TWI799205B - 抗-腫瘤抗原奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種抗-腫瘤抗原奈米抗體，其與一人類白血球抗原-G專一性結合。本發明亦提供該抗-腫瘤抗原奈米抗體的核酸編碼序列、該抗-腫瘤抗原奈米抗體用於治療癌症及免疫相關疾病的用途，及用於檢測HLA-G表現量的方法。

Description

抗-腫瘤抗原奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用
本發明是有關於一種抗-腫瘤抗原奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用。
癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續多年居十大死因之榜首。
常規的腫瘤治療方法包括手術治療、放射線治療、化學治療及標靶治療等。腫瘤免疫治療為上述治療方法以外的另一種治療腫瘤的方法，是透過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫及體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散及復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。然而，目前的腫瘤治療方法仍存在效果不彰及副作用強烈的問題，甚至會衍生出其他免疫相關疾病。
人類白血球抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)已被發現高度表現於多種實體腫瘤上，且有抑制免疫細胞的特性。因此，已有研究人員致力於研發以HLA-G作為辨識腫瘤的標靶分子並找出這些標靶分子是否具有成為抗癌藥物的潛力。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎且更有效治療癌症及免疫相關疾病的醫藥品以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種抗-腫瘤抗原奈米抗體，其與一人類白血球抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)專一性結合，該抗-腫瘤抗原奈米抗體包含一選自於下列所組成的群組中的胺基酸序列：序列識別號：1、序列識別號：2、序列識別號：3，及其任意組合。
在本發明的一實施例中，該胺基酸序列是該抗-腫瘤抗原奈米抗體的一重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)的胺基酸序列。
在本發明的一實施例中，該抗-腫瘤抗原奈米抗體與一可結晶片段區域(fragment crystallizable region, Fc region)綴合。
在本發明的一實施例中，該抗-腫瘤抗原奈米抗體與一第二抗體綴合以形成雙特異性T細胞連接(bispecific T-cell engager, BiTE)、三特異性T-細胞連接(triple specific T-cell engager, TriTE)、雙特異性殺手細胞連接(bispecific killer cell enager, BiKE)、三特異性殺手細胞連接(triple specific killer cell engager, TriKE)，或任一雙特異性抗體。
在本發明的一實施例中，該抗-腫瘤抗原奈米抗體阻斷該HLA-G與該HLA-G的一受體的交互作用及/或結合。
在本發明的一實施例中，該受體是殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4, KIR2DL4)或白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1, LILRB1)。
本發明之另一目的為提供一種經分離的核酸，其編碼一如前所述的抗-腫瘤抗原奈米抗體之胺基酸序列，該經分離的核酸包含一選自於下列所組成的群組中的核苷酸序列：序列識別號：4、序列識別號：5、序列識別號：6，及其任意組合。
本發明之另一目的為提供一種醫藥組成物，包含一如前所述的抗-腫瘤抗原奈米抗體及一醫藥學上可接受的載劑。
本發明之另一目的為提供一種如前所述的抗-腫瘤抗原奈米抗體用於製備一治療癌症及免疫相關疾病之醫藥品的用途。
本發明之另一目的為提供一種用於檢測HLA-G表現量的方法，包含對一待測樣品投予一如前所述的抗-腫瘤抗原奈米抗體。
在本發明的一實施例中，該待測樣品是血液、尿液、痰液、唾液或體液。
綜上所述，本發明抗-腫瘤抗原奈米抗體的功效在於：藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive enzyme linked immunosorbent assay, competitive ELISA)證明抗-HLA-G奈米抗體在IC50的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其受體:殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4, KIR2DL4)及白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1, LILRB1)之間的交互作用、增強自然殺手細胞(natural killer cell, NK cell)對人類乳癌細胞株MDA-MB-231的細胞溶解(cytolysis)作用及細胞毒性、藉由西方墨點分析(Western blotting)證明抗-HLA-G奈米抗體可以識別人類癌細胞株MDA-MB-231及A549細胞的細胞溶解產物中的HLA-G蛋白質、流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)、藉由免疫細胞化學分析證明抗-HLA-G奈米抗體可以識別細胞膜上的HLA-G蛋白質、HLA-G的表現與質膜標誌Pan-鈣黏素(Pan-Cadherin)共定位於MDA-MB-231及A549細胞上，及藉由免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)證明抗-HLA-G抗體可用以偵測HLA-G的表現，藉此達到治療癌症及免疫相關疾病的效用。特別地，相較於習知的抗體必須藉由載體將基因轉染至細胞中表現抗體功能而有低產量及效果不彰的缺點，本發明抗-腫瘤抗原奈米抗體可在體外大規模製備後直接投藥至需要的個體內進行治療。另外，本發明也可達到檢測HLA-G表現量的效用。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在
