語“奈米態氧化鋅”或“奈米氧化鋅”係指氧化鋅之奈米顆粒，以下實施例所使用之“奈米氧化鋅”為一種 3D 多枝花狀奈米氧化鋅（multibranched flower-liked nano zinc oxide, 3D nano-ZnO），係由國立中興大學材料科學與工程學系薛涵宇教授研究室提供。
實施例
實施例一、奈米氧化鋅與三氟敏組合施用對具抗藥性（trifloxystrobin-resistant）之草莓炭疽病菌株菌（
Colletotrichumspp.）的抑制效果
本實例係自台中與苗栗草莓產區蒐集 20 株炭疽病菌株，利用比濁法與盤式分光光度儀，分析不同劑量之三氟敏與炭疽病菌共培養的生長曲線，計算最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC），加以評估病原菌對農藥的感受性。依據分析結果大略將田間採集之草莓炭疽病菌株區分為對三氟敏具敏感性（sensitive）之 C38 等十菌株、中抗藥性（moderate resistant）之 C19 等五菌株以及高抗藥性（highly resistant）之 C31 等五菌株。以本試驗結果作為基礎，將 C6 與 C8 作為敏感性標準菌株，D2、CG8 及 CG68 作為抗藥性標準菌株，進行以下的組合施用試驗。
首先，利用微孔盤與分光光度儀進行比濁法測量，分析奈米氧化鋅與三氟敏組合使用對炭疽病菌生長曲線之抑制及最低抑菌濃度（MIC）與無抑菌濃度（none inhibitory concentration, NIC）之影響，進行抗感性變化評估。將90 μl 之 0.125% 瓊脂半固態（semi-solid）PDA、5 μl 之 800 ppm 奈米氧化鋅（混合後最終濃度 20 ppm）、5 μl 梯度濃度之三氟敏及 100 μl 炭疽病菌孢子懸浮液（10
6conidia/ml）各別加入 96 孔盤中，三氟敏在微孔盤中的最終濃度為500、300、100、25、12.5、6.25、1.5625 ppm，奈米氧化鋅最終濃度為 20 ppm。於 30°C 下恆溫培養，期間每 15 分鐘測量一次 OD
600視作炭疽病菌之生長讀值，連續測量 72 小時。其後將數據與無農藥對照組校正後的數據，以梯形原理計算 OD
600與培養時間之曲線下面積，以各濃度三氟敏之曲線下面積除以對照組之曲線下面積，得出 fractional areas [f(a)]，將 f(a) 和藥劑濃度指數值之曲線代入Gompertz equation，得出參數後計算最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）與無抑菌濃度（none inhibitory concentration, NIC）參考Lambert, R. J. W., & Pearson, J.,
Journal of Applied Microbiology,
88(5), 784-790, 2000。
表一、組合施用三氟敏與奈米氧化鋅對抗藥性與敏感性炭疽病菌標準菌株之最低抑菌濃度與無效應濃度之影響。
MR：中抗藥性；HR：高抗藥性。數據取自三次獨立試驗，每一試驗進行四重複。
| 菌株 | 處理 | MIC (ppm) | NIC (ppm) | |
| 三氟敏-抗藥性 | D2 MR | 三氟敏 | 1919.1 | 10.0 |
| 三氟敏+奈米氧化鋅 | 1325.6 | 1.1 | ||
| CG8 HR | 三氟敏 | 8506.6 | 0.0 | |
| 三氟敏+奈米氧化鋅 | 269.6 | 2.0 | ||
| CG68 HR | 三氟敏 | 15228.3 | 0.001 | |
| 三氟敏+奈米氧化鋅 | 37.1 | 0.002 | ||
| 三氟敏-敏感性 | C6 | 三氟敏 | 1.7 | 0.6 |
