TWI815147B - 基於核酸疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種可用於提供電轉移源的新型裝置，特別是一種提供方波電脈衝的電裝置，藉由電探針可促進將核酸輸送到細胞內。
Description
本發明涉及一種可用於提供電轉移源的電針灸裝置，特別是涉及一種提供方波電脈衝的電針灸裝置，藉由電探針可促進將核酸輸送到細胞內。
DNA疫苗有幾個優點，包括快速生產、對溫度不敏感及成本低，因此是對抗突發傳染病爆發的有效疫苗形式。目前在臨床試驗網站(https://clinicaltrials.gov)上已註冊了 10 多項COVID-19 DNA疫苗的臨床研究，其中之一開始在印度進行以Pharmajet™傳輸DNA疫苗的三期臨床試驗已完成，並已獲得當地政府的緊急使用授權。利用電轉移遞送是DNA疫苗開發的主要趨勢。DNA疫苗接種與電穿孔相結合大大提高了DNA疫苗的功效 [Lucille Adam, J Immunol June 15, 2020, 204 (12) 3375-3388; Feng Lin, Vaccine, 2011 Sep 9;29(39):6771-80; Maya Williams, Vaccine. 2019 Jul 26;37(32):4444-4453]。電穿孔接種DNA疫苗的動物實驗成功結果，引領各種人體用電穿孔裝置的開發，包括Cellectra
®(Inovio Inc., USA)、Trigrid
®(Ichor Medical Systems, USA)及ELETTRODO E-GUN (Takis Biotech., Italt) [PMID: 33392485; PMID: 32664486; PMID: 32850116]。由於新設計的電子裝置尚須獲得監管部門的批准，需要很長時間。為了克服此一限制，我們在 COVID-19的DNA疫苗接種中使用了臨床可用的電針灸機。
針灸在中國及全世界使用的歷史悠久。在美國，每年約有350萬成年人接受針灸治療 [PMID：29140486]。本發明之電針灸傳輸，使用的電壓低於其他DNA疫苗設備（5-40 V v.s. 75 V）。電針灸已被證明可以藉由活化巨噬細胞中的 JAK2/STAT3 訊號路徑 [PMID: 33754049] 來調節免疫反應，或活化迷走神經以增強抗腫瘤免疫力 [PMID: 33636172]。這些結果指出，電針灸機的電轉移不僅增加了DNA的攝取，而且活化了免疫細胞分泌細胞因子以增強免疫反應。另一方面，也顯示了電脈衝可能會誘發發炎反應，並可能促進 DNA 疫苗在體內的功效。
本發明涉及一種電子裝置，藉由電探針提供一方塊波電子脈衝，以促進核酸遞送進細胞內。
該電探針可以是一針狀物或導電物質。
電子脈衝輸出在5-75伏特之間，頻率在20-120赫茲之間，間隔為50毫秒至5分鐘。
核酸可為核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)或去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)。
該核酸包含編碼蛋白質的基因，並且基因密碼子已針對哺乳動物細胞表現進行了最佳化。
編碼的基因可在N端包含分泌前導序列(secreting leader sequence)及KoZak序列，其中分泌前導序列可以是天然基因序列或選自其他蛋白質基因。
該分泌前導序列可以源自組織纖維蛋白溶酶原活化物 (tissue plasminogen activator, TPA)、人類Igκ、人類IgE、CD5及CD33。
RNA或DNA以皮內(intradermally)或肌內(intramuscularly)注射，然後從電子裝置發出電脈衝。
該DNA編碼的蛋白質是人體內的免疫原性組合物，包括病原體或腫瘤抗原。
該病原體為嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。
本發明還涉及一種用於增強遞送核酸入細胞的方法，包括：藉由電探針提供方波電脈衝。
