TWI818952B - Cd38蛋白抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本申請涉及一種抗體或其抗原結合片段,其以1×10-9M以下的K D 值與CD38蛋白相結合。所述的抗體或其抗原結合片段對於CD38蛋白的特異性識別結合能力強、可藉由抗體依賴的細胞介導的細胞毒性ADCC、補體依賴的細胞毒性CDC和/或細胞凋亡殺死CD38+細胞。本申請還提供了所述抗體或其抗原結合片段在預防和治療腫瘤中的應用。
Description
本申請涉及生物醫藥領域,具體涉及一種能與CD38蛋白結合的抗體。
CD38蛋白是可以催化NAD+轉化為環狀ADP核糖(cADPR,cyclic ADP-ribose)並將cADPR水解成ADP核糖的雙功能外切酶。CD38蛋白是惡性漿細胞上表達的抗原之一,在各種惡性血液病細胞中表達,包括但不限於多發性骨髓瘤細胞、B細胞慢性淋巴細胞白血病細胞、B細胞急性淋巴細胞性白血病細胞。
然而,目前已研發的CD38抗體識別活性有限,細胞毒性活性有限,且對腫瘤的抑制能力有限,因此亟待開發新的CD38抗體以用於新藥研發。
本申請提供了一種CD38抗體及其應用。本申請提供的CD38抗體具有下列性質中的一種或多種:1)能夠以較高的親和力和特異性結合CD38蛋白;2)能夠藉由抗體依賴的細胞介導的細胞毒性ADCC、補體依
賴的細胞毒性CDC和/或細胞凋亡殺死CD38+細胞;3)能夠殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長;4)能夠用於預防或治療腫瘤;5)能夠抑制CD38蛋白與CD38配體結合。本申請還提供該CD38抗體的製備方法和應用。
一方面,本申請提供了一種抗體或其抗原結合片段,其以1×10-9M或更低的K D 值與CD38蛋白相結合。
在某些實施方式中,本申請的抗體或其抗原結合片段能夠藉由與CD38蛋白特異性結合而殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長。
在某些實施方式中,本申請的抗體或其抗原結合片段能夠藉由抗體依賴的細胞介導的細胞毒性ADCC、補體依賴的細胞毒性CDC和/或細胞凋亡殺死CD38+細胞。
在某些實施方式中,本申請的抗體或其抗原結合片段不結合或基本上不結合BSA、CD19、TROP2、CD47、AXL或Gas6等不相關抗原。
在某些實施方式中,該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。在某些實施方式中,該CD38陽性的腫瘤選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
在某些實施方式中,該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在某些實施方式中,該腫瘤的細胞包括選自下組的細胞:Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞。
在某些實施方式中,當該抗體或其抗原結合片段與CD38蛋白結合時,其結合相應于人CD38蛋白第60位至第89位胺基酸殘基中的一個或多個殘基(其中,人CD38蛋白第60位至第89位的胺基酸序列如SEQ ID NO:15所示)。
在某些實施方式中,該抗體選自下組:單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
在某些實施方式中,該抗原結合片段選自下組:Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和ScFv。
在某些實施方式中,該CD38蛋白為人CD38蛋白或猴CD38蛋白。例如,所述CD38蛋白可以不為小鼠CD38蛋白,或者可以不為大鼠CD38蛋白。
在某些實施方式中,本申請的抗體或其抗原結合片段,其與對照抗體競爭結合所述CD38蛋白,其中該對照抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區,所述對照抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,該LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列;該LCDR2包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列;該LCDR3包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列,該對照抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,該HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列;該HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列;該HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該對照抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列,且該對照抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該對照抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。例如,該對照抗體輕鏈或其片段包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。
在某些實施方式中,該對照抗體的重鏈包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列。例如,該對照抗體重鏈或其片段包含下述任一項所示
的胺基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。
在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段包含抗體輕鏈或其片段。在某些實施方式中,該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1,且該LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。在某些實施方式中,該抗體輕鏈或其片段包含LCDR2,且該LCDR2包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。在某些實施方式中,該抗體輕鏈或其片段包含LCDR3,且該LCDR3包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL,且該輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該抗體輕鏈或其片段還包含人恆定區。在某些實施方式中,該人恆定區包括人Ig κ恆定區。
在某些實施方式中,該抗體輕鏈或其片段包含包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。例如,該抗體輕鏈或其片段包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。
在某些實施方式中,該抗體或其抗原結合片段包含抗體重鏈或其片段。在某些實施方式中,該抗體重鏈或其片段包含HCDR1,且該HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。在某些實施方式中,該抗體重鏈或其片段包含HCDR2,且該HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。在某些實施方式中,該抗體重鏈或其片段包含HCDR3,且該HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH,且該重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,該抗體重鏈或其片段還包含人恆定區。在某些實施方式中,人恆定區包括人IgG恆定區。在某些實施方式中,該IgG恆定區包含人IgG1恆定區。
在某些實施方式中,該抗體重鏈包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列。例如,該抗體重鏈或其片段包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。
另一方面,本申請提供了分離的核酸分子,其包含編碼本申請所述的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
在某些實施方式中,該核酸分子中的至少一種經密碼子優化。
在某些實施方式中,該核酸分子包含一個或多個選自下組的多核苷酸序列:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
另一方面,本申請提供了載體,其包含本申請所述的核酸分子。
另一方面,本申請提供了細胞,其包含本申請所述的核酸分子或本申請所述的載體。
另一方面,本申請提供了製備該抗體或其抗原結合片段的方法。該方法包括在使得該抗體或其抗原結合片段表達的條件下,培養本申請所述的細胞。
另一方面,本申請提供了藥物組合物,其包含本申請所述的抗體或其抗原結合片段、所述的核酸分子、所述的載體和/或所述的細胞,以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
另一方面,本申請提供了該抗體或其抗原結合片段在製備預防或治療腫瘤的藥物中的用途。
在某些實施方式中,該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。在某些實施方式中,該CD38陽性的腫瘤選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。在某些實施方式中,該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
另一方面,本申請提供的該抗體或其抗原結合片段可用於預防或治療腫瘤。
在某些實施方式中,該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。在某些實施方式中,該CD38陽性的腫瘤選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。在某些實施方式中,該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
另一方面,本申請提供了預防或治療腫瘤的方法,該方法包括向有需要的受試者施用本申請所述的抗體或其抗原結合片段、所述的分子核酸、所述的載體、所述的細胞和/或所述的藥物組合物。
在某些實施方式中,該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。在某些實施方式中,該CD38陽性的腫瘤選自下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。在某些實施方式中,該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
另一方面,本申請提供了抑制CD38蛋白與CD38配體結合的方法,該方法包括施用本申請所述的抗體或其抗原結合片段、所述的核酸分子、所述的載體和/或所述的細胞。
在某些實施方式中,該CD38配體包括CD31。
本領域技術人员能够从下文的詳細描述中容易地洞察到本公開的其它方面和優势。下文的詳細描述中仅顯示和描述了本公開的示例性實施方式。如本領域技術人员將认识到的,本公開的內容使得本領域技術人员能够对所公開的具體實施方式进行改動而不脫离本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地,本申請的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的,而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能够更好地理解本申請所涉及發明的特點和優势。對圖式簡要说明書如下:第1圖顯示的是將本申請所述抗體SG003構建全抗體表達載體的物理圖譜。
第2圖顯示的是本申請所述抗體SG003與CD38蛋白的結合能力。
第3圖顯示的是本申請所述抗體SG003特異性識別CD38蛋白的結果。
第4A圖至第4D圖顯示的是本申請所述抗體SG003與代表性細胞表面的CD38蛋白結合的能力。
第5A圖至第5D圖顯示的是本申請所述抗體SG003對代表性細胞的ADCC活性。
第6圖顯示的是本申請所述抗體SG003對腫瘤生長的抑制效果。
第7圖顯示的是施用本申請所述抗體SG003對小鼠生存率的影響。
第8A圖至第8B圖顯示的是施用本申請所述抗體SG003與不同屬來源的CD38分子結合能力。
第9圖顯示的是施用本申請所述抗體SG003進行隨機突變後與CD38分子的結合能力。