Figure 02_image007
20%的範圍內，較佳為在
Figure 02_image007
10%的範圍內，最佳為在
Figure 02_image007
5%的範圍內。
如本文中所使用的，用語“抗-人類白血球抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)奈米抗體(nanobody, NB)”與“抗-腫瘤抗原奈米抗體”可交換使用。
如本文中所使用的，用語“第二抗體”意指可與奈米抗體綴合以形成雙特異性T細胞連接(bispecific T-cell engager, BiTE)、三特異性T-細胞連接(triple specific T-cell engager, TriTE)、雙特異性殺手細胞連接(bispecific killer cell enager, BiKE)、三特異性殺手細胞連接(triple specific killer cell engager, TriKE)，或任一雙特異性抗體的抗體。較佳地，第二抗體可包括，但不限於：抗CD3
Figure 02_image009
、CD3、程序性細胞死亡配體1 (programmed cell death ligand 1, PD-L1)、程序性細胞死亡配體2 (programmed cell death ligand 2, PD-L2)、T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, Tim3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、EGFRvIII、人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2, Her2)、B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen, BCMA)、CD19、CD20、CD34、CD16、Fc、上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、間皮素(mesothelin)、紐約食道鱗狀上皮細胞癌-1 (New York esophageal squamous cell carcinoma-1, NY-ESO-1)、糖蛋白100 (glycoprotein 100, gp100)及黏蛋白1 (Muc1)抗體。
如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
依據本發明的醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明的該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。
如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核酸片段”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。 實施例 1. 抗 -HLA-G 奈米抗體的製備
在本實施例中，抗-人類白血球抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)奈米抗體(nanobody, NB)的製備流程如下。關於重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)的生產流程如下。VHH基因建構於表現載體pET22b (Amp抗性)或pSB-init (CmR抗性)中；質體經限制性內切酶消化及定序驗證鑑定。將 1
Figure 02_image001
L經鑑定的質體(約50 ng)加入BL21(DE3)中，37°C作用過夜。用單菌落接種含有抗性的LB培養基，並在37°C、220 r/min下培育培養物過夜。隔夜培養物以1:100的比例接種於含抗性的新鮮LB培養基(10L-20L)中，並於37°C、220r/min培養。當OD 600達至0.8時，冷卻至室溫。加入最終濃度為0.1 mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，20°C、220 r/min誘導過夜。藉由離心(20 mM Tris pH8.0、150 mM NaCl)在細胞破裂後獲取細胞及上清液。上清液藉由流通(flow-through)與 Ni-NTA珠粒(1mL)結合。用含有合適梯度咪唑(imidazole)(10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、250 mM及500 mM）的緩衝液清洗並洗脫Ni-NTA珠粒。用SDS-PAGE分析洗脫部分，根據蛋白質的純度及產量(離子交換層析或凝膠過濾層析)確定後續的純化方案。符合要求的蛋白質藉由凝膠過濾層析分離純化，緩衝液更換為PBS緩衝液。用SDS-PAGE分析蛋白質組分，將符合要求的組分合併濃縮，用0.22
Figure 02_image001
m濾膜過濾、分裝。之後，將蛋白質儲存於-20°C或更低溫度。