| 三氟敏+奈米氧化鋅 | 1.7 | 0.6 | ||
| C8 | 三氟敏 | 2.0 | 0.5 | |
| 三氟敏+奈米氧化鋅 | 1.7 | 0.6 |
參見表一，將對三氟敏具抗藥性（三氟敏-抗藥性）之標準菌株，在三氟敏與 20 ppm 奈米氧化鋅組合施用並共培養 72 小時後，顯示對於藥劑的敏感性在最低抑菌濃度上皆有明顯改變。在組合施用並共培養後，中抗藥性標準菌株 D2 之 MIC 由原先的 1919.1 ppm 降至 1325.6 ppm，其 NIC 則由 10.0 ppm 降至 1.1 ppm；高抗藥性菌株 CG8 之MIC，由原先的 8506.6 ppm 降至 269.6 ppm；另一高抗藥性菌株 CG68 之 MIC 則由原先的 15228.3 ppm 降至 37.1 ppm。而 CG8 與 CG68 此二具高度抗藥性菌株之 NIC 則略微提升，分別為由 0.0 上升至 2.0 ppm，以及由 0.001 上升至 0.002 ppm；至於敏感性（三氟敏-敏感性） 標準菌株在三氟敏與 20 ppm 奈米氧化鋅組合施用並共培養 72 小時後，其對於藥劑的敏感性在最低抑菌濃度（MIC）上皆無明顯改變。敏感性標準菌株 C6 在組合施用並共培養前後，其 MIC 與 NIC 均無變化，分別保持在 1.7 ppm 與 0.6 ppm。另一敏感性標準菌株 C8 在組合施用並共培養後，其 MIC 自 2.0 ppm 略微下降至 1.7 ppm，NIC 則由 0.5 ppm 略升為 0.6 ppm。本研究結果顯示，組合施用奈米氧化鋅和三氟敏可以降低抗藥性菌株和敏感性菌株的最低抑菌濃度，而在抗藥性程度愈高的菌株，於奈米氧化鋅和三氟敏之組合施用後，觀察到更加顯著的差異。
組合施用之交互作用
根據 Gisi 研究（Gisi, U,
Phytopathology,
86(11): 1273-1279, 1996）引用之 Abbott 公式，進行奈米氧化鋅和三氟敏組合施用對抑制草莓炭疽病菌之交互作用評估，其中 A 與 B 各分別為單獨使用特定濃度奈米氧化鋅和特定濃度三氟敏對炭疽病菌的抑制率，經換算而得到預期之抑制率（%
C exp= A+B-(AB/100)），將組合使用前述濃度之奈米氧化鋅和三氟敏對炭疽病菌實際生長抑制率（
C obs）與預期值相除，以評估其協同係數（synergy factor, SF =
C obs/
C exp），若數值大於 1 則兩者之間有協同效用（synergistic effect），介於 0.75-1 之間則兩者之間具有加成效用（additive effect），低於 0.75 則兩者之間為拮抗作用（antagonistic effect）。
為評估組合施用不同濃度之三氟敏與 10、20 或 80 ppm 奈米氧化鋅對於抗藥性菌株 D2、CG8 及 CG68 之生長曲線的影響，並以純水條件下之生長曲線作為對照組，經由換算得出抑制率如圖1。
由圖1A之結果顯示，在未添加任何奈米氧化鋅的條件下，不同濃度三氟敏對 D2 菌株的抑制率範圍為 26.3-49.9% ；當與 10 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 -10.7-54.0%；當與 20 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 4.3-63.6%；當與 80 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 14.1-64.9%。在相同三氟敏濃度下，氧化鋅的組合施用對於抑制率無顯著效果（p＞0.05）。