第10圖顯示的是表示本申請所述抗體SG003結合CD38蛋白表位的情況。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式,熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地了解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中,術語“抗體”通常是指一種能够特異性識别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如,抗體可包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈組成的免疫球蛋白,並且包括任何包含其抗原結合部分的分子。術语“抗體”包括單株抗體、抗體片段或抗體衍生物,包括但不限於人抗體(全人源抗體)、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(例如,scFv),以及與抗原結合的抗體片段(例如,Fab、Fab’和(Fab)2片段)。術語“抗體”還包括抗體的所有重組體形式,例如在原核細胞中表達的抗體、未糖基化的抗體以及本文該的任何與抗原結合的抗體片段及其衍生物。每條重鏈可由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區構成。每條輕鏈可由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區構成。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高變區,它們散布在稱為構架區(FR)
的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成,它們从胺基端至羧基端可按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可介導該免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合,該宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞(例如,效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。
在本申請中,術語“抗體結合片段”通常是指抗體中發揮特異性結合抗原功能的一個或多個片段。抗體的抗原結合功能可藉由抗體的全長片段来實现。抗體的抗原結合功能也可藉由以下来實現:包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重鏈,或者,包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的輕鏈。(1)Fab片段,即由VL、VH、CL和CH結構域組成的一價片段;(2)F(ab’)2片段,包含藉由铰鏈區處的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段;(3)由VH和CH結構域組成的Fd片段;(4)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段;(5)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546);(6)分離的互補決定區(CDR)和(7)可視需要地藉由接头連接的兩個或以上分離的CDR的組合。此外,還可包括由VL和VH配對形成的一價單鏈分子Fv(scFv)(参見Bird等(1988)Science 242:423-426;以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。該“抗原結合部分”還可包括免疫球蛋白融合蛋白,該融合蛋白包含選自以下的結合結構域:(1)與免疫球蛋白铰鏈區多肽融合的結合結構域多肽;(2)與铰鏈區融合的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區;和(3)與CH2恆定區融合的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區。
在本申請中,術語“CD38蛋白”和“CD38抗原”在本文中可互換使用,並且包括CD38的任何變體,同種型和物種同系物,其由細胞天然表達或在用CD38基因轉染的細胞上表達。在本申請中,CD38可以為人CD38,其在GenBank中的登錄號為BAA18966.1。在本申請中,CD38可以為猴CD38,例如獼猴CD38,其在GenBank中的登錄號為AAT36330.1。本申請所述的CD38蛋白也可被稱為ADP核糖基環化酶1,cADPr水解酶1,Cd38-rs1,環狀ADP-核糖水解酶1,I-19或NIM-R5抗原。“CD38+細胞”通常可以指表達CD38蛋白的細胞。也可稱之為CD38陽性細胞。“CD38-細胞”通常可以指基本上不表達CD38蛋白的細胞。
在本申請中,術語“CD31蛋白”通常是指在血小板表面,培養的內皮細胞間連接處和骨髓細胞系中發現的130-140kDa大小的跨膜糖蛋白,又稱血小板-內皮細胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)。在本申請中,該CD31可以為人CD31,其在GenBank中的登錄號為NP_000433.4。CD31可作為CD38的配體,在血栓形成和血管生成中發揮作用。
在本申請中,術語“ADCC”是抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),通常是指是指具有殺傷活性的細胞藉由其表面表達的Fc受體(FcR)識別包被於靶抗原上的Fc段。借助該ADCC,免疫系統的效應細胞主動溶解其膜表面抗原已被特異性抗體結合的靶細胞。
在本申請中,術語“CDC”是補體依賴型細胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC),通常是指補體參與的細胞毒作用。即藉由特異性抗體與細胞膜表面相應抗原結合,形成複合物而激活補體經典途徑,所形成的攻膜複合物對靶細胞發揮裂解效應。
在本申請中,術語“癌症”通常是指或描述哺乳動物的生理狀況,其典型特徵在於細胞增殖或存活失調。癌症的例子包括但不限於癌,淋巴瘤,母細胞瘤,肉瘤和白血病以及淋巴惡性腫瘤。例如,可以為淋巴瘤。
在本申請中,術語“淋巴瘤”通常是指一種淋巴系統的惡性腫瘤。淋巴瘤的發生是由於淋巴結細胞或淋巴細胞開始無法控制地繁殖,並產生具有異常能力,可以侵入整個身體其他組織的癌細胞。淋巴瘤有多種亞型,其中兩種主要的類型為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在本申請中,術語“霍奇金淋巴瘤”(Hodgkin's lymphoma,HL)通常是指一種由淋巴細胞類白細胞產生的一種淋巴瘤。在本申請中,術語“非霍奇金淋巴瘤”(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)通常是指除了霍奇金淋巴瘤外其他類型的淋巴瘤。
在本申請中,術語“白血病”通常是指一種造血系統惡性增殖性疾病,通常指因白血病細胞大量增殖、累積所引起的一類疾病。克隆性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積,並浸潤其他非造血組織和器官,同時抑制正常造血功能。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發熱以及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛。
在本申請中,術語“多發性骨髓瘤”(Multiple myeloma,MM)通常是指一種漿細胞不正常增生致使侵犯骨髓的一種惡性腫瘤。多發性骨髓瘤導致癌細胞在骨髓中聚集,使得健康的血細胞被排除。癌細胞產生可導致併發症的異常蛋白質而不是正常的抗體。
在本申請中,術語“Raji細胞”通常是指能產生Epstein-Barr病毒株的連續的人類細胞系。病毒將轉化臍帶淋巴細胞並且在
Raji細胞中誘導早期抗原。Raji細胞被廣泛用作轉染宿主,也被用於瞭解造血細胞和其他細胞惡性腫瘤。此外,因為其具有和表達某些補體成分的幾種受體以及免疫球蛋白G的Fc受體,因而還被用於檢測免疫複合物。
在本申請中,術語“Daudi細胞”通常是指來源於Burkitt淋巴瘤的細胞系。儘管Daudi細胞存在胞內I類重鏈,但其表面無I類人類白血球抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子表達,這是因為其編碼β 2-微球蛋白(β 2m)的基因存在缺陷,導致該蛋白質缺乏可翻譯的mRNA。
在本申請中,術語“Ramos細胞”通常是指一種Burkitt淋巴瘤的細胞系。該細胞不帶有Epstein-Barr病毒株,會分泌IgM。
在本申請中,術語“RPMI8226細胞”通常是指一種人多發性骨髓瘤的細胞系。
在本申請中,術語“K D ”可與“KD”互换使用,通常是指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數,單位為M(mol/L)。KD可藉由物質AB和其解離得到的物質A和物質B的濃度來計算:KD=c(A)*c(B)/c(AB)。由該公式可知,KD值越大,說明解離越多,代表物質A、B之間的親和力越弱;反之,KD值越小,說明解離越少,代表物質A、B之間的親和力越強。
在本申請中,術語“單株抗體”通常是指一群基本同源的抗體的抗體,即包含該群的各個抗體除了可能的以微量存在的天然發生的突變之外是相同的。單株抗體是高度特異性的,直接針對單個抗原性位點。例如,該單株抗體可以藉由融合瘤技術製備或者藉由使用重組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中產生單株抗體也可以得自噬菌體抗體文庫,
使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.,222:581-597(1991)該的技術進行。
在本申請中,術語“單鏈抗體”(scFv)通常是指通常是指是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區藉由短肽連接子(linker)連接而成的分子。
在本申請中,術語“嵌合抗體”通常是指這樣的抗體,其中每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源,或者屬於特定的類別,而該鏈的其餘區段則與另一物種中的相應序列同源。例如,輕鏈和重鏈的可變區均來自一個動物物種(如小鼠、大鼠等)的抗體的可變區,而恆定部分則與來自另一物種(如人)的抗體序列同源。例如,為獲得嵌合抗體,可利用非人源的B細胞或融合瘤細胞產生可變區,而與其組合的恆定區則來自人。該可變區具有易於製備的優點,並且其特異性不受與其組合的恆定區的來源的影響。同時,由於嵌合抗體的恆定區可來源於人類,因此嵌合在注射時抗體引發免疫應答的可能性會低於使用恆定區為非人來源的抗體。
在本申請中,術語“人源化抗體”通常是指一種嵌合抗體,其含有較少的來自非人免疫球蛋白的序列,從而降低異種抗體引入到人類中時的免疫原性,同時保持抗體的完全抗原結合親和力和特異性。例如,可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其變體;包括“重塑”(reshaping),(Verhoeyen,et al.,1988 Science 239:1534-1536;Riechmann,et al.,1988 Nature 332:323-337;Tempest,et al.,Bio/Technol 1991 9:266-271),“高度加成”(hyperchimerization),(Queen,et al.,1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033;Co,et al.,1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873;Co,et al.,1992 J Immunol 148:1149-1154)和
“貼面”(veneering),(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美國專利US5639641)等技術手段,對非人源的結合域進行人源化。如果其他區域,例如鉸鏈區和恆定區結構域也源自非人來源,則這些區域也可以被人源化。
在本申請中,術語“表位”通常是指抗原決定簇,即指分子中被免疫系統識別(例如被抗體識別)的部分。例如,表位可以是被免疫系統識別的抗原上不連續的三維位點。表位通常由分子的化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成,並通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。表位根據結構,可分為構象表位和非構象表位(線性表位)。表位可以由連續的殘基構成,或者由被抗原聚合物的折疊造成領近的不連續殘基形成。
在本申請中,術語“IgG”通常是指免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)。IgG是人的免疫球蛋白之一,其他還有lgA、lgM、IgD和lgE。根據IgG分子中的γ鏈抗原性差異,人IgG有四個亞型:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG在免疫中發揮重要的作用。在本申請中,術語“IgG1”通常是指IgG中占比最高的一類亞型,與Fc受體有較高親和性。
在本申請中,術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本申請中,術語“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子。該載體可將插入的核酸分子轉移到細胞中和/或細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於
