TWI792955B - 抗-t細胞奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種抗-T細胞奈米抗體，其與一CD3 ε專一性結合。本發明亦提供該抗-T細胞奈米抗體的核酸編碼序列、該抗-T細胞奈米抗體用於治療癌症、免疫調節及活化免疫細胞的用途，及用於檢測CD3 ε表現量的方法。

Description

抗-T細胞奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用
本發明是有關於一種抗-T細胞奈米抗體暨其核酸編碼序列及其應用。
癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續多年居十大死因之榜首。
常規的腫瘤治療方法包括手術治療、放射線治療、化學治療及標靶治療等。腫瘤免疫治療為上述治療方法以外的另一種治療腫瘤的方法，是透過激活患者自身免疫系統，利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質誘導機體的特異性細胞免疫及體液免疫反應，增強機體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散及復發，以達到清除或控制腫瘤的目的。然而，目前的腫瘤治療方法仍存在效果不彰及副作用強烈的問題，甚至會衍生出其他免疫相關疾病。
CD3ε (CD3 epsilon)為在T細胞上發現的一種跨膜蛋白，已被發現與腫瘤及調節免疫功能有關聯性。因此，已有研究人員致力於研發以CD3ε作為辨識腫瘤及調節免疫功能的標靶分子並找出這些標靶分子是否具有成為抗癌藥物或免疫調節藥物的潛力。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出新穎且更有效治療癌症、免疫調節及活化免疫細胞的醫藥品以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種抗-T細胞奈米抗體，其與一CD3 ε (CD3 epsilon)專一性結合，該抗-T細胞奈米抗體包含一選自於下列所組成的群組中的胺基酸序列：序列識別號：1、序列識別號：2、序列識別號：3，及其任意組合。
在本發明的一實施例中，該胺基酸序列是該抗-T細胞奈米抗體的一重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)的一胺基酸序列。
在本發明的一實施例中，該抗-T細胞奈米抗體進一步包含一可結晶片段區域(fragment crystallizable region, Fc region)。
在本發明的一實施例中，該抗-T細胞奈米抗體與一第二抗體綴合以形成雙特異性T細胞連接(bispecific T-cell engager, BiTE)、三特異性T-細胞連接(triple specific T-cell engager, TriTE)、雙特異性殺手細胞連接(bispecific killer cell enager, BiKE)、三特異性殺手細胞連接(triple specific killer cell engager, TriKE)，或任一雙特異性抗體。
在本發明的一實施例中，該抗-T細胞奈米抗體活化及/或聚集CD3 ε陽性細胞。
本發明之另一目的為提供一種經分離的核酸，其編碼一如前所述的抗-T細胞奈米抗體之胺基酸序列，該經分離的核酸包含一選自於下列所組成的群組中的核苷酸序列：序列識別號：4、序列識別號：5、序列識別號：6，及其任意組合。
本發明之另一目的為提供一種醫藥組成物，包含一如前所述的抗-T細胞奈米抗體及一醫藥學上可接受的載劑。
本發明之另一目的為提供一種如前所述的抗-T細胞奈米抗體用於製備一治療癌症、免疫調節及活化免疫細胞之醫藥品的用途。
本發明之另一目的為提供一種用於檢測CD3 ε表現量的方法，包含對一待測樣品投予一如前所述的抗-T細胞奈米抗體。
在本發明的一實施例中，該待測樣品是血液、尿液、痰液、唾液、體液、腫瘤、器官、組織或細胞。
綜上所述，本發明抗-T細胞奈米抗體的功效在於：藉由T細胞(即周邊血液單核細胞)增殖及活化分析(T cell (i.e., peripheral blood mononuclear cell, PBMC) proliferation and activation assay)證明抗-CD3 ε奈米抗體可促進T細胞群聚增生及活化、增強PBMC中CD3陽性T細胞增殖、增強γδ T (GDT)細胞中CD3陽性T細胞增殖、藉由西方墨點分析(Western blotting)證明抗-CD3 ε奈米抗體可以識別人類T細胞的細胞溶解產物中的CD3 ε蛋白質、藉由免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)及流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)證明抗-CD3 ε奈米抗體可藉由流動式細胞測量分析偵測細胞樣品中CD3 ε的表現、藉由表面電漿子共振結合分析(surface plasmon resonance binding assay, SPR binding assay)證明抗-CD3 ε奈米抗體以0.5056 nM內的K D有效結合CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體，及藉由免疫細胞化學分析證明抗-CD3 ε奈米抗體可用來偵測細胞樣品中CD3 ε的表現，藉此可達到治療癌症、免疫調節及活化免疫細胞的效用。