關於奈米抗體是生產及純化自大腸桿菌( E. coli)。為了生產奈米抗體形式的大腸桿菌，參考文獻Microb Cell Fact. 2019 Mar 11;18(1):47來進行。簡言之，使用大腸桿菌菌株HB2151。編碼胺苄青黴素(ampicillin)抗性的質體pET (Creative Biolab)被用於細胞質蛋白生產。用pET-HLA-G或HLA-G多專一性奈米抗體質體新轉化的大腸桿菌HB2151被接種在5 mL含有50
Figure 02_image001
g/mL胺苄青黴素的培養基中，並在37°C培養過夜。之後，將 1 mL這種預培養物接種到100 mL培養基中並在37°C下生長。過夜培養後，每100 mL培養物中加入兩片EnPresso加強片及額外劑量的葡萄糖釋放酶(0.6 U/L)。同時，藉由加入1mM IPTG持續24小時誘導重組奈米抗體蛋白質表現。然後收集培養物並在冰上冷卻5分鐘，然後在6,000 × g及4°C下離心15 分鐘。去除上清液後，細胞沉澱物藉由高容量Myc-tag結合樹脂使用固定化金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)進行純化。根據製造商操作流程(Clontech Laboratories)在天然條件下進行基於重力流的層析(gravity-flow-based chromatography)。藉由向每個200 mg細菌細胞沉澱物添加1 mL xTractor細胞裂解緩衝液(Clontech Laboratories)，並輔以不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics)及25 U核酸內切酶(Thermo Scientific Pierce)，可實現有效的細胞裂解。在冰上作用15分鐘、10,000 × g及4°C離心20分鐘以去除細胞碎片後，將澄清的上清液加到含有1 mL預裝樹脂的重力流管柱上，並在室溫下作用30分鐘。在藉由添加含有300 mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫奈米抗體之前，用20及40 mM的咪唑濃度清洗管柱兩次。使用截留分子量為3.5-5 kDa的纖維素酯膜(cellulose ester membrane)(Spectrum ®Laboratories)藉由對PBS進行透析來去除咪唑及更換緩衝液。
關於抗-HLA-G奈米抗體各選植株的互補決定區(complementarity determining region, CDR)的排列(alignment)及胺基酸序列顯示於表1。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9的胺基酸序列為序列識別號：1；抗-HLA-G奈米抗體選殖株#20的胺基酸序列為序列識別號：2；抗-HLA-G奈米抗體選殖株#33的胺基酸序列為序列識別號：3；編碼抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9的胺基酸序列之核苷酸序列為序列識別號：4；編碼抗-HLA-G奈米抗體選殖株#20的胺基酸序列之核苷酸序列為序列識別號：5；編碼抗-HLA-G奈米抗體選殖株#33的胺基酸序列之核苷酸序列為序列識別號：6。 表1
選殖株 CDR1 CDR2 CDR3
#9 GRTYSSNC IYTGGDGI AADPNRRRMGVGGSC
#20 GFTVDDSD ITSGGGK VAPAWTGYGCT
#33 AYTFSASG AATYTRSAKT AVARCAGRPDRSTLTSFAW
實施例 2. 藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法 (competitive enzyme linked immunosorbent assay, competitive ELISA) 測定 抗 -HLA-G 奈米抗體 的 HLA-G/ 殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個 Ig 域及長胞質尾 4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4, KIR2DL4) 或白血球免疫球蛋白樣受體子族 B 成員 1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1, LILRB1) 軸阻斷 (axis blockade)
在本實施例中，藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive enzyme linked immunosorbent assay, competitive ELISA)測定抗-HLA-G奈米抗體的HLA-G/殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4, KIR2DL4)軸阻斷之操作流程如下。首先，將HLA-G重組蛋白(CAT#：TP305216, Origene)(0.2
Figure 02_image001
g/ml，每孔100
Figure 02_image001
l)在96孔盤上於4
Figure 02_image011
塗覆過夜。隔天，移除塗覆緩衝液，在室溫下用3%脫脂牛奶封阻2小時。接著，用PBST (0.05% Tween溶於PBS中)清洗5次。添加不同濃度的抗-HLA-G奈米抗體(選殖株#9、#20或 #33)或商用抗-HLA-G單株抗體(87G)於4
Figure 02_image011
過夜。清洗5次後，於室溫加入生物素化的KIR2DL4 (biotinylated KIR2DL4)(Sino Biological, Cat: 13052-H02S)(0.2 mg/ml，每孔100
Figure 02_image001
l) 2小時。清洗9次後，每孔與100
Figure 02_image001
l 含有鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化酶綴合物(streptavidin-HRP conjugates)(ThermoFisher, CatNo: N100，稀釋滴度：5000:1)的PBST在室溫下作用2小時。以PBST清洗9次後，加入50