而不同濃度的三氟敏對 CG8 菌株的抑制率範圍為 2.1-80.0%，當與 10 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 -11.0 - 55.0%；與 20 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 -10.0 - 60.2%；與 80 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 35.0 - 71.0%。在 100 ppm 三氟敏濃度下與 80 ppm 氧化鋅的施用對於抑制率有明顯效果（圖1B）。
不同濃度的三氟敏對 CG68 菌株的抑制率範圍為 42.1 - 82.7%，當與 10 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 -14.7 - 87.0%；與 20 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 -3.4 - 74.7%；與 80 ppm 氧化鋅組合施用時，不同濃度三氟敏在組合施用後之抑制率範圍為 17.3 - 77.4%。在 100 ppm 三氟敏濃度下與 80 ppm 氧化鋅的施用對於抑制率有明顯效果（圖1C）。
將組合施用不同濃度之三氟敏與 80 ppm 氧化鋅對於抗藥性菌株 D2、CG8 及 CG68 之生長曲線的影響，並以純水條件下之生長曲線作為對照組，經由換算得出抑制率後，使用 Gisi（1996） 提出之 Abbott 公式進行協同係數換算，顯示三氟敏與奈米氧化鋅彼此之間對於三個菌株大多具有加成與協同效果。組合施用三氟敏和奈米氧化鋅的比例為 1.5625:80 在 D2 菌株可以觀察到最高的協同效用係數 3.1；而組合施用三氟敏和奈米氧化鋅的比例為 1.5625:80 在 CG8 菌株可以觀察到最高的協同效用係數 1.8；而組合施用三氟敏和奈米氧化鋅的比例為 1.5625:80，在 CG68 菌株可以觀察到最高的協同效用係數 1.3（圖2）。
以光學顯微鏡觀察組合施用對於高抗藥性菌株之菌絲生長的影響
將 60 與 80 ppm奈米氧化鋅與三氟敏（最終濃度 500 與 100 ppm）組合施用於高抗藥性菌株 CG8，在共同培養 72 小時後，緩慢攪動 96 孔盤樣本槽 30 下，取 2 μl 於玻片上，透過光學顯微鏡觀察真菌菌絲之外觀並紀錄，並以純水作為對照組，進行三次重複試驗，每處理四重複。
圖3之結果顯示，在單獨施用 60 ppm 奈米氧化鋅之處理組，可觀察到高抗藥性菌株 CG8 之菌絲生長，相較於對照組在長度上顯示其生長略受限，且其分支（branching） 前端縊縮（圖3K），與對照組相比其分支之間的距離較近；而在施用 80 ppm 奈米氧化鋅的情況下，分支菌絲的側枝（lateral branch）生長點旺盛，但皆因生長受限而偏短小，菌絲尖端（apical branching）與側枝彼此相當接近，使整體菌絲呈叢狀，其分支彼此之間的距離，相較於 60 ppm 奈米氧化鋅處理組，顯示更為接近（圖3A-C）。而在以 100 ppm 三氟敏與 60 ppm 氧化鋅組合施用之條件下，觀察到菌絲相較於單獨施用 100 ppm 三氟敏之處理組更顯著受到抑制，同樣也觀察到分支處之間的距離也相較對照組接近；而當以 100 ppm 三氟敏與 80 ppm 氧化鋅組合施用時，其分支處之間的距離亦相較對照組接近，且其分支菌絲生長勢較以 100 ppm 三氟敏與 60 ppm 氧化鋅組合施用之處理組緩慢（圖3D-F），菌絲尖端也觀察到縊縮（圖3M-O）。當三氟敏濃度提升至 500 ppm 時，無論其與 60 ppm 氧化鋅組合施用之處理組，或其與80 ppm 氧化鋅組合施用之處理組，和對照組相比，均觀察到菌絲生長較對照組更為緩慢，且分支情況明顯受到抑制（圖3G-I），而在與80 ppm 氧化鋅組合施用之處理組，可觀察到菌絲前端有縊縮現象（圖3R）。