TWI819926B

TWI819926B - 治療或預防黃疸的乳酸菌組合物

Info

Publication number: TWI819926B
Application number: TW111148730A
Authority: TW
Inventors: 何協勳; 郭易緯; 林家弘; 王惠姍; 黃彥宇; 林文揚; 夏可強
Original assignee: 豐華生物科技股份有限公司
Priority date: 2021-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-10-21
Also published as: TW202320824A

Abstract

本發明之抑制大腸桿菌及/或治療或預防黃疸的乳酸菌組合物，包含動物雙歧桿菌CP-9菌株或唾液乳酸桿菌AP-32菌株。此外，本發明更提出一種所提之乳酸菌組合物用於製備抑制大腸桿菌生長的組合物。另外，本發明再提出一種所提之乳酸菌組合物用於製備治療或預防黃疸的組合物。

Description

治療或預防黃疸的乳酸菌組合物

本申請案為中華民國發明專利申請號第110142663號之申請案的分割案。

本發明關於一種乳酸菌組合物，特別關於一種治療或預防黃疸的乳酸菌組合物。

膽紅素為血紅素的代謝產物。於血紅素代謝或膽紅素排出過程發生問題時，則可能誘發黃疸。依體內不同類型的膽紅素含量，可判斷黃疸的原因。未結合型膽紅素（間接型膽紅素）含量偏高多與血紅素的代謝異常有關，如：感染或藥物引起的溶血、血球過度製造、先天性遺傳疾病、或溶血性疾病；而結合型膽紅素（直接型膽紅素）含量偏高則多與膽紅素的排出異常有關，如：病毒感染引起的肝炎（包括：B型肝炎或C型肝炎）或膽道疾病（包括：膽道阻塞、結石、腫瘤、膽管炎、或原發性膽道性肝硬化）。

新生兒黃疸為好發於嬰幼兒的一種疾病。西方國家的新生兒黃疸發病率約60至70％，亞洲國家甚至更高。常見的新生兒黃疸有生理性黃疸與母乳性黃疸。生理性黃疸為嬰幼兒肝臟機能尚未發育完全，使得膽紅素的吸收、轉換與移除能力差，而於血液存留所致。生理性黃疸常出現於出生後2至7天，約1周左右達高峰，接著逐漸消退至正常。由此可知，生理性黃疸為肝臟尚未發育完全時，無法完全代謝未結合型膽紅素使其濃度過高，導致高濃度的未結合型膽紅素經由腸、肝循環回流至血液，而造成黃疸指數過高所致。生理性黃疸的治療主要採用照光治療法，其以藍光（波長425至457nm）將未結合型膽紅素轉變成無毒性異構物排出體外。母乳性黃疸通常發生於出生後4至14天內，為母乳特定成份（如：黃體脂醇或脂肪酸）干擾蛋白與膽紅素結合，以減少或延遲膽紅素的轉化所造成。其他的新生兒黃疸，如：病理性黃疸、阻塞性黃疸、或核黃疸，成因複雜，須由醫師進一步診斷後，始決定進行手術或其他治療。

目前有研究分析黃疸嬰幼兒與非黃疸嬰幼兒的腸道菌相，期透過改變腸道菌相的平衡來改善黃疸。中國大陸發明專利申請號CN106038609A利用次世代基因定序（NGS）比較黃疸嬰幼兒與非黃疸嬰幼兒的腸道菌株，發現前者的雙歧桿菌與擬桿菌明顯較後者少。中國大陸發明專利公告號CN101450083B提出服用酪酸梭菌活菌可減緩新生兒餵養不耐的情況，包含黃疸持續時間減少，但並未分析照光時數與黃疸指數的變化。目前利用益生菌的黃疸輔助治療並未明確達到降低黃疸指數或照光時數的效果。

因此，開發一種用於黃疸輔助治療的益生菌菌株，實際有效降低黃疸指數與照光時數，確實為本發明所屬技術領域所欲解決的課題之一。

咸認乳酸菌（lactic acid bacteria）為安全且廣泛使用的益生菌。常見的乳酸菌包括：乳酸桿菌屬（ Lactobacillus）、乳球菌屬（ Lactococcus）、小球菌屬（ Pediococcus）、腸球菌屬（ Enterococcus）、鏈球菌屬（ Streptococcus）、雙歧桿菌屬（ Bifidobacterium）、芽孢桿菌屬（ Bacillus）、及明串珠菌屬（ Leuconostoc）等。