複製DNA或RNA的載體,以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體可以是當引入合適的細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常,藉由培養包含該載體的合適的細胞,該載體可以產生期望的表達產物。
在本申請中,術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體,或者能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段的個體細胞,細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個細胞的子代。由於天然的,意外的或故意的突變,子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同,但能夠表達本申請所述的抗體或其抗原結合片段即可。該細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌),也可以是真核細胞(例如酵母細胞,例如COS細胞,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,HeLa細胞,HEK293細胞,COS-1細胞,NS0細胞或骨髓瘤細胞)。在一些實施方案中,該細胞是哺乳動物細胞。例如,該哺乳動物細胞可以是CHO-K1細胞。在本申請中,術語“重組細胞”通常指在其中引入了重組表達載體的細胞。該重組細胞不僅包括某種特定的細胞,還包括這些細胞的後代。
在本申請中,術語“蛋白A”和“ProA”在本文中可互換使用,並且包括從其天然來源回收的蛋白A,合成產生的蛋白A(例如藉由肽合成或藉由重組技術),以及保留蛋白質結合能力的變體。該蛋白質A可以從Repligen,Pharmacia和Fermatech購買。蛋白質A通常固定在固相載體材料上。術語“ProA”還指親和層析樹脂或含有與其共價連接的蛋白A的色譜固體支持基質的柱。
在本申請中,術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動,例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、
2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
在本申請中,術語“包括”通常是指包含、總括、含有或包涵的含義。在某些情況下,也表示“為”、“由……組成”的含義。
抗體、其抗體結合片段或變體
在一個方面,本申請提供了一種抗體或其抗原結合片段或變體,其以1×10-9M以下(例如,該K D 的值不高於約1×10-9M、不高於約9×10-10M、不高於約8×10-10M、不高於約7×10-10M、不高於約6×10-10M、不高於約5×10-10M、不高於約4×10-10M、不高於約3×10-10M、不高於約2×10-10M、不高於1×10-10M或不高於約1x10-11M或以下)的K D 值與CD38蛋白相結合。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段,可藉由抗體依賴的細胞介導的細胞毒性ADCC、補體依賴的細胞毒性CDC和/或細胞凋亡殺死CD38+細胞。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段或變體,可藉由與CD38蛋白特異性結合而殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長。例如,該腫瘤可以包括CD38陽性的腫瘤。如,該CD38陽性的腫瘤可以選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。又例如,該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。該腫瘤的細胞可以選自下組:Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞。在本申請中,該抗體或其抗原結合片段可以殺傷多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金
淋巴瘤細胞或抑制多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤生長。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段,當與CD38蛋白結合時,其可以結合相應於人CD38蛋白第60位至第89位的胺基酸殘基中的一個或多個殘基。例如,人CD38蛋白第60位至第89位的胺基酸殘基可以如SEQ ID NO:15所示。
在本申請中,該抗體或其抗原結合片段還可能結合相應於人CD38蛋白第90位至第119位的胺基酸殘基,相應於人CD38蛋白第150位至第159位的胺基酸殘基,或者,相應於人CD38蛋白第180位至第189位的胺基酸殘基。
在本申請中,該抗體或其抗原結合片段可基本上不結合相應於人CD38蛋白第170位至第179位的胺基酸殘基,或者,不可結合相應於人CD38蛋白第291位至第300位的胺基酸殘基。
本申請所述的抗體可以為單克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和/或全人源抗體。本申請所述抗體的抗原結合片段可以為Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和/或ScFv片段。
本申請所述的CD38蛋白可為人CD38蛋白或猴CD38蛋白。例如,該CD38蛋白可以不為小鼠CD38蛋白,或者可以不為大鼠CD38蛋白。在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段基本上不結合小鼠CD38蛋白或大鼠CD38蛋白。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段,可以與對照抗體競爭結合該CD38蛋白。該對照抗體可以包含輕鏈可變區和重鏈可變區。例如,該對照抗體的輕鏈可變區可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,該LCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列;該LCDR2可包含SEQ ID NO:2
所示的胺基酸序列;該LCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列,該参比抗體的重鏈可變區可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,該HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列;該HCDR2可包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列;該HCDR3可包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
在本申請中,該對照抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列可以包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列,且該對照抗體的重鏈可變區的胺基酸序列可以包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
在本申請中,該對照抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列;例如,該對照抗體的輕鏈可包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。該對照抗體的重鏈可包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列;例如,該對照抗體的重鏈可包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。
例如,該對照抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列,且該對照抗體的重鏈可包含SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列。例如,該對照抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列,且該對照抗體的重鏈可包含SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列。例如,該對照抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列,且該對照抗體的重鏈可包含SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列。例如,該對照抗體的輕鏈可包含SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列,且該對照抗體的重鏈可包含SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含抗體輕鏈或其片段。
例如,該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR1,且該LCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR2,且該LCDR2可包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR3,且該LCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列。
本申請所述抗體的輕鏈或其片段可包含輕鏈可變區VL,且該輕鏈可變區VL可包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列。
在本申請中,該抗體輕鏈或其片段可包括Ig κ恆定區,例如可包含人Ig κ恆定區。
在本申請中,該抗體輕鏈或其片段可包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列:
(SEQ ID NO:22)。其中,X20=T或S;X27=S或N;X31=S或T;X34=F或Y;X57=N和D;X58=L或I;X59=E或Q;X97=E或Q;X98=L或V;X100=F或S;X101=T或S。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:11所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在選自以下任一組的胺基酸取代:(a)在X20、X27、X34、X58、X59、X97和/或X100處的胺基酸取代;(b)在X34、X57、X59、X100和/或X101處的胺基酸取代;和(c)在X27、X31和/或X98處的胺基酸取代。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:11所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在X20、X27、X34、X58、X59、X97和/或X100處的胺基酸取代,其中,X20處的胺基酸可被取代為T或S;X27處的胺基酸可被取代為S或N;X34處的胺基酸可被取代為F或Y;X58處的胺基酸可被取代為L或I;X59處的胺基酸可被取代為E或Q;X97處的胺基酸可被取代為E或Q;X100處的胺基酸可被取代為F或S。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:11所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在X34、X57、X59、X100和/或X101處的胺基酸取代,其中,X34處的胺基酸可被取代為F或Y;X57處的胺基酸可被取代為N或D;X59處的胺基酸可被取代為E或Q;X100處的胺基酸可被取代為F或S;X101處的胺基酸可被取代為T或S。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:11所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在X27、X31和/或X98處的胺基酸取代,其中,X27處的胺基酸可被取代為S或N;X31處的胺基酸可被取代為S或T;X98處的胺基酸可被取代為L或V。
例如,該抗體輕鏈或其片段可包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含抗體重鏈或其片段。
在本申請中,該抗體重鏈或其片段可包含HCDR1,且該HCDR1可包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。該抗體重鏈或其片段可包含HCDR2,且該HCDR2可包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。又例
如,該抗體重鏈或其片段可包含HCDR3,且該HCDR3可包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