特別地，本發明抗-T細胞奈米抗體可扮演調節免疫功能及活化免疫細胞的角色，且相較於習知的抗體必須藉由載體將基因轉染至細胞中表現抗體功能而有低產量及效果不彰的缺點，本發明抗-T細胞奈米抗體可在體外大規模製備後直接投藥至需要的個體內進行治療。另外，本發明也可達到檢測CD3 ε表現量的效用。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在
Figure 02_image005
20%的範圍內，較佳為在
Figure 02_image005
10%的範圍內，最佳為在
Figure 02_image005
5%的範圍內。
如本文中所使用的，用語“第二抗體”意指可與奈米抗體綴合以形成雙特異性T細胞連接(bispecific T-cell engager, BiTE)、三特異性T-細胞連接(triple specific T-cell engager, TriTE)、雙特異性殺手細胞連接(bispecific killer cell enager, BiKE)、三特異性殺手細胞連接(triple specific killer cell engager, TriKE)，或任一雙特異性抗體的抗體。較佳地，第二抗體可包括，但不限於：抗程序性細胞死亡配體1 (programmed cell death ligand 1, PD-L1)、程序性細胞死亡配體2 (programmed cell death ligand 2, PD-L2)、T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, Tim3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、EGFRvIII、人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2, Her2)、B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen, BCMA)、CD19、CD20、CD34、人類白血球抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)、上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、間皮素(mesothelin)、紐約食道鱗狀上皮細胞癌-1 (New York esophageal squamous cell carcinoma-1, NY-ESO-1)、糖蛋白100 (glycoprotein 100, gp100)及黏蛋白1 (Muc1)抗體。
如本文中所使用的，用語“CD3e”與“CD3 ε”可交換使用。
如本文中所使用的，用語“CD3e奈米抗體”、“CD3e nb” 、“CD3e Nb”、 “CD3e nanobody”、“抗-CD3 ε奈米抗體”及“抗-T細胞奈米抗體”可交換使用。
如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
依據本發明的醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明的該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。
如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核酸片段”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。 實施例 1. 抗 -CD3 ε 奈米抗體的製備
在本實施例中，抗-CD3 ε (CD3 epsilon)奈米抗體(nanobody, NB)的製備流程如下。關於重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)的生產流程如下。VHH基因建構於表現載體pET22b (Amp抗性)或pSB-init (CmR抗性)中；質體經限制性內切酶消化及定序驗證鑑定。將 1