為了便於說明本發明，本發明的上述發明內容所表達的中心思想以具體的例子來表達。實施例中的各個項目是根據適合於說明的比例、尺寸、變形量或位移量來描繪，而不是按照如上所述的實際元件的比例繪製。
細胞株
將人類胚胎腎細胞株HEK293T培養於Dulbecco’s modified Eagle 培養基 (DMEM, GIBCO-BRL, Grand Island, NY)，該培養基另添加了10%熱滅活胎牛血清 (HyClone, Logan, Utah)、100 U/ml 青黴素 (penicillin)、100 µg/ml 鏈黴素(streptomycin)、0.1 mM 非必需氨基酸及2 mM 左旋麩醯胺酸 (L-glutamine) (GIBCO-BRL)。非貼壁細胞則是培養於RPMI 1640培養基 (GIBCO-BRL) 中，該培養基另添加了10%加熱滅活的胎牛血清、100 U/ml 青黴素及100 µg/ml 鏈黴素。
動物模式
雌性 BALB/c小鼠乃獲自財團法人國家實驗研究院國家實驗動物中心 (National Laboratory Animal Breeding and Research Center, Taipei, Taiwan)，所使用小鼠在6至12週齡之間。所有動物皆飼養於國家衛生研究院 (National Health Research Institutes, NHRI) 的動物中心，並按照院內實驗動物照護及使用指引進行飼養。所有動物實驗計畫均獲得國家衛生研究院內實驗動物照護及使用委員會 (IACUC)的批准。
質體建構及製備
編碼全長或成熟SARS-CoV-2棘蛋白 (spike protein)基因的DNA序列針對小鼠或人類密碼子的使用進行了最佳化。在成熟的完整棘蛋白或各種截短的棘蛋白片段之5' 端插入組織纖維蛋白溶酶原活化物 (tissue plasminogen activator, TPA) 的前導序列基因。DNA序列由GenScript Biotech合成，各基因經PCR擴增並次選殖 (subclone)至臨床使用的載體pVAX1中。質體轉入DH5α大腸桿菌株進行質體擴增。
動物實驗
將指定劑量的質體DNA注射到Balb/c小鼠的脛骨前肌中進行肌內免疫接種，接著以BTX電穿孔儀(ECM830, USA)進行電穿孔 (75伏特，脈衝長50毫秒，間隔100毫秒，刺激10次)；或是使用傳統電針灸機 (5-75伏特，20-120赫茲，間隔三周免疫共2次)。在第一次免疫接種後的第4周及第6週從下頜採血收集血液樣本。
免疫測定
棘-特異抗體的含量係由ELISA測定。簡言之，取1μg/ml的重組蛋白 (Sino Biological, China) 50 μl塗覆在96孔微孔盤上，並加入0.1 M pH 9.6的碳酸鹽緩衝液，在4°C培養過夜。接著以含0.05% tween 20的PBS溶液洗滌該微孔盤兩次，然後在室溫下用含5%脫脂牛乳的PBS溶液封閉2小時。將來自免疫動物的稀釋血清加到孔中於室溫2小時。加入HRP偶聯的抗小鼠之山羊IgG (Sigma, USA)後，再加入SureBlue TMB 1-Component 過氧化物酶受質 (KPL)。使用ELISA讀數器測量在450 nm處的吸光度。
細胞因子生成檢測
使用細胞因子ELISA來檢測T細胞的反應。免疫小鼠的脾細胞在含有10μg/ml重組蛋白或多肽的RPMI-10完全培養基中，以37℃培養3-4天後，收集上清液並分析細胞因子的生成。根據製造商的操作說明，使用匹配的抗體組 (R&D Systems, Inc. MN, USA)以ELISA對小鼠之IL-2、IL-5、IL-13及IFN-γ進行定量。
SARS-CoV-2
病毒感染的中和效價
將Vero細胞接種於96孔盤中（2.4×10
4個細胞/孔），並在含有 5% FBS之M199培養基中於37°C培養24小時以形成單層。抗SARS-CoV-2的小鼠抗血清以M199培養基序列稀釋。每個血清稀釋度都準備一式四份以供實驗四重複。BALB/c小鼠的免疫前血清及抗重組S蛋白的抗血清在56℃下預處理30分鐘，藉以破壞不耐熱的非特異性病毒抑制物質。接著用DMEM培養基將血清稀釋至1/20的起始濃度，將其加入已含有0.2 ml 200 TCID