該抗體重鏈或其片段可包含重鏈可變區VH,且該重鏈可變區VH可包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
在本申請中,該抗體重鏈或其片段還包含人恆定區。例如,該人恆定區可包括人IgG恆定區。例如,該IgG恆定區可包含人IgG1恆定區。
在本申請中,該抗體重鏈或其片段可包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列:
(SEQ ID NO:23)。其中,X27=F或Y;X28=D或N;X33=W或Y;X52=N、Q或S;X54=D、E或N;X57=T或S;X58=I或L;X59=N或Q;X61=T或S;X64=L或V;X100=W或Y;X102=A或G;X103=T或S;X106=F或Y;X107=D或N。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:13所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在選自以下任一組的胺基酸取代:
(a)在X27、X28、X33、X52、X54、X59、X102和/或X103處的胺基酸取代;(b)在X52、X54、X61、X100和/或X103處的胺基酸取代;和(c)在X52、X57、X58、X64、X106和/或X107的胺基酸取代。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:13所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在X27、X28、X33、X52、X54、X59、X102和/或X103處的胺基酸取代,其中,X27處的胺基酸可被取代為F或Y;X28處的胺基酸可被取代為D或N;X33處的胺基酸可被取代為W或Y;X52處的胺基酸可被取代為N或Q;X54處的胺基酸可被取代為D或E;X59處的胺基酸可被取代為N或Q;X102處的胺基酸可被取代為A或G;X103處的胺基酸可被取代為T或S。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:13所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在X52、X54、X61、X100和/或X103處的胺基酸取代,其中,X52處的胺基酸可被取代為N或S;X54處的胺基酸可被取代為D或N;X61處的胺基酸可被取代為T或S;X100處的胺基酸可被取代為W或Y;X103處的胺基酸可被取代為T或S。
在一些實施方式中,與SEQ ID NO:13所示抗體的輕鏈相比,該抗體輕鏈或其片段至少包含在X52、X57、X58、X64、X106和/或X107處的胺基酸取代,其中,X52處的胺基酸可被取代為N或S;X57處的胺基酸可被取代為T或S;X58處的胺基酸可被取代為I或L;X64處的胺基酸可被取代為L或V;X106處的胺基酸可被取代為F或Y;X107處的胺基酸可被取代為D或N。
在某些實施方式中,該抗體重鏈可包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。
在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段中LCDR1可包括SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或其變體;LCDR2可包括SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列或其變體;LCDR3可包括SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列或其變體;且HCDR1可包括SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列或其變體;HCDR2可包括SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列或其變體;HCDR3可包括SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列或其變體。例如,該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗體。在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包含輕鏈可變區,該輕鏈可變區可包括SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列或其變體;且其中重鏈可包含重鏈可變區,該重鏈可變區可包括SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列或其變體。例如,該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的輕鏈可變區及重鏈可變區的抗體。在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含輕鏈和重鏈,該輕鏈可包括SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列且該重鏈可包括如SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列。例如,該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的輕鏈及重鏈胺基酸序列。
在某些實施方式中,本申請所述的抗體可以為SG003。抗體SG003的LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列;VL可包含SEQ ID NO.7所示的胺基酸序列;HCDR1、LCDR2和LCDR3可分别包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的胺基酸序列;VH可包含SEQ ID NO.8所示
的胺基酸序列;輕鏈可包含SEQ ID NO.11所示的胺基酸序列;重鏈可包含SEQ ID NO.13所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段與参比抗體競爭結合CD38蛋白(例,人CD38蛋白或猴CD38蛋白)。該對照抗體可包含LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3,且其LCDR1可包括SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列;LCDR2可包括SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列;LCDR3可包括SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列;其HCDR1可包括SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列;HCDR2可包括SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列;HCDR3可包括SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。在某些實施方式中,該對照抗體可包括抗體SG003或與其具有相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3的抗體。在某些實施方式中,該對照抗體可包含輕鏈可變區和重鏈可變區,該輕鏈可變區可包括SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列;且該重鏈可變區可包括SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。例如,該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的輕鏈可變區及重鏈可變區的抗體。在某些實施方式中,該對照抗體可包含輕鏈和重鏈,該輕鏈可包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列且該重鏈可包含SEQ ID NO:13所示胺基酸序列。例,該對照抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的輕鏈及重鏈。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段或,還可以在其輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列中包含一個或多個隨機突變(例,一個或多個、一個或數個胺基酸取代)。例,該抗體或其抗原結合片段可在其輕鏈可變區的框架區L-FR1~L-FR4的一個或多個位點包含一個或多個隨機突變(例,一個或多個,一個或數個胺基酸取代),和/或在其重鏈可變區的框架區
H-FR1~H-FR4的一個或多個位點包含一個或多個隨機突變(例,一個或多個,一個或數個胺基酸取代)。例,發生隨機突變後,該抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20;和/或,該抗體或其抗原結合片段或的重鏈可包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。發生隨機突變後的CD38抗體或其抗原結合片段,仍具有特異性結合人CD38蛋白和猴CD38蛋白的能力。
在某些實施方式中,本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包括SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列;並且其重鏈可包括SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列;或者,本申請該抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包括SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列;並且其重鏈可包括SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列;或者,本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包括SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列;並且其重鏈可包括SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列。
在本申請中涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列,還應理解為至少包含以下的範圍:與該該蛋白質或多肽具备相同或類似功能的變體或同源物。
在本申請中,該變體可以為,在該蛋白質和/或該多肽(例如,特異性結合CD38蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如,該功能性變體可包含已經藉由至少1個,例如1-30個、1-20個或1-10個,又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物學特性。例如,該功能性變體可保持改變
之前的該蛋白質或該多肽的至少60%,70%,80%,90%,或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如,該取代可以為保守取代。
在本申請中,該同源物可以為,與該蛋白質和/或該多肽(例如,特異性結合CD38蛋白的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如,具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中,該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”:將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較,確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如,A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目,將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即,窗大小),並且將結果乘以100,以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對,可以按本領域已知的多種方式實現,例如,使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數,包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。該同源性也可以藉由以下的方法測定:FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以参見W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”,美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),85:2444-2448,1988;和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”,Science,227:1435-1441,1989。對BLAST算法的描述可參見S.Altschul、