本發明之目的在於開發一種乳酸菌組合物，其能抑制腸道中致病性大腸桿菌（ Escherichia coli）的活性以降低β-glucuronidase的產生。文獻J Hepatol. 2005 Feb;42(2):170-2記載大腸桿菌等致病性病原菌會於腸道產生大量的β-glucuronidase而影響體內的膽紅素代謝。若開發的乳酸菌組合物能抑制腸道中致病性大腸桿菌的活性以降低β-glucuronidase的產生，則其於臨床上可降低黃疸指數來治療或預防黃疸。

於是，本發明提出一種抑制大腸桿菌及/或治療或預防黃疸的乳酸菌組合物，包含動物雙歧桿菌（ Bifidobacterium animalis subsp. lactis）CP-9菌株（寄存編號：BCRC 910645）或唾液乳酸桿菌（ Lactobacillus salivarius subsp. salicinius）AP-32菌株（寄存編號：BCRC 910437）。

依本發明，動物雙歧桿菌CP-9菌株與唾液乳酸桿菌AP-32菌株可抑制大腸桿菌的生長，因此所提的乳酸菌組合物具有潛力來抑制大腸桿菌生長及/或治療或預防黃疸。

本發明更提出一種上述乳酸菌組合物用於製備抑制大腸桿菌生長的組合物。

本發明再提出一種上述乳酸菌組合物用於製備治療或預防黃疸的組合物。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：

本發明所用的菌株以冷凍乾燥培養物形式寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，地址為新竹市食品路331號、以及中國典型培養物保藏中心，地址為中國、武漢、武漢大學，詳細寄存資訊如表1所列。表1、菌株寄存資訊

菌株	分類	相關專利	寄存編號	寄存日期
CP-9	動物雙歧桿菌	中華民國發明專利公告號I572713	BCRC 910645	2014年8月21日
中國大陸發明專利公告號CN105985918B	CCTCC M2014588	2014年11月24日
AP-32	唾液乳酸桿菌	中華民國發明專利公告號I384990	BCRC 910437	2009年7月30日
中國大陸發明專利公告號CN102835666B	CCTCC M2011127	2011年4月10日

本發明發現動物雙歧桿菌CP-9菌株與唾液乳酸桿菌AP-32菌株能抑制腸道中產生β-glucuronidase之致病性大腸桿菌的活性，進而降低黃疸指數與照光時數。特別是，此些菌株的組合對抑制大腸桿菌的生長有協同效果，故其單獨或共同存在的組合物可用來抑制大腸桿菌及/或治療或預防黃疸。

本發明之一實施方式提出一種抑制大腸桿菌及/或治療或預防黃疸的乳酸菌組合物，含有動物雙歧桿菌CP-9菌株或唾液乳酸桿菌AP-32菌株。於一較佳例中，所提的乳酸菌組合物含有動物雙歧桿菌CP-9菌株以及唾液乳酸桿菌AP-32菌株。於一較佳例中，所提的乳酸菌組合物為食品組合物或醫藥組合物。於一較佳例中，所提的乳酸菌組合物尚包含生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。

於所提的乳酸菌組合物為食品組合物的條件下，生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可為食用上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，其實例為食品，但不以此為限。食品可為流體乳品（如：牛奶或濃縮牛奶）、發酵乳品（如：優酪乳）、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶、發酵豆奶、蔬果汁、果汁、運動飲料、果凍、餅乾、能量棒、健康食品、動物飼料、或膳食補充品，但不以此為限。

於所提的乳酸菌組合物為醫藥組合物的條件下，生理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可為藥理上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體，其實例為溶劑、緩衝劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、安定劑、螯合劑、膠凝劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑、或脂質體，但不以此為限。醫藥組合物可呈口服劑型或非經腸道投予的劑型，口服劑型的實例為粉劑、錠劑、片劑、口含錠、丸劑、膠囊、溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、酏劑、濃漿、或滴劑，但不以此為限；非經腸道投予之劑型的實例為液體劑型，但不以此為限，本文所用的「非經腸道投予」乙詞包括：皮下投予、肌肉內投予、脊椎內投予、靜脈內投予、或舌下投予，但不以此為限。