在個別以 60 及 80 ppm 奈米氧化鋅與三氟敏組合施用之培養基生長 72 小時後，觀察到高抗藥性菌株 CG8 的菌絲分枝（branching） 與菌絲生長，相較於對照組皆有較緩慢的情況（圖3）。菌絲分支系統（branching systems）具有頂端優勢（apical dominance）之現象，菌絲尖端分支（apical branching）抑制菌絲側枝（lateral branch）生長，並使分支點將養分供應到尖端菌絲生長，待菌絲尖端與分支點將距離拉開後，這些分支點方始活化，此為菌絲透過時間與空間調節機制確保組織正常生長之模式，而奈米氧化鋅與三氟敏組合施用會使炭疽病菌菌絲分支系統的正常模式受到破壞，不僅失去頂端優勢，菌株側枝也無法正常生長。
實施例二、以離葉接種評估奈米氧化鋅之防病能力
供試植物材料係採自溫室，切取香水品種草莓第二片完全展開葉，裝進含有濕擦手紙之夾鏈袋內帶回研究室進行試驗。在室內以酒精噴灑葉片至完全覆蓋，等待 15 秒後，以無菌水漂洗葉片 15 秒，即完成葉片表面消毒。其後以過火消毒之剪刀切除部分葉柄，將葉柄新鮮切口插入裝有 50 ml 無菌水之離心管中保濕，移入抽氣櫃風乾至葉表無水滴殘留為止。將標籤固定於葉柄，截去部分葉柄，維持約 4 cm 葉柄長度，將葉柄末端約 1 cm 插入含有 400 ml 無菌水之塑膠保鮮盒（42.3×31.0×10.5 cm
3），並以塑膠滅菌袋（55×37 cm
2）覆蓋在頂蓋與保鮮盒間維持實驗過程高相對濕度並避免水氣逸散。以葉片主脈為中線，用紅色奇異筆標定草莓葉片左右兩側，以針頭（0.8×40 mm） 穿刺標定點製造傷口，其後於穿刺孔滴 100 ppm 奈米氧化鋅或一般氧化鋅 10 μl 在草莓葉片上，再於傷口處接種 10
6conidia/ml 炭疽病菌之孢子懸浮液 10 μl，於 28°C 定溫培養 14 日，每日觀察記錄病斑大小（Chung
et al., 2020），比較奈米氧化鋅及一般氧化鋅在植體上的保護效果。
依照農業藥物毒物試驗所之植保資訊系統登記之 43.7% 三氟敏水懸劑建議稀釋 3,000 倍進行換算，得出田間建議施用濃度約為 145 ppm，並以此作為三氟敏進行組合施用之濃度。而奈米氧化鋅之濃度則是以 96 孔盤試驗 CG8 所得出之結果圖 1B 中，選擇具有顯著抑制效果之 80 ppm 進行組合施用。以無菌水十倍序列稀釋 100,000 ppm 奈米氧化鋅溶液至 1,000 ppm，再配製成 80 ppm 奈米氧化鋅及三氟敏和氧化鋅混合液，將三種處理液各別裝入噴罐備用。
草莓葉片表面消毒方式如前所述，並於風乾後各別葉噴 1 ml 上述三種處理液，使其完全覆蓋葉片表面，並以無菌水作為對照組，移到抽氣櫃風乾至葉表無液體殘留為止，將標籤固定於葉柄，截去部分葉柄後將葉柄末端插入含有 400 ml 無菌水之塑膠保鮮盒（42.3×31.0×10.5 cm
3） 中，維持試驗過程高相對濕度。以葉片主脈為中線，用紅色奇異筆標定草莓葉片左右兩側，以針頭穿刺標定點製造傷口，再於傷口處接種 10
6spore/ml 對三氟敏具抗藥性炭疽病菌 D2、CG8 及 CG68 菌株與敏感性菌株 C6 之孢子懸浮液 10 μl，於 28°C 定溫培養 14 日，每日觀察記錄病斑大小（Chung
et al., 2020），並計算所有接種點之罹病率（disease incidence），評估組合施用奈米氧化鋅與三氟敏對抗藥性菌株於植體之防治效力，每處理四重複，共進行一（C6、D2及CG68）至兩（CG8）次試驗。