W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”,分子生物學雜誌,215:403-410,1990。
核酸、載體、細胞和製備方法
在另一個方面,本申請還提供了分離的一種或多種核酸分子。該一種或多種核酸分子可包含編碼本申請所述的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。例如,該一種或多種核酸分子中的的多核苷酸可以編碼完整的該抗體或其抗原結合片段,也可以編碼其中的一部分(例如,HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。
本申請所述的核酸分子中的至少一種該核酸分子可經密碼子優化。例如,該密碼子優化的方法包括但不限於:消除稀有密碼子、調整GC含量、增加mRNA的穩定性、調整mRNA的二級結構、合理設計接頭和調整起始密碼子環境。
在某些實施方式中,該核酸分子可包含一個或多個選自下組的多核苷酸序列:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。其中,SEQ ID NO:9可編碼本申請所述抗體SG003的輕鏈可變區。SEQ ID NO:10可編碼本申請所述抗體SG003的重鏈可變區。SEQ ID NO:12可編碼本申請所述抗體SG003的輕鏈。SEQ ID NO:14可編碼本申請所述抗體SG003的重鏈。
本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如,其可以是藉由以下方法產生或合成的:(i)在體外擴增的,例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的,(ii)藉由克隆重組產生的,(iii)純化的,例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離,或者(iv)合成的,例如藉由化學合成。在某些實施方式中,該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
在本申請中,可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該的抗體或其抗原結合片段的核酸,這些方法包括但不限於,採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR,具體操作可參見Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在另一個方面,本申請提供了一種或多種載體,其包含本申請該的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外,該載體中還可包含其他基因,例如允許在適當的細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外,該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的,例如,可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中,該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化,但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列,例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如,5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區,啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。本申請該的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括,例如質粒、粘粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如,該載體為表達載體。例如,該表達載體可以為T-easy。
在另一個方面,本申請提供了細胞,該細胞可包含本申請該的一種或多種核酸分子和/或本申請所述的一種或多種載體。在某些實施方式中,每種或每個細胞可包含一個或一種本申請所述的核酸分子或載體。在某些實施方式中,每種或每個細胞可包含多個(例如,2個或以上)或多種(例如,2種或以上)本申請所述的核酸分子或載體。例如,可將本申請所述的載體引入該細胞中,例如真核細胞,如來自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將本申請所述的載體引入該細胞中,例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。例如,該細胞可以為CHO-S。
在另一個方面,本申請提供了製備該抗體或其抗原結合片段的方法。該方法可包括,在使得該抗體或其抗原結合片段表達的條件下,培養該本申請所述的細胞。例如,可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等,這些方法是本領域普通技術人員所瞭解的。
在某些情形中,該方法還可包括分離和/或純化該抗體或其抗原結合片段的步骤。例如,可以採用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖進行親和层析,還可藉由凝胶电泳和/或高效液相色增等来純化和分離本申請所述的抗體或其抗原結合片段。例如,還可以使用Protein A親和純化。
藥物組合物、應用
在另一個方面,本申請提供了一種藥物組合物,其可包含本申請所述的抗體、其抗體結合片段或變體,所述的核酸分子,所述的載體,所述的細胞,以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
該藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金属复合物和/或非離子表面活性劑等。
在本申請中,該藥物組合物可被配製用於口服給藥,靜脈內給藥,肌肉內給藥,在腫瘤部位的原位給藥,吸入,直腸給藥,陰道給藥,經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。
該藥物組合物可以用於抑制腫瘤生長。例如,本申請的藥物組合物可以抑制或延緩疾病的發展或進展,可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤),和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
本申請所述的藥物組合物可以包含治療有效量的該抗體或其抗原結合片段。該治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的病症或病症(例如癌症)和/或其任何併發症而所需的劑量。
另一方面,本申請提供了該抗體或其抗原結合片段在製備預防或治療腫瘤的藥物中的用途。
另一方面,本申請提供了用於預防或治療腫瘤的該抗體或其抗原結合片段。
另一方面,本申請提供了預防或治療腫瘤的方法,其包括向有需要的受試者施用本申請所述的抗體或其抗原結合片段、所述的分子核酸、所述的載體、所述的細胞和/或所述的藥物組合物。
在本申請中,該腫瘤可包括CD38陽性的腫瘤。例如,該CD38陽性的腫瘤可以選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
在某些實施方式中,該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
另一方面,本申請提供了抑制CD38蛋白與CD38配體結合的方法,其包括施用本申請所述的抗體或其抗原結合片段、所述的核酸分子、所述的載體和/或所述的細胞。
在本申請中,該CD38配體可以包括CD31蛋白。
在某些實施方式中,該抑制CD38蛋白與CD38配體結合的方法為體外或離體方法。
本申請可包括以下的實施方案:
1.抗體或其抗原結合片段,其以1×10-9M或更低的K D 值與CD38蛋白相結合。
2.根據實施方案1所述的抗體或其抗原結合片段,其能够藉由與CD38蛋白特異性結合而殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長。
3.根據實施方案1-2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其能够藉由抗體依賴的細胞介導的細胞毒性ADCC、補體依賴的細胞毒性CDC和/或細胞凋亡杀死CD38+細胞。
4.根據實施方案3所述的抗體或其抗原結合片段,其中該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。
5.根據實施方案4所述的抗體或其抗原結合片段,其中該CD38陽性的選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
6.根據實施方案3-5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,
其中該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
7.根據實施方案3-6中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該腫瘤的細胞包括選自下組的細胞:Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞。
8.根據實施方案1-7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,當其與CD38蛋白結合時,其結合相應於人CD38蛋白第60位至第89位胺基酸殘基中的一個或多個殘基。
9.根據實施方案1-8中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體選自下組:單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
10.根據實施方案1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段選自下組:Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和ScFv片段。
11.根據實施方案1-10中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該CD38蛋白為人CD38蛋白或猴CD38蛋白。
12.根據實施方案1-11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其與對照抗體競爭結合該CD38蛋白,其中該對照抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區,該對照抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,該LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列;該LCDR2包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列;該LCDR3包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列,該對照抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,該HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列;該HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列;該HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
13.根據實施方案12所述的抗體或其抗原結合片段,其中該
對照抗體的輕鏈可變區包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列且該對照抗體的重鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
14.根據實施方案12-13中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該對照抗體的輕鏈包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列;且該對照抗體的重鏈包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列。