50SARS-CoV-2病毒的孔中，於37°C培養2 小時。隨後，將病毒-血清混合物接種到Vero細胞單層上並於37°C培養4-6天。在感染後第 4 天記錄每個孔中的病毒誘導的細胞病變效應(cytopathic effects, CPE)。中和效價即正比於防止50%接種感染的血清最高稀釋度。
質體建構
合成編碼小鼠密碼子最佳化的SARS-CoV2-S DNA序列，以限制酶NheI及NotI處理並在人類巨細胞病毒迅早期啟動子 (human cytomegalovirus immediate-early promoter)及牛生長激素之多腺苷酸化訊息片段 (bovine growth hormone polyadenylation signal)的控制下選殖至pVAX1載體中。S蛋白的不同片段（tRBD、tRBDTM、tSARS2-S、tSdTM）亦分別通過PCR擴增並次選殖至pVAX1中。在這些構建體中，S蛋白的天然前導序列以人類組織纖維蛋白溶酶原活化物 (TPA) 前導序列取代，以增強哺乳動物細胞中的分泌蛋白質表現量。
抗
SARS-CoV-2 S
蛋白之小鼠抗血清的免疫原性
為評估DNA疫苗接種的免疫原性，BALB/c小鼠以3週的間隔利用電穿孔 (BTX, ECM830)將pCMV、pSARS-S及pSARS2-S肌內注射兩次。在第一次免疫接種後的第4週及第6週收集血清，以ELISA分別分析血清對重組SARS-CoV2棘蛋白的S1+S2區、RBD區及融合域的反應性。免疫接種pSARS-S及pSARS2-S的小鼠在第4週及第6週的血清中能引起較高的S蛋白特異性及融合域的IgG效價（圖1A及1C）。與pSARS-S及pCMV（載體對照組）相比， 免疫接種pSARS2-S的小鼠表現出更高的RBD特異性IgG效價（圖 1B），然而更重要的是，所產生的抗體是否可以中和SARS-CoV-2感染。為了測量中和抗體效價，將血清與SARS-CoV-2病毒混合，然後感染 Vero 細胞。免疫接種pCMV-SARS2-S後，可以在第4週及第6週產生非常高的中和病毒抗體效價，而pCMV-SARS-S則否（圖2）。
評估S蛋白中的不同片段是否能誘導更高的抗S蛋白免疫反應。如圖3A所示，每個片段在N端加入TPA前導序列以增強蛋白質分泌。將這些質體肌肉注射到小鼠肌肉中，然後使用BTX電穿孔儀ECM830進行電穿孔。數據顯示，各組的血清在第4週可誘導不同程度的抗S蛋白 抗體（圖 3B）。在第4週，完整S蛋白產生較高的抗S蛋白抗體效價。然而pCMV-tRBD免疫血清的抗體效價則是在第6週顯示出最高的抗S蛋白抗體效價（圖 3C）。進一步比較各組的中和抗體效價，以中和試驗分析第4週及第6週的血清。如圖4所示，pCMV-tRBD及pCMV-tSARS2-S在第4週及第6週均能比其他組誘導出更高的中和抗體。這些結果也顯示大部分中和抗體源於棘蛋白的RBD區域。因此RBD可以單獨用作候選疫苗。
為了在臨床上應用電穿孔DNA疫苗接種，使用針灸機提供電轉移源。將pCMV-SARS2-S（100 μg/小鼠）注射到小鼠肌肉中，接著藉由針灸機的兩針陣列施以電脈衝。比較5、10、30秒及5分鐘的電脈衝間隔，以最佳化電轉移條件。數據顯示，來自僅5秒電脈衝間隔免疫接種的小鼠血清在第4週及第6週即具有與其他電脈衝間隔相近的抗S蛋白抗體效價（圖 5）。進一步分析中和抗體效價，比較了第4週及第6週的血清。在第4週，各電脈衝間隔產生的中和抗體效價相近，然而30秒的電脈衝間隔仍顯示出最高的中和抗體效價（圖 6）。因此，在特定條件下，傳統針灸機的電脈衝可以提高DNA疫苗接種的效果。
使用不同電壓免疫接種
pSARS2-S
後，對
SARS-CoV-2
感染的抗體反應及中和活性
用100 μg pSARS2-S或pCMV對Balb/c小鼠進行兩次肌內免疫接種，然後以指定電壓藉由針灸機施以電脈衝，兩次接種的間隔為3週。在第一次免疫接種後第6週收集血清樣品，以ELISA及TCID