亦比較一般氧化鋅與奈米氧化鋅處理對於草莓炭疽病在葉片上病害發展之影響，以中等抗藥性菌株 D2 與敏感性菌株 E3 進行葉片穿刺接種，施用 100 ppm 氧化鋅於穿刺孔並於施用後第 7 日觀察並紀錄病斑發展（圖4） 與面積大小（圖5）。結果顯示，在接種中抗性菌株 D2 之葉片上觀察到奈米氧化鋅與一般氧化鋅處理相較於對照組皆可顯著抑制病斑發展，兩者之間無顯著差異表現差異，顯示菌株本身對氧化鋅亦有感受性之差異。在對三氟敏具抗藥性之 D2 菌株施用一般態與奈米態氧化鋅相較於對照組皆出現顯著差異之結果，顯示氧化鋅的粒徑並非唯一對炭疽病菌產生毒性的因素。在敏感性菌株 E3 接種之葉片上觀察到奈米氧化鋅相較於一般氧化鋅與對照組，皆可顯著抑制病斑發展（參見圖4及圖5）。
為評估 80 ppm 奈米氧化鋅與田間建議施用濃度 145 ppm 之三氟敏組合施用在植物組織上對草莓炭疽病的防病效果，遂以離葉噴施三氟敏與奈米氧化鋅後穿刺接種敏感性炭疽病菌 C6 菌株、抗藥性炭疽病菌 D2、CG8 及 CG68 菌株進行比較。結果顯示，組合施用 145 ppm 三氟敏與 80 ppm 氧化鋅，無論在菌株 C6、D2、CG8 或 CG68 接種處理的葉片均可以觀察到在處理後第 3 日就顯著抑制病斑擴展（參見圖7、圖8），且於施用後第 7 日，組合施用相較於單獨施用三氟敏，草莓葉片上的炭疽病病斑大小顯著受到抑制（如圖6所示）。其中，接種炭疽病菌 CG8 之處理，於施用後第 7 日，組合施用之抑制率仍維持在 90% 以上（圖8），而單獨施用三氟敏之抑制率則降至 64.1%。菌株 C6、D2 與 CG68 在接種後第 7 日之單獨施用三氟敏與組合施用處理的抑制率彼此之間無顯著差異（p＞0.05）（圖8）。由於組合施用處理後一週內，皆可顯著抑制葉片上病斑的擴展，而植物保護資訊系統於草莓炭疽病登記延伸用藥之 43.7% 三氟敏水懸劑建議施藥方法為”病害發生初期開始施藥，必要時隔 7 天施藥一次＂，以本試驗結果配合植保資訊系統建議之三氟敏施用頻率，每週施用一次，推論在穩定環境下組合施用 145 ppm 三氟敏與 80 ppm 奈米氧化鋅，在田間應用於抑制草莓炭疽病菌相當具有潛力。
綜合上述研究結果顯示，組合施用奈米氧化鋅和三氟敏可以降低抗藥性菌株和敏感性菌株的最低抑菌濃度，在抗藥性程度愈高的菌株於組合施用後觀察到愈顯著的差異；且在抗藥性炭疽病菌株 D2、CG8 及 CG68 上，依據三氟敏和氧化鋅組合施用之比例不同，呈現加成或協同效果。另外，也在離葉接種試驗結果中觀察到，組合施用對於高抗藥性菌株 CG8 與 CG68 的抑制效果較好。表示，將奈米氧化鋅與農藥（例如三氟敏）組合施用，可提升低劑量農藥之抑菌效果，並可有效降低病原菌抗藥性產生之風險，因此利用奈米氧化鋅與農藥組合施用，能使農藥回復對已具抗藥性病原菌株之抑制生長效力，亟具推廣於田間應用之潛力。
根據以上敘述，本領域具通常知識者可輕易的了解本發明的必要特徵，並在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，對本發明進行各種的改變與修改，以適用於各式的用途與情況，因此，其他的實施例也應落入本發明的專利範圍中。
無
圖1係顯示組合施用不同濃度奈米氧化鋅與三氟敏對三氟敏抗性炭疽病菌株 D2、CG8 及 CG68 之抑制率。分別將 10 與 20 ppm 奈米氧化鋅混合不同濃度（0、1.5625、6.25、12.5、25、100、300、500 ppm）之三氟敏與 10
6conidia/ml 之抗性菌株 D2(A)、CG8(B) 及 CG68(C) 之分生孢子 100 μl，置於裝有半固態 PDA 之 96 孔盤，在 30℃ 下共培養 72 小時後，以各處理生長曲線之曲線下面積，經由與水對照組（control）之曲線下面積換算抑制率。試驗進行一重複，每重複包含三個樣本，誤差線為標準誤差（Standard error, SE），並以 Tukey HSD 檢驗統計相同字母表示無顯著差異（p＞0.05）。