Figure 02_image007
L經鑑定的質體(約50 ng)加入BL21(DE3)中，37°C作用過夜。用單菌落接種含有抗性的LB培養基，並在37°C、220 r/min下培育培養物過夜。隔夜培養物以1:100的比例接種於含抗性的新鮮LB培養基(10L-20L)中，並於37°C、220r/min培養。當OD 600達至0.8時，冷卻至室溫。加入最終濃度為0.1 mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，20°C、220 r/min誘導過夜。藉由離心(20 mM Tris pH8.0、150 mM NaCl)在細胞破裂後獲取細胞及上清液。上清液藉由流通(flow-through)與 Ni-NTA珠粒(1mL)結合。用含有合適梯度咪唑(imidazole)(10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、250 mM及500 mM）的緩衝液清洗並洗脫Ni-NTA珠粒。用SDS-PAGE分析洗脫部分，根據蛋白質的純度及產量(離子交換層析或凝膠過濾層析)確定後續的純化方案。符合要求的蛋白質藉由凝膠過濾層析分離純化，緩衝液更換為PBS緩衝液。用SDS-PAGE分析蛋白質組分，將符合要求的組分合併濃縮，用0.22
Figure 02_image007
m濾膜過濾、分裝。之後，將蛋白質儲存於-20°C或更低溫度。
關於奈米抗體是生產及純化自大腸桿菌( E. coli)。為了生產奈米抗體形式的大腸桿菌，參考文獻Microb Cell Fact. 2019 Mar 11;18(1):47來進行。簡言之，使用大腸桿菌菌株HB2151。編碼胺苄青黴素(ampicillin)抗性的質體pET (Creative Biolab)被用於細胞質蛋白生產。用CD3 ε或CD3 ε多專一性奈米抗體質體新轉化的大腸桿菌HB2151被接種在5 mL含有50
Figure 02_image007
g/mL胺苄青黴素的培養基中，並在37°C培養過夜。之後，將 1 mL這種預培養物接種到100 mL培養基中並在37°C下生長。過夜培養後，每100 mL培養物中加入兩片EnPresso加強片及額外劑量的葡萄糖釋放酶(0.6 U/L)。同時，藉由加入1mM IPTG持續24小時誘導重組奈米抗體蛋白質表現。然後收集培養物並在冰上冷卻5分鐘，然後在6,000 × g及4°C下離心15分鐘。去除上清液後，細胞沉澱物藉由高容量Myc-tag結合樹脂使用固定化金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)進行純化。根據製造商操作流程(Clontech Laboratories)在天然條件下進行基於重力流的層析(gravity-flow-based chromatography)。藉由向每個200 mg細菌細胞沉澱物添加1 mL xTractor細胞裂解緩衝液(Clontech Laboratories)，並輔以不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics)及25 U核酸內切酶(Thermo Scientific Pierce)，可實現有效的細胞裂解。在冰上作用15分鐘、10,000 × g及4°C離心20分鐘以去除細胞碎片後，將澄清的上清液加到含有1 mL預裝樹脂的重力流管柱上，並在室溫下作用30分鐘。在藉由添加含有300 mM咪唑的洗脫緩衝液洗脫奈米抗體之前，用20及40 mM的咪唑濃度清洗管柱兩次。使用截留分子量為3.5-5 kDa的纖維素酯膜(cellulose ester membrane)(Spectrum ®Laboratories)藉由對PBS進行透析來去除咪唑及更換緩衝液。
CD3ε VHH由HuSdL ®人類單域抗體庫(human single domain antibody library)(Creative Biolabs)生成。簡而言之，在用CD3ε抗原結合/洗滌/洗脫進行四輪汰洗(panning)後，挑取約100個選殖株，然後藉由噬菌體酵素結合免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)選擇陽性單株噬菌體。對陽性選殖株進行桑格法(Sanger method)定序，得到奈米抗體序列。
關於進行DNA定序的選殖株項目顯示於下表1。 表1
項目 選殖株(clones)
1 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、17、18、19、20、25、27、29、32、34、35、36、37、39、42、45、49、50、57、58、66、67、68、70、71、73、74、75、84、85、88、90、92、93、21、23、24、30、41、47、48、54、55、60、63、72、76、77、82、89、91