Figure 02_image001
l的TMB受質(用於偵測HRP活性)(ThermoFisher, Cat No:N301)。之後，添加50
Figure 02_image001
l的終止溶液(ThermoFisher, Cat No:N600)來終止反應，然後使用450 nm波長的ELISA讀取儀進行測量。將商用抗-HLA-G單株抗體(87G)的最高濃度設置為100%阻斷KIR2DL4/HLA-G交互作用以計算其他反應。
另外，藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive ELISA)測定抗-HLA-G奈米抗體的HLA-G/白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1, LILRB1)軸阻斷之操作流程大體上是相同於上述，不同之處在於：將生物素化的KIR2DL4替換成生物素化的LILRB1 (Sino Biological, Cat: 16014-H08H)，及將商用抗-HLA-G單株抗體(87G)的最高濃度設置為100%阻斷LILRB1/HLA-G交互作用以計算其他反應。
本實施例的結果顯示於圖1A至圖1H，其中LILRB1表示白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1)；KIR2DL4表示殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4)；nb表示奈米抗體(nanobody)；87G表示商用抗-HLA-G單株抗體。本實施例的結果證實，商用抗-HLA-G單株抗體(87G)在41.4 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其受體之一KIR2DL4之間的交互作用。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9在6.14 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其受體之一KIR2DL4之間的交互作用，阻斷活性以87G正規化。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#20在814 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其受體之一KIR2DL4之間的交互作用，阻斷活性以87G正規化。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#33在53.3 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其受體之一KIR2DL4之間的交互作用，阻斷活性以87G正規化。商用抗-HLA-G單株抗體(87G)在100.9 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其另一受體之一LILRB1之間的交互作用。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9在0.825 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其另一受體之一LILRB1之間的交互作用，阻斷活性以87G正規化。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#20在0.174 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其另一受體之一LILRB1之間的交互作用，阻斷活性以87G正規化。抗-HLA-G奈米抗體選殖株#33在0.074 ng/ml (IC50)的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其另一受體之一LILRB1之間的交互作用，阻斷活性以87G正規化。 實施例 3. 抗 -HLA-G 奈米抗體在 增強自然殺手細胞 (natural killer cell, NK cell) 對人類乳癌細胞株 MDA-MB-231 的細胞溶解 (cytolysis) 作用的效用評估
在本實施例中，抗-HLA-G奈米抗體在增強自然殺手細胞(natural killer cell, NK cell)對人類乳癌細胞株MDA-MB-231 (購自美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC))的細胞溶解(cytolysis)作用的效用評估之實驗流程如下。將1
Figure 02_image003
10 5的MDA-MB-231細胞接種至12-孔盤上過夜。隔天，將5
Figure 02_image003
10 5的初代自然殺手細胞添加至含有MDA-MB-231細胞的孔中。接著，添加1
Figure 02_image001
g/ml抗-HLA-G奈米抗體(選殖株#9、#20或 #33)或10
Figure 02_image001
g/ml商用抗-HLA-G單株抗體(87G) (87G, ThermoFisher, Cat No: 14-9957-82)。48 小時後，初代自然殺手細胞對MDA-MB-231細胞的專一性溶解藉由使用流式細胞術分析的活死細胞介導的細胞毒性測定來確定。
抗-HLA-G奈米抗體增強自然殺手細胞對人類乳癌細胞株MDA-MB-231的細胞溶解作用的結果顯示於圖2。本實施例的結果證實，抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9、#20及#33增強自然殺手細胞誘導的對腫瘤細胞(MDA-MB-231)的細胞毒性。 實施例 4. 抗 -HLA-G 奈米抗體的西方墨點分析 (Western blotting) 結果