所提的動物雙歧桿菌CP-9菌株與唾液乳酸桿菌AP-32菌株可單獨地為活性菌株或去活性菌株。此外，於所提之乳酸菌組合物含有動物雙歧桿菌CP-9菌株以及唾液乳酸桿菌AP-32菌株的條件下，動物雙歧桿菌CP-9菌株與唾液乳酸桿菌AP-32菌株的菌數比為1：9至9：1，較佳地為1：1至9：1。

本發明之一實施方式更提出一種上述組合物的用途，為用於製備抑制大腸桿菌生長的組合物或用於製備治療或預防黃疸的組合物。

所製備的組合物可投予至有抑制大腸桿菌生長需求的個體來達到抑制大腸桿菌生長之目的。本文所用的「個體」乙詞包括：哺乳類動物，但不以此為限；哺乳類動物可為人、猴子、牛、綿羊、馬、豬、山羊、狗、貓、小鼠、或大鼠，但不以此為限。本文所用的「抑制大腸桿菌生長」乙詞意指降低、減緩、或終止大腸桿菌生長或傳播，或意指防範大腸桿菌生長或傳播。基於用於製備抑制大腸桿菌生長之組合物的用途，上述組合物更可用於製備治療或預防大腸桿菌感染所致之疾病的組合物，如：泌尿道感染或腸胃道感染。

所製備的組合物可投予至有治療或預防黃疸需求的個體來達到治療或預防黃疸之目的。此外，個體更可於投予前、時、及/或後接受照光治療。更進一步地說，所製備的組合物可投予至有治療或預防黃疸需求的個體來降低黃疸指數而達到治療或預防黃疸之目的。而且，所製備的組合物可投予至有治療或預防黃疸需求的個體來降低照光時數。本文所用的「個體」乙詞包括：哺乳類動物，但不以此為限；哺乳類動物可為人、猴子、牛、綿羊、馬、豬、山羊、狗、貓、小鼠、或大鼠，但不以此為限。本文所用的「黃疸」乙詞包括：成人肝臟或膽道相關疾病引起結合型膽紅素過高的黃疸，如：病毒感染引起之肝炎（B型肝炎或C型肝炎）所致的黃疸或膽道疾病（膽道阻塞、結石、腫瘤、膽管炎、或原發性膽道性肝硬化）所致的黃疸，但不以此為限。本文所用的「黃疸」乙詞或包括：嬰幼兒肝臟發育不全引發的黃疸或大腸桿菌感染泌尿道引發的黃疸，但不以此為限。

茲以下述實施例，例示說明本發明。

＜實施例1：製備菌粉＞

將菌株於37℃下培養於含0.05％半胱胺酸（cysteine）的MRS培養基24小時，以活化菌株。接著，取菌數10 ⁸CFU的活化菌株以2%體積濃度種植於5mL的含60mg/mL葡萄糖與0.05%半胱胺酸的MRS培養基中，並於37℃下培養20小時。之後，將形成的培養物以轉速3,000rpm離心10分鐘後，去除上層液，沉澱物則以適量的0.1M PBS洗滌。接著，使用適量的PBS分散菌株並調整成濃度10 ¹⁰CFU/mL的菌液，繼而冷凍乾燥以得到乾燥菌粉，供後續實驗用。

＜實施例2：大腸桿菌生長的分析＞

將乳酸菌菌株（總菌數濃度1x10 ⁹CFU/mL）以寬度2cm塗抹於固態培養基，而另一固態培養基則不塗抹益生菌作為控制組。培養2天後，注入14mL預共培病原菌的培養基並凝固後，將病原菌液大腸桿菌均勻塗抹於預共培病原菌的培養基上。於適當時間培養後，將菌盤取出並以尺量測抑菌圈直徑，以評估乳酸菌菌株的抑菌活性。

如圖1A所示，於總菌數相同下，CP-9菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑為5.3±0.2cm，L-53菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑為3.2±0.1cm。以上結果表示雖然同屬動物雙歧桿菌，但CP-9菌株對大腸桿菌的抑制活性明顯優於L-53菌株。