藉由桑格法(Sanger method)對選殖株#2噬菌粒(phagemid)進行定序，然後將所有DNA序列藉由電腦模擬轉譯成相應的編碼胺基酸。之後，由於選殖株#2 DNA及對應CDR胺基酸與奈米抗體噬菌粒選殖株的胺基酸序列全數相同，故挑選選殖株#2。關於抗-CD3 ε奈米抗體的胺基酸序列分別為序列識別號：1、序列識別號：2及序列識別號：3，核苷酸序列分別為序列識別號：4 、序列識別號：5及序列識別號：6。接著，對選殖株#2進行競爭型酵素結合免疫吸附分析法(competitive enzyme linked immunosorbent assay, competitive ELISA)，操作流程如下。在大腸桿菌中擴增選殖株#2噬菌粒，然後收集上清液。將CD3ε重組蛋白(0.2
Figure 02_image007
g)塗佈、洗滌後，將250
Figure 02_image007
l含有選殖株#2噬菌體的TB培養基、模擬TB培養基及PBS對照組加入每個孔中。隔天，移除上清液，用PBST洗滌，然後與抗-M13噬菌體辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)-綴合的二級抗體作用2小時。清洗後，加入TMB受質(用於偵測HRP活性)(50
Figure 02_image007
l)，並藉由EILSA讀取儀利用450 nm通道偵測訊號。結果顯示於下表2。 表2
項目 塗佈(coating)：CD3 ε (OD 450)
選殖株#2 0.639
培養基 0.215
磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS) 0.221
二級抗體為辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)-山羊抗人類IgG (可結晶片段區域(fragment crystallizable region, Fc region))
實施例 2. 抗 -CD3 ε 奈米抗體的 T 細胞增殖及活化分析結果
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體的T細胞(即周邊血液單核細胞)增殖及活化分析(T cell (i.e., peripheral blood mononuclear cell, PBMC) proliferation and activation assay)的操作流程如下。將1 x 10 6的PBMC細胞接種在12孔盤中，存在或不存在抗-CD3 ε奈米抗體 (1
Figure 02_image007
g/ml)或臨床用CD3ε單株抗體OKT3 (10 mg/ml, Invitrogen, Cat:MA1-10175)。接著，添加50
Figure 02_image009
/ml的IL-2及2
Figure 02_image007
g/ml的IL-15 (Sino Biological, Cat No:10360-H07E)。5或7天後，記錄總細胞數，然後用FITC-綴合的CD3單株抗體(OKT3, 11-0037-42, eBioscience)染色，然後藉由流動式細胞測量術進行分析。照片是用顯微鏡在40x下拍攝。CD3陽性細胞數計算為CD3細胞百分比(%)×總細胞數。
抗-CD3 ε奈米抗體的T細胞(即周邊血液單核細胞)增殖及活化分析結果顯示於圖1A及圖1B。由圖1A及圖1B可見，本發明抗-CD3 ε奈米抗體可促進T細胞群聚增生及活化。 實施例 3. 抗 -CD3 ε 奈米抗體在增強 PBMC 中 CD3 陽性 T 細胞增殖上的效用評估
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體在增強PBMC中CD3陽性T細胞增殖上的效用評估的操作流程如下。將1 x 10 6的PBMC細胞接種在12孔盤中，存在或不存在抗-CD3 ε奈米抗體(10、100、1000、5000 ng/ml)。接著，添加50
Figure 02_image009
/ml的IL-2 (Gibco, PHC0021)及2
Figure 02_image007
g/ml的IL-15 (Sino Biological, Cat No:10360-H07E)。3或7天後，記錄總細胞數，然後用FITC-綴合的CD3單株抗體(OKT3, 11-0037-42, eBioscience)染色，然後藉由流動式細胞測量術進行分析。照片是用顯微鏡在40x下拍攝。CD3陽性細胞數計算為CD3細胞百分比(%)×總細胞數。
抗-CD3 ε奈米抗體在增強PBMC中CD3陽性T細胞增殖上的效用評估的結果顯示於圖2A至圖2C，其中CD3e nb表示抗-CD3 ε奈米抗體，Vehicle表示載體。由圖2A至圖2C可見，抗-CD3 ε奈米抗體以叢集形成(cluster formation)的方式顯著地刺激PBMCs中CD3陽性T細胞增殖。 實施例 4. 抗 -CD3 ε 奈米抗體在增強 γδ T (GDT) 細胞中 CD3 陽性 T 細胞增殖上的效用評估