50評估抗S蛋白的抗體效價及抗SARS-CoV2-S的中和抗體（圖7A-7B）。
倉鼠免疫
接種
pSARS2-S
後，對
SARS-CoV-2
感染的抗體反應及中和活性
為探索pSARS2-S疫苗接種的保護功效，敘利亞倉鼠在第0週及第 3週鼻內接種pSARS2-S。免疫接種後，收集第6週血清用於抗S蛋白抗體及中和抗體效價分析（圖 8A-8B）。
使用電針灸機接種pSARS2-S對倉鼠的保護作用
為探索pSARS2-S疫苗接種的保護功效，敘利亞倉鼠在第0週及第3週鼻內接種pSARS2-S。在SARS-CoV-2攻擊後，每天監測倉鼠體重。這些結果顯示，pSARS2-S免疫接種可保護敘利亞倉鼠免受SARS-CoV-2感染（圖 9A-9E）。
本發明提供了一種利用電穿孔(EP)的S蛋白基因之DNA疫苗。SARS-CoV及SARS-CoV-2的S蛋白基因針對哺乳動物細胞表現進行密碼子最佳化，並選殖至哺乳動物細胞表現載體中，分別稱為 pSARS-S及pSARS2-S。在293T細胞中暫時性表現後，藉由免疫印跡證實了S蛋白的表現。免疫接種後，收集血液用於抗原特異性抗體及中和抗體效價分析。免疫接種pSARS-S及pSARS2-S均誘導了相似程度的對SARS-CoV-2的S2的抗體。相較之下，只有免疫接種pSARS2-S誘導了針對SARS-CoV-2受體結合域 (RBD)的抗體，而 pSARS-S則無。免疫接種pSARS2-S可誘導非常高效價的SARS-CoV-2中和抗體，但pSARS-S則否。分析SARS-CoV-2 S蛋白特異性T細胞反應，其免疫反應偏向於Th1。這些數據顯示DNA疫苗接種是COVID-19的良好候選手段之一。
無
圖 1 小鼠經 pSARS -S 及 pSARS2-S 免疫接種後的抗體反應。每組Balb/c小鼠以3週的間隔用100μg的pSARS-S、pSARS2-S或pCMV肌肉注射兩次。在初次免疫接種後第4週及第6週採集血清樣本。以ELISA評估針對SARS-CoV2-S、RBD及融合域的抗體。
圖 2 免疫接種 pSARS -S 及 pSARS2-S 後對 SARS-CoV-2 感染的中和活性。以3週的間隔，用100 μg的pSARS-S、pSARS2-S或pCMV對每組Balb/c小鼠進行兩次肌內免疫接種。在初次免疫接種後第4週及第6週採集血清樣本。藉由中和試驗評估疫苗所誘導針對SARS-CoV-2的中和活性。
圖 3 小鼠經不同 SARS-CoV2 Spike 片段免疫接種後的抗體反應。(A) 除pCMV-mIL-21外，每個S蛋白的DNA片段在其N端融合了源自組織纖維蛋白溶酶原活化物 (tissue plasminogen activator, TPA)的前導序列。每組Balb/c小鼠以3週的間隔用100 μg的pCMV、pCMV-tRBD、pCMV-tRBDTM、pCMV-tSARS2-S、pCMV-tSdTM或pCMV-tSdTM+mIL21肌肉注射兩次。在初次免疫接種後 第4週(B) 及 第6週(C) 採集血清樣本，並以ELISA評估針對SARS-CoV2-S的抗體。
圖 4 免疫接種 SARS-CoV2 Spike 片段後對 SARS-CoV-2 感染的中和活性。以3週的間隔，用100 μg的pCMV、pCMV-tRBD、pCMV-tRBDTM、pCMV-tSARS2-S、pCMV-tSdTM或pCMV-tSdTM+mIL21對每組Balb/c小鼠進行兩次肌內免疫接種。在初次免疫接種後第4週及第6週採集血清樣本。藉由中和試驗評估疫苗所誘導針對SARS-CoV-2的中和活性。
圖 5 使用針灸機免疫接種 pSARS2-S 後的抗體反應。每組Balb/c小鼠以3週的間隔，用100μg的pSARS2-S或pCMV肌肉注射兩次再用針灸機施以電脈衝（電壓：40伏特，頻率：120赫茲）。在初次免疫接種後第4週及第6週採集血清樣本。以ELISA評估針對SARS-CoV2-S的抗體。
