TWI821883B - 大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種大腸桿菌基因編輯系統，包含大腸桿菌、輔助質體和供體質體。其中輔助質體包含轉座酶複合物表現卡匣、Cas12k表現卡匣、第一sgRNA卡匣、第一抗生素抗性基因和第一複製起始點，供體質體包含ShCAST轉座子左端序列、外源基因表現卡匣、ShCAST轉座子右端序列、第二sgRNA卡匣、第二抗生素抗性基因和一第二複製起始點。所述大腸桿菌基因編輯系統可以簡便且有效的嵌入大片段的DNA序列至目標染色體中，且不會造成大腸桿菌基因體的雙股斷裂，以調節不同生物技術中有用的大腸桿菌菌株代謝途徑。
Description
本發明是有關於一種微生物的基因編輯技術，特別是一種大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法。
大腸桿菌是工業上用於生產重組蛋白和生質化學品的最廣泛使用的細菌。有許多不同的大腸桿菌菌株用於各種目的。例如，BL21(DE3)菌株常用於重組蛋白生產；MG1655、W3110和W菌株用於生產生質化學品；DH10Bac菌株含有結合桿狀病毒基因體和質體特徵的桿粒(Bacmid)，在Bac-to-Bac
TM系統中被用於桿粒的改造，基改桿粒可用來生產重組桿狀病毒，重組桿狀病毒常用於生產重組蛋白或是當作基因遞送的載體。
為了提高大腸桿菌的生產性能，通常需要嵌入多種代謝途徑基因至目標染色體，來永久操縱代謝途徑。然而將大片段基因嵌入到大腸桿菌中仍然是一項具有挑戰性的任務。儘管使用λ-Red系統的基因重組可以輕鬆地將基因嵌入到大腸桿菌中，但嵌入片段大小極有限。自從CRISPR/Cas9技術問世以來，CRISPR/Cas9與λ-Red結合以進一步提高嵌入DNA大小，成功嵌入大於10 kb的DNA片段到大腸桿菌基因體中。儘管CRISPR/Cas9結合λ-Red系統可在MG1655菌株中進行基因工程與代謝工程，但在其他重要大腸桿菌菌株如BL21(DE3)和W中的基因嵌入效率相對較低，可能是因為前述系統誘導DNA雙股斷裂(double-strand breaks, DSBs)，並利用內在的DNA修復機制，將欲嵌入的DNA嵌入到基因體中。然而不同菌株的DNA修復能力差異很大，因此導致其他大腸桿菌菌株的嵌入效率較低。
CRISPR相關轉座酶(ShCAST)是一種新興的靶向基因組敲入和敲除的強大工具，其無關於宿主細胞修復機制，結合了轉座酶的高效DNA嵌入和CRISPR介導的可編程無DNA雙股斷裂的基因嵌入，但ShCAST技術在染色體特定位置仍有嵌入不佳的問題。因此，如何改善上述應用於大腸桿菌的基因編輯系統的缺失，為目前所欲解決的重要課題之一。
有鑑於此，本發明提供一種大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法，所述大腸桿菌基因編輯系統透過增強
Cas12k基因表達、修改複製起始點的序列以及增加sgRNA表現量，只需表達四種蛋白，由兩個質體協作即可進行多位點基因嵌入，並嵌入大片段DNA至目標染色體中
。並可進一步降低基因編輯時的溫度，以提升基因編輯效率。
本發明之一態樣是在提供一種大腸桿菌(
Escherichia coli)基因編輯系統，其包含大腸桿菌、輔助質體和供體質體。輔助質體包含依序排列之轉座酶複合物表現卡匣、Cas12k表現卡匣、第一sgRNA卡匣、第一抗生素抗性基因和第一複製起始點。其中轉座酶複合物表現卡匣包含第一啟動子、
tnsB基因、
tnsC基因和
tniQ基因，Cas12k表現卡匣包含第二啟動子和
Cas12k基因，第一sgRNA卡匣包含第三啟動子和sgRNA序列。所述sgRNA序列由骨架和間隔(spacer)所構成。供體質體包含依序排列之ShCAST轉座子左端序列、外源基因表現卡匣、ShCAST轉座子右端序列、第二sgRNA卡匣、第二抗生素抗性基因和第二複製起始點。外源基因表現卡匣包含外源基因，第二sgRNA卡匣包含一第四啟動子和sgRNA序列。其中間隔之序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列相對應，且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。
依據前述之大腸桿菌基因編輯系統，其中所述第二啟動子可為lac啟動子、Tet啟動子、T7啟動子、Tac啟動子或J23118啟動子。
依據前述之大腸桿菌基因編輯系統，其中轉座酶複合物表現卡匣可更包含一終止子，且終止子連接於
tniQ基因之3’端。
依據前述之大腸桿菌基因編輯系統，其中外源基因表現卡匣可更包含第五啟動子和第三抗生素抗性基因，且所述第三抗生素抗性基因與第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。
依據前述之大腸桿菌基因編輯系統，其中供體質體可更包含CRISPRi模組，所述CRISPRi模組位於ShCAST轉座子左端序列和外源基因表現卡匣之間。
依據前述之大腸桿菌基因編輯系統，其中大腸桿菌可為BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。
本發明之另一態樣是在提供一種大腸桿菌(
Escherichia coli)基因編輯方法，包含下述步驟：先構築輔助質體和供體質體。其中輔助質體包含依序排列之轉座酶複合物表現卡匣、Cas12k表現卡匣、第一sgRNA卡匣、第一抗生素抗性基因和第一複製起始點，其中轉座酶複合物表現卡匣包含第一啟動子、
tnsB基因、
tnsC基因和
tniQ基因，Cas12k表現卡匣包含第二啟動子和
Cas12k基因，第一sgRNA卡匣包含第三啟動子和sgRNA序列。所述sgRNA序列由骨架和間隔(spacer)所構成。供體質體包含依序排列之ShCAST轉座子左端序列、外源基因表現卡匣、ShCAST轉座子右端序列、第二sgRNA卡匣、第二抗生素抗性基因和第二複製起始點，其中外源基因表現卡匣包含外源基因，第二sgRNA卡匣包含第四啟動子和sgRNA序列，且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。將輔助質體和供體質體共同轉型至大腸桿菌中，以得到轉型株。再培養所述轉型株，係於一編輯溫度下培養一編輯時間，其中輔助質體表現之一TnsB蛋白、一TnsC蛋白、一TniQ蛋白和一Cas12k蛋白形成一ShCAST轉座子蛋白酶複合物，且輔助質體表現sgRNA序列，供體質體表現sgRNA序列，將外源基因嵌入轉型株之第一特定序列中。
依據前述之大腸桿菌基因編輯方法，其中大腸桿菌可為BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。
依據前述之大腸桿菌基因編輯方法，其中所述編輯溫度可為30
oC。
依據前述之大腸桿菌基因編輯方法，其中供體質體可更包含一CRISPRi模組，CRISPRi模組位於ShCAST轉座子左端序列和外源基因表現卡匣之間。
依據前述之大腸桿菌基因編輯方法，可更包含一篩選步驟，係以含有抗生素之培養基培養轉型株，以篩選成功共同轉型輔助質體和供體質體的轉型株。