在本實施例中，抗-HLA-G奈米抗體的西方墨點分析(Western blotting)的操作流程如下。在含有蛋白酶抑制劑混合物的PRO-PREP蛋白質萃取溶液(iNtRON，台北，台灣)中獲取細胞，並在4°C下劇烈振盪15分鐘，然後離心。收集上清液，然後使用Bio-Rad BCA試劑(Bio-Rad Hercules，CA，USA)測定蛋白質濃度。將30 μg的每個樣品裂解物在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，然後電印跡到PVDF膜上。在TBST封阻中加入5% BSA後，將膜與初級抗體(溶於TBST中)在4°C下作用過夜。接著，清洗4次並以辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)-綴合的山羊-抗小鼠或兔子IgG (Upstate, Billerica, MA, USA)作用兩小時。以TBST清洗4次後，印跡與SuperSignal West Pico ECL試劑(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)一起作用1分鐘，然後藉由暴露於Kodak-X-Omat膠片來檢測化學發光。
抗-HLA-G奈米抗體的西方墨點分析結果顯示於圖3A及圖3B，其中圖3A使用細胞株為人類乳癌細胞株MDA-MB-231，商用抗體(commercial antibody)為HLA-G (E8N9C) XP ®Rabbit mAb#79769，上排數字表示MDA-MB-231細胞株的細胞溶解產物(cell lysate)的量(
Figure 02_image001
g)，初級抗體(primary antibody)的濃度為1 ng/ml，商用抗體組的二級抗體為抗-兔子-辣根過氧化酶(anti-rabbit-horseradish peroxidase, anti-Rab-HRP)(1:1000)，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)奈米抗體(1 ng/ml)，實驗組(#9、#20)的二級抗體為抗-VHH-HRP (1:1000)。
圖3B使用細胞株為人類非小細胞肺癌細胞株A549 (購自美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC))，商用抗體為HLA-G (E8N9C) XP ®Rabbit mAb#79769，上排數字表示A549細胞株的細胞溶解產物的量(
Figure 02_image001
g)，初級抗體的濃度為1 ng/ml，商用抗體組的二級抗體為抗-兔子-辣根過氧化酶(1:1000)，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(VHH)奈米抗體(1 ng/ml)，實驗組(#9、#20)的二級抗體為抗-VHH-HRP (1:1000)。本實施例的結果顯示，藉由西方墨點分析，抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9及#20可以識別人類癌細胞株MDA-MB-231及A549細胞的細胞溶解產物中的HLA-G蛋白質。 實施例 5. 抗 -HLA-G 奈米抗體的 流動式細胞測量分析 (flow cytometric analysis) 結果
在本實施例中，抗-HLA-G奈米抗體的流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)的操作流程如下。首先，將HLA-G重組蛋白(CAT#：TP305216, Origene)(0.2
Figure 02_image001
g/ml，每孔100
Figure 02_image001
l)在96孔盤上於4
Figure 02_image011
塗覆過夜。隔天，移除塗覆緩衝液，在室溫下用3%脫脂牛奶封阻2小時。接著，用PBST (0.05% Tween溶於PBS中)清洗5次。添加不同濃度的抗-HLA-G奈米抗體(選殖株#9、#20或 #33)或商用抗-HLA-G單株抗體(87G)於4
Figure 02_image011
過夜。清洗5次後，於室溫加入生物素化的KIR2DL4 (biotinylated KIR2DL4)(Sino Biological, Cat: 13052-H02S)(0.2 mg/ml，每孔100
Figure 02_image001
l) 2小時。清洗9次後，每孔與100
Figure 02_image001
l 含有鏈黴抗生物素蛋白-辣根過氧化酶綴合物(streptavidin-HRP conjugates)(ThermoFisher, CatNo: N100，稀釋滴度：5000:1)的PBST在室溫下作用2小時。以PBST清洗9次後，加入50
Figure 02_image001
l的TMB受質(用於偵測HRP活性)(ThermoFisher, Cat No:N301)。之後，添加50
Figure 02_image001
l的終止溶液(ThermoFisher, Cat No:N600)來終止反應，然後使用450 nm波長的ELISA讀取儀進行測量。將商用抗-HLA-G單株抗體(87G)的最高濃度設置為100%阻斷KIR2DL4/HLA-G交互作用以計算其他反應。
抗-HLA-G奈米抗體的流動式細胞測量分析結果顯示於圖4，其中人類乳癌細胞株MDA-MB-231及人類非小細胞肺癌細胞株A549的量為1
Figure 02_image003
10 6，商用抗體(commercial Ab)為PE (#12-9957-42)(它是一種抗-HLA-G單株抗體，0.25
Figure 02_image001
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)及商用單株抗體87G，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(VHH)奈米抗體(0.25