15.根據實施方案1-14中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其與對照抗體競爭結合該CD38蛋白,其中該對照抗體包含輕鏈和重鏈,其中該對照抗體的輕鏈包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20;且該對照抗體的重鏈包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。
16.根據實施方案1-15中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含抗體輕鏈或其片段。
17.根據實施方案16所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1,且該LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列。
18.根據實施方案16-17中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段包含LCDR2,且該LCDR2包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
19.根據實施方案16-18中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段包含LCDR3,且該LCDR3包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列。
20.根據實施方案16-19中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL,且該輕鏈可變區VL
包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列。
21.根據實施方案16-20中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段還包含人恆定區。
22.根據實施方案21所述的抗體或其抗原結合片段,其中該人恆定區包括人Ig κ恆定區。
23.根據實施方案16-22中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列。
24.根據實施方案27所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體輕鏈或其片段包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20。
25.根據實施方案1-24中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體包含抗體重鏈或其片段。
26.根據實施方案25所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體重鏈或其片段包含HCDR1,且該HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
27.根據實施方案25-26中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體重鏈或其片段包含HCDR2,且該HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列。
28.根據實施方案25-27中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體重鏈或其片段包含HCDR3,且該HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
29.根據實施方案25-28中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH,且該重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
30.根據實施方案25-29中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體重鏈或其片段還包含人恆定區。
31.根據實施方案30所述的抗體或其抗原結合片段,該人恆定區包括人IgG恆定區。
32.根據實施方案31所述的抗體或其抗原結合片段,其中該IgG恆定區包含人IgG1恆定區。
33.根據實施方案25-32中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體重鏈包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列。
34.根據實施方案33所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體重鏈包含下述任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21。
35.分離的一種或多種核酸分子,其包含編碼實施方案1-34中任一項該的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
36.根據實施方案35所述的核酸分子,其中至少一種該核酸分子經密碼子優化。
37.根據實施方案35-36中任一項所述的核酸分子,其中該核酸分子包含一個或多個選自下組的多核苷酸序列:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
38.載體,其包含實施方案35-37中任一項所述的核酸分子。
39.細胞,其包含實施方案35-37中任一項所述的核酸分子或實施方案38所述的載體。
40.製備實施方案1-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括在使得該抗體或其抗原結合片段表達的條件下,培養實施方案39所述的細胞。
41.藥物組合物,其包含實施方案1-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、實施方案35-37中任一項所述的核酸分子、實施方案38所述的載體和/或實施方案39所述的細胞,以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
42.實施方案1-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段在製備預防或治療腫瘤的藥物中的用途。
43.根據實施方案42所述的用途,其中該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。
44.根據實施方案43所述的用途,其中該CD38陽性的腫瘤選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
45.根據實施方案42-44中任一項所述的用途,其中該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
46.實施方案1-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其用於預防或治療腫瘤。
47.根據實施方案46所述的抗體或其抗原結合片段,其中該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。
48.根據實施方案47所述的抗體或其抗原結合片段,其中該CD38陽性的腫瘤選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
49.根據實施方案46-48中任一項所述的用途,其中該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
50.預防或治療有需要的受試者中的腫瘤的方法,其包括向該受試者施用實施方案1-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、實施方案35-37中任一項所述的分子核酸、實施方案38所述的載體、實施方案39所述的細胞和/或實施方案40所述的藥物組合物。
51.根據實施方案50所述的方法,其中該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。
52.根據實施方案51所述的方法,其中該CD38陽性的腫瘤選自以下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
53.根據實施方案50-52中任一項所述的方法,其中該腫瘤選自以下組:非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
54.抑制CD38蛋白與CD38配體結合的方法,該方法包括施用實施方案1-34中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、實施方案35-37中任一項所述的核酸分子、實施方案38所述的載體和/或實施方案39所述的細胞。
55.根據實施方案54所述的方法,其中該CD38配體包括CD31。
不欲被任何理論所限,下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的產品、方法或系統的工作方式,而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
實施例1 融合瘤抗體製備及基因選殖
小鼠免疫:balb/c小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)經皮下(s.c.)用弗氏佐劑或弗氏不完全佐劑混合100μg可溶性CD38抗原(購自北京義翹神州生物技術有限公司)免疫3次。在第0天用弗氏完全佐劑,在第14天和第28天用弗氏不完全佐劑。將免疫小鼠的脾細胞根據標準方法融合於小鼠骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC)。
融合瘤融合:按現有常規融合瘤融合方法融合小鼠脾臟,HAT篩選法篩選融合後的融合瘤細胞(每個孔105個細胞)。在12天後後,
取上清用CD38抗原包被的酶標板進行ELISA檢測。較佳純株藉由有限稀釋法進行第二輪亞克隆。獲得穩定表達目的抗體的融合瘤株後進行保種建庫。
製備RNA:使用RNA提取試劑盒TRIzol Reagent(購自Life technologies)製備RNA。用反轉錄試劑盒(購自北京全式金生物技術有限公司)製備編碼抗體基因的cDNA,以cDNA為模板做PCR擴增抗體可變區基因,選殖T-easy載體,將選殖得到的抗體重鏈和輕鏈可變區序列測序,並進一步獲得對應的胺基酸序列。
實施例2 抗體人源化改造及製備
在實施例1獲得鼠源抗體可變區重、輕鏈序列的基礎上,藉由NCBI提供的在線序列比對方法(IgBlast)與NCBI數據庫中已有人源抗體序列進行比對,確定潛在的人源化位;進一步藉由SwissModel搭建鼠源抗體可變區三維結構,確定人源化位點;針對相應的人源化位點,開展人源化改造,獲得人源化抗體序列。
將人源化改造後的抗體命名為SG003,測序結果顯示,抗體SG003的LCDR1-3的胺基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示;VL的胺基酸序列如SEQ ID NO.7所示;經優化密碼子,反向翻譯獲得的編碼VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;抗體SG003的HCDR1-3的胺基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示;VH的胺基酸序列如SEQ ID NO.8所示;經優化密碼子,反向翻譯獲得的編碼VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
抗體SG003的輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.11所示;編碼其的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。抗體SG003的重鏈的胺基酸
序列如SEQ ID NO.13所示;編碼其的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
將獲得的人源化改造後的抗體可變區基因選殖進含有人IgG恆定區基因的真核表達載體pCMV-163中,構建全抗體表達載體,其物理圖譜如第1圖所示。第1圖中,真核表達載體pCMV-163的各個組成成分均為本領域已知的成分,按照所示次序重組而成。
使用ExpiCHOTM Expression System試劑盒(購自Thermo Fisher Scientific),將獲得的編碼抗體SG003的真核表達載體轉染至CHO-S細胞中進行表達,收集含有目的蛋白的細胞培養上清,利用常規的Protein A親和純化目標抗體。
實施例3 人源化抗體結合靶抗原
用含有1μg/ml CD38-His融合蛋白的PBS溶液在4℃包被ELISA板過夜。該板隨後用含有0.01%吐溫-20的PBS溶液(PBST)洗滌,向PBST加入10%的胎牛血清在37℃封閉1小時,然後加入不同濃度的SG003抗體、對照抗體Daratumumab(達雷木單抗,DARZALEX),在37℃反應1小時。用PBST洗滌後,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP,購自Thermo Fisher Scientific),在37℃反應30分鐘。然後用PBST重複洗板5遍,在吸水紙上儘量拍幹殘留液滴,向每孔加入100μl TMB(購自eBioscience),在室溫(20±5℃)避光放置1-5min。向每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應,用酶標儀在450nm處讀取OD值,分析抗體與靶抗原CD38-His結合能力。結果顯示,SG003抗體與對照抗體Daratumumab相比,顯示出更強的結合活性,結果如第2圖所示。第2圖中,EC50值為35.1±10.5ng/mL,Daratumumab抗體的EC50值為150.9±105.8ng/mL。