圖 6 使用針灸機以不同時間長度免疫接種 pSARS2-S 後對 SARS-CoV-2 感染的中和活性。每組Balb/c小鼠以3週的間隔，用100 μg的pSARS2-S或pCMV肌肉注射兩次再用針灸機施以電脈衝（電壓：40伏特，頻率：120赫茲）。在初次免疫接種後第4週及第6週採集血清樣本。藉由TCID50評估疫苗所誘導針對SARS-CoV-2的中和活性。
圖 7 使用針灸機以不同電壓免疫接種 pSARS2-S 後對 SARS-CoV-2 感染的抗體反應及中和活性。每組Balb/c小鼠以3週的間隔，用100 μg的pSARS2-S或pCMV肌肉注射兩次再用針灸機以指定電壓施以電脈衝。在初次免疫接種後第6週採集血清樣本。藉由ELISA及TCID50評估抗-S-抗體效價及針對SARS-CoV-2的中和抗體。
圖 8 倉鼠免疫接種 pSARS2-S 後對 SARS-CoV-2 感染的抗體反應及中和活性。為探討pSARS2-S疫苗接種的保護功效，敘利亞倉鼠在第0週及第3周鼻內接種pSARS2-S，並在第6週鼻內採集血清用於抗-S-抗體及中和抗體效價分析。
圖 9 使用電針灸機接種 pSARS2-S 對倉鼠 的保護作用。為了探索pSARS2-S疫苗接種的保護功效，敘利亞倉鼠在第0週及第 3 週鼻內接種 pSARS2-S。用SARS-CoV-2攻擊後，每天監測倉鼠體重。這些結果顯示pSARS2-S免疫接種可保護敘利亞倉鼠免受SARS-CoV-2感染。
無
Claims (18)
- 一種提供方波電脈衝的電子裝置，藉由一電探針促進核酸遞送到細胞內；其中該核酸包含編碼蛋白質的基因，並且該基因之密碼子針對哺乳動物細胞表現進行了最佳化。
- 如請求項1所述之電子裝置，其中該電探針可為針或一導電材料。
- 如請求項1所述之電子裝置，其提供之電力輸出電壓為5-75伏特，頻率為20-120赫茲，刺激時間為50毫秒至5分鐘。
- 如請求項1所述之電子裝置，其中該核酸可為RNA或DNA。
- 如請求項1所述之電子裝置，其中該編碼基因的N端包含一分泌前導序列(secreting leader sequence)及一KoZak序列，其中該分泌前導序列可為天然基因序列或選自其他蛋白質基因。
- 如請求項5所述之電子裝置，其中該分泌前導序列源自組織纖溶酶原活化物(Tissue plasminogen activator,TPA)、人類Igκ、人類IgE、CD5及CD33。
- 如請求項4所述之電子裝置，其中該RNA或DNA以皮內(intradermally)或肌內(intramuscularly)注射，再施以來自該電子裝置的一電脈衝。
- 如請求項1所述之電子裝置，其中該核酸編碼一源自病原體或腫瘤抗原之蛋白質。
- 如請求項8所述之電子裝置，其中該病原體為SARS-CoV-2。
- 一種增強核酸遞送到細胞中之方法，包含：藉由一電探針提供一方波電脈衝，其中該核酸包含編碼蛋白質的基因，並且該基因之密碼子針對哺乳動物細胞表現進行了最佳化。
- 如請求項10所述之方法，其中該電探針可為針或一導電材料。
- 如請求項10所述之方法，其提供之電力輸出電壓為5-75福特，頻率為20-120赫茲，間隔為50毫秒至5分鐘。
- 如請求項10所述之方法，其中該核酸可為RNA或DNA。
- 如請求項10所述之方法，其中該編碼基因的N端包含一分泌前導序列(secreting leader sequence)及一KoZak序列，其中該分泌前導序列可為天然基因序列或選自其他蛋白質基因。
- 如請求項14所述之方法，其中該分泌前導序列源自組織纖溶酶原活化物(Tissue plasminogen activator,TPA)、人類Igκ、人類IgE、CD5及CD33。
- 如請求項13所述之方法，其中該RNA或DNA以皮內(intradermally)或肌內(intramuscularly)注射，再施以來自如請求項1所述之電子裝置的一電脈衝。
- 如請求項10所述之方法，其中該核酸編碼一源自病原體或腫瘤抗原之蛋白質。
- 如請求項17所述之方法，其中該病原體為SARS-CoV-2。
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