如圖1B所示，於總菌數相同下，AP-32菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑為3.9±0.2cm，L-28菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑為2.6±0.2cm。以上結果表示雖然同屬唾液乳酸桿菌，但AP-32菌株對大腸桿菌的抑制活性明顯優於L-28菌株。

綜合圖1A與1B的結果，說明相同菌種但不同的菌株對大腸桿菌的抑制活性仍有差異。

如圖1C所示，於總菌數相同下，CP-9菌株與AP-32菌株之菌數比1：9的大腸桿菌抑菌圈直徑為3.9±0.2cm；CP-9菌株與AP-32菌株之菌數比1：1的大腸桿菌抑菌圈直徑為6.7±0.2cm；CP-9菌株與AP-32菌株之菌數比9：1的大腸桿菌抑菌圈直徑為5.9±0.2cm。由於菌數比1：1的大腸桿菌抑菌圈直徑以及菌數比9：1的大腸桿菌抑菌圈直徑均大於僅CP-9菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑以及僅AP-32菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑，表示CP-9菌株與AP-32菌株之菌數比於1：1至9：1的條件下，此些菌株的組合對大腸桿菌的抑制活性有協同效應。

如圖1D所示，於總菌數相同下，CP-9菌株與AP-32菌株之菌數比1：1的大腸桿菌抑菌圈直徑為6.3±0.2cm；CP-9菌株與L-28菌株之菌數比1：1的大腸桿菌抑菌圈直徑為3.4±0.1cm。由於CP-9菌株與AP-32菌株之菌數比1：1的大腸桿菌抑菌圈直徑均大於僅CP-9菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑以及僅AP-32菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑，而CP-9菌株與L-28菌株之菌數比1：1的大腸桿菌抑菌圈直徑僅大於僅L-28菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑，但小於僅CP-9菌株的大腸桿菌抑菌圈直徑，表示雖然同屬唾液乳酸桿菌，但僅CP-9菌株與AP-32菌株的組合對大腸桿菌的抑制活性具協同效果。

＜實施例3：黃疸指數與照光時數的分析＞

自中國醫藥大學兒童醫院新生兒中重度病房收取137位嬰幼兒，其為足月嬰兒（≧37週）且出生後第4天的黃疸指數大於15mg/dL，但有以下之一疾病則予以排除：（1）甲狀腺功能減退、（2）唐氏症、（3）溶血ABO血型、（4）腸胃疾病、（5）G6PD缺乏症（蠶豆症）、（6）血管瘤、（7）頭顱血腫或出血、（8）嚴重週產期窒息、（9）胎兒染色體異常、（10）發紺型先天性心臟病、（11）臍膨出、（12）早發性敗血症、（13）肝衰竭。最後，以121位嬰幼兒作為測試者。

接著，將這121位測試者隨機分成三組，分別為「CP-9＋照光治療組」、「AP-32＋照光治療組」、與「安慰劑＋照光治療組」等。所有測試者均進行黃疸照光治療，波長為藍光425至457nm，照光時間依照孕婦懷孕週數、嬰兒週數與相關併發症病況調整，詳細條件請參照表2。表2、黃疸照光標準

條件出生時間	懷孕週數35週至37週又6天；懷孕週數≧38週但有其他併發症風險	懷孕週數≧38週
標準照光	加強照光	標準照光	加強照光
12小時	6	7.5	7.5	9
24小時	8	10	10	11.5
36小時	9.5	11.5	11.5	13.5
48小時	12	13	13	15
60小時	12.5	14.5	14.5	16.5
72小時	13.5	15.5	15.5	17.5
3.5天	14	16.5	16.5	19
4天	14.5	17	17	20
4.5天	15	18	18	20.5
≧5天	15	18	18	21

此外，「CP-9＋照光治療組」的測試者與「AP-32＋照光治療組」的測試者於照光治療期間的每日上午與下午餵食菌數5x10 ⁹CFU的菌株，「安慰劑＋照光治療組」的測試者則於照光治療期間的每日上午與下午餵食等量麥芽糊精；將對應粉末添加至母乳或配方奶供餵食。此外，自入院日到出院日期間採測試者血液樣本並分析血清膽紅素濃度。