依據前述之大腸桿菌基因編輯方法，其中抗生素可為氨苄青黴素(ampicillin, Amp)、卡納黴素(kanamycin, Km)、壯觀黴素(spectinomycin, Spc)或氯黴素(chloramphenicol, Cm)。
[大腸桿菌基因編輯系統]
本發明之大腸桿菌(
Escherichia coli)基因編輯系統包含大腸桿菌、輔助質體100和供體質體300。其中的大腸桿菌可為BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。
請參照第1A圖，其繪示本發明輔助質體100之構築示意圖。輔助質體100包含依序排列之轉座酶複合物表現卡匣110、Cas12k表現卡匣120、第一sgRNA卡匣130、第一抗生素抗性基因140和第一複製起始點150。其中轉座酶複合物表現卡匣110包含第一啟動子111、
tnsB基因112、
tnsC基因113和
tniQ基因114，Cas12k表現卡匣120包含第二啟動子121和
Cas12k基因122，第一sgRNA卡匣130包含第三啟動子131和sgRNA序列132。所述sgRNA序列132由骨架133和間隔134所構成，其中間隔134之序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列相對應。進一步地說，轉座酶複合物表現卡匣110可更包含一終止子(圖未繪示)，且終止子連接於
tniQ基因114之3’端。第二啟動子121可為lac啟動子、Tet啟動子、T7啟動子、Tac啟動子或J23118啟動子。
請參照第1B圖，其繪示本發明之供體質體300之構築示意圖。供體質體300包含依序排列之ShCAST轉座子左端序列310、外源基因表現卡匣320、ShCAST轉座子右端序列330、第二sgRNA卡匣340、第二抗生素抗性基因350和第二複製起始點360。外源基因表現卡匣320包含外源基因321，第二sgRNA卡匣340包含一第四啟動子341和sgRNA序列342。所述sgRNA序列342由骨架343和間隔344所構成，其中sgRNA序列342與sgRNA序列132的序列相同，且間隔344之序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列相對應。第一抗生素抗性基因140和第二抗生素抗性基因350不相同。進一步地說，外源基因表現卡匣320可更包含第五啟動子(圖未繪示)和第三抗生素抗性基因(圖未繪示)，且所述第三抗生素抗性基因與第一抗生素抗性基因140和第二抗生素抗性基因350不相同。此外，供體質體300可更包含CRISPRi模組(圖未繪示)，所述CRISPRi模組位於ShCAST轉座子左端序列310和外源基因表現卡匣320之間。
[大腸桿菌基因編輯方法]
請參照第2圖，其繪示本發明之大腸桿菌基因編輯方法400之步驟流程圖。在第2圖中，大腸桿菌基因編輯方法400包含步驟410、步驟420、步驟430和步驟440。
步驟410為構築輔助質體，輔助質體包含依序排列之轉座酶複合物表現卡匣、Cas12k表現卡匣、第一sgRNA卡匣、第一抗生素抗性基因和第一複製起始點，其中轉座酶複合物表現卡匣包含第一啟動子、
tnsB基因、
tnsC基因和
tniQ基因，Cas12k表現卡匣包含第二啟動子和
Cas12k基因，第一sgRNA卡匣包含第三啟動子和sgRNA序列。所述sgRNA序列由骨架和間隔所構成。
步驟420為構築供體質體，供體質體包含依序排列之ShCAST轉座子左端序列、外源基因表現卡匣、ShCAST轉座子右端序列、第二sgRNA卡匣、第二抗生素抗性基因和第二複製起始點，其中外源基因表現卡匣包含外源基因，第二sgRNA卡匣包含第四啟動子和sgRNA序列，且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。
步驟430為將輔助質體和供體質體共同轉型至大腸桿菌中，以得到轉型株。進一步地，可更包含篩選步驟，係以含有抗生素之培養基培養轉型株，以篩選成功共同轉型輔助質體和供體質體的轉型株。所述抗生素為氨苄青黴素(ampicillin, Amp)、卡納黴素(kanamycin, Km)、壯觀黴素(spectinomycin, Spc)或氯黴素(chloramphenicol, Cm)。
步驟440為培養所述轉型株，係於一編輯溫度下培養一編輯時間，其中輔助質體表現之一TnsB蛋白、一TnsC蛋白、一TniQ蛋白和一Cas12k蛋白形成一ShCAST轉座子蛋白酶複合物，且輔助質體表現sgRNA序列，供體質體表現sgRNA序列，將外源基因嵌入轉型株之第一特定序列中。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
1.驗證ShCAST系統可於多種大腸桿菌菌株中嵌入DNA到指定位置
為了評估ShCAST系統是否在常見的大腸桿菌菌株中起作用，試驗上依據習知的ShCAST系統構建供體質體和5個輔助質體作為測試例。
請參照第3A圖，其繪示測試例之輔助質體和供體質體之構築示意圖，測試例之輔助質體(pH-sglacZ)依序包含由SEQ ID NO: 1所示序列之lac啟動子所驅動的SEQ ID NO: 2所示序列之
tnsB基因、SEQ ID NO: 3所示序列之
tnsC基因、SEQ ID NO: 4所示序列之
tniQ基因和SEQ ID NO: 5所示序列之
Cas12k基因，由SEQ ID NO: 6所示序列之J23119啟動子所驅動的sgRNA序列、SEQ ID NO: 12所示序列之氨苄青黴素抗性基因(ampicillin resistance, Amp
R)，以及SEQ ID NO: 13所示序列之ColE1複製起始點(ori)。sgRNA序列由骨架和間隔所構成，所建構的5個輔助質體之差異在於sgRNA序列之間隔不同，分別靶向
lacZ基因中5個不同的原型間隔區(PSP1到PSP4和對照組Φ)，其中靶向PSP1之間隔如SEQ ID NO: 7所示，靶向PSP2之間隔如SEQ ID NO: 8所示，靶向PSP3之間隔如SEQ ID NO: 9所示，靶向PSP4之間隔如SEQ ID NO: 10所示，對照組(Φ)的間隔如SEQ ID NO: 11所示。
而測試例之供體質體(pDonor)依序包含由SEQ ID NO: 14所示序列之ShCAST轉座子左端序列、SEQ ID NO: 15所示序列之卡納黴素抗性基因(kanamycin resistance, Km
R)、SEQ ID NO: 16所示序列之ShCAST轉座子右端序列以及SEQ ID NO: 17所示序列之R6K複製起始點(ori)。
試驗上以大腸桿菌BL21(DE3)菌株進行測試，因為BL21(DE3)菌株難以使用CRISPR/Cas9或λ-Red系統進行編輯。請參照第3B圖，其繪示以藍白篩選測試測試例嵌入效率流程示意圖，將構築好的pH-sglacZ和pDonor共同電穿孔至BL21(DE3)菌株，劃線至含有選擇抗生素、X-gal、IPTG的LB培養盤，37
oC培養過夜。由於使用R6K ori進行複製的pDonor 在BL21(DE3)菌株、MG1655菌株、W3110菌株和W菌株等不含
pir基因的細胞中複製，菌落僅會在DNA嵌入發生後形成。因此靶向嵌入(on- target integration)會產生白色菌落(因