圖2為組合施用三氟敏與奈米氧化鋅之比例與其對應之協同係數。將 80 ppm 奈米氧化鋅混合不同濃度（0、1.5625、6.25、12.5、25、100、300、500 ppm）之三氟敏與抗藥性菌株 D2、CG8 及 CG68 之分生孢子，於裝有半固態 PDA 之 96 孔盤，在 30℃ 下培養 72 小時後，以各處理生長曲線之曲線下面積經由與水對照組（control）之曲線下面積換算抑制率實際值，並與抑制率預期值相除得到協同係數（Synergistic factor, SF）。當數值大於 1 則兩者之間有協同效用，介於 0.75-1 之間 則兩者之間具有加成效用。試驗進行一重複，每重複包含三個樣本。
圖3係顯示不同濃度三氟敏與奈米氧化鋅組合施用於炭疽病菌 CG8 菌株，在光學顯微鏡下之菌絲生長變化。將奈米氧化鋅和三氟敏組合施用於高抗藥性菌株 CG8，（A, J）水對照組；（B, K）奈米氧化鋅 60 ppm 處理；（C, L）奈米氧化鋅 80 ppm 處理；（D, M）三氟敏 100 ppm 處理；（E, N）三氟敏 100 ppm 混合奈 米氧化鋅 60 ppm 處理；（F, O） 三氟敏 100 ppm 混合奈米氧化鋅 80 ppm 處理；（G, P）三氟敏 500 ppm 處理；（H, Q）三氟敏 500 ppm 混合奈米氧化鋅 60 ppm 處理；（I, R）三氟敏 500 ppm 混合奈米氧化鋅 80 ppm 處理，在 30℃ 之半固態 PDA 共培養 72 小時後，緩慢攪動 96 孔盤各樣本槽 30 下，取 2 μl 於玻片上，在光學顯微鏡下觀察其菌絲外觀（A-I）與菌絲尖端（J-R）。圖3 A-I 中比例尺代表 200 µm，圖3 J-R 中比例尺代表 10 µm，位於各圖右下角。試驗進行三重複，每重複包含四個樣本。
圖4係顯示以離葉接種比較一般態與奈米態氧化鋅處理對炭疽病菌病斑擴展之影響。將 10 μl 一般態（B, E） 與奈米態（C, F）氧化鋅各 100 ppm 滴在草莓葉片穿刺點上，其後再分別於穿刺孔接種 10 μl 炭疽病菌株 D2(A-C) 與 E3(D-F) 之分生孢子懸浮液（10
6conidia/ml），並在接種後第 七日紀錄病斑擴展狀況，以水作為兩種氧化鋅處理之對照組（A, D）。右下角比例尺為 1 公分。試驗進行三重複，每重複包含四個葉片樣本，每個葉片有三個接種點。
圖5係顯示以離葉接種比較一般態與奈米態氧化鋅處理對炭疽病菌中等抗藥性菌株 D2 與敏感性菌株 E3 在草莓葉片上病斑面積之影響。將 10 μl 一般態與奈米態氧化鋅各 100 ppm 滴在草莓葉片穿刺點上，其後再分別於穿刺孔接種 10 μl 炭疽病菌株 D2 與 E3 之分生孢子懸浮液（10
6conidia/ml） 並以水作為對照組，並在接種後第七日紀錄病斑面積。試驗進行三重複，每重複包含四個葉片樣本，每個葉片有三個接種點，Error bar 代表標準誤差（SE），並以 Tukey HSD 檢驗統計上有顯著差異（p＜0.05）。
圖6係顯示組合施用奈米氧化鋅與三氟敏在草莓離葉接種對敏感性炭疽病菌 C6 菌株、抗藥性炭疽病菌 D2、CG8 及 CG68 菌株病斑發展之抑制效果。以噴霧方式各別單獨施用 1 ml 之 80 ppm 奈米氧化鋅（B, F, J, N）、145 ppm 三氟敏（C, G, K, O）及組合施用兩者混合液（D, H, L, P）在草莓葉片上，其後穿刺接種炭疽病菌 C6 菌株（A-D）、D2 菌株（E-H）、CG8 菌株（I-L）及 CG68 菌株（M-P），在接種後第 7 日紀錄病斑大小之影像，以水作為對照組（A, E, I, M）。右下角比例尺為 1 公分。試驗進行兩次（CG8）與一次（C6、D2 及 CG68），每重複包含四個葉片樣本，每個葉片有三個接種點。
圖7為在草莓離葉接種條件下，以奈米氧化鋅與三氟敏組合施用對敏感性炭疽病菌 C6 菌株、抗藥性炭疽病菌 D2、CG8 及 CG68 菌株造成之病斑面積及罹病率。以噴霧方式將單獨施用 1 ml 之 80 ppm 奈米氧化鋅、145 ppm 三氟敏及組合施用兩者之混合液各別施用在草莓葉片上，並以同體積的水作為對照組，其後穿刺接種炭疽病菌 C6(A, B)、D2(C, D)、CG8(E, F) 及 CG68(G, H) 菌株（10