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體在增強γδ T (GDT)細胞中CD3陽性T細胞增殖上的效用評估的操作流程如下。將1 x 10 6的初代γδ T (GDT)細胞細胞接種在12孔盤中，存在或不存在抗-CD3 ε奈米抗體(10、100、1000、5000 ng/ml)。接著，添加50
Figure 02_image009
/ml的IL-2 (Gibco, PHC0021)及2
Figure 02_image007
g/ml的IL-15 (Sino Biological, Cat No:10360-H07E)。3或7天後，記錄總細胞數，然後用FITC-綴合的CD3單株抗體(OKT3, 11-0037-42, eBioscience)染色，然後藉由流動式細胞測量術進行分析。照片是用顯微鏡在40x下拍攝。CD3陽性GDT細胞數計算為CD3 GDT細胞百分比(%)×總細胞數。
抗-CD3 ε奈米抗體在增強gamma delta T (GDT)細胞中CD3陽性T細胞增殖上的效用評估的結果顯示於圖3A至圖3D，其中CD3e nb表示抗-CD3 ε奈米抗體。本實施例的結果顯示，抗-CD3 ε奈米抗體可以劑量依賴方式有效地增強γδ T細胞增殖。 實施例 5. 抗 -CD3 ε 奈米抗體的西方墨點分析 (Western blotting) 結果
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體的西方墨點分析(Western blotting)的操作流程如下。在含有蛋白酶抑制劑混合物的PRO-PREP蛋白質萃取溶液(iNtRON，台北，台灣)中獲取細胞，並在4°C下劇烈振盪15分鐘，然後離心。收集上清液，然後使用Bio-Rad BCA試劑(Bio-Rad Hercules，CA，USA)測定蛋白質濃度。將30 μg的每個樣品裂解物在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，然後電印跡到PVDF膜上。在TBST封阻中加入5% BSA後，將膜與初級抗體(溶於TBST中)在4°C下作用過夜。接著，清洗4次並以辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)-綴合的山羊-抗小鼠或兔子IgG (Upstate, Billerica, MA, USA)作用兩小時。以TBST清洗4次後，印跡與SuperSignal West Pico ECL試劑(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)一起作用1分鐘，然後藉由暴露於Kodak-X-Omat膠片來檢測化學發光。
抗-CD3 ε奈米抗體的西方墨點分析結果顯示於圖4，其中上排數字表示T細胞蛋白質溶解產物(protein lysate)的量(µg)，(a)使用傳統抗體#ab135372，其為抗-CD3抗體，初級抗體濃度為10 µg/ml (1:1000)，二級抗體為抗-兔子-HRP (1:1000)；(b)使用抗-CD3 ε奈米抗體(即為重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)奈米抗體)，初級抗體濃度為1 µg/ml (1:1000)，二級抗體為抗-VHH-HRP (1:1000)。本實施例的結果顯示，藉由西方墨點分析，抗-CD3 ε奈米抗體可以識別人類T細胞的細胞溶解產物中的CD3 ε蛋白質。 實施例 6. 抗 -CD3 ε 奈米抗體的 免疫組織化學染色 (immunohistochemistry staining, IHC staining) 結果
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體的免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)的操作流程如下。人類PBMC樣品被固定在10%的甲醛中並包埋在石蠟中。切片(厚度 = 3
Figure 02_image007
m)使用蘇木精及伊紅染色。對於免疫組織化學，抗原回復(antigen retrieval)藉由在99
Figure 02_image011
微波進行。切片用H 2O 2清洗及作用15分鐘以阻斷內源性過氧化酶，然後在5% BSA中浸泡30分鐘。然後將切片與初級抗體在4°C下作用過夜。接著，將切片以稀釋的生物素-綴合的二級抗體在室溫下作用2小時或在4°C下作用過夜。最後，切片在室溫下與聚合物一起作用10分鐘然後二胺基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB) (是辣根過氧化酶最敏感、最常用的顯色反應物)染色，用蘇木精及伊紅染色，並使用中性橡膠固定。染色的定量藉由光學顯微鏡(Nikon，日本)以40倍及400倍放大率獨立進行。