實施例4 人源化抗體親和力測定
採用BIACORE生物大分子相互作用儀(GE公司)分析抗體親和力。在芯片上偶聯抗人IgG-Fab抗體(購自Abcam),利用抗人IgG抗體捕獲SG003抗體,抗體濃度定為1μg/mL,進樣時間為60-150秒;以抗原CD38為流動相,使用6個濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100nM),結合時間為120秒;解離時間為1200秒;使用10mM甘胺酸-鹽酸緩衝液(pH2.1)進行再生,時間為60秒。結果顯示SG003抗體親和力如表1所示。
實施例5 人源化抗體特異性識別靶抗原
將牛奶(北京博邁德生物技術有限公司)、BSA(BOVOGEN)、CD19(北京義翹神州生物技術有限公司)、TROP2(北京義翹神州生物技術有限公司)、CD47(北京麥格珀爾生物科技有限公司)、CD38(北京義翹神州生物技術有限公司)、Gas6(R&D)等各蛋白以及AXL(ACRO Biosystems)分别包被ELISA板條,1mg/ml,4℃過夜;PBST洗滌後,加入10%的胎牛血清,37℃封閉1小時;加入SG003抗體,37℃反應1小時;PBST洗滌後,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP,Thermo Fisher Scientific),室溫反應30分神;PBST重
複洗板5遍,在吸水紙上盡量拍乾殘留液滴;每孔加入100ml TMB(eBioscience),室溫(20±5℃)避光放置1-5min;每孔加入100ml 2N H2SO4終止液終止受質反應,酶標儀450nm處讀取OD值,分析抗體與蛋白結合能力。
結果如第3圖所示,第3圖的結果顯示,SG003抗體均能特異性識别靶抗原CD38,但與牛奶、BSA、CD19、TROP2、CD47、AXL、Gas6等蛋白均無顯著的結合反應。
實施例6 人源化抗體與細胞表面抗原的結合
利用流式分析技術檢測Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞表面CD38蛋白與SG003抗體及對照抗體Daratumumab的結合。收集對數生長期細胞,調整細胞密度到5×106個細胞/mL,在冰上預冷。用含2%FBS預冷的生理鹽水將SG003抗體、對照抗體Daratumumab稀釋成不同濃度。取100μL細胞,加入等體積該稀釋抗體,於4℃避光反應30min。反應結束後,洗滌細胞兩次。用稀釋後的PE標記小鼠抗人IgG二抗(PE Mouse Anti-Human IgG,購自BD Pharmingen)100μL重懸細胞,4℃避光反應30min。反應結束後,用2%FBS預冷的生理鹽水洗滌細胞兩次。用400μL 1%多聚甲醛重懸細胞。用流式細胞儀(BD Calibur)分析抗體與細胞表面抗原的結合能力。
結果顯示,SG003抗體能特異性識别Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞表面CD38,該識别活性明顯高於對照抗體Daratumumab且呈劑量依赖性,其中與Raji細胞結合(第4A圖)的EC50值SG003為34.4ng/mL,Daratumumab為49.3ng/mL。與Daudi細胞結合(第4B圖)的EC50值SG003為36.7ng/mL,Daratumumab為50.9ng/mL。
與Ramos細胞結合(第4C圖)的EC50值SG003為81.5ng/mL,Daratumumab為95.1ng/mL。與RPMI8226細胞結合(第4D圖)的EC50值SG003為140.3ng/mL,Daratumumab為176.5ng/mL。
實施例7 人源化抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性
首先將實驗所需靶細胞(Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞)調整密度至2×105個細胞/mL重懸在ADCC緩衝液(無酚紅MEM培養液+1%FBS)中,並加入96孔板(50μL/孔)。隨後向每孔中加入100μL不同濃度的SG003抗體,混勻後在37℃,含5%CO2的培養箱中孵育30min。再將實驗所需效應細胞NK92MI-CD16a(購自華博生物)調整密度至1.2×106cell/mL,加入有靶細胞的孔中,使得靶細胞:效應細胞=1:6。混勻後在37℃,含5%CO2的培養箱中孵育4-6h後,移除96孔板內部分原液(100μL/孔),加入LDH檢測試劑盒(Cytotoxicity Detection Kit,購自Roche)中LDH反應混合物(100μL/孔),於37℃反應10min。再加入終止液(50μL/孔),輕微混勻。用酶標儀在492nm時讀取OD值,同時以650nm處的OD值為背景值。實驗中同時設置如下對照組,其中對照1為ADCC緩衝液,對照2為靶細胞+ADCC緩衝液,對照3為靶細胞+裂解液+ADCC緩衝液,對照4為靶細胞+效應細胞+ADCC緩衝液。特異性殺傷率%=((實驗組-對照4)/(對照3-對照2))×100%。量效曲线採用GraphPad Prism Version 5進行數據分析。
結果顯示,使用Raji靶細胞和NK92MI-CD16a效應細胞檢測時,SG003抗體顯示了非常有效的ADCC活性(參見第5A圖),EC50值SG003為6.97ng/mL,Daratumumab為17.0ng/mL。Daudi作為靶細胞時,
EC50值SG003為0.72ng/mL,Daratumumab為4.6ng/mL(參見第5B圖)。同時SG003抗體還顯示出對Ramos細胞有效的ADCC活性(參見第5C圖),EC50值SG003為0.69±0.007ng/mL,Daratumumab為3.01ng/mL。SG003抗體還顯示出對RPMI8226細胞有效的ADCC活性(參見第5D圖),EC50值SG003為1.46ng/mL,Daratumumab為4.94ng/mL。
實施例8 人源化抗體體內抑制腫瘤活性
藉由向CB17 SCID小鼠接種Raji-Luc細胞建立腫瘤模型,來評價SG003抗體抑制腫瘤活性的效果。
選擇雌性,5~8週齡的CB17 SCID小鼠(購自北京百奥賽圖基因生物技術有限公司)進行試驗。Raji-Luc細胞為北京百奥賽圖基因生物技術有限公司在Raji細胞的基礎上,轉入螢光素報告基因後獲得的穩定細胞系。復甦培養至所需數量後,收集對數期生長細胞懸浮至5×106個/0.2mL濃度,以0.2mL/隻的數量藉由尾靜脈接種到CB17 SCID小鼠,接種後於第0天、第7天用小動物成像儀觀察腫瘤生長情況及體重,並於第7天挑選腫瘤成像信號適中的18隻小鼠入組,隨機分組分配到3個組中,每組6隻。然後開始對動物進行给藥,設生理鹽水對照組、陽性對照組(Daratumumab,購自强生公司)以及實驗組(SG003),给藥劑量為200μg/kg,兩週給藥一次,共给藥2次,觀察小鼠體重、腫瘤生長情況以及小鼠生存率。
結果顯示,Daratumumab以及SG003抗體均可為實驗動物所耐受。各組給藥動物和溶劑對照組比較有明顯腫瘤生長抑制效果(參見第6圖),第一次給藥後第七天,Daratumumab以及SG003抗體治療組的平均螢光强度分别為(平均3.92E+07,標準誤差4.04E+06)、(平均3.19E+07,
標準誤差:9.32E+06),顯著低於對照組平均腫瘤螢光强度為(平均3.04E+08,標準誤差4.29E+07)。
然後,進一步觀察動物生存率,對照組的中位生存時間為分組後12天,Daratumumab為21天,而SG003組為28天。SG003組優效於Daratumumab組(參見第7圖)。
實施例9 嵌合抗體種屬識別特異性
將人(Human)、小鼠(Mouse)、大鼠(Rat)、食蟹猴(Cynomolgus)等不同種屬的CD38胞外段蛋白(北京義翹神州生物技術有限公司)分別包被ELISA板條,1mg/ml,4℃過夜;PBST洗滌後,加入10%的胎牛血清,於37℃封閉1小時;分别加入待測SG003抗體、對照抗體Daratumumab,37℃反應1小時;PBST洗滌後,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗入IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP,購自Thermo Fisher Scientific),室溫反應30分钟;PBST重複洗板5遍,在吸水紙上進量拍乾殘留液滴;每孔加入100ml TMB(購自eBioscience),室溫(20±5℃)避光放置1-5min;每孔加入100ml 2N H2SO4終止液終止受質反應,用酶標儀在450nm處讀取OD值,分析抗體與不同種属CD38蛋白的結合能力。
結果顯示,SG003抗體能識别人和食蟹猴的CD38蛋白分子,但與小鼠和大鼠的CD38蛋白分子無結合反應;結果如第8A圖所示。
而對照抗體Daratumumab只識别人CD38蛋白分子,與小鼠、大鼠及食蟹猴的CD38蛋白分子均無結合反應。結果如第8B圖所示。
實施例10 人源化抗體突變後保持生物學活性
借助基因工程技術,可以對SG003抗體可變區序列進行隨
机突變,獲得新的抗體可變區序列,並進一步獲得新的抗體輕鏈和重鏈序列。例如,在SG003抗體基礎上進行隨機突變後獲得的抗體,其輕鏈胺基酸序列可為SEQ ID NO:16,且重鏈胺基酸序列可為SEQ ID NO:17;或者,其輕鏈胺基酸序列可為SEQ ID NO:18,且重鏈胺基酸序列可為SEQ ID NO:19;或者,其輕鏈胺基酸序列可為SEQ ID NO:20,且重鏈胺基酸序列可為SEQ ID NO:2I。將分別包含上述突變後輕鏈和重鏈的組合的抗體依次命名為SG003M1-3(例如,SG003M1抗體的輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:16,且重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO:17)。
参考實施例2的方法製備新抗體,参考實施例4的方法評價抗體活性。隨機突變後的抗體SG003M1-3可以識别CD38抗原(參見第9圖)。經測定,SG003M1的EC50值為15.72ng/mL、SG003M2的EC50值為27.75ng/mL、SG003M3的EC50值為6.10ng/mL。隨機選擇SG003M1,測定親和力結果如表2所示。
實施例11 人源化抗體的表位驗證
利用Epitope-mapping方法分析抗體SG003識别CD38抗原的表位。利用丙胺酸替代法設計CD38抗原突變體(表3,其中突變後的胺基酸均為丙胺酸),藉由聚合酶鏈式反應(PCR)及重疊延伸(overlap)等分子生物學技術獲得CD38野生型及多種突變體基因,琼脂糖凝胶电泳
分離回收後,使用HindIII與NheI限制性內切酶進行酶切,選殖入pEGFP-N1載體。測序正確後,使用HighGene轉染試劑盒(ABclonal),根據試劑盒說明书該方法將含有CD38野生型或突變體基因的載體轉染293T細胞。轉染48小時後,胰酶消化收取細胞,製備單細胞懸液;將目的細胞與抗體SG003以10μg/ml的工作濃度進行4℃恆溫孵育30min,之後使用GAH-IgG Fc PE(Invitrogen,Cat:12-4998-82)進行4℃恆溫孵育30min,流式檢測FITC和PE兩個通道的螢光强度,其中FITC螢光强度代表CD38分子及其突變體表達水平,PE螢光强度代表SG003抗體結合抗原的强弱。
第10圖的流式結果顯示,抗體SG003與突變體21、22、23不結合,這個結果暗示著CD38蛋白的第60-89位胺基酸區域為抗體SG003識别的主要表位。
前述詳細說明是以解釋和举例的方式提供的,並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本文所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員来說是顯而易見的,且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LCDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HCDR3
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH
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<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 密碼子優化後的VL核苷酸
<210> 10
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 密碼子優化後的VH核苷酸
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003輕鏈
<210> 12
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003輕鏈 核苷酸
<210> 13