lacZ基因被破壞)，而與其他基因座的脫靶嵌入(off-target integration)則會產生藍色菌落。
請參照第3C圖，為測試例靶向不同
lacZ基因位置的藍白篩選結果圖，結果顯示只轉型pDonor的組別沒有產生菌落形成，顯示沒有嵌入DNA。而共同轉型pDonor和pH-sglacZ的對照組(即間隔為靶向擾亂序列Φ)僅導致稀少的藍色菌落，顯示其為零星脫靶嵌入。而共同轉型pDonor和分別靶向PSP1、PSP2、PSP3、PSP4的pH-sglacZ則產生白色菌落和藍色菌落。
請再參照第3D圖，為測試例靶向不同
lacZ基因位置的效率結果圖。試驗上將靶向嵌入效率定義為白色菌落數除以總菌落數，第3D圖的結果顯示，位點的選擇對試驗例的靶向嵌入效率的起到了關鍵作用，其中靶向嵌入效率最差的位點為PSP4，靶向嵌入效率約為66.0%，而靶向嵌入效率最佳的位點為PSP3，靶向嵌入效率約為90.4%。
在BL21(DE3)菌株的成功編輯後，試驗上以類似的方式測試了其他在生物技術領域常用的大腸桿菌菌株
，對其
lacZ基因的PSP3位置進行靶向嵌入。請參照第3E圖，為不同大腸桿菌菌株中的測試例靶向效率結果圖，透過計算白色菌落比例證明試驗例靶向PSP3在BL21(DE3)菌株、MG1655菌株、W3110菌株中皆有高效靶向嵌入效率(約為91.8 ± 1.2%)，而在W菌株中也高達約為79.8%。
2.本發明之大腸桿菌基因編輯系統可提高靶向目標嵌入效率
雖然原版的ShCAST(即測試例)可以嵌入大腸桿菌染色體上所指定的位置，然而不同位置的編輯效率有所差異，在某些特定的位點(例如
lacZ基因的PSP4位點)的靶向嵌入效率相對較低。這使得使用原版的ShCAST靶向特定基因時，必須篩選出效率較佳的sgRNA，使用上較不便利。因此本發明之大腸桿菌基因編輯系統可透過增強
Cas12k基因表達優化ShCAST系統。
精準嵌入DNA需仰賴於Cas12k蛋白和sgRNA的協作來定位相鄰間隔原基序(Protospacer adjacent motif, PAM)序列和PSP。然而，原版的ShCAST 的
Cas12k基因位在lac啟動子驅動的操作子(operon)的最末端，這可能導致Cas12k蛋白表達量不足影響嵌入精準度。因此，本發明藉由構建一系列輔助質體(pH-promoter)來改進ShCAST系統。
請參照第4A圖和第4B圖，第4A圖為本發明之第一實施方式之輔助質體和測試例之輔助質體之構築示意圖，其中測試例之輔助質體(pHC)和第3A圖中相同，在此不再贅述；第4B圖繪示本發明之第一實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖，本發明之第一實施方式之供體質體與測試例之供體質體相同，在此不再贅述。而本發明之第一實施方式之輔助質體與測試例之輔助質體之差異在於，
Cas12k基因具有獨立啟動子以組成Cas12k表現卡匣，且在
tniQ基因後具有如SEQ ID NO: 35所示序列之終止子，試驗上分別使用不同獨立啟動子，分別為SEQ ID NO: 1所示序列之lac啟動子、SEQ ID NO: 18所示序列之Tet啟動子、SEQ ID NO: 19所示序列之T7啟動子、SEQ ID NO: 20所示序列之Tac啟動子和SEQ ID NO: 21所示序列之J23118啟動子構築本發明之第一實施方式之輔助質體，並分別命名為pH-lac、pH-Tet、pH-T7、pH-Tac、pH-J23118。第一實施方式之輔助質體和測試例之輔助質體的sgRNA序列之間隔皆相同，如SEQ ID NO: 10所示，其靶向
lacZ基因中最難嵌入的位置(PSP4)，而sgRNA序列之骨架如SEQ ID NO: 36所示。
請參照第4C圖，為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之
Cas12k基因表現量之分析結果圖。將前述構築好的輔助質體電穿孔到BL21(DE3)菌株中。在含氨芐青黴素(ampicillin, Amp)的培養液中篩選及培養搭配IPTG誘導後，抽取RNA進行分析，qRT-PCR 分析證實
Cas12k基因表達在測試例(pHC)中最弱，但
Cas12k基因表達可透過使用獨立啟動子表達得到改善，
Cas12k基因表達強度順序如下：T7 ＞ Tac ≥ J23118 ＞ Tet ＞ lac。
請再參照第4D圖，為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之靶向
lacZ基因嵌入效率。為了驗證提升
Cas12k基因表達對基因編輯效率的影響，將前述構築好的輔助質體(pH-lac、pH-Tet、pH-T7、pH-Tac、pH-J23118或pHC)與 pDonor共電穿孔至BL21(DE3)菌株中，再塗抹到含有Amp/Km/IPTG/X-gal的LB培養盤上。當使用T7啟動子、Tac啟動子和J23118啟動子獨立表現
Cas12k基因時，可將靶向嵌入效率提升至94.2%-97.6%，而測試例(pHC)中僅約66.0%。但當
Cas12k基因表達超過閾值時，靶向嵌入效率便無法繼續增加。而使用lac啟動子沒有辦法改善靶向嵌入效率，推測可能是由於
Cas12k基因表達不足。
為了證明本發明之大腸桿菌基因編輯系統的泛用性，試驗上構建分別以pH-T7和pHC作為輔助質體的基礎，並替換sgRNA序列，使其靶向BL21(DE3)菌株中的其他基因位置，以比較pH-T7與pHC在不同位點的基因編輯效率，其中靶向位置分別有PSP41位置、
adhE基因和
poxB基因，靶向PSP41位置之間隔如SEQ ID NO: 22所示，靶向
adhE基因之間隔如SEQ ID NO: 23所示，靶向
poxB基因之間隔如SEQ ID NO: 24所示。
請參照第4E圖，為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之靶向不同基因位點的嵌入效率，結果顯示，本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統與測試例相比，在PSP41位置的靶向嵌入效率可由34.1%提升至65.3%，在
adhE基因位置的靶向嵌入效率可由0%提升至68.7%，在
poxB基因位置的靶向嵌入效率可由79.3%提升至88.2%，再次證明增加
Cas12k基因表達可增強了靶向嵌入效率。
此外，試驗上另比較了編輯溫度對基因編輯的影響
，將pH-T7和pDonor共同電穿孔至BL21(DE3)菌株中，以靶向PSP41、
adhE基因和
poxB基因的位點，然後在30
oC或37
oC下過夜培養。請參照第4F圖和第4G圖，第4F圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯方法於不同編輯溫度下之靶向嵌入效率，第4G圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法脫靶嵌入之全基因組測序分析結果圖。結果顯示，在PSP41、
adhE基因和
poxB基因位點，30
oC培養條件下比37
oC可達到更高的靶向標嵌入效率，且效果顯著(
p＜ 0.05)，本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯方法在