抗-CD3 ε奈米抗體的免疫組織化學染色結果顯示於圖5，其中CD3e nb表示抗-CD3 ε奈米抗體，SP7是傳統抗-CD3抗體。本實施例的結果顯示，抗-CD3 ε奈米抗體可藉由免疫組織化學染色用以偵測CD3 ε的表現。 實施例 7. 抗 -CD3 ε 奈米抗體的 流動式細胞測量分析 (flow cytometric analysis) 結果
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體的流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)的操作流程如下。將人類PBMC用FITC綴合的CD3ε奈米抗體(1
Figure 02_image007
g/ml)及OKT3抗體(抗-CD3單株抗體)(10
Figure 02_image007
g/ml)在冰上染色45分鐘，洗滌後，使用FL1通道藉由流動式細胞測量分析細胞。
抗-CD3 ε奈米抗體的流動式細胞測量分析結果顯示於圖6，其中(a)中FSC-A表示前向散射面積(forward scatter area)，SSC-A表示側向散射面積(side scatter area)，fcs表示流動式細胞測量術標準(flow cytometry standard)，(b)中Alexa Fluor 488-A是一種明亮的綠色螢光染料，其激發於488 nm波長的雷射光線。由圖6可見，抗-CD3 ε奈米抗體可藉由流動式細胞測量分析偵測細胞樣品中CD3 ε的表現。 實施例 8. 抗 -CD3 ε 奈米抗體對 CD3
Figure 02_image013
/CD3
Figure 02_image015
異二聚體的 表面電漿子共振結合分析 (surface plasmon resonance binding assay, SPR binding assay) 結果
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體對CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體的表面電漿子共振結合分析(surface plasmon resonance binding assay, SPR binding assay)的操作流程如下。CM5或NTA晶片，由BIAcore T200 (Biacore-GE Healthcare, Piscataway, NJ)進行SPR分析。簡言之，在10 mM緩衝溶液(pH 4.0、5.5 或6.0)中以20 μg/mL的濃度範圍稀釋蛋白質(CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
重組蛋白質)樣品，以獲得最大的表面保留用於固定在晶片上，遵循表面製備過程並選擇配體(CD3
Figure 02_image001
或CD3
Figure 02_image001
多專一性奈米抗體、25、12.5、6.25、3.125、1.5625及0.78125 nM)塗覆在晶片上。然後是再生探索(regeneration scouting)及表面性能測試(surface performance test)，在再生探索及表面性能測試之後，然後選擇再生方法來運行實驗。然後選擇結合分析(BINDING ANALYSIS)及直接結合(DIRECT BINDING)來研究蛋白質結合。選擇動力學分析(KINETIC ANALYSIS)並選擇質量轉移(MASS TRANSFER)進行結合實驗的動力學分析。之後，進行數據分析及動力學常數確定。
抗-CD3 ε奈米抗體對CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體的表面電漿子共振結合分析(SPR binding assay)結果顯示於圖7，其中分析濃度為62.5 nM、31.25 nM、15.625 nM、7.8125 nM、3.90625 nM、1.953 nM)，締合時間(association time)為120秒，解離時間(dissociation time)為600秒，Kd: 5.056 x 10 -10= 0.5056nM，使用塗覆CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體重組蛋白質(ACROBiosystems, Cat:CDD-H52W1)的NTA晶片。由圖7可見，抗-CD3 ε奈米抗體以0.5056 nM內的K D有效結合CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體。 實施例 9. 抗 -CD3 ε 奈米抗體的 免疫細胞化學 (immunocytochemistry) 分析結果