首先，所有測試者入院日的血清膽紅素濃度無明顯差異，所有測試者出院日的血清膽紅素濃度亦無明顯差異。接著，分析所有測試者的黃疸下降速率，計算公式如下：。

如圖2所示，CP-9＋照光治療組的黃疸下降速率為0.16±0.02mg/dL/hr，AP-32＋照光治療組為0.155±0.017mg/dL/hr，兩者均高於安慰劑＋照光治療組的0.1±0.01mg/dL/hr，這表示CP-9菌株與AP-32菌株可有效下降黃疸指數。

如圖3所示，CP-9＋照光治療組的總照光時數為44.82±3.23hr，AP-32＋照光治療組為45.49±3.91hr，兩者均低於安慰劑＋照光治療組的57.80±4.02hr，這表示CP-9菌株與AP-32菌株可有效降低黃疸照光時數。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

無

圖1A為長條圖，說明不同動物雙歧桿菌菌株對大腸桿菌生長的影響；圖1B為長條圖，說明不同唾液乳酸桿菌菌株對大腸桿菌生長的影響；圖1C為長條圖，說明動物雙歧桿菌CP-9菌株與唾液乳酸桿菌AP-32菌株的不同混合比對大腸桿菌生長的影響；圖1D為長條圖，說明不同菌株組合物對大腸桿菌生長的影響；圖2為長條圖，說明不同乳酸菌菌株搭配照光治療對黃疸指數的影響；以及圖3為長條圖，說明不同乳酸菌菌株搭配照光治療對黃疸照光時數的影響。

1、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2014/08/21，BCRC 910645 2、TW中華民國，食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，2009/07/30，BCRC 910437

Claims

一種乳酸菌組合物用於製備治療或預防黃疸之組合物的用途，其中該乳酸菌組合物包含：唾液乳酸桿菌（ Lactobacillus salivariussubsp. salicinius）AP-32菌株（寄存編號：BCRC 910437）。
如請求項1所述之用途，其中該黃疸包括：成人肝臟或膽道相關疾病引起結合型膽紅素過高的黃疸、嬰幼兒肝臟發育不全引發的黃疸、或大腸桿菌感染泌尿道引發的黃疸。
如請求項2所述之用途，其中該成人肝臟或膽道相關疾病引起結合型膽紅素過高的黃疸包括：病毒感染引起之肝炎所致的黃疸或膽道疾病所致的黃疸。
如請求項3所述之用途，其中該病毒感染引起的肝炎包括：B型肝炎或C型肝炎，該膽道疾病包括：膽道阻塞、結石、腫瘤、膽管炎、或原發性膽道性肝硬化。
如請求項1所述之用途，其中投予該組合物至一治療或預防黃疸需求的個體前、時、及/或後，該個體接受照光治療。
一種乳酸菌組合物用於製備治療或預防黃疸之組合物的用途，其中該乳酸菌組合物包含：動物雙歧桿菌（ Bifidobacterium animalissubsp. lactis）CP-9菌株（寄存編號：BCRC 910645）以及唾液乳酸桿菌（ Lactobacillus salivariussubsp. salicinius）AP-32菌株（寄存編號：BCRC 910437），其中該動物雙歧桿菌CP-9菌株與該唾液乳酸桿菌AP-32菌株的菌數比為1：9。
如請求項6所述之用途，其中該黃疸包括：成人肝臟或膽道相關疾病引起結合型膽紅素過高的黃疸、嬰幼兒肝臟發育不全引發的黃疸、或大腸桿菌感染泌尿道引發的黃疸。
如請求項7所述之用途，其中該成人肝臟或膽道相關疾病引起結合型膽紅素過高的黃疸包括：病毒感染引起之肝炎所致的黃疸或膽道疾病所致的黃疸。
如請求項8所述之用途，其中該病毒感染引起的肝炎包括：B型肝炎或C型肝炎，該膽道疾病包括：膽道阻塞、結石、腫瘤、膽管炎、或原發性膽道性肝硬化。
如請求項6所述之用途，其中投予該組合物至一治療或預防黃疸需求的個體前、時、及/或後，該個體接受照光治療。