poxB基因上的靶向標嵌入效率可達到100%，在
adhE基因上的靶向標嵌入效率達到90%。且值得注意的是，測試例(即原始ShCAST系統)無法於
adhE基因進行編輯。且由第4G圖的全基因組測序分析結果再次驗證，3個編輯試驗的菌落均沒有脫靶嵌入。
綜上所述，本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法藉由使用獨立的強啟動子(例如T7啟動子或Tac啟動子)增強
Cas12k基因表達，並可進一步將編輯溫度降低至30
oC來優化原始的ShCAST系統。是以本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法能夠高效、精確和多重嵌入到大腸桿菌基因組中以產生穩定的菌株，後續實驗進一步以本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法驗證其可應用之處。
3.本發明之大腸桿菌基因編輯系統可以高效的嵌入大於14.5 kb的DNA
對於生產生質產品，通常需要嵌入合成代謝途徑，然而，代謝途徑通常包含多個基因並且難以使用λ-Red系統或CRISPR/Cas9同時嵌入。特別是CRISPR/Cas9介導的嵌入在BL21(DE3)菌株中效率低下。
請參照第5A圖，繪示本發明之第二實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖。為了評估本發明之大腸桿菌基因編輯系統是否能夠在BL21(DE3)菌株中嵌入大片段DNA，試驗上構建了4個攜帶壯觀黴素抗性基因(spectinomycin resistance, Spc
R)和填充DNA(stuffer)的供體質體(pD-stuffer)，以測試本發明之大腸桿菌基因編輯系統可嵌入至目標基因的DNA片段大小，其中壯觀黴素抗性基因的序列如SEQ ID NO: 25所示，填充DNA的大小分別為2 kb、5 kb、7 kb和14.5 kb。試驗上所使用的輔助質體為靶向PSP3的pH-T7 (pH-T7-sglacZ)，將輔助質體和4個不同大小的供體質體(pD-Stuffer)共同電穿孔到BL21(DE3)菌株中。在30
oC下用Spc/Amp/IPTG/X-gal過夜培養，進行藍白篩選。
請參照第5B圖至第5D圖，第5B圖為經本發明之第二實施方式之大腸桿菌基因編輯系統處理後之菌落生長情形之照片圖，第5C圖為本發明之第二實施方式之大腸桿菌基因編輯系統嵌入不同長度DNA之成功編輯之菌落數之統計圖，第5D圖為本發明之第二實施方式之大腸桿菌基因編輯系統靶向嵌入不同長度DNA之成功編輯效率統計圖。
第5B圖的結果顯示，無論以包含填充DNA大小是2 kb、5 kb、7 kb或14.5 kb的供體質體進行基因編輯，所得到的菌落大部分為白色，顯示填充DNA正確嵌入目標
lacZ基因。而第5C圖的結果顯示，雖然隨著嵌入DNA片段大小變大，相應的菌落數(cfu)逐漸變少(從2 kb的菌落數為約1200 cfu至14.5 kb的菌落數為約100 cfu)。但由第5D圖的結果顯示，共同轉型4種供體質體的靶向嵌入效率都同樣高(＞ 96.6%)。
4.利用本發明之大腸桿菌基因編輯系統對BL21(DE3)菌株進行基因組和代謝工程以提高蛋白質產量
BL21(DE3)菌株通常用於蛋白質生產，但在大規模高密度的發酵過程中，細菌所產生的酸性副產物積累，通常會降低pH值和產品產量、品質(例如對酸性敏感的蛋白)。目前已知敲除生產酸性副產物的基因如乙酸鹽(
ackA、
pta、
YccX)、甲酸鹽(
pflB)或乳酸鹽(
ldhA、
dld、
ptsG)的基因可以提高生物衍生產品的產量。然而，刪除這些基因會導致細胞生長減慢。此外有鑑於
poxB基因缺失可以減少醋酸鹽產生，試驗上可利用本發明之大腸桿菌基因編輯系統建構低產酸BL21(DE3)菌株。
請參照第6A圖，其繪示本發明之第三實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖。試驗上利用本發明之大腸桿菌基因編輯系統建構低產酸BL21(DE3)菌株，使用pH-T7作為骨架構建了輔助質體pH-T7-sgpoxB，其將間隔替換靶向
poxB基因的間隔(如SEQ ID NO: 24所示)。同時建構供體質體(pD-dC-PLBA-EG)，pD-dC-PLBA-EG依序包含SEQ ID NO: 14所示序列之ShCAST轉座子左端序列、CRISPRi模組、SEQ ID NO: 19所示序列之T7啟動子、SEQ ID NO: 26所示序列之
EGFP基因、SEQ ID NO: 15所示序列之卡納黴素抗性基因、SEQ ID NO: 16所示序列之ShCAST轉座子右端序列以及SEQ ID NO: 27所示序列之R101/repA複製起始點，其中CRISPRi模組可同時抑制
ptsG基因、
ldhA基因、
pflB基因和
pta基因，其序列如SEQ ID NO: 28所示。試驗上另構建僅表達
EGFP基因和卡納黴素抗性基因的供體質體pT7-EG作為對照組
，其不包含CRISPRi模組。
請再參照第6B圖，其繪示本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統所建構之低產酸平台之示意圖。試驗上將輔助質體(pH-T7-sgpoxB)和供體質體 (pD-dC-PLBA-EG)共同電穿孔到BL21(DE3)菌株中，並建構了可表達EGFP和CRISPRi模組抑制
ptsG基因(P)、
ldhA基因(L)、
pflB基因(B)和
pta基因(A)的dC-PLBA-EG菌株，以及可表達EGFP但沒有 CRISPRi模組的對照組T7-EG菌株。以菌落PCR和qRT-PCR證實了本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統可將10.3 kb的CRISPRi模組/
EGFP基因/卡納黴素抗性基因的表現卡匣和3.7 kb的
EGFP基因/卡納黴素抗性基因的表現卡匣正確嵌入並同時破壞
poxB基因。
請再參照第6C圖至第6F圖，第6C圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之產酸相關基因表達量分析，第6D圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之產酸量分析，第6E圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之發酵液螢光圖，第6F圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之螢光值定量分析結果圖。
為了驗證CRISPRi模組的效果，試驗上將dC-PLBA-EG菌株和T7-EG菌株與200 ng/ml的四環素(Tetracycline, Tc)一起培養以誘導CRISPRi模組的表現。第6C圖的qRT-PCR分析結果證明dC-PLBA-EG菌株中產酸相關基因-
ptsG基因、
ldhA基因、
pflB基因和