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003重鏈
<210> 14
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003重鏈 核苷酸
<210> 15
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突變後的輕鏈1
<210> 17
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突變後的重鏈1
<210> 18
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突變後的輕鏈2
<210> 19
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突變後的重鏈2
<210> 20
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突變後的輕鏈3
<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突變後的重鏈3
<210> 22
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 輕鏈通式
<220>
<221> X20
<222> (20)..(20)
<223> X20=T或S
<220>
<221> X27
<222> (27)..(27)
<223> X27=S或N
<220>
<221> X31
<222> (31)..(31)
<223> X31=S或T
<220>
<221> X34
<222> (34)..(34)
<223> X34=F或Y
<220>
<221> X57
<222> (57)..(57)
<223> X57=N或D
<220>
<221> X58
<222> (58)..(58)
<223> X58=L或I
<220>
<221> X59
<222> (59)..(59)
<223> X59=E或Q
<220>
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<222> (97)..(97)
<223> X97=E或Q
<220>
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<220>
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<222> (100)..(100)
<223> X100=F或S
<220>
<221> X101
<222> (101)..(101)
<223> X101=T或S
<210> 23
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重鏈通式
<220>
<221> X27
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<223> X27=F或Y
<220>
<221> X28
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<223> X28=D或N
<220>
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<222> (33)..(33)
<223> X33=W或Y
<220>
<221> X52
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<223> X52=N}Q或S
<220>
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<220>
<221> X57
<222> (57)..(57)
<223> 57=T或S
<220>
<221> X58
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<223> X58=I或L
<220>
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<222> (59)..(59)
<223> X59=N或Q
<220>
<221> X61
<222> (61)..(61)
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<220>
<221> X64
<222> (64)..(64)
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<220>
<221> X100
<222> (100)..(100)
<223> X100=W或Y
<220>
<221> X102
<222> (102)..(102)
<223> X102=A或G
<220>
<221> X103
<222> (103)..(103)
<223> X103=T或S
<220>
<221> X106
<222> (106)..(106)
<223> X106=F或Y
<220>
<221> X107
<222> (107)..(107)
<223> X107=D或N
Claims (21)
- 一種抗體或其抗原結合片段,其與CD38蛋白相結合,該抗體包含抗體輕鏈或其片段和抗體重鏈或其片段,該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,該抗體重鏈或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3;其中該LCDR1的胺基酸序列為SEQ ID NO:1,該LCDR2的胺基酸序列為SEQ ID NO:2,該LCDR3的胺基酸序列為SEQ ID NO:3,該HCDR1的胺基酸序列為SEQ ID NO:4,該HCDR2的胺基酸序列為SEQ ID NO:5,以及該HCDR3的胺基酸序列為SEQ ID NO:6。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區VL和重鏈可變區VH;其中該輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列,該重鏈可變區VH包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
- 一種抗體或其抗原結合片段,其與CD38蛋白相結合,其中該抗體或其抗原結合片段包含抗體輕鏈的LCDR1、LCDR2和LCDR3,以及抗體重鏈的HCDR1、HCDR2和HCDR3;其中該抗體輕鏈以及抗體重鏈任選自以下組合:(1)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示;(2)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示;(3)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示;以及(4)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
- 一種抗體或其抗原結合片段,其與CD38蛋白相結合,其中該抗體或其抗原結合片段包含抗體輕鏈的可變區VL,以及抗體重鏈的可變區VH;其中該抗體輕鏈以及抗體重鏈任選自以下組合:(1)該抗體輕鏈的胺基酸序列 如SEQ ID NO:11所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示;(2)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示,該抗體重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示;(3)該抗體輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示;以及(4)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
- 一種抗體或其抗原結合片段,其與CD38蛋白相結合,其中該抗體或其抗原結合片段包含抗體輕鏈和抗體重鏈;其中該抗體輕鏈以及抗體重鏈任選自以下組合:(1)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:11所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:13所示;(2)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:16所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:17所示;(3)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:18所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示;以及(4)該抗體輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示,該抗體重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體選自下組:單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段選自下組:Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和ScFv片段。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該CD38蛋白為人CD38蛋白或猴CD38蛋白。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其與對照抗體競爭結合所述CD38蛋白,其中該對照抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區,該對照抗體的輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和 LCDR3,該LCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列;所述LCDR2包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列;該LCDR3包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列,所該對照抗體的重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,該HCDR1包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列;該HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列;該HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸分子,其包含編碼申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
- 如申請專利範圍第10項所述的核酸分子,其中至少一種該核酸分子經密碼子優化。
- 如申請專利範圍第10項所述的核酸分子,其中該核酸分子包含一個或多個選自下組的多核苷酸序列:SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
- 一種載體,其包含申請專利範圍第10至12項中任一項所述的核酸分子。
- 一種細胞,其包含申請專利範圍第10至12項中任一項所述的核酸分子或申請專利範圍第13項所述的載體。
- 一種製備申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包括在使得所述抗體或其抗原結合片段表達的條件下,培養申請專利範圍第14項所述的細胞。
- 一種藥物組合物,其包含申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第10至12項中任一項所述的核酸分子、申請專利範圍第13項所述的載體和/或申請專利範圍第14項所述的細胞,以及視需要地藥學上可接受的佐劑。
- 一種申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的用途,其用在製備預防或治療腫瘤的藥物。
- 如申請專利範圍第17項所述的用途,其中該腫瘤包括CD38陽性的腫瘤。
- 如申請專利範圍第18項所述的用途,其中該CD38陽性的腫瘤選自下組:多發性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
- 一種抑制CD38蛋白與CD38配體結合的方法,該方法包括施用申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第10至12項中任一項所述的核酸分子、申請專利範圍第13項所述的載體和/或申請專利範圍第14項所述的細胞,該抑制CD38蛋白與CD38配體結合的方法為體外或離體方法。
- 如申請專利範圍第20項所述的方法,其中該CD38配體包括CD31。
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