6conidia/ml），在接種後第 3、5 及 7 日紀錄病斑大小（A, C, E, G）與罹病率（B, D, F, H）。試驗進行一次（C6、D2 及 CG68）與二次（CG8）重複，每重複包含四個葉片樣本，每個葉片有三個接種點。Error bar 代表標準誤差（SE），並以 Fisher’s LSD 檢驗統計，相同字母表示無顯著差異（p＞0.05）。
圖8係顯示組合施用奈米氧化鋅與三氟敏在草莓離葉接種條件下對敏感性炭疽病菌 C6 菌株、抗藥性炭疽病菌 D2、CG8 及 CG68 菌株引發病斑之抑制率。以噴霧方式將單獨施用 1 ml 之 80 ppm 奈米氧化鋅、145 ppm 三氟敏及組合施用兩者之混合液各別施用在草莓葉片上，其後穿刺接種炭疽病菌 C6(A)、D2(B)、CG8(C) 及 CG68(D) 菌株（10
6conidia/ml），在接種後第 3、5 及 7 日以三種處理與水對照組之病斑大小換算成抑制率。試驗進行一次（C6、D2 及 CG68）至兩次（CG8）重複，每重複包含四個葉片樣本，每個葉片有三個接種點。Error bar 代表標準誤差（SE），並以 Fisher’s LSD 檢驗統計，相同字母表示無顯著差異（p＞0.05）。
無
Claims (10)
- 一種用於防治已對一農藥產生抗藥性之植物病原菌的方法，包含將10-100ppm之氧化鋅與一田間建議施用濃度之農藥組合施用於已受抗藥性病原菌感染的植株，使該農藥產生對於該已對其產生抗藥性之病原菌的抑制能力；其中該農藥係選自史托比類(strobilurin)、苯并咪唑類(benzimidazoles)及三唑類(triazole)藥劑。。
- 如請求項1所述的方法，其中該氧化鋅為奈米氧化鋅(nano zinc oxide)。
- 如請求項1或2所述的方法，其中該氧化鋅之組合施用量為20-80ppm。
- 如請求項1所述的方法，其中該農藥為史托比類(strobilurin)藥劑。
- 如請求項4所述的方法，其中該農藥為三氟敏(trifloxystrobin)。
- 如請求項1所述的方法，其中該植物病原菌為炭疽病菌(C.gloeosporioides species complex)。
- 一種抑制抗藥性植物病原菌生長的組合物，包含10-100ppm之氧化鋅與一田間建議施用濃度之已產生抗藥性病原菌的農藥；其中該農藥為史托比類(strobilurin)藥劑。
- 如請求項7所述的組合物，其中該組合物包含20-80ppm之氧化鋅。
- 如請求項7所述的組合物，其中該氧化鋅為奈米氧化鋅。
- 如請求項7或8所述的組合物，其中該農藥為三氟敏(trifloxystrobin)。
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Citations (7)
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2022
- 2022-04-15 TW TW111114567A patent/TWI821996B/zh active
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 期刊 張碧芳et al 奈米材料抑制動物與植物病原菌生長的功效 永續農業 36 2015 p23-30 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202341868A (zh) | 2023-11-01 |
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