pta基因的表達程度比對照組T7-EG菌株減少至少78%。相應地，dC-PLBA-EG菌株在培養48小時後培養液的pH值比T7-EG菌株的pH值下降更慢、細胞生長更快且有更高的生物質(biomass)。而第6D圖的HPLC分析結果圖進一步證實，與T7-EG菌株相比，dC-PLBA-EG菌株所產生的醋酸鹽減少了42%，所產生的乳酸鹽降低了57%，所產生的甲酸鹽降低了100%。此外，第6E圖和第6F圖的結果顯示，在IPTG誘導後，dC-PLBA-EG菌株產生的EGFP表現量比T7-EG菌株多了367%。上述數據皆顯示，本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法能夠將CRISPRi模組和
EGFP基因有效嵌入到BL21(DE3)菌株的基因體中，改造代謝途徑並增強重組蛋白的生產。
5.利用本發明之大腸桿菌基因編輯系統改良MG1655菌株的基因組工程以提高琥珀酸產量
MG1655是一種優良的大腸桿菌菌株，用於生產生質化學品，如琥珀酸。為了瞭解本發明之大腸桿菌基因編輯系統是否可以在MG1655中修改代謝途徑以提高琥珀酸產量。文獻指出過量表達乳酸乳球菌
pyc基因可增強琥珀酸生產而
adhE基因表達導致副產物（乙醇）生成，因此試驗上使用本發明之大腸桿菌基因編輯系統將
pyc基因嵌入基因組並同時破壞
adhE基因。
請參照第7A圖，其繪示本發明之第四實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖。輔助質體pH-Tac-sgadhE的sgRNA序列之間隔如SEQ ID NO: 23所示，其靶向
adhE基因，而骨架如SEQ ID NO: 36所示。供體質體pPyc則包含了以Tet啟動子(SEQ ID NO: 18所示)驅動的
pyc基因(SEQ ID NO: 29所示)和壯觀黴素抗性基因(如SEQ ID NO: 25所示)組成的6 kb表現匣。值得注意的是，由於T7啟動子僅在BL21(DE3)菌株中起作用，而在其他大腸桿菌菌株中不起作用，因此驅動
Cas12k基因表達的啟動子在pH-Tac-sgadhE中更改為SEQ ID NO: 20所示序列之Tac啟動子。
請再參照第7B圖，其繪示本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之編輯示意圖。將pH-Tac-sgadhE和pPyc共同電穿孔至MG1655菌株-dC-PLB中，其中dC-PLB含有CRISPRi系統可抑制
ptsG基因(P)、
ldhA基因(L)和
pflB基因(B)。篩選出成功基因編輯的菌落後，挑起菌落在42
oC且無抗生素培養基中培養，以去除pH-Tac-sgadhE和pPyc，所得菌株命名為dC-PLB-sh-Pyc。
請參照第7C圖至第7E圖，第7C圖為本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之嵌入之
pyc基因表達量之分析結果圖，第7D圖為本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之嵌入之
adhE基因表達量之分析結果圖，第7E圖為本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之琥珀酸產量之分析結果圖。
第7C圖至第7E圖的結果顯示，與野生型MG1655 (WT)和dC-PLB相比，以Tc誘導CRISPRi模組和
pyc基因表達後，dC-PLB-sh-Pyc有顯著更高的
pyc基因表達，並且幾乎檢測不到的
adhE基因表達。通過添加誘導劑Tc和厭氧培養，由於
ptsG基因、
ldhA基因和
pflB基因被CRISPRi模組抑制，dC-PLB產生的琥珀酸比WT菌株多21%。而由本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統改造的dC-PLB-sh-Pyc產生的琥珀酸分別比WT菌株和dC-PLB菌株多62%和41%。上述的數據顯示，本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法能夠輕鬆實現嵌入
pyc基因和敲除
adhE基因的目標，應用於MG1655菌株的基因組和代謝工程以生產琥珀酸。
6.本發明之大腸桿菌基因編輯系統可在DH10Bac菌株中編輯桿粒(Bacmid)並製成重組病毒
桿狀病毒是一種昆蟲病毒，可以高效地將轉殖基因送到目標哺乳動物細胞中，重組桿狀病毒製備通常從將轉殖基因選殖到商業化桿粒(Bac-to-Bac系統)上預先設計的多重選殖位(Multiple cloning site,MCS)開始，桿粒結合了質體和桿狀病毒基因組的特徵，並存在於大腸桿菌DH10Bac中。商用桿粒系統雖易於使用，卻不能決定嵌入基因位置，也不可更改桿粒骨架，目前很難使用CRISPR/Cas9編輯桿粒的骨架，推測是由於在細菌中，桿粒的拷貝數(copy number)不只一套，且CRISPR/Cas9引發DNA雙股斷裂後DNA修復機制不佳。為了解決這個問題並實現輕鬆編輯桿粒，試驗上利用本發明之大腸桿菌基因編輯系統來編輯DH10Bac細胞中的桿粒。
請參照第8A圖，其繪示本發明之第五實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖，試驗上選擇將外源基因嵌入桿狀病毒攜帶的桿狀病毒的非必須基因-V-cath基因。輔助質體(pH-Tac-sgVC-Cm)依序包含轉座酶複合物表現卡匣、Cas12k表現卡匣、第一sgRNA卡匣、第一抗生素抗性基因和第一複製起始點，其中轉座酶複合物表現卡匣包含lac啟動子、tnsB基因、tnsC基因和tniQ基因，Cas12k表現卡匣包含Tac啟動子和Cas12k基因，第一sgRNA卡匣包含J23119啟動子和sgRNA序列，其間隔如SEQ ID NO：30所示(靶向V-cath基因)，骨
架如SEQ ID NO：36所示。第一抗生素抗性基因為SEQ ID NO：31所示序列之氯黴素抗性基因(chloramphenicol resistance,CmR)，第一複製起始點為SEQ ID NO：32所示序列之p15A複製起始點(ori)。而供體質體pD-CM-sg-VC依序包含ShCAST轉座子左端序列(SEQ ID NO：14所示)、外源基因表現卡匣、ShCAST轉座子右端序列(SEQ ID NO：16所示)、第二sgRNA卡匣、第二抗生素抗性基因和一第二複製起始點。其中外源基因表現卡匣包含SEQ ID NO：33所示序列之CMV啟動子、SEQ ID NO：34所示序列之mCherry基因和壯觀黴素抗性基因(SpcR)，第二sgRNA卡匣包含J23119啟動子和sgRNA序列，其間隔如SEQ ID NO：30所示(靶向V-cath基因)，第二抗生素抗性基因為氨苄青黴素抗性基因，第二複製起始點為SEQ ID NO：13所示序列之ColE1複製起始點。
請參照第8B圖和第8C圖，第8B圖繪示本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統編輯桿狀病毒流程圖，第8C圖為以菌落PCR驗證本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統成功嵌入之分析結果圖。試驗上將輔助質體pH-Tac-sgVC-Cm和供體質體pD-CM-sg-VC通過熱休克進行共轉型到攜帶桿粒的DH10Bac菌株中。再使用三種抗生素Cm/Km/Spc篩選並重新劃線培養，再藉由菌落PCR確認mCherry/SpcR(總長3.6kb)是否順利整合到V-cath基因座中，提取並轉染編輯好的桿粒進入昆蟲細胞Sf9細胞株，生產重組桿狀病毒Bac-CM。第8C圖的菌落PCR結果顯示，