在本實施例中，抗-CD3 ε奈米抗體的免疫細胞化學(immunocytochemistry)分析的操作流程如下。將細胞(1 x 10 5)接種在6孔盤的蓋玻片上，培育過夜。在指定的處理後，將細胞固定在1%多聚甲醛(paraformaldehyde)中，用PBS清洗，在含有0.5% BSA的PBS中使用0.1% Triton X-100透化 30 分鐘，用2% BSA封阻，並與專一性抗體(配於2% BSA/含有0.05% Tween-20的PBS (PBST)中)一起作用。在清洗之後，將細胞與螢光素綴合的二級抗體一起作用，用PBST清洗，並使用含有抗褪色劑及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)的水性封固劑封固。在Leica TCS SP8 X共焦顯微鏡(Leica)下分析影像。
抗-CD3 ε奈米抗體的免疫細胞化學(immunocytochemistry)分析結果顯示於圖8，其中抗-CD3 ε奈米抗體的濃度為1 ng/ml，SP7是傳統抗-CD3抗體(1:500, MA1-90582, Invitrogen)，二級抗體為抗-VHH-螢光素(fluorescein, FITC)(1:5000)。本實施例的結果顯示，藉由免疫細胞化學分析，抗-CD3 ε奈米抗體可用來偵測細胞樣品中CD3 ε的表現。
綜上所述，本發明抗-T細胞奈米抗體(即抗-CD3 ε抗體)藉由T細胞(即周邊血液單核細胞)增殖及活化分析(T cell (i.e., peripheral blood mononuclear cell, PBMC) proliferation and activation assay)證明抗-CD3 ε奈米抗體可促進T細胞群聚增生及活化、增強PBMC中CD3陽性T細胞增殖、增強γδ T (GDT)細胞中CD3陽性T細胞增殖、藉由西方墨點分析(Western blotting)證明抗-CD3 ε奈米抗體可以識別人類T細胞的細胞溶解產物中的CD3 ε蛋白質、藉由免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)及流動式細胞測量分析(flow cytometric analysis)證明抗-CD3 ε奈米抗體可藉由流動式細胞測量分析偵測細胞樣品中CD3 ε的表現、藉由表面電漿子共振結合分析(surface plasmon resonance binding assay, SPR binding assay)證明抗-CD3 ε奈米抗體以0.5056 nM內的K D有效結合CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體，及藉由免疫細胞化學分析證明抗-CD3 ε奈米抗體可用來偵測細胞樣品中CD3 ε的表現，藉此可達到治療癌症、免疫調節及活化免疫細胞的效用。特別地，本發明抗-T細胞奈米抗體可扮演調節免疫功能及活化免疫細胞的角色，且相較於習知的抗體必須藉由載體將基因轉染至細胞中表現抗體功能而有低產量及效果不彰的缺點，本發明抗-T細胞奈米抗體可在體外大規模製備後直接投藥至需要的個體內進行治療。另外，本發明也可達到檢測CD3 ε表現量的效用。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
無
圖1A及圖1B顯示抗-CD3 ε奈米抗體的T細胞(即周邊血液單核細胞)增殖及活化分析(T cell (i.e., peripheral blood mononuclear cell, PBMC) proliferation and activation assay)結果。 圖2A至圖2C顯示抗-CD3 ε奈米抗體在增強PBMC中CD3陽性T細胞增殖上的效用評估的結果，其中CD3e nb表示抗-CD3 ε奈米抗體，Vehicle表示載體。 圖3A至圖3D顯示抗-CD3 ε奈米抗體在增強gamma delta T (GDT)細胞中CD3陽性T細胞增殖上的效用評估的結果，其中CD3e nb表示抗-CD3 ε奈米抗體，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。 圖4顯示抗-CD3 ε奈米抗體的西方墨點分析(Western blotting)結果，其中上排數字表示T細胞蛋白質溶解產物(protein lysate)的量(µg)，(a)使用傳統抗體#ab135372，其為抗-CD3抗體，初級抗體濃度為10 µg/ml (1:1000)，二級抗體為抗-兔子-辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP) (1:1000)；(b)使用抗-CD3 ε奈米抗體(即為重鏈可變域(heavy chain variable domain, VHH)奈米抗體)，初級抗體濃度為1 µg/ml (1:1000)，二級抗體為抗-VHH-HRP (1:1000)。 