Figure 02_image001
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)，二級抗體為兔子抗-駱駝VHH, iFluor555 (rabbit anti-camelid VHH, iFluor555)(0.5
Figure 02_image005
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)，MFI表示平均螢光強度(mean fluorescence intensity)，unstained表示未染色，clone表示選殖株。 實施例 6. 抗 -HLA-G 奈米抗體的 免疫細胞化學 (immunocytochemistry) 分析結果
在本實施例中，抗-HLA-G奈米抗體的免疫細胞化學(immunocytochemistry)分析的操作流程如下。將腫瘤細胞(1 x 10 5)接種在6孔盤的蓋玻片上，培育過夜。在指定的處理後，將細胞固定在1%多聚甲醛(paraformaldehyde)中，用PBS清洗，在含有0.5% BSA的PBS中使用0.1% Triton X-100透化 30 分鐘，用2% BSA封阻，並與專一性抗體(配於2% BSA/含有0.05% Tween-20的PBS (PBST)中)一起作用。在清洗之後，將細胞與螢光素綴合的二級抗體一起作用，用PBST清洗，並使用含有抗褪色劑及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)的水性封固劑封固。在Leica TCS SP8 X共焦顯微鏡(Leica)下分析影像。
抗-HLA-G奈米抗體的免疫細胞化學分析結果顯示於圖5A及5B，其中圖5A使用細胞株為人類乳癌細胞株MDA-MB-231，圖5B使用細胞株為人類非小細胞肺癌細胞株A549，商用抗體4H84是一種抗-HLA-G單株抗體，抗-HLA-G奈米抗體的濃度為1 ng/ml，二級抗體為抗-VHH-螢光素(fluorescein, FITC)(1:5000)。由圖5A及5B可見，藉由免疫細胞化學分析，抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9及#20可以識別細胞膜上的HLA-G蛋白質，使用抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9及#20、商用抗體4H84及商用Pan-鈣黏素(Pan-Cadherin)抗體，HLA-G的表現與質膜標誌Pan-鈣黏素(Pan-Cadherin)共定位於MDA-MB-231及A549細胞上。 實施例 7. 抗 -HLA-G 奈米抗體的 免疫組織化學染色 (immunohistochemistry staining, IHC staining) 結果
在本實施例中，抗-HLA-G奈米抗體的免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)的操作流程如下。人類胎盤樣品被固定在10%的甲醛中並包埋在石蠟中。切片(厚度 = 3
Figure 02_image001
m)使用蘇木精及伊紅染色。對於免疫組織化學，抗原回復(antigen retrieval)藉由在99
Figure 02_image011
微波進行。切片用H 2O 2清洗及作用20分鐘以阻斷內源性過氧化酶，然後在5% BSA中浸泡30分鐘。然後將切片與初級抗體在4°C下作用過夜。在清洗之後，將切片以稀釋的生物素-綴合的二級抗體在室溫下作用2小時或在4°C下作用過夜。最後，切片在室溫下與聚合物一起作用10 分鐘然後二胺基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB) (是辣根過氧化酶最敏感、最常用的顯色反應物)染色，用蘇木精及伊紅染色，並使用中性橡膠固定。染色的定量藉由光學顯微鏡(Nikon，日本)以40倍及400倍放大率獨立進行。
抗-HLA-G奈米抗體的免疫組織化學染色結果顯示於圖6，其中所用樣品為人類胎盤，商用抗體為4H84 (它是一種抗-HLA-G單株抗體)(#sc-21799)，濃度200
Figure 02_image001
g/ml，作用濃度4
Figure 02_image001
g/ml，商用抗體組的二級抗體為山羊抗-兔子HRP，DAB表示二胺基聯苯胺(diaminobenzidine)(是辣根過氧化酶最敏感、最常用的顯色反應物)，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(VHH)奈米抗體(作用濃度4
Figure 02_image001
g/ml)，實驗組(#9)的抗體包括兔子抗-駱駝VHH抗體(rabbit anti-camelid VHH antibody)、生物素(biotin)(0.5
Figure 02_image005
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)及山羊抗-兔子HRP。本實施例的結果證實，抗-腫瘤抗原奈米抗體(即抗-HLA-G抗體)可藉由免疫組織化學染色用以偵測HLA-G的表現。