mCherry/Spc
R確實順利整合到
V-cath基因座中。
請再參照第8D圖和第8E圖，第8D圖為本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統所欲破壞之
V-cath基因表達量之分析結果圖，第8E圖為經本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統處理後之重組桿狀病毒轉導HEk293-FT之分析結果圖。
藉由比較野生型桿狀病毒(Bac-WT)和Bac-CM中
vp39基因(
vp39基因可產生桿狀病毒衣殼蛋白，是必須基因)和
V-cath基因的拷貝數。第8D圖的結果顯示，在Bac-CM與Bac-WT有相似的
vp39基因拷貝數(因此有相似的桿狀病毒顆粒數)，但是無法偵測出Bac-CM的
V-cath基因的拷貝數，顯示
V-cath基因已被完全破壞。最後以螢光顯微鏡觀察以Bac-WT和Bac-CM轉導的HEK293-FT細胞，第8E圖的結果顯示，大多數用Bac-CM轉導的細胞中有mCherry的表現，但在用Bac-WT轉導的細胞中則沒有。這些數據證實本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統能夠在大腸桿菌 DH10Bac中輕鬆進行桿粒編輯和進行重組桿狀病毒基因工程，製作出的重組桿狀病毒可用於將基因高效導入哺乳動物細胞中。
綜上所述，本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法可運用於許多在生物技術上較為重要卻難以使用CRISPR/Cas9系統編輯的各種大腸桿菌菌株，例如BL21(DE3)菌株、W3110菌株、W菌株。藉由使用強啟動子獨立表達
Cas12k基因以增加表達量、修改複製起始點的序列、增加sgRNA表現量以及將基因編輯溫度由37
oC降至30
oC等條件，可將各種大腸桿菌菌株的靶向嵌入效率顯著提高至＞90%。且本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法能夠將DNA嵌入到使用原始ShCAST難以嵌入的基因位點中，並且能夠以100%嵌入效率嵌入大至14.5 kb的DNA片段。此外，本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法具有高度應用性，可利用本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法將CRISPRi模組嵌入到BL21(DE3)菌株的基因體中以抑制酸性副產物積累，從而增加重組蛋白的產量。還可使用本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法將代謝途徑基因嵌入到MG1655菌株的基因體中，以提高琥珀酸產量。此外，本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法亦能編輯DH10Bac菌株中的桿粒，進而能夠輕鬆地設計桿狀病毒的骨架，建構重組桿狀病毒用於傳遞基因至哺乳動物細胞。是以本發明之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法在大腸桿菌中不會造成無DNA雙股斷裂，並具有重組病毒工程方面的巨大潛力。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
100:輔助質體
110:轉座酶複合物表現卡匣
111:第一啟動子
112:tnsB基因
113:tnsC基因
114:tniQ基因
120:Cas12k表現卡匣
121:第二啟動子
122:Cas12k基因
130:第一sgRNA卡匣
131:第三啟動子
132,342:sgRNA序列
133,343:骨架
134,344:間隔
140:第一抗生素抗性基因
150:第一複製起始點
300:供體質體
310:ShCAST轉座子左端序列
320:外源基因表現卡匣
321:外源基因
330:ShCAST轉座子右端序列
340:第二sgRNA卡匣
341:第四啟動子
350:第二抗生素抗性基因
360:第二複製起始點
400:大腸桿菌基因編輯方法
410,420,430,440:步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1A圖繪示本發明之輔助質體之構築示意圖；
第1B圖繪示本發明之供體質體之構築示意圖；
第2圖繪示本發明之大腸桿菌基因編輯方法之步驟流程圖；
第3A圖繪示測試例之輔助質體和供體質體之構築示意圖；
第3B圖繪示以藍白篩選測試測試例嵌入效率流程示意圖；
第3C圖為測試例靶向不同
lacZ基因位置的藍白篩選結果圖；
第3D圖為測試例靶向不同
lacZ基因位置的效率結果圖；
第3E圖為不同大腸桿菌菌株中的測試例靶向效率結果圖；
第4A圖繪示本發明之第一實施方式之輔助質體和測試例之輔助質體之構築示意圖；
第4B圖繪示本發明之第一實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖；
第4C圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之
Cas12k基因表現量之分析結果圖；
第4D圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之靶向
lacZ基因嵌入效率；
第4E圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之靶向不同基因位點的嵌入效率；
第4F圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯方法於不同編輯溫度下之靶向嵌入效率；
第4G圖為本發明之第一實施方式之大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法脫靶嵌入之全基因組測序分析結果圖；
第5A圖繪示本發明之第二實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖；
第5B圖為經本發明之第二實施方式之大腸桿菌基因編輯系統處理後之菌落生長情形之照片圖；
第5C圖為本發明之第二實施方式之大腸桿菌基因編輯系統嵌入不同長度DNA之成功編輯之菌落數之統計圖；
第5D圖為本發明之第二實施方式之大腸桿菌基因編輯系統靶向嵌入不同長度DNA之成功編輯效率統計圖；
第6A圖繪示本發明之第三實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖；
第6B圖繪示本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統所建構之低產酸平台之示意圖；