圖5顯示抗-CD3 ε奈米抗體的免疫組織化學染色(immunohistochemistry staining, IHC staining)結果，其中CD3e nb表示抗-CD3 ε奈米抗體，SP7是傳統抗-CD3抗體。 圖6顯示抗-CD3 ε奈米抗體的流動式細胞測量分析結果，其中(a)中FSC-A表示前向散射面積(forward scatter area)，SSC-A表示側向散射面積(side scatter area)，fcs表示流動式細胞測量術標準(flow cytometry standard)，(b)中Alexa Fluor 488-A是一種明亮的綠色螢光染料，其激發於488 nm波長的雷射光線。 圖7顯示抗-CD3 ε奈米抗體對CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體的表面電漿子共振結合分析(SPR binding assay)結果，其中分析濃度為62.5 nM、31.25 nM、15.625 nM、7.8125 nM、3.90625 nM、1.953 nM，締合時間(association time)為120秒，解離時間(dissociation time)為600秒，Kd: 5.056 x 10 -10= 0.5056nM，使用塗覆CD3
Figure 02_image001
/CD3
Figure 02_image003
異二聚體重組蛋白質(ACROBiosystems, Cat:CDD-H52W1)的NTA晶片。 圖8顯示抗-CD3 ε奈米抗體的免疫細胞化學(immunocytochemistry)分析結果，其中抗-CD3 ε奈米抗體的濃度為1 ng/ml，SP7是傳統抗-CD3抗體(1:500, MA1-90582, Invitrogen)，二級抗體為抗-VHH-螢光素(fluorescein, FITC)(1:5000)。
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<151> 2022-03-18
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 1
Figure 111110941-A0305-02-0017-1
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 2
Figure 111110941-A0305-02-0017-2
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 3
Figure 111110941-A0305-02-0018-3
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 4
Figure 111110941-A0305-02-0018-4
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 5
Figure 111110941-A0305-02-0018-5
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 6
Figure 111110941-A0305-02-0018-6

Claims (6)

  1. 一種抗-T細胞奈米抗體，其與一CD3 ε(CD3 epsilon)專一性結合，該抗-T細胞奈米抗體是由序列識別號：1、序列識別號：2及序列識別號：3所示胺基酸序列所組成，其中該序列識別號：1所示胺基酸序列是互補決定區1(complementarity determining region 1,CDR1)，該序列識別號：2所示胺基酸序列是CDR2，及該序列識別號：3所示胺基酸序列是CDR3，該抗-T細胞奈米抗體是生產及純化自大腸桿菌(E.coli)菌株HB2151。
  2. 一種經分離的核酸，其編碼一如請求項1的抗-T細胞奈米抗體之胺基酸序列。
  3. 一種醫藥組成物，包含一如請求項1的抗-T細胞奈米抗體及一醫藥學上可接受的載劑。
  4. 一種如請求項1的抗-T細胞奈米抗體用於製備一治療癌症、免疫調節及活化免疫細胞之醫藥品的用途。
  5. 一種用於檢測CD3 ε表現量的方法，包含對一待測樣品投予一如請求項1的抗-T細胞奈米抗體。
  6. 如請求項5的方法，其中該待測樣品是血液、尿液、痰液、唾液或體液。
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