綜上所述，本發明抗-腫瘤抗原奈米抗體(即抗-HLA-G抗體) 藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive enzyme linked immunosorbent assay, competitive ELISA)證明抗-HLA-G奈米抗體在IC50的50%阻斷活性內阻斷HLA-G與其受體:殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4, KIR2DL4)及白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1, LILRB1)之間的交互作用、增強自然殺手細胞(natural killer cell, NK cell)對人類乳癌細胞株MDA-MB-231的細胞溶解(cytolysis)作用及細胞毒性、藉由西方墨點分析(Western blotting)證明抗-HLA-G奈米抗體可以識別人類癌細胞株MDA-MB-231及A549細胞的細胞溶解產物中的HLA-G蛋白質、流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)、藉由免疫細胞化學分析證明抗-HLA-G奈米抗體可以識別細胞膜上的HLA-G蛋白質、HLA-G的表現與質膜標誌Pan-鈣黏素(Pan-Cadherin)共定位於MDA-MB-231及A549細胞上，及藉由免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)證明抗-HLA-G抗體可用以偵測HLA-G的表現，藉此達到治療癌症及免疫相關疾病的效用。特別地，相較於習知的抗體必須藉由載體將基因轉染至細胞中表現抗體功能而有低產量及效果不彰的缺點，本發明抗-腫瘤抗原奈米抗體可在體外大規模製備後直接投藥至需要的個體內進行治療。另外，本發明也可達到檢測HLA-G表現量的效用。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1A至圖1H顯示藉由競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive enzyme linked immunosorbent assay, competitive ELISA)測定抗-HLA-G奈米抗體的HLA-G/殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4, KIR2DL4)或白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1, LILRB1)軸阻斷，其中LILRB1表示白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1)；KIR2DL4表示殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4 (killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 4)；nb表示奈米抗體(nanobody)；87G表示商用抗-HLA-G單株抗體。 圖2是一數據圖，顯示抗-HLA-G奈米抗體增強自然殺手細胞(natural killer cell, NK cell)對人類乳癌細胞株MDA-MB-231的細胞溶解(cytolysis)作用，其中HLA-G mAB (87G)表示商用抗-HLA-G單株抗體(87G)。 圖3A顯示抗-HLA-G奈米抗體的西方墨點分析結果，使用細胞株為人類乳癌細胞株MDA-MB-231，商用抗體(commercial antibody)為HLA-G (E8N9C) XP ®Rabbit mAb#79769，上排數字表示MDA-MB-231細胞株的細胞溶解產物(cell lysate)的量(
Figure 02_image001
g)，初級抗體(primary antibody)的濃度為1 ng/ml，商用抗體組的二級抗體為抗-兔子-辣根過氧化酶(anti-rabbit-horseradish peroxidase, anti-Rab-HRP)(1:1000)，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)奈米抗體(1 ng/ml)，實驗組(#9、#20)的二級抗體為抗-VHH-HRP (1:1000)。 圖3B顯示抗-HLA-G奈米抗體的西方墨點分析結果，使用細胞株為人類非小細胞肺癌細胞株A549，商用抗體為HLA-G (E8N9C) XP ®Rabbit mAb#79769，上排數字表示A549細胞株的細胞溶解產物的量(
Figure 02_image001
g)，初級抗體的濃度為1 ng/ml，商用抗體組的二級抗體為抗-兔子-辣根過氧化酶(1:1000)，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(VHH)奈米抗體(1 ng/ml)，實驗組(#9、#20)的二級抗體為抗-VHH-HRP (1:1000)。 圖4顯示抗-HLA-G奈米抗體的流動式細胞測量分析結果，其中人類乳癌細胞株MDA-MB-231及人類非小細胞肺癌細胞株A549的量為1
Figure 02_image003
10 6，商用抗體(commercial Ab)為PE (#12-9957-42)(它是一種抗-HLA-G單株抗體，0.25
Figure 02_image001
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)及87G，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(VHH)奈米抗體(0.25
Figure 02_image001
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)，二級抗體為兔子抗-駱駝VHH, iFluor555 (rabbit anti-camelid VHH, iFluor555)(0.5
Figure 02_image005
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)，MFI表示平均螢光強度(mean fluorescence intensity)，unstained表示未染色，clone表示選殖株。 圖5A及5B顯示抗-HLA-G奈米抗體的免疫細胞化學分析，其中圖5A使用細胞株為人類乳癌細胞株MDA-MB-231，圖5B使用細胞株為人類非小細胞肺癌細胞株A549，商用抗體4H84是一種抗-HLA-G單株抗體，抗-HLA-G奈米抗體的濃度為1 ng/ml，二級抗體為抗-VHH-螢光素(fluorescein, FITC)(1:5000)。 圖6顯示抗-HLA-G奈米抗體的免疫組織化學染色結果，其中所用樣品為人類胎盤，商用抗體為4H84 (它是一種抗-HLA-G單株抗體)(#sc-21799)，濃度200