第6C圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之產酸相關基因表達量分析；
第6D圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之產酸量分析；
第6E圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之發酵液螢光圖；
第6F圖為本發明之第三實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之螢光值定量分析結果圖；
第7A圖繪示本發明之第四實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖；
第7B圖繪示本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之編輯示意圖；
第7C圖為本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之嵌入之
pyc基因表達量之分析結果圖；
第7D圖為本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之嵌入之
adhE基因表達量之分析結果圖；
第7E圖為本發明之第四實施方式之大腸桿菌基因編輯系統之琥珀酸產量之分析結果圖；
第8A圖繪示本發明之第五實施方式之輔助質體和供體質體之構築示意圖；
第8B圖繪示本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統編輯桿狀病毒流程圖；
第8C圖為以菌落PCR驗證本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統成功嵌入之分析結果圖；
第8D圖為本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統所欲破壞之
V-cath基因表達量之分析結果圖；以及
第8E圖為經本發明之第五實施方式之大腸桿菌基因編輯系統處理後之重組桿狀病毒轉導HEk293-FT之分析結果圖。
<110> 國立清華大學
<120> 大腸桿菌基因編輯系統及其基因編輯方法
<130> CP-5449-TW
<140> TW111103228
<141> 2022-01-26
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lac啟動子
<400> 1
<210> 2
<211> 1755
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tnsB基因
<400> 2
<210> 3
<211> 831
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tnsC基因
<400> 3
<210> 4
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tniQ基因
<400> 4
<210> 5
<211> 1920
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas12K基因
<400> 5
<210> 6
<211>
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> J23119啟動子
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：PSP1
<400> 7
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：PSP2
<400> 8
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：PSP3
<400> 9
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：PSP4
<400> 10
<210> 11
<211>
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：Φ
<400> 11
<210> 12
<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氨苄青黴素抗性基因
<400> 12
<210> 13
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ColE1複製起始點
<400> 13
<210> 14
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shCAST轉座子左端序列
<400> 14
<210> 15
<211> 795
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 卡納黴素抗性基因
<400> 15
<210> 16
<211> 212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shCAST轉座子右端序列
<400> 16
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R6K複製起始點
<400> 17
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tet啟動子
<400> 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7啟動子
<400> 19
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tac啟動子
<400> 20
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> J23118啟動子
<400> 21
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：PSP41
<400> 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：adhE基因
<400> 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：poxB基因
<400> 24
<210> 25
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 壯觀黴素抗性基因
<400> 25
<210> 26
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFP基因
<400> 26
<210> 27
<211> 1695
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R101/repA複製起始點
<400> 27
<210> 28
<211> 6833
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CRISPRi模組