Figure 02_image001
g/ml，作用濃度4
Figure 02_image001
g/ml，商用抗體組的二級抗體為山羊抗-兔子HRP，DAB表示二胺基聯苯胺(diaminobenzidine)(是辣根過氧化酶最敏感、最常用的顯色反應物)，抗-HLA-G奈米抗體為重鏈可變域(VHH)奈米抗體(作用濃度4
Figure 02_image001
g/ml)，實驗組(#9)的抗體包括兔子抗-駱駝VHH抗體(rabbit anti-camelid VHH antibody)、生物素(biotin)(0.5
Figure 02_image005
g配於100
Figure 02_image001
l PBS溶液中)及山羊抗-兔子HRP。
<110> 中國醫藥大學附設醫院
<120> 抗-腫瘤抗原奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用
<150> US 63/165,266
<151> 2021-03-24
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9
<400> 1
Figure 111110937-A0305-02-0018-1
Figure 111110937-A0305-02-0019-2
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-HLA-G奈米抗體選殖株#20
<400> 2
Figure 111110937-A0305-02-0019-3
<210> 3
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-HLA-G奈米抗體選殖株#33
<400> 3
Figure 111110937-A0305-02-0020-4
<210> 4
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-HLA-G奈米抗體選殖株#9
<400> 4
Figure 111110937-A0305-02-0021-5
<210> 5
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-HLA-G奈米抗體選殖株#20
<400> 5
Figure 111110937-A0305-02-0021-6
<210> 6
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-HLA-G奈米抗體選殖株#33
<400> 6
Figure 111110937-A0305-02-0022-7

Claims (11)

  1. 一種抗-腫瘤抗原奈米抗體，其與一人類白血球抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)專一性結合，該抗-腫瘤抗原奈米抗體是一選自於下列所組成的群組中的胺基酸序列：序列識別號：1、序列識別號：2及序列識別號：3；該抗-腫瘤抗原奈米抗體是生產及純化自大腸桿菌(E.coli)菌株HB2151。
  2. 如請求項1的抗-腫瘤抗原奈米抗體，其中該胺基酸序列是該抗-腫瘤抗原奈米抗體的一重鏈可變域(heavy chain variable domain,VHH)的胺基酸序列。
  3. 如請求項2的抗-腫瘤抗原奈米抗體，其阻斷該HLA-G與該HLA-G的一受體的交互作用及/或結合。
  4. 如請求項3的抗-腫瘤抗原奈米抗體，其中該受體是殺手細胞免疫球蛋白樣受體兩個Ig域及長胞質尾4(killer cell immunoglobulin like receptor,two Ig domains and long cytoplasmic tail 4,KIR2DL4)或白血球免疫球蛋白樣受體子族B成員1(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1,LILRB1)。
  5. 一種經分離的核酸，其編碼一如請求項1至4中任一項的抗-腫瘤抗原奈米抗體之胺基酸序列，該經分離的核酸是一選自於下列所組成的群組中的核苷酸序列：序列識別號：4、序列識別號：5、序列識別號：6，及其組合。
  6. 一種醫藥組成物，包含一如請求項1至4中任一項的抗-腫瘤抗原奈米抗體及一醫藥學上可接受的載劑。
  7. 一種如請求項1至4中任一項的抗-腫瘤抗原奈米抗體用於製備一治療癌症之醫藥品的用途。
  8. 一種用於檢測HLA-G表現量的方法，包含對一待測樣品投予一如請求項1至4中任一項的抗-腫瘤抗原奈米抗體。
  9. 如請求項8的方法，其中該待測樣品是血液、尿液、痰液、唾液或體液。
  10. 一種抗體綴合物，包含一如請求項1至4中任一項所述的抗-腫瘤抗原奈米抗體，及一可結晶片段區域(fragment crystallizable region,Fc region)，其中該抗-腫瘤抗原奈米抗體與該可結晶片段區域綴合。
  11. 一種抗體綴合物，包含一如請求項1至4中任一項所述的抗-腫瘤抗原奈米抗體，及一第二抗體，其中該抗-腫瘤抗原奈米抗體與該第二抗體綴合以形成雙特異性T細胞連接(bispecific T-cell engager,BiTE)、三特異性T-細胞連接(triple specific T-cell engager,TriTE)、雙特異性殺手細胞連接(bispecific killer cell enager,BiKE)、三特異性殺手細胞連接(triple specific killer cell engager,TriKE)，或任一雙特異性抗體。
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