<400> 28
<210> 29
<211> 3414
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pyc基因
<400> 29
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 間隔：：V-cath基因
<400> 30
<210> 31
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 氯黴素抗性基因
<400> 31
<210> 32
<211> 546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p15A複製起始點
<400> 32
<210> 33
<211> 584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV啟動子
<400> 33
<210> 34
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCherry基因
<400> 34
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 終止子
<400> 35
<210> 36
<211> 230
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 骨架
<400> 36
100:輔助質體
110:轉座酶複合物表現卡匣
111:第一啟動子
112:tnsB基因
113:tnsC基因
114:tniQ基因
120:Cas12k表現卡匣
121:第二啟動子
122:Cas12k基因
130:第一sgRNA卡匣
131:第三啟動子
132:sgRNA序列
133:骨架
134:間隔
140:第一抗生素抗性基因
150:第一複製起始點
Claims (8)
- 一種大腸桿菌(Escherichia coli)基因編輯系統，包含：一大腸桿菌，其中該大腸桿菌為BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株；一輔助質體，包含依序排列之一轉座酶複合物表現卡匣、一Cas12k表現卡匣、一第一sgRNA卡匣、一第一抗生素抗性基因和一第一複製起始點，其中轉座酶複合物表現卡匣包含一第一啟動子、一tnsB基因、一tnsC基因和一tniQ基因，該Cas12k表現卡匣包含一第二啟動子和一Cas12k基因，該第一sgRNA卡匣包含一第三啟動子和一sgRNA序列，該sgRNA序列由一骨架和一間隔(spacer)所構成，其中該第一啟動子為lac啟動子，該第二啟動子為Tet啟動子、T7啟動子、Tac啟動子或J23118啟動子，且當該第二啟動子為T7啟動子時，該大腸桿菌為BL21(DE3)菌株，該骨架之序列如SEQ ID NO：36所示，該間隔之序列與該大腸桿菌之一染色體之一第一特定序列相對應；以及一供體質體，包含依序排列之一ShCAST轉座子左端序列、一外源基因表現卡匣、一ShCAST轉座子右端序列、一第二sgRNA卡匣、一第二抗生素抗性基因和一第二複製起始點，其中該外源基因表現卡匣包含一外源基因，該第二sgRNA卡匣包含一第四啟動子和該sgRNA序列； 其中該第一抗生素抗性基因和該第二抗生素抗性基因不相同。
- 如請求項1所述之大腸桿菌基因編輯系統，其中該轉座酶複合物表現卡匣更包含一終止子，且該終止子連接於該tniQ基因之3’端。
- 如請求項1所述之大腸桿菌基因編輯系統，其中該外源基因表現卡匣更包含一第五啟動子和一第三抗生素抗性基因，且該第三抗生素抗性基因與該第一抗生素抗性基因和該第二抗生素抗性基因不相同。
- 如請求項3所述之大腸桿菌基因編輯系統，其中該供體質體更包含一CRISPRi模組，該CRISPRi模組位於該ShCAST轉座子左端序列和該外源基因表現卡匣之間。
- 一種大腸桿菌(Escherichia coli)基因編輯方法，包含：構築一輔助質體，其中該輔助質體包含依序排列之一轉座酶複合物表現卡匣、一Cas12k表現卡匣、一第一sgRNA卡匣、一第一抗生素抗性基因和一第一複製起始點，其中該轉座酶複合物表現卡匣包含一第一啟動子、一tnsB基因、一tnsC基因和一tniQ基因，該Cas12k表現卡 匣包含一第二啟動子和一Cas12k基因，該第一sgRNA卡匣包含一第三啟動子和一sgRNA序列，該sgRNA序列由一骨架和一間隔(spacer)所構成，其中該第一啟動子為lac啟動子，該第二啟動子為Tet啟動子、T7啟動子、Tac啟動子或J23118啟動子，該骨架之序列如SEQ ID NO：36所示；構築一供體質體，其中該供體質體包含依序排列之一ShCAST轉座子左端序列、一外源基因表現卡匣、一ShCAST轉座子右端序列、一第二sgRNA卡匣、一第二抗生素抗性基因和一第二複製起始點，其中該外源基因表現卡匣包含一外源基因，該第二sgRNA卡匣包含一第四啟動子和該sgRNA序列，且該第一抗生素抗性基因和該第二抗生素抗性基因不相同；將該輔助質體和該供體質體共同轉型至一大腸桿菌中，以得到一轉型株，其中該大腸桿菌為BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株，且當該第二啟動子為T7啟動子時，該大腸桿菌為BL21(DE3)菌株，該sgRNA序列之該間隔之序列與該大腸桿菌之一染色體之一第一特定序列相對應；以及培養該轉型株，係於一編輯溫度下培養一編輯時間，其中該編輯溫度為30℃，該輔助質體表現之一TnsB蛋白、一TnsC蛋白、一TniQ蛋白和一Cas12k蛋白形成一ShCAST轉座子蛋白酶複合物，且該輔助質體表現該 sgRNA序列，該供體質體表現該sgRNA序列，將該外源基因嵌入該轉型株之該第一特定序列中。
- 如請求項5所述之大腸桿菌基因編輯方法，其中該供體質體更包含一CRISPRi模組，該CRISPRi模組位於該ShCAST轉座子左端序列和該外源基因表現卡匣之間。
- 如請求項5所述之大腸桿菌基因編輯方法，更包含一篩選步驟，係以含有一抗生素之一培養基培養該轉型株，以篩選成功共同轉型該輔助質體和該供體質體的該轉型株。
- 如請求項7所述之大腸桿菌基因編輯方法，其中該抗生素為氨苄青黴素(ampicillin,Amp)、卡納黴素(kanamycin,Km)、壯觀黴素(spectinomycin,Spc)或氯黴素(chloramphenicol,Cm)。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Weizhong Chen et al., Targeted genetic screening in bacteria with a Cas12k-guided transposase. Cell Reports. 36(9):109635. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109635. 2021 Aug 31; pages 